專利名稱：：一種提高母體泌乳期機體抗氧化能力的中草藥添加劑及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種飼料中草藥添加劑。(二)
背景技術(shù)：
：增強動物的免疫力可以有效地防止疾病的發(fā)生和流行，并提高生產(chǎn)和繁殖性能。哺乳動物的泌乳周期從開始、高峰到干乳除了受到內(nèi)在生理機制的調(diào)控，也受到外在炎癥因T的誘發(fā)或溫度及管理的影響。當(dāng)外在因了引發(fā)的緊迫，干擾了內(nèi)在牛理機制時，體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)功能下降，致使體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如丙二醛(MDA)蓄積，MDA又可氧化細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞膜的嚴(yán)重?fù)p傷。由于自由基對糖、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子具有損害作用，因此可誘導(dǎo)機體功能下降和代謝紊亂，導(dǎo)致哺乳動物泌乳量下降、免疫力降低。長期以來，生產(chǎn)中多用抗生素等化學(xué)類制劑做飼料添加劑來防病治病。然而在飼料中長期亞治療量的使用帶來許多引起醫(yī)療界和消費者極大關(guān)注的負(fù)面效應(yīng)，如藥物殘留、微生物的耐藥性、破壞微生態(tài)平衡、降低機體的免疫力等。因此尋找滅然、無公害的綠色添加劑成為近年來動物學(xué)者們致力的重點。大量研究表明，許多中草藥含有相當(dāng)高的抗氧化物質(zhì)，具有較強抗氧化能力和有效清除自由基活性的能力，能提高機體防御體系的抗氧化酶活力，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等。但以往研究大多數(shù)在生長動物和老齡動物。因此尋找提高哺乳動物泌乳期機體抗氧化能力具有非常重要的意義。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能夠增強泌乳大鼠、母豬和奶牛機體的抗氧化能力，改善健康狀況的提高母體泌乳期機體抗氧化能力的中草藥添加劑。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的中草藥添加劑包括中草藥黃芪，將黃芪6065'C烘T，過40目篩粉碎后得到黃甚原粉添加劑。本發(fā)明的中草藥添加劑的應(yīng)用方法為將6065°C烘十后的黃芪過40目篩粉碎，得到的黃芪原粉按1%的量均勻添加到泌乳大鼠、母豬飼糧或泌乳奶牛精料補充料中即可。本發(fā)明涉及一種提高哺乳動物(大鼠、母豬和奶牛)泌乳期機體抗氧化能力的中草藥添加劑及其使用方法。將黃芪烘干、粉碎后按1%的量均勻添加到泌乳大鼠、母豬飼糧或泌乳奶牛精料補充料中，能增強泌乳大鼠、母豬和奶牛機體的抗氧化能力，改善健康狀況。本發(fā)明的目的是解決大鼠、母豬和奶牛等哺乳動物在泌乳期體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)功能下降的問題。為解決上述問題，本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案是先用大鼠作為模型動物，在幾種促乳中草藥中篩選出具有穩(wěn)定抗氧化效果的中草藥，然后再在泌乳大鼠、母豬和奶牛進行試驗。最后發(fā)現(xiàn)在泌乳大鼠和母豬飼糧以及奶牛精料補充料中添加1%黃芪抗氧化效果最好，提卨了大鼠、母豬和奶牛泌乳中后期血清和心肌中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(TAOC)水平，顯著降低了泌乳后期血清、肝臟、腎臟和心肌中丙二醛(MDA)水平(PO.05或尸O.01)。其應(yīng)用后能改善哺乳動物健康狀況，具有很好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。本發(fā)明通過中草藥來調(diào)控母體效應(yīng)的重要因素之一一母乳。以國際通用哺乳動物模型——大鼠為試驗動物，初篩(li促奶效果明顯的中草藥單劑，從以下六個方面丌展了中草藥單劑促乳效果、機理及對子代影響的基礎(chǔ)研究。一、篩選中草藥單劑選用妊娠雌性大鼠72只，分成9組，每組8只。從妊娠期第18天到泌乳期第22天，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加1%中草藥(分別為通草、黃芪、王不留行、益母草、熟地、穿山甲、五味子、女貞子)。母鼠分娩后當(dāng)日將每窩仔鼠一律調(diào)整為8只。結(jié)果表明與對照組相比，黃芪顯著提高了泌乳中后期母鼠的泌乳量和仔鼠增重(PO.05或PO.01);8種中草藥對泌乳大鼠的采食量和體重均沒有顯著影響(P〉0.05)。