專利名稱：枯草芽孢桿菌殺菌肽的體外表達(dá)及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明枯草芽孢桿菌殺菌肽的體外表達(dá)及其方法屬于現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)早在1960年以前，人們就對(duì)微生物的拮抗作用進(jìn)行了廣泛的生理生化研究，對(duì)各類拮抗物質(zhì)進(jìn)行了分門(mén)別類，對(duì)醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展作出很大貢獻(xiàn)。近年來(lái)人們對(duì)從乳酸桿菌中分離得到的肽類抗生素的作用機(jī)制和分子遺傳學(xué)研究擴(kuò)展的非常廣泛和深入(綜述文章有Klaenhammer，T.R.(1993).Genetics of bacteriocins producedby lactic acid bacteria.FEMS Microbiol Rev 12，39-86.和Jack，R.W.，Tagg，J.R.& Ray，B.(1995).Bacteriocins of gram-positive bacteria.Microbiol Rev 59，171-200.)。因?yàn)樗鼈兺渌目股夭煌幵谟谒鼈儙缀醪粫?huì)引起微生物的抗藥性，比如乳酸鏈球菌肽(nisin)作為食品的防腐劑已有五十年的歷史，但是并沒(méi)發(fā)現(xiàn)有腐敗菌產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象。因此肽類抗生素將在今后的食品業(yè)和醫(yī)藥業(yè)擁有巨大應(yīng)用前景(Breukink，E.，Wiedemann，I.，van Kraaij，C.，Kuipers，O.P.，Sahl，H.G.& de Kruijff，B.(1999).Use ofthe Cell Wall Precursor Lipid II by a Pore-Forming Peptide Antibiotic.Science 287，2361-2364.)。
殺菌肽LCI是我們實(shí)驗(yàn)室從枯草芽孢桿菌AO14的培養(yǎng)液中分離出的堿性多肽，分子量為5.4 kDa。它對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzaestrain G.)水稻條斑病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzea S2)馬鈴薯青枯病菌(Pseudomonas solanacearum POl)煙草青枯病菌(Pseudomonassolanacearum T62，T64)和辣椒青枯病菌(Pseudomonas solanacearum PE1)有明顯的抑制作用。其全部氨基酸序列為AIKLVQSPNG NFAASFVLDG TKWIFKSKYY DSSKGYWVGI YEVWDRK通過(guò)對(duì)國(guó)際基因及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank和Swiss-port)的檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與此殺菌肽序列結(jié)構(gòu)相似的蛋白或基因。該結(jié)果已發(fā)表(劉進(jìn)元，陳章良，抗菌多肽LCI的一級(jí)結(jié)構(gòu)，自然科學(xué)進(jìn)展，1994，4(3)365-367)。
枯草芽孢桿菌拮抗性廣，拮抗物質(zhì)變化多樣。我們國(guó)內(nèi)近些年來(lái)對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌蛋白的研究也時(shí)有報(bào)道，在分子生物學(xué)方面的研究尚不深入(比如辛玉成，秦淑蓮，金靜，張迎春，徐坤，蘋(píng)果霉心病生防菌株抗菌蛋白的提純與部分性質(zhì)初報(bào)，萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，16(1)。孫建，枯草芽孢桿菌B-903菌株抗生物質(zhì)對(duì)植物病原真菌的抑制作用，植物病理學(xué)報(bào)，1995，25(1)69～72)。
發(fā)明的目的在廣泛的研究利用植物、動(dòng)物和昆蟲(chóng)來(lái)源的抗植物病原菌和病蟲(chóng)害基因進(jìn)行農(nóng)作物抗病育種，并取得許多成果的同時(shí)，研究來(lái)源于拮抗微生物的抗病基因并應(yīng)用于植物基因工程目前還比較少。
本實(shí)驗(yàn)室在1990年以來(lái)就已從大田中分離出數(shù)種拮抗能力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，并分離純化出數(shù)種對(duì)植物病原真菌和病原細(xì)菌的體外生長(zhǎng)有抑制作用的多肽和蛋白質(zhì)。進(jìn)一步克隆出這些抗病基因，利用它們不同的作用機(jī)理而產(chǎn)生的可能的協(xié)同作用，將其同時(shí)導(dǎo)入植物，有希望使轉(zhuǎn)基因植物即獲得廣譜抗菌能力又對(duì)單一病原菌的抗性增強(qiáng)。具有廣譜抗菌，對(duì)人畜無(wú)毒的肽類抗生素同樣可以用于基于生物基因工程的食品與醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。
