專利名稱：一種克隆短日植物光周期反應相關基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種克隆基因的方法，特別是涉及克隆短日植物中與光周期反應相關基因的方法。
以往對植物光周期反應機制的研究，集中在光周期調控花芽分化和開花的機制方面，主要研究方法是比較短日處理和長日處理的差異。由于光周期導致的生理生化過程多樣而復雜，僅通過二者的比較難以確認哪些反應起關鍵作用。自20世紀60年代起，光周期反應機制研究一直進展緩慢。近年來，由于同源異型基因的發(fā)現(xiàn)和分子生物學技術的發(fā)展，植物發(fā)育生物學的研究重點轉向擬南芥菜等模式植物器官發(fā)生的分子機制方面。但由于所用模式植物擬南芥菜的光周期反應不甚敏感，且大部分基因型表現(xiàn)長日反應，并非光周期反應機制研究的良好材料，致使光周期反應的分子機制研究一直未能取得突破。
在前人工作的基礎上，本發(fā)明的發(fā)明人對大豆開花后光周期反應進行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了大豆的花逆轉和花序逆轉現(xiàn)象(韓天富等，作物學報，1998，24168-171)，為進一步系統(tǒng)地研究短日植物光周期現(xiàn)象的規(guī)律奠定了堅實的基礎。
本發(fā)明的技術方案如下，一種克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，對同一品種的植株分別進行以下處理；
1)自短日植物出苗起，對其進行短日處理，直至開花；2)自短日植物出苗起，對其進行短日處理8-15天，然后進行長日處理，誘導植株發(fā)生頂端花序逆轉；3)一直進行長日處理，使植株保持營養(yǎng)生長狀態(tài)；在上述處理中植株發(fā)育的不同階段，取植物組織，通過基因差異表達分析方法，比較不同發(fā)育狀態(tài)植株中基因表達的差異，篩選、克隆與光周期反應直接相關的基因。
所述第一種處理的植株開花后，進行長日處理，誘導恢復營養(yǎng)生長后，再進行短日處理，可誘導生殖生長，該過程可以循環(huán)進行。
所述短日植物是大豆，其中優(yōu)選的是自貢冬豆，最優(yōu)選的是自貢冬豆純系。
第二種處理中，自短日植物出苗起，對其進行短日處理13天效果較好。
所述短日處理是指每天日照10-12.5小時；所述長日處理是指每天日照14小時以上。
用于研究不同發(fā)育狀態(tài)植株中基因表達的差異，篩選、克隆與光周期反應直接相關基因的植物組織是葉片或生長點。
本發(fā)明巧妙地將開花逆轉現(xiàn)象應用于大豆光周期反應機制研究，建立了以自貢冬豆為試材，短日處理(正常開花)-長日處理(持續(xù)營養(yǎng)生長)一短日處理后進行長日處理(開花逆轉)三位一體的實驗系統(tǒng)，將以往只比較長日和短日兩種處理差異的系統(tǒng)，改進為同時比較長日處理、短日處理和開花逆轉三者差異的新系統(tǒng)，大大提高了生理生化和分子差異篩選的可靠性。利用這一可靠、高效、簡單的方法，借助現(xiàn)代分子生物學技術(如差別顯示技術、微陣列技術等)，可分析出大豆光周期誘導過程中發(fā)育相關基因的表達模式，克隆大豆光周期反應相關基因，為研究這些基因的表達和調控機制、揭示光周期現(xiàn)象的本質、能動地改良和調控大豆乃至其它作物的開花期、成熟期和生態(tài)適應性奠定基礎。
用本發(fā)明所提供的開花逆轉誘導方法，將已開花并開始結實的短日敏感品種置于長日條件下，誘導植株產生整株逆轉，產生新的分枝，此類植株的基部有部分莢果可正常成熟。對發(fā)生整株逆轉的材料再次進行短日處理，可使植株重新開花結實，從而在大豆等短日照敏感植物的繁種過程中實現(xiàn)一次播種、多次采種。可用于果菜類蔬菜的生產和大田作物的快速繁種。
本發(fā)明將開花逆轉現(xiàn)象引入光周期反應相關基因的克隆，便于排除光周期誘導產生的次要反應，并可排除春化作用的干擾。本發(fā)明的方法不僅可研究短日照對生殖發(fā)育的促進作用，而且可用于研究長日抑制作用，同時還可用于研究光周期引起的開花時間及花器官結構的變化。
除了合理利用太陽光以外，用帆布棚或暗室遮光，白熾燈人工補光來控制照光時間。遮光期間植株頂端光量子通量在0.02-0.03uEs-1m-2以下，補光期間植株頂端光量子通量為28.5-50.1uEs-1m-2，光量子通量測定所用的儀器為美國Li-COR公司的Li-188B型數(shù)字式光量子/輻射/光照強度綜合測定計。除了光照外，實驗期間對植株進行正常的田間管理。
實施例1、苗期光周期信號的接收器官定位在處理早期，取單葉作為取樣器官；單葉衰老發(fā)黃后，用展開的功能復葉作為取樣器官。研究證明，單葉是苗期光周期信號的接收器官。出苗后，對自貢冬豆幼苗進行13天每天12小時的短日誘導，處理期間去除三出復葉。經(jīng)13天短日處理的植株，即使以后轉移到非誘導條件下也可產生頂端花序，說明對單葉進行光周期誘導即可使植株開始生殖發(fā)育，從而將苗期光周期信號的接收器官定位于單葉上；實施例2、短日處理的最佳時間常規(guī)播種，子葉展開后分組進行5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15天，每天12小時的短日處理，此后移至16小時長日條件下，直至實驗結束。18天左右，植株發(fā)生頂端花序逆轉。其中短日處理13天然后進行長日處理的材料逆轉頻率最高，達到56.5％?？梢姡雒绾筮M行13天短日處理然后進行長日處理，可保證頂端分生組織開始花芽分化，而長日處理又會使花序逆轉。