二、驗證步驟一篩選出的黃芪是否具有穩(wěn)定的作用效果，并觀察了對泌乳母鼠和仔鼠血常規(guī)值、血液生化指標(biāo)及其仔鼠臟器系數(shù)的影響選用妊娠雌性大鼠64只，分成4組，每組16只。從妊娠期第18天到泌乳期第22天，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加1%黃甚。母鼠分娩后當(dāng)日將每窩仔鼠一律調(diào)整為8只。結(jié)果與試驗一相一致與對照組相比，黃芪顯著提高了泌乳中后期母鼠的泌乳量和仔鼠增重(尸<0.05或PO.Ol)，同時改善了料奶比(尸<0.05或尸O.Ol)。各組仔鼠的臟器(心、肝、腎、脾和肺)系數(shù)差異不顯著(尸>0.05)。與對照組相比，黃芪顯著提高泌乳期母鼠血液紅細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白含量(尸<0.05)。各組仔鼠的血常規(guī)值及母鼠和仔鼠的血清生化參數(shù)(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶活性和葡萄糖、尿素氮、膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白含量)差異均不顯著(/>>0.05)。三、探討黃芪對泌乳母鼠和仔鼠內(nèi)分泌、免疫和抗氧化功能的影響選用妊娠18大大鼠%只，分成4組，每組24只。對照組詞喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加1%黃芪。母鼠分娩后當(dāng)日將每窩仔鼠一律調(diào)整為8只。結(jié)果表明，在內(nèi)分泌指標(biāo)方面與對照組相比，黃芪能顯著提高泌乳中后期母鼠血清中生長激素(GH)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和催乳素(PRL)含量或PO.Ol)，但對雌激素和胰島素濃度影響不顯著(尸>0.05)。此外，黃芪組還顯著提高了泌乳中后期母鼠血清中T3(尸<0.05)和丁4(尸O.Ol)含量。在哺乳中后期，黃芪組哺乳仔鼠血清中GH、IGF-1、T3和T4含量顯著高于對照組(尸0.05或戶<0.01)，但胰島素含量差異不顯著(尸>0.05)。在免疫指標(biāo)方面與對照組相比，黃芪能顯著提高泌乳后期母鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-oc)水平和脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(尸<0.05)。黃芪組哺乳仔鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和小腸粘膜分泌型免疫球蛋白A(slgA)含量均顯著高于對照組。泌乳期內(nèi)各組母鼠和仔鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)均差異不顯著(P>0.05)。在抗氧化指標(biāo)方面與對照組相比，黃甚顯著提高泌乳中后期母鼠血清和心肌中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(TAOC)水平，顯著降低了泌乳后期母鼠血清、肝臟、腎臟和心肌中丙二醛(MDA)水平(PO.05或PO.01)。與對照組相比，黃芪組22日齡哺乳仔鼠血清SOD活性和TAOC水平及肝臟中SOD活性顯著提高(PO.05),而血清中MDA水平顯著降低(尸<0.05)。四、探討黃芪對泌乳母鼠腸道菌群及其仔鼠腸道菌群、形態(tài)和消化酶活性的影響選用妊娠18天大鼠32只，分成4組，每組8只。對照組飼喂基礎(chǔ)詞糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加1%黃芪。母鼠分娩后當(dāng)日將每窩仔鼠一律調(diào)整為8只。結(jié)果表明與對照組相比，黃芪能顯著降低泌乳母鼠腸道大腸桿菌數(shù)量(尸<0.05);黃芪組哺乳仔鼠腸道大腸桿菌數(shù)量顯著減少(戶<0.05)，雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(PO.05);黃芪組仔鼠絨毛高度、粘膜厚度和腺窩深度顯著提高(PO.05或PO.01)。五、探討促乳中草藥對泌乳母鼠乳腺發(fā)育的影響選用妊娠18天大鼠96只，分成4組，每組24只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加1%黃芪。母鼠分娩后當(dāng)日將每窩仔鼠一律調(diào)整為8只。結(jié)果表明與對照組相比，黃芪組泌乳大鼠乳腺濕重和乳腺指數(shù)顯著提高(尸<0.05或尸<0.01)。利用實時熒光定量PCR的相對定量分析方法，發(fā)現(xiàn)黃芪促進了泌乳大鼠乳腺P-酪蛋白和PRL受體基因的表達(dá)。