分離和純化特異的抗菌類多肽，對(duì)它們進(jìn)行生理生化特性以及結(jié)構(gòu)和功能的研究分析，主要是拮抗機(jī)理的闡明，這在植物基因工程和植物病理學(xué)領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。闡明多肽的結(jié)構(gòu)與功能在很大程度上要依賴于該多肽基因的克隆和體外的表達(dá)，從而為克隆出該多肽的其它相關(guān)基因、研究基因的表達(dá)與調(diào)控提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)為獲得轉(zhuǎn)基因抗菌農(nóng)作物打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
發(fā)明的內(nèi)容及方案1.按照已有的LCI氨基酸序列合成其基因。
2.將LCI基因克隆到中間載體pBC7。
3.將LCI基因克隆到表達(dá)載體pBVAB16。
4.LCI殺菌肽在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。
5.表達(dá)的LCI的分離純化。
6.表達(dá)的LCI的殺菌活性檢測(cè)。
7.表達(dá)的LCI對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的抑制作用。
優(yōu)點(diǎn)及效果將重組表達(dá)載體pBV AB16轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)42℃高溫誘導(dǎo)，在5小時(shí)時(shí)LCI的表達(dá)量達(dá)到最高，經(jīng)對(duì)電泳凝膠的掃描分析，LCI的表達(dá)量占大腸桿菌的總蛋白含量8.7％。
殺菌肽LCI是胞外釋放的質(zhì)粒編碼的核糖體合成的肽鏈，具有低分子量、帶正電荷和熱穩(wěn)定性。
純化的LCI能專門(mén)殺死水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌株G，LCI最低有效濃度為2.5μg/ml，該菌的在0.13mg/ml的LCI處理下存活率為10-3。
LCI含有同其它細(xì)菌素相似的保守的序列結(jié)構(gòu)，它們主要是乳酸菌的第二類細(xì)菌素。根據(jù)推測(cè)的LCI的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及LCI的體外轉(zhuǎn)錄抑制活性，可以初步推斷LCI是進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，抑制了RNA的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)而引起細(xì)菌死亡。不同于其它細(xì)菌素只能殺死革蘭氏陽(yáng)性菌，LCI能殺死革蘭氏陰性菌的這個(gè)特征將大大有利于核糖體合成的細(xì)菌素在基因工程抗病育種的應(yīng)用，該基因可望首先應(yīng)用于植物抗病育種及特效菌肥的生產(chǎn)。


圖1.LCI基因序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。A丙氨酸，I異亮氨酸，K賴氨酸，L亮氨酸，V纈氨酸，Q谷氨酰胺，S絲氨酸，P脯氨酸，N天冬酰胺，G甘氨酸，F(xiàn)苯丙氨酸，D天冬氨酸，T蘇氨酸，W色氨酸，Y酪氨酸，E谷氨酸，R精氨酸。下劃線的區(qū)域?yàn)榛瘜W(xué)合成的片段。
圖2.LCI在不同濃度下對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)菌株G生長(zhǎng)的抑制作用。LCI的濃度為0μg/ml(●)；0.6μg/ml(O)；2.5μg/ml(△)；4.9μg/ml(▲)；9.8μg/ml(■)。
圖3.LCI對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌株G殺死能力的測(cè)定。LCI的兩個(gè)濃度為0.13mg/ml(●)和0.066mg/ml(■)。
圖4.LCI不同濃度對(duì)對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的影響。LCI的濃度第1道為不加LCI的對(duì)照，第2道0.11mg/ml，第3道0.22mg/ml，第4道0.39mg/ml。
圖5.LCI的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及與其它細(xì)菌素多肽序列的比較。圖中的方框、下劃線、陰影和黑體都代表保守區(qū)域。CFChou-Fasman；GORGarnier-Osguthorpe-Robson。