實施例3、營養(yǎng)生長與生殖生長的互相轉換正常播種的自貢冬豆純系，自子葉展開，每天自然光照12小時，然后用帆布棚遮光12小時，18天植株開花。此后移至16小時長日條件下，21天后，植株發(fā)生頂端花序逆轉和整體逆轉，恢復到營養(yǎng)生長狀態(tài)。將發(fā)生頂端花序逆轉和整株逆轉的材料置于12小時短日條件下，20天后，植株在逆轉過程中新產生的枝條上重新開花、結莢。
實施例4、克隆大豆光周期反應相關基因一、對同一品種的植株分別進行以下處理1、短日(SD)處理誘導植株正常開花正常播種的自貢冬豆純系，自子葉展開，每天自然光照12小時，然后用帆布棚遮光12小時，18天植株開花。
2、長日(LD)處理使植株保持營養(yǎng)生長狀態(tài)正常播種的自貢冬豆純系，自子葉展開，每天自然光照12小時，然后用帆布棚遮光12小時，13天后，利用自然光照加白熾燈人工補光達到每天16小時光照，21天后，植株發(fā)生頂端花序逆轉，原有花莢開始大量脫落，著生于植株主莖基部的極少數(shù)存留花莢發(fā)育遲緩，4周左右，主莖葉腋處產生分枝，逐步恢復到旺盛的營養(yǎng)生長狀態(tài)。
3、一直進行長日處理，使植株保持營養(yǎng)生長狀態(tài)正常播種的自貢冬豆純系，自子葉展開，每天利用自然光照加白熾燈人工補光達到每天16小時光照，使植株保持營養(yǎng)生長狀態(tài)。
4、大豆光周期反應基因的克隆a)取樣。在處理的不同時期選取單葉(苗期)或當時的功能葉。置液氮中速凍，保存于-70℃冰箱中備用。
b)基因分離。提取不同處理的mRNA，反轉錄合成cDNA，分別用Oligo(dT)12XX和不同隨機引物組合，作PCR；用測序膠分離，篩選短日下表達、長日下不表達、開花逆轉過程中先表達后關閉的特異片段；用常規(guī)方法克隆特異片段。
c)克隆片段的特異性檢測。用得到的特異片段為探針，對不同光周期處理的RNA作Northern blot分析，進一步確定片段對光周期反應的特異性。
d)按常規(guī)方法進行核苷酸序列測定。
權利要求
1.一種克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，對同一品種的植株分別進行以下處理1)自短日植物出苗起，對其進行短日處理，直至開花；2)自短日植物出苗起，對其進行短日處理8-15天，然后進行長日處理，誘導植株發(fā)生頂端花序逆轉；3)一直進行長日處理，使植株保持營養(yǎng)生長狀態(tài)；在上述處理中植株發(fā)育的不同階段，取植物組織，通過基因差異表達分析方法，比較不同發(fā)育狀態(tài)植株中基因表達的差異，篩選、克隆與光周期反應直接相關的基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于所述第一種處理的植株開花后，進行長日處理，誘導恢復營養(yǎng)生長后，再進行短日處理，誘導生殖生長，該過程可以循環(huán)進行。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于所述短日植物是大豆。
4.根據(jù)權利要求3所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于所述短日植物是自貢冬豆，其中優(yōu)選自貢冬豆純系。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于第二種處理中，自短日植物出苗起，對其進行短日處理13天。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于所述短日處理是指每天日照10-12.5小時。
7.根據(jù)權利要求1或2所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于所述長日處理是指每天日照14小時以上。
8.根據(jù)權利要求1所述的克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，其特征在于在植株的不同階段所取的植物組織是葉片或生長點。
全文摘要
一種克隆短日植物光周期反應相關基因的方法。本發(fā)明的技術方案是，一種克隆短日植物光周期反應相關基因的方法，對同一品種的植株分別進行以下處理1)自短日植物出苗起，對其進行短日處理，直至開花；2)自短日植物出苗起，對其進行短日處理8－15天，然后進行長日處理，誘導植株發(fā)生頂端花序逆轉；3)一直進行長日處理，使植株保持營養(yǎng)生長狀態(tài)；在上述處理中植株發(fā)育的不同階段，取植物組織，通過基因差異表達分析方法，比較不同發(fā)育狀態(tài)植株中基因表達的差異，篩選、克隆與光周期反應直接相關的基因。本發(fā)明可廣泛用于短日植物如大豆發(fā)育相關基因的克隆和育種材料的多次采種。
文檔編號A01H3/00GK1408211SQ0114179
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月19日 優(yōu)先權日2001年9月19日
發(fā)明者韓天富, 吳存祥 申請人:中國農業(yè)科學院作物育種栽培研究所