六、探討促乳中草藥對斷乳仔鼠生長性能的影響選用妊娠18天大鼠32只，分成4組，每組8只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加P/。黃芪。母鼠分娩后當(dāng)日將每窩仔鼠一律調(diào)整為8只。仔鼠在22日齡斷奶，每窩選擇中等大小兩只雌性仔鼠和兩只雄性仔鼠，原籠飼養(yǎng)4周，均飼喂基礎(chǔ)飼糧。結(jié)果表明，在斷乳后l-4周，黃芪組仔鼠體重和采食量均顯著高于對照組(尸<0.05或尸<0.01)。與對照組相比，在斷乳后第l周，黃芪組仔鼠的閂增重顯著提高(尸<0.01)，死亡率明顯下降。上述試驗結(jié)果表明，黃芪具有穩(wěn)定的促乳功效，能對子代生長發(fā)育產(chǎn)生積極的影響，能對子代生長發(fā)育產(chǎn)生積極的影響。本發(fā)明的有益效果有1)黃芪能夠提高泌乳大鼠的泌乳量，改善料奶比，促進哺乳仔鼠生長；2)黃芪能提高泌乳母鼠血液中紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白含量；3)黃芪能顯著提高泌乳大鼠泌乳期血清中GH、IGF-1、PRL水平及哺乳仔鼠血清中GH、IGF-1、T3和T4水平；4)黃芪能顯著提高泌乳大鼠泌乳期血清中TNF-a水平和脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；5)泌乳大鼠飼糧中添加黃芪，能顯著提高哺乳仔鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和小腸粘膜sIgA6)黃芪顯著提高了泌乳期母鼠血清和心肌中SOD、GSH-Px活性和TAOC水平，顯著降低血清、肝臟、腎臟和心肌中MDA水平；7)黃芪飼喂泌乳大鼠，能減少哺乳仔鼠腸道大腸桿菌定植、促進雙歧桿菌增殖；8)黃芪飼喂泌乳大鼠，能顯著提高22日齡哺乳仔鼠絨毛高度、粘膜厚度和腺窩深度；9)黃芪能顯著提高泌乳大鼠乳腺濕重和乳腺指數(shù)，并能促進泌乳大鼠乳腺(3-酪蛋白和PRL受體基因的表達(dá)；10)在母鼠哺乳詞糧中添加黃芪，能提高22日齡斷乳仔鼠的成活率、采食量和斷乳早期的增重速度。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明本實施例將黃芪烘干6065"C、過40目篩粉碎后按1%的量均勻添加到泌乳大鼠、母豬飼糧或泌乳奶牛精料補充料中，經(jīng)實驗證明能夠增強泌乳大鼠、母豬和奶牛機體的抗氧化能力，改善健康狀況。1、試驗動物和詞糧本實施例采用150只SpragueDawley(SD)雌性大鼠(體重220士10g)與雄鼠合籠(雌雄比例為3:1)，次晨取雌鼠陰道分泌物鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1天，單籠飼養(yǎng)。在妊娠第18天，選擇108只母鼠，隨機分為9組，每組12只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)飼糧配方與營養(yǎng)成分見表l)，試驗組飼糧基礎(chǔ)飼糧+1%中草藥(王不留行)。王不留行中草藥購自哈爾濱市寶豐大藥房，烘干(60~65°C)后粉碎，過40目篩。在分娩后當(dāng)日選擇窩產(chǎn)仔數(shù)8-12只、母鼠體重和仔鼠平均體重相近的72窩，并將每窩仔鼠數(shù)調(diào)整到8只。試驗從母鼠妊娠第18天開始到泌乳期第22天結(jié)束。研究王不留行對母鼠泌乳量的影響。表l大鼠基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平原料Ingredients%營養(yǎng)成分Composition")%'"微量元素預(yù)混料組成(%):MnS04.H20,6.65;ZnS04.H2O，3.39;CuS04.5H20，0.97;FeS04.7H20,6.97;KI(含I,0.65%)，2.2;玉米淀粉，80.80。("維生素預(yù)混料組成(kg-1):VA,4000IU;VDj,1000IU;VE，50IU;VK3，50嗎;VB"6mg;VB2，6mg;VB6,7mg;煙酸，30mg;泛酸鈣，16mg;葉酸，2mg;生物素，0.2mg。'3>為計算值。營養(yǎng)成分含量以風(fēng)干物質(zhì)為基礎(chǔ)。2、飼養(yǎng)管理SD大鼠由哈爾濱漢方試驗鼠類養(yǎng)殖所提供，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所動物房單籠喂養(yǎng)，自由采食、飲水，室溫控制在25土rC左右，相對濕度50%左右，12h光照和黑暗。