實(shí)施例1、LCI基因的化學(xué)合成及其克隆殺菌肽LCI產(chǎn)生于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A014的培養(yǎng)液。它總共由47個(gè)氨基酸組成，含有6個(gè)賴氨酸、1個(gè)精氨酸和3個(gè)色氨酸。根據(jù)LCI的氨基酸序列，使用植物體偏愛(ài)的密碼子，加上起始和終止密碼子以及ClaI和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)，人工合成了的LCI的DNA基因片段(見(jiàn)圖1.)。四個(gè)加下劃線的核酸片段是用DNA合成儀ABI381A(LKB)以固相亞磷酰胺法合成的1. 5′atatcgatggctatcaagctggtgcagtccccaaacggcaacttcgccgct 3′2. 5′acttgaagatccacttagtaccgtccagcacgaaggaagcggcgaagttgc 3′3. 5′taagtggatcttcaagtccaaatactatgactccagcaagggctactgggt 3′4. 5′cgaagcttacttgcggtcccacacctcgtagatgccgacccagtagccctt 3′每個(gè)片斷含有51個(gè)核苷酸殘基。它們是用含有8M尿素的16％的丙烯酰胺凝膠電泳純化的。含有DNA片斷的膠段浸入0.5M NaCl溶液中過(guò)夜，而后上清液經(jīng)DEAE-Sepharose進(jìn)一步純化，脫鹽、冷凍干燥。每個(gè)DNA片斷以200pmol等量混合后在水浴中85℃加熱5分鐘，而后漸漸冷卻到室溫。再加入dNTP和T4DNA多聚酶，在37℃進(jìn)行填平反應(yīng)。
2、LCI表達(dá)載體的構(gòu)建合成的LCI基因片段經(jīng)Cla I和Hind III雙酶切，用T4 DNA連接酶將它連接到經(jīng)同樣的這兩種酶處理過(guò)的pBluescript II KS質(zhì)粒上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和篩選，得到含有LCI基因的克隆質(zhì)粒pBC7。該質(zhì)粒經(jīng)序列分析證實(shí)含有正確的LCI基因。
pBC7質(zhì)粒經(jīng)Cla I酶消化后用DNA多聚酶I Klenow大片斷進(jìn)行補(bǔ)平，而后用BamH I消化，用2％的瓊脂糖回收LCI基因片段。質(zhì)粒pBV220經(jīng)EcoRI消化后用DNA多聚酶I Klenow大片斷進(jìn)行補(bǔ)平，而后用BamH I消化。將LCI基因片段連接到pBV220質(zhì)粒中后，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和篩選，制成質(zhì)粒pBVAB16。
3.超表達(dá)的LCI的提取和純化含有質(zhì)粒pBVAB16的大腸桿菌DH5α，在LB液體培養(yǎng)基中活化，其中氨芐青霉素含量為50mg/l，按1％的接種量接入新鮮的同種培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2.5小時(shí)，而后42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)，轉(zhuǎn)速均為200rpm。
誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)離心4000rpm 10分鐘回收后，用50mM Tris-HCl，pH7.8緩沖液洗兩遍，冰浴中超聲破碎400W 30次，每次15秒，間隔10秒，60℃加熱20分鐘，10000rpm離心20分鐘，去掉沉淀。而后經(jīng)離子交換液相色譜CM-Sepharose Fast Flow C26/20以0～0.6M NaCl線性梯度洗脫。得到的活性色譜峰加入4M硫酸銨調(diào)成2M，加入0.5M，pH6.5的磷酸二氫鉀調(diào)成50mM，微慮后用疏水作用液相色譜Phenyl-Superose HR5/5以1.7～0M硫酸銨進(jìn)行線性洗脫，得到的主峰即為純化的LCI。此LCI樣品經(jīng)PD-10Sephadex G-25M(Pharmacia)脫鹽后凍干，保存于-20℃?zhèn)溆?。用Tris-tricine SDS-PAGE電泳確定LCI的純度。LCI的濃度由280nm紫外吸收法和Lowry法測(cè)定。LCI的表達(dá)量由薄層掃描儀對(duì)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠分析確定。
由于pBV AB16質(zhì)粒有以下特點(diǎn)，使LCI在大腸桿菌中得到了高效的表達(dá)1、質(zhì)粒中含有SD序列，其后緊接多克隆位點(diǎn)，若位于起始密碼子AUG上游3～11個(gè)核苷酸處，與16s rRNA的3’端序列互補(bǔ)，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的高效翻譯；2、PR和PL兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)，而且PL受CI蛋白抑制，可通過(guò)溫度的變化來(lái)誘導(dǎo)它的表達(dá)，從而增強(qiáng)了表達(dá)的穩(wěn)定性和強(qiáng)度；3、來(lái)自大腸桿菌的rrB核糖體基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)具有強(qiáng)的終止作用，能夠避免密碼子的通讀，有利于質(zhì)?！拗飨到y(tǒng)的穩(wěn)定。
利用LCI熱穩(wěn)定的特性，在E.coli中超表達(dá)的LCI可以從超聲波破碎的細(xì)胞懸液中抽提出來(lái)，并且用熱水浴的辦法使大部分蛋白質(zhì)受熱變形沉淀下來(lái)，從而很容易地用CM-Sepharose Fast Flow及Phenyl-Superose HR5/5或者M(jìn)onoS液相色譜純化得到電泳純的LCI。通過(guò)薄層掃描測(cè)定LCI的表達(dá)量為大腸桿菌總蛋白量的8.7％。表達(dá)的LCI電泳表觀分子量為3.5kDa。