3、檢測指標(biāo)與方法(1)大鼠泌乳量在3、8、13、18日齡采用仔鼠體重差法(SampsonandJansen，1984)測定大鼠泌乳量，根據(jù)仔鼠體重和增重來評估母鼠泌乳量，其力'程為Yield=[(0.0322+(0.0667xweight)+(0.877xgain))x8，其中Yield:母鼠H廣奶重匸g);Weight:仔鼠平均體重(g/d);Gain:仔鼠平均增重(g/d);8:每窩仔鼠數(shù)量。(2)母鼠和仔鼠體重在l、8、15、22閂齡早8:OO稱量母鼠和每窩仔鼠重量，計算每周增重速度。稱重前曰(既7、14、21日齡)22:00斷料供水。(3)采食量記錄哺乳期第121天采食量，每周統(tǒng)計1次。哺乳期前2周，因仔鼠完全靠吸吮母乳米Corn29.71餅Soybeanmeal20粉Flour16麩Wheatbran12粱Sorghum12粉Fishmeal5粉Bonemeal2酵母Brewersdriedyeast1魚肝汕Cod-liveroil1食鹽Salt1微量元素預(yù)混料("Mineralpremix0.25維生素預(yù)混料'2)Vitaminpremix0.04合計Total100粗蛋白Crudeprotein19.88總能Grossenergy(M.T/kg)17.1蛋氨酸Methionine0.36賴氨酸Lysine0.95鈣Calcium0.92總磷Phosphorus0.76玉豆而麥高魚骨牛長，故飼料消耗可視為母鼠采食量，哺乳期第三周則為每窩母鼠和仔鼠的混合采食量。在泌乳期第3、11和22天每組選取8窩，分別將每窩母鼠和仔鼠全部斷頸處死，取血液。處死前夜，動物禁食，自由飲水。血液分置于離心管中，經(jīng)3000rpm離心后，取血清冷凍保存，用于生長激素(GH)、胰島素(Ins.)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、催乳素(PRL)、雌激素(E2)以及甲狀腺素(T3和丁4)、免疫球蛋白G(IgG)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(TAOC)等指標(biāo)測定。同時取每窩母鼠和一只平均體重仔鼠心、肝、腎組織，以生理鹽水稀釋成10%或1%組織勻漿，-20'C保存，用于SOD、GSH-Px、MDA和TAOC等指標(biāo)測定。同時在泌乳期第22天，每窩選l只平均體重仔鼠，無菌取母鼠和仔鼠脾臟，置于無菌青霉素瓶中，用于測定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。同時取仔鼠十二指腸粘液，用于sIgA(分泌型免疫球蛋白A)測定。(4)生長激素用生長激素(GH)放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn))進行測定。測定歩驟取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB，SoSs和待測樣品管等，然后用微量加樣器按下表加樣。操作程序表如表2。表2生長激素操作程序表(nL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>充分混勻后，室溫放置15分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘,吸棄上清，測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)。結(jié)果計算計算各管的百分結(jié)合率以So(cmp數(shù))為Bo，各標(biāo)準(zhǔn)管(cmp數(shù))為Bi，求各管的百分結(jié)合率。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>計算各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)果，在半對數(shù)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B/B。為縱坐標(biāo)，繪制Bi/Bo-Log圖或在Logit-Log坐標(biāo)紙上作圖。未知樣品濃度可根據(jù)Bi/BQ的百分結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出。(5)胰島素用胰島素(Ins.)放射免疫分析測定盒(北京北方牛物技術(shù)研究所牛.產(chǎn))進行測定。測定步驟取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB，SoS5和待測樣品管等，然后用微量加樣器按下表加樣。操作程序表如表3。表3胰島素測定操作程序表(pL)總T管NSB管"0"管各標(biāo)準(zhǔn)管樣品管緩沖液—200100—-Ii]s.標(biāo)準(zhǔn)品(S「S6)—_—100一樣品———一丄oo'25工-Ins.100100100100100Tns.抗體——100100100混勻，37。C溫育18-24小時驢抗兔免疫分離劑—500500500500充分混勻后，室溫放置15分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，吸棄上清，測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpra)。結(jié)果計算計算各管的百分結(jié)合率以So(cmp數(shù))為Bo，各標(biāo)準(zhǔn)管(cmp數(shù))為Bi，求各管的百分結(jié)合率。Bi(cmp)-NSB(cmp)Bi/B0%=_X麵。Bo(c即)-NSB(c即)計算各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)果，在半對數(shù)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B，/Bo為縱坐標(biāo)，繪制B,/B。-Log圖或在Logit-Log坐標(biāo)紙上作圖。未知樣品濃度可根據(jù)B,/Bo的百分結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出。(6)胰島素樣生長因子-1用胰島素樣生長因子(IGF-1)放射免疫分析(包被試管法)測定盒(BIOCODE-HYCE，Belgium)進行測定。測定盒組成(1)抗IGF-1單抗包被管；(2)IGF-1系列標(biāo)準(zhǔn)(6瓶凍干品)0，24，63，266，620，1300ng/ml，用0.5ml樣品稀釋液溶解；(3)質(zhì)控血清(2瓶凍干品)用0.5ml樣品稀釋液溶解；(4)^I-IGF-1單抗；(5)濃洗滌液用900ml蒸餾水稀釋。樣品處理取25pL樣品加lml樣品稀釋劑，按1/41比例稀釋。分析過程將包被管上標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控和樣品，并按表4加樣。_表4IGF-1測定過程(pL)_標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清和樣品總T管(非包被管O標(biāo)W物iU5標(biāo)準(zhǔn)50--質(zhì)控血清和樣品-50-室溫(20-30'C)在最大速率350rpm的水-卞振蕩器上振蕩2小吋，吸出或倒出除總T外的所有管的混合液后，分別用洗滌液2mj洗滌兩次，測各管的放射性，計數(shù)1分鐘。_結(jié)果計算用下面公式計算各管的百分結(jié)合率標(biāo)準(zhǔn)或樣品cinpB/T(%)=_X100%Tc即計算各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)果，在半對數(shù)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B/T為縱坐標(biāo)，繪制B/T-Log圖或在Logit-Log坐標(biāo)紙上作圖。未知樣品濃度可根據(jù)B/T的百分結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出。(6)催乳素用催乳素放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn))進行測定。測定盒組成(1)PRL標(biāo)準(zhǔn)品零標(biāo)準(zhǔn)用3ml蒸餾水溶解，其余標(biāo)準(zhǔn)分別準(zhǔn)確地加入lml蒸熘水溶解，溶解15分鐘搖勻，溶解后其濃度分別為0、125、250、500、1000、2000、4000uIU;(2)^I-PRL標(biāo)記物；(3)兔抗-PRL抗體;'(4)驢抗兔免疫分離劑。測定步驟取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB，SoS6和待測樣品管等后,用微量加樣器按下表加樣。操作程序表如表5。表5催乳素測定過程(pL)總憎NSB管"0"管各標(biāo)準(zhǔn)管樣品管零標(biāo)準(zhǔn)—200100—-PRL標(biāo)準(zhǔn)品(S,-SJ———100-樣品——-—100100100100100100兔抗-PRL抗體——100100100混勻，4'C溫育18-24小時驢抗兔免疫分離劑一500500500500充分混勻后，室溫放置15分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，吸棄上清，測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)。結(jié)果計算計算各管的百分結(jié)合率以S。(cmp數(shù))為B。，各標(biāo)準(zhǔn)管(cmp數(shù))為Bi，求各管的百分結(jié)合率。