應(yīng)該指出的是，經(jīng)離心去除的細(xì)胞碎片和60℃熱處理產(chǎn)生的沉淀中都有抑菌活性，也就是說(shuō)，有相當(dāng)一部分LCI沒(méi)有被回收到。若這些沉淀用緩沖液再?zèng)_洗兩次，合并洗滌液，有希望提高得率。
4.LCI的抗菌活性檢測(cè)1、96孔板濁度比色法確定LCI的抑菌比活用水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzea strain G)為指示菌，將它用LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜活化(200rpm，28℃)后，取20μl，加入100μl新鮮的LB培養(yǎng)基，20μl不同濃度的LCI水溶液(從1.1mg/ml LCI開(kāi)始，以二倍法稀釋八次)，加入96孔板，重復(fù)兩次。無(wú)抑制對(duì)照為將20μl LCI液換成20μl無(wú)離子水，空白對(duì)照為120μl LB培養(yǎng)基和20μl無(wú)離子水。96孔板于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)。每隔一小時(shí)，在微量分光光度計(jì)(Microplate AutoreaderEL310，BIO-TEK INSTRUMENTS)上，于540nm的光線下測(cè)量每個(gè)樣品孔的光密度。
由病原細(xì)菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae G不同的生長(zhǎng)曲線可以確定LCI的抑菌的最低濃度為2.5μg/ml(見(jiàn)圖2.)。
2、平板擴(kuò)散法分析LCI的抑菌譜在LB培養(yǎng)基平板上，倒入1ml活化的被測(cè)菌(包括Xanthomonas oryzaepv.oryzea strain G)培養(yǎng)懸濁液，涂平，3分鐘后移去多余的液體，晾干。在平板的不同位置上分別滴加5μl LCI溶液，5μl相應(yīng)的緩沖液為對(duì)照，于28℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀測(cè)抑菌圈大小。另外一種方法是將5μl LCI溶液，5μl相應(yīng)的緩沖液為對(duì)照先分別滴加在平板的同一條線上，待液滴消失后，用接種環(huán)蘸取活化好的菌液沿著兩個(gè)液滴的位置劃一直線。一個(gè)平板可以同時(shí)測(cè)定數(shù)種不同的細(xì)菌。28℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀測(cè)抑菌圈。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LCI對(duì)Xanthomonas oryzae pv.oryzae G有特殊的抑制作用。
3、LCI的殺菌能力測(cè)試將過(guò)夜活化的X.oryzae pv.oryzae strain G用LB液體培養(yǎng)基稀釋到0.035OD 600nm。經(jīng)微慮除菌的LCI樣品(0.53mg/ml)作一次二倍稀釋后，分別以100μl的量與300μl的稀釋菌液混合與微量離心管中，在室溫下存放。每隔一定的時(shí)間，取出20μl于980μl的LB液體培養(yǎng)基中混勻，而后取出100μl涂于LB瓊脂板上，28℃過(guò)夜培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)在平板上形成的克隆數(shù)可以確定LCI的殺菌能力。從圖3.可以看出LCI并不是立即殺死細(xì)菌，細(xì)菌的數(shù)目在加入LCI后大約半小時(shí)開(kāi)始下降，下降過(guò)程持續(xù)到八個(gè)小時(shí)。水稻白葉枯病菌(X.oryzaepv.oryzae strain G)對(duì)LCI的兩個(gè)濃度0.13mg/ml(●)和0.066mg/ml(■)都表現(xiàn)大概一致的敏感趨勢(shì)，在高的LCI濃度下，該菌的存活率大約為10-3。
在大腸桿菌中表達(dá)的LCI可能沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后的修飾，但是天然的LCI則有可能，而且這種修飾往往會(huì)賦予殺菌肽更多的活性特征。另外現(xiàn)在還很難說(shuō)明增加在N端的蛋氨酸是否會(huì)影響LCI的殺菌特性。
水稻白葉枯病菌X.oryzae pv.oryzae G是革蘭氏陰性菌，而在通常條件下革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生的細(xì)菌素只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有作用。目前已知的植物病原細(xì)菌大都是革蘭氏陰性菌，因此LCI能殺死革蘭氏陰性菌的這個(gè)特征將大大有利于核糖體合成的細(xì)菌素在基因工程抗病育種的應(yīng)用。
5.LCI對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的抑制實(shí)驗(yàn)用Riboprobe Combination System(Promega)和SP6多聚酶來(lái)測(cè)定LCI可能的轉(zhuǎn)錄抑制活性。體外轉(zhuǎn)錄分析在20μl的反應(yīng)體系中含有40mM Tris-HCl，pH7.5，6mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM NaCl，10mM DTT，500μM each ATP，GTP，CTP and UTP，40 U Recombinant RNasin Ribonuclease inhibitor，0.5μg pGEMExpress Positive Control Template，20 U SP6多聚酶，在37℃反應(yīng)80分鐘。在不同的反應(yīng)中加入不同量的LCI。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖(含0.5μg/ml溴化乙錠)電泳后，于254nm的紫外光下觀測(cè)RNA的合成量。如圖4所示，LCI的三個(gè)不同濃度第2道0.11mg/ml，第3道0.22mg/ml和第4道0.39mg/ml相對(duì)于不加LCI的對(duì)照(第1道)都表現(xiàn)出對(duì)RNA合成的影響，而且在0.39mg/ml濃度時(shí)，RNA的合成幾乎全被抑制。
6.LCI的序列分析對(duì)LCI的序列通過(guò)http//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)點(diǎn)用BLAST軟件在″nr″數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行了搜索，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似的多肽或基因。LCI的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)GCG軟件用Chou-Fasman(CF)和Garnier-Osguthorpe-Robson(GOR)兩種方法分析確定。LCI的計(jì)算分子量為5595.12 Da它的計(jì)算等電點(diǎn)pI＝10.25。如圖5所示，根據(jù)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和與其它細(xì)菌素氨基酸序列的對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在LCI的N端到第23位的色氨酸的肽段中可能含有一個(gè)βsheet的結(jié)構(gòu)，而在此色氨酸之后到肽鏈的C端可能形成一個(gè)能夠跨越質(zhì)膜的雙親結(jié)構(gòu)，有如細(xì)菌素piscicocins V1。細(xì)菌素中肽段結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)作用對(duì)于它的活性十分重要，就象lactococcin G，plantaricin A和plantaricin S的活性要求它的alpha與beta鏈協(xié)同作用一樣。
殺菌肽LCI的一級(jí)結(jié)構(gòu)與許多其它種類的細(xì)菌素有三處相同之處，其中還包括羊毛硫抗生素。第一、第二類細(xì)菌素的保守序列YGNGV在LCI中結(jié)構(gòu)不全，在相同的位置它只有NG。參考肽鏈中色氨酸的位置，可以發(fā)現(xiàn)第十位的甘氨酸是十分保守的，如圖5的方框所示。它在許多細(xì)菌素中都是如此，如lactacinF和lacticin 481等等。第二、細(xì)菌素中色氨酸的殘基數(shù)含量從1個(gè)到4個(gè)不等，大多數(shù)含有2至3個(gè)，但是它們的分布卻是規(guī)律性的，盡管并不是十分嚴(yán)謹(jǐn)。在細(xì)菌素divercin V41中的任何一個(gè)色氨酸經(jīng)過(guò)N-溴琥珀酰胺化會(huì)使細(xì)菌素失去活性，因此推測(cè)LCI中的3個(gè)色氨酸對(duì)其殺菌活性同樣起者重要的功能。第三、LCI肽鏈中的第28到30位的KYY結(jié)構(gòu)在細(xì)菌素enterocin I(enterocin L50A)也存在，在細(xì)菌素enterocin L50B在則含有類似的結(jié)構(gòu)KFY。KYY及其類似結(jié)構(gòu)在其它一些細(xì)菌素中也有，只是不在肽鏈的中部，而是在N端區(qū)域，同時(shí)在此位置代替KYY結(jié)構(gòu)的是異亮氨酸殘基。
根據(jù)這些特征，推斷LCI與乳酸菌中第二類細(xì)菌素的pediocin家族的細(xì)菌素最為相似，它們是curvacin A(sakacin A)，divercin V41，enterocin I(L50A)，enterocin L50B，pediocin PA-1(AcH)和sakacin P。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌殺菌肽的體外表達(dá)及其方法，其特征在于所述方法包括(1)殺菌肽LCI基因的化學(xué)合成及其克??；(2)殺菌肽LCI表達(dá)載體的構(gòu)建；(3)超表達(dá)的殺菌肽LCI的提取和純化；(4)殺菌肽LCI的抗菌活性檢測(cè)；(5)殺菌肽LCI對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的抑制實(shí)驗(yàn)；(6)殺菌肽LCI的序列分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.