Bi(crap)-NSB(c即)Bi/B0%=_X100%Bo(c即)-NSB(卿)計算各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)果，在半對數(shù)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，Bi/Bo為縱坐標(biāo)，繪制Bi/Bo-Log圖或在Logit-Log坐標(biāo)紙上作圖。未知樣品濃度可根據(jù)Bi/Bo的百分結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出。/，、臉~■船乂/乂H收_^曰子用雌二醇(E2)放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn))進行測定。測定盒組成(1)雌二醇(E2)標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、5、20、80、320、1280、4000pg/ml;(2)125I-E2;(3)兔抗-E2抗體；(4)驢抗兔免疫分離劑；(5)E2質(zhì)控血清。測定歩驟取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB，SoS6和待測樣品管等，然后用微量加樣器按下表加樣。操作程序表如表6。表6雌二j定過程(nL)總T管NSB管'0"管各標(biāo)準(zhǔn)管樣品管蒸餾水零標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(S,-S5)樣品或質(zhì)控兔抗-Ez抗體驢抗兔免疫分離劑100200100100訓(xùn)100混勻，37'C水浴1小時500500100100100500100100.100500充分混勻后，室溫放置15分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，吸棄上清，測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)。結(jié)果計算計算各管的百分結(jié)合率以So(cmp數(shù))為Bo，各標(biāo)準(zhǔn)管(cmp數(shù))為B,，求各管的百分結(jié)合率。Bi(cmp)-NSB(cmp)Bi/B0%=_X層oBo(c卿)-NSB(c即)計算各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)果，在半對數(shù)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，Bi/Bo為縱坐標(biāo)，繪制Bi/Bo-Log圖或在Logit-Log坐標(biāo)紙上作圖。未知樣品濃度可根據(jù)B,/Bo的百分結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。(8)甲狀腺素(T3和T4)用甲狀腺素(T3或TV)放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn))進行測定。測定盒組成(1)甲狀腺素(T3或T4)標(biāo)準(zhǔn)品；(2)125I-T3或I25I-T4;(3)羊抗-丁3或T4抗體；(4)驢抗兔免疫分離劑；(5)T3或T4質(zhì)控血清。測定步驟取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB，S。s6和待測樣品管等，然后用微量加樣器按下表加樣。操作程序表如表7。_表7甲狀腺素測定過程(^L)_^他iunn她"r\，，祉々-I-二V化站-PACI站_WJ'目_roD百_U目_廿1VJ、W目_目蒸餾水零標(biāo)準(zhǔn).5050--'標(biāo)準(zhǔn)品(S「Ss)———50—樣品或質(zhì)控————50、-E,200200200200200羊抗-T3或TJ亢休——勤100100混勻，37。C溫育45分鐘驢抗兔免疫分離劑—500500500500充分混勻后，室溫放置15分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，吸棄十.淸，測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)。結(jié)果計算計算各管的百分結(jié)合率以Sq(cmp數(shù))為Bo，各標(biāo)準(zhǔn)管(cmp數(shù))為Bi，求各管的白分結(jié)合率。Bi(cmp)-NSB(crap)B,/B',%=_X100%Bo(cnip)-NSB(cmp)計算各標(biāo)準(zhǔn)點的結(jié)果，在半對數(shù)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B,/Bo為縱坐標(biāo)，繪制Bi/Bo-Log圖或在Logit-Log坐標(biāo)紙上作圖。未知樣品濃度可根據(jù)B/Bo的百分結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出。