(1)中所述的殺菌肽LCI基因的化學(xué)合成及其克隆，其特征在于人工合成了殺菌肽LCI的DNA基因，基因序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列圖如下Cla I startcodon A - I - K - L - V - Q - S - P - N - Gatatcgatg gct atc aag ctg gtg cag tcc cca aac ggctatagctac cga tag ttc gac cac gtc agg ggt ttg ccgN - F - A - A - S - F - V - L - D - Gaac ttc gcc gcttcc ttc gtg ctg gac ggtttg aag cgg cga agg aag cac gac ctg ccaT - K - W - I - F - K - S - K - Y - Yact aag tgg atc ttc aag tcc aaa tac tattga ttc acc tag aag ttc agg ttt atg ataD - S - S - K - G - Y - W - V - G - Igac tcc agc aag ggc tac tgg gtc ggc atcctg agg tcgttc ccg atg acc cag ccg tagstopY - E - V - W - D - R - Kcodontac gag gtg tgg gac cgc aag taagcttcgatg ctc cac acc ctg gcg ttc attcgaagc▲Hind III
3.根據(jù)權(quán)利要求1.(2)中所述的殺菌肽LCI表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于合成的LCI基因片段經(jīng)Cla I和Hind III雙酶切，用T4 DNA連接酶將它連接到經(jīng)同樣的這兩種酶處理過(guò)的pBluescript II KS質(zhì)粒上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和篩選，得到含有LCI基因的克隆質(zhì)粒pBC7，該質(zhì)粒經(jīng)序列分析證實(shí)含有正確的LCI基因，pBC7質(zhì)粒經(jīng)Cla I酶消化后用DNA多聚酶I Klenow大片斷進(jìn)行補(bǔ)平，而后用BamH I消化，用2％的瓊脂糖回收LCI基因片段，質(zhì)粒pBV220經(jīng)EcoR I消化后用DNA多聚酶I Klenow大片斷進(jìn)行補(bǔ)平，而后用BamH I消化，將LCI基因片段連接到pBV220質(zhì)粒中后，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和篩選，制成質(zhì)粒pBVAB16。
4.根據(jù)權(quán)利要求1.(3)中所述的超表達(dá)殺菌肽LCI的提取和純化，其特征在于含有質(zhì)粒pBVAB16的大腸桿菌DH5α，在LB液體培養(yǎng)基中活化，其中氨芐青霉素含量為50mg/l，按1％的接種量接入新鮮的同種培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2.5小時(shí)，而后42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)，轉(zhuǎn)速均為200rpm；誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)離心4000rpm 10分鐘回收后，用50mM Tris-HCl，pH7.8緩沖液洗兩遍，冰浴中超聲破碎400W 30次，每次15秒，間隔10秒，60℃加熱20分鐘，10000rpm離心20分鐘，去掉沉淀，而后經(jīng)離子交換液相色譜CM-Sepharose Fast Flow C26/20以0～0.6M NaCl線性梯度洗脫，得到的活性色譜峰加入4M硫酸銨調(diào)成2M，加入0.5M，pH6.5的磷酸二氫鉀調(diào)成50mM，微慮后用疏水作用液相色譜Phenyl-Superose HR5/5以1.7～0M硫酸銨進(jìn)行線性洗脫，得到的主峰即為純化的LCI，此LCI樣品經(jīng)PD-10 Sephadex G-25M脫鹽后凍干，保存于-20℃?zhèn)溆?，用Tris-tricine SDS-PAGE電泳確定LCI的純度，LCI的濃度由280nm紫外吸收法和Lowry法測(cè)定，LCI的表達(dá)量由薄層掃描儀對(duì)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠分析確定；由于pBVAB16質(zhì)粒有以下特點(diǎn)，使LCI在大腸桿菌中得到了高效的表達(dá)1、質(zhì)粒中含有SD序列，其后緊接多克隆位點(diǎn)，若位于起始密碼子AUG上游3～11個(gè)核苷酸處，與16s rRNA的3’端序列互補(bǔ)，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的高效翻譯；2、PR和PL兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)，而且PL受CI蛋白抑制，可通過(guò)溫度的變化來(lái)誘導(dǎo)它的表達(dá)，從而增強(qiáng)了表達(dá)的穩(wěn)定性和強(qiáng)度；3、來(lái)自大腸桿菌的rrB核糖體基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)具有強(qiáng)的終止作用，能夠避免密碼子的通讀，有利于質(zhì)?！拗飨到y(tǒng)的穩(wěn)定；利用LCI熱穩(wěn)定的特性，在E.coli中超表達(dá)的LCI可以從超聲波破碎的細(xì)胞懸液中抽提出來(lái)，并且用熱水浴的辦法使大部分蛋白質(zhì)受熱變形沉淀下來(lái)，從而很容易地用CM-Sepharose Fast Flow及Phenyl-Superose HR5/5或者M(jìn)onoS液相色譜純化得到電泳純的LCI，通過(guò)薄層掃描測(cè)定LCI的表達(dá)量為大腸桿菌總蛋白量的8.7％，表達(dá)的LCI電泳表觀分子量為3.5kDa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1.(4)中所述的殺菌肽LCI的抗菌活性檢測(cè)，其特征在于殺菌肽LCI的抗菌活性檢測(cè)包括(1)、96孔板濁度比色法確定LCI的抑菌比活用水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzea strain G為指示菌，將它用LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜活化，200rpm，28℃，而后取20μl，加入100μl新鮮的LB培養(yǎng)基，20μl不同濃度的LCI水溶液，即從1.1mg/ml LCI開(kāi)始，以二倍法稀釋八次，加入96孔板，重復(fù)兩次；無(wú)抑制對(duì)照為將20μl LCI液換成20μl無(wú)離子水，空白對(duì)照為120μl LB培養(yǎng)基和20μl無(wú)離子水，96孔板于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，每隔一小時(shí)，在微量分光光度計(jì)Microplate AutoreaderEL310，BIO-TEK INSTRUMENTS上，于540nm的光線下測(cè)量每個(gè)樣品孔的光密度；由病原細(xì)菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae G不同的生長(zhǎng)曲線可以確定LCI的抑菌的最低濃度為2.5μg/ml；(2)、平板擴(kuò)散法分析LCI的抑菌譜在LB培養(yǎng)基平板上，倒入1ml活化的被測(cè)菌，包括Xanthomonas oryzaepv.oryzea strain G，培養(yǎng)懸濁液，涂平，3分鐘后移去多余的液體，晾干，在平板的不同位置上分別滴加5μl LCI溶液，5μl相應(yīng)的緩沖液為對(duì)照，于28℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀測(cè)抑菌圈大小，另外一種方法是將5μl LCI溶液，5μl相應(yīng)的緩沖液為對(duì)照先分別滴加在平板的同一條線上，待液滴消失后，用接種環(huán)蘸取活化好的菌液沿著兩個(gè)液滴的位置劃一直線，一個(gè)平板可以同時(shí)測(cè)定數(shù)種不同的細(xì)菌，28℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀測(cè)抑菌圈，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LCI對(duì)Xanthomonas oryzaepv.oryzae G有特殊的抑制作用；(3)、LCI的殺菌能力測(cè)試將過(guò)夜活化的X.oryzae pv.oryzae strain G用LB液體培養(yǎng)基稀釋到0.035OD 600nn，經(jīng)微慮除菌的LCI樣品，濃度為0.53mg/ml，作一次二倍稀釋后，分別以100μl的量與300μl的稀釋菌液混合于微量離心管中，在室溫下存放，每隔一定的時(shí)間，取出20μl于980μl的LB液體培養(yǎng)基中混勻，而后取出100μl涂于LB瓊脂板上，28℃過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)在平板上形成的克隆數(shù)可以確定LCI的殺菌能力，從圖3.可以看出LCI并不是立即殺死細(xì)菌，細(xì)菌的數(shù)目在加入LCI后大約半小時(shí)開(kāi)始下降，下降過(guò)程持續(xù)到八個(gè)小時(shí)，水稻白葉枯病菌X.oryzae pv.oryzae strain G對(duì)LCI的兩個(gè)濃度0.13mg/ml(●)和0.066mg/ml(■)都表現(xiàn)大概一致的敏感趨勢(shì)，在高的LCI濃度下，該菌的存活率大約為10-3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1.