(9)1%組織勻漿蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮蘭法，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。測定原理蛋白分子具有一NH3+基團，當(dāng)顯色的CBBcj25o顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時CBBcj25o染料上的陰離子與蛋白一NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過測吸光度可計算出蛋白含量。操作步驟按表8進行。表8組織蛋白的測定步驟空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管蒸餾水(ml)0.05-—lmg/ml左右的標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)—0.05—樣品(ml)-—0.05CBB,顯色劑(ml)3.03.03.0混勻，靜置10min，于595nm處比色。結(jié)果計算測定管吸光度一空白管吸光度蛋白含量(g/L)=-X標(biāo)準(zhǔn)管濃度(g/L)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一空白管吸光度(10)血清與1%組織勻漿中sod活性的測定總超氧化物歧化酶(t-sod)采用黃嘌呤氧化物酶法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。'測定原理通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺ttzAtt^t"、JS3TTA+k1=1化IAAiB3口Tm止匕A卞AD3"^ttm、■/_/、、I/.、I/.rfc，丄、、!7I"tif廿nTI、I/.tft業(yè)4.+、、,171"形;j乂ivH股顯，i土亞'巴:m川'、JTFitir王"。糸s丄'ti，iti"j;/已兀7T兀兀;叉w識'j疋升'議7ii/叉。^i個漢Y"樣品含sod時，則對超氧陰離子有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品sod的活性。試驗材料(1)微量移液器、塑料試管、試管架、旋渦混勻器、冰箱、水浴鍋和日本島津UV-2401PC紫外可見分光光度計；(2)試劑一液體10mlx2瓶，用時每瓶加蒸餾水稀釋至100ml;(3)試劑二:液體7mlx2瓶，應(yīng)于4'C10。C保存；(4)試劑三:液體7mlx2瓶，應(yīng)于4。C10'C保存；(5)試劑四液體0.5mlx2支，4'C保存(注意不可冷凍)；4號稀釋液7mlx2瓶，4'C保存，用時二者按l:14稀釋，可以一次或分次稀釋。配好后4'C保存(注意不可冷凍，且所用吸嘴須為消毒處理過)。(6)試劑五粉劑xl支，用時加70'C80'C熱雙蒸水150ml溶解備用，配好后的試劑避光4'C冷藏(注意加熱過程中水分蒸發(fā)減少，必須補至150ml)。操作步驟按表9進行操作。表9總SOD活性的測定步驟試劑測定管對照管1號試劑(ml)樣品(ml)蒸餾水(ml)2號試劑(ml)3號試劑(ml)4號試劑(ml)顯色劑(ml)1.00.050.1.0.10.1用旋渦泡勻器充分混勻，置37'C恒溫水浴40min。21.00.050.10.10.12混勻，室溫放置10min，于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。結(jié)果計算血清中SOD活性每ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個亞硝酸鹽單位(NU)。計算公式對照管吸光度一測定管吸光度SOD活力(NU/ml)=-對照管吸光度+50%><稀釋倍數(shù)組織勻漿中SOD活性每mg組織蛋白在lml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個亞硝酸鹽單位(NU)。計算公式SOD活力(雨mgprot)對照管吸光度一測定管吸光度對照管吸光度+50%乂稀釋倍數(shù)+組織中蛋白含量(11)血清與10%組織勻漿巾GSH-Px活性的測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用二硫代二硝基苯甲酸比色法測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定原理GSH-Px可以促進過氧化氫(H202)與還原型谷胱肝肽(GSH)反應(yīng)生成H20及氧化型谷胱y肽，GSH-Px的活力可用酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈較穩(wěn)定的黃色，在412nm處測定其吸廣度即可計算出GSH的量。