(5)中所述的殺菌肽LCI的對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的抑制實(shí)驗(yàn)，其特征在于用Riboprobe Combination System(Promega)和SP6多聚酶來(lái)測(cè)定LCI可能的轉(zhuǎn)錄抑制活性，體外轉(zhuǎn)錄分析在20μl的反應(yīng)體系中含有40mM Tris-HCl，pH7.5，6mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM NaCl，10mM DTT，500μM each ATP，GTP，CTP and UTP，40 U Recombinant RNasin Ribonuclease inhibitor，0.5μg pGEMExpress Positive Control Template，20 U SP6多聚酶，在37℃反應(yīng)80分鐘，在不同的反應(yīng)中加入不同量的LCI，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖，含0.5μg/ml溴化乙錠，電泳后，于254nm的紫外光下觀測(cè)RNA的合成量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1.(5)中所述的殺菌肽LCI的序列分析，其特征在于對(duì)LCI的序列通過(guò)http//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)點(diǎn)用BLAST軟件在″nr″數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行了搜索，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似的多肽或基因；LCI的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)GCG軟件用Chou-Fasman(CF)和Garnier-Osguthorpe-Robson(GOR)兩種方法分析確定，LCI的計(jì)算分子量為5595.12Da，它的計(jì)算等電點(diǎn)pI＝10.25；如圖5所示，根據(jù)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和與其它細(xì)菌素氨基酸序列的對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在LCI的N端到第23位的色氨酸的肽段中可能含有一個(gè)βsheet的結(jié)構(gòu)，而在此色氨酸之后到肽鏈的C端可能形成一個(gè)能夠跨越質(zhì)膜的雙親結(jié)構(gòu)，有如細(xì)菌素piscicocins V1，細(xì)菌素中肽段結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)作用對(duì)于它的活性十分重要，就象lactococcin G，plantaricin A和plantaricin S的活性要求它的alpha與beta鏈協(xié)同作用一樣；殺菌肽LCI的一級(jí)結(jié)構(gòu)與許多其它種類的細(xì)菌素有三處相同之處，其中還包括羊毛硫抗生素；第一、第二類細(xì)菌素的保守序列YGNGV在LCI中結(jié)構(gòu)不全，在相同的位置它只有NG；參考肽鏈中色氨酸的位置，可以發(fā)現(xiàn)第十位的甘氨酸是十分保守的，如圖5的方框所示，它在許多細(xì)菌素中都是如此，如lactacinF和lacticin 481等等；第二、細(xì)菌素中色氨酸的殘基數(shù)含量從1個(gè)到4個(gè)不等，大多數(shù)含有2至3個(gè)，但是它們的分布卻是規(guī)律性的，盡管并不是十分嚴(yán)謹(jǐn)；在細(xì)菌素divercin V41中的任何一個(gè)色氨酸經(jīng)過(guò)N-溴琥珀酰胺化會(huì)使細(xì)菌素失去活性，因此推測(cè)LCI中的3個(gè)色氨酸對(duì)其殺菌活性同樣起者重要的功能；第三、LCI肽鏈中的第28到30位的KYY結(jié)構(gòu)在細(xì)菌素enterocin I也存在，在細(xì)菌素enterocin L50B在則含有類似的結(jié)構(gòu)KFY，KYY及其類似結(jié)構(gòu)在其它一些細(xì)菌素中也有，只是不在肽鏈的中部，而是在N端區(qū)域，同時(shí)在此位置代替KYY結(jié)構(gòu)的是異亮氨酸殘基；根據(jù)這些特征，推斷LCI與乳酸菌中第二類細(xì)菌素的pediocin家族的細(xì)菌素最為相似，它們是curvacin A，divercin V41，enterocin I，enterocin L50B，pediocinPA-1和sakacin P。
全文摘要
利用生物技術(shù)的方法,根據(jù)殺菌肽LCI的氨基酸序列使用植物體偏愛(ài)的密碼子人工合成了LCI的DNA基因片段。構(gòu)建的質(zhì)粒pBVAB16在大腸桿菌DH5α中高效表達(dá)LCI,占大腸桿菌總蛋白量的8.7%。大腸桿菌經(jīng)離心、超聲破碎、加熱沉淀,以及離子交換和疏水作用液相色譜可以得到純化的LCI。LCI能專門(mén)殺死水稻白葉枯病菌菌株G,最低有效濃度為2.5μg/ml。初步推斷LCI是進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi),抑制了RNA的轉(zhuǎn)錄而引起細(xì)菌死亡。該基因可望用于植物抗病育種及特效菌肥的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1274008SQ00102740
公開(kāi)日2000年11月22日 申請(qǐng)日期2000年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月3日
發(fā)明者徐慶, 郭麗華, 陳章良 申請(qǐng)人:北京大學(xué)