試劑(1)貯備液:用時取O.lml加蒸餾水至100m，4"C保存;(2)甲粉1瓶、加90-100的熱蒸餾水170ml，充分完全溶解；乙粉，加90-100的熱蒸餾水50ml，充分完全溶解；將已配好的甲乙兩種溶液混合，室溫靜止冷卻后，取上清進行實驗；(3)粉劑，1瓶，加蒸餾水200ml溶解，4'C保存；(4)粉劑，加蒸餾水50ml溶解，4'C避光保存；(5)粉劑，46支，每只加蒸餾水10ml溶解，避光冷藏；(6)標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液貯備液雙蒸水=1:9，Bp10倍稀釋配成應(yīng)用液。操作步驟按表10操作。表10總GSH-Px活性的測定步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>混勻，室溫靜置15分鐘后，412nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值,結(jié)果計算血清中GSH-Px活力定義規(guī)定每O.lml血清在37。C反應(yīng)5分鐘，扣除非酶反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低lpmol/L為一個酶活力單位。計算公式非酶管吸光度一酶管吸光度.標(biāo)準(zhǔn)品樣品稀血清GSH-Px活力-X濃度X釋倍數(shù)(U)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一空白管吸光度組織中GSH-Px活力定義規(guī)定每mg蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低l|amol/L為一個酶活力單位。非酶管吸光度一酶管吸光度標(biāo)準(zhǔn)品樣品稀組織蛋組織GSH-Px活力=-X濃疫X釋倍數(shù)+白含量(U/mgprot)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一空白管吸光度(12)血清與10%組織勻漿中總抗氧化能力的測定總抗氧化能力(TAOC)釆用比色法測定。TAOC試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定原理機體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使F^+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。試劑盒組成與配制(1)液體60mlx2瓶，4'C保存；(2)粉劑><2支，。用時每支加雙蒸水至120ml，室溫保存；溶每瓶加蒸餾水稀釋至100ml。(3)黃色貯備液10ml/支，避光冷藏保存。貯備液的稀釋液30mlx2瓶。試劑三應(yīng)用液的配制臨用前取貯備液以稀釋液稀釋，比例為l:19。(4)溶液24mlxl瓶；(5)溶液24mlxl瓶。操作步驟按表ll進行操作。表llTAOC的測定步驟_對照管_測定管試劑一(ml)TT"樣品a試劑二(ml)2.02.0試劑三應(yīng)ffl液(ral)0.50.5旋渦混勻器充分混勻，37'C水浴30分鐘試劑四(ml)0.10.1樣品a0.1_旋渦混勻器充分混勻，放置10分鐘，蒸餾水調(diào)零，lcni光徑、520nm處測各管吸光度。_a:樣本參考量血清為O.lral;10%組織勻漿0.1-0.2ml。結(jié)果計算-血清中TOAC(單位/ml)=(測定管吸光度-對照管吸光度)+0.01+30><樣品稀釋倍數(shù)組織中TOAC(單位/毫克蛋白)=(測定管吸光度-對照管吸光度)+0.01+30><樣品稀釋倍數(shù)+所測樣本蛋白含量(13)血清與10%組織勻衆(zhòng)中MDA含量的測定丙二醛(MDA含量)采用硫代巴比妥酸法(TBA)。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定原理過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。試劑(1)微量移液器、塑料試管、試管架、旋渦混勻器、冰箱、離心機、水浴鍋和日本島津UV-2401PC紫外可見分光光度計；(2)試劑一液體6mlx2瓶，室溫保存。(3)試劑二液體6mlx2瓶，用時每瓶加170ml雙蒸水混勻。(4)試劑三:粉劑xl支，用時加80°CIOCTC熱雙蒸水中，充分溶解后用雙蒸水補足至60ml，再加冰醋酸60ml，混勻，避光冷藏。(5)標(biāo)準(zhǔn)品10nmol/ml四乙氧基丙烷5mlxl瓶。操作步驟按表12進行。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>旋渦混勻器充分混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，刺一小孔，95'C水浴40min，取出后流水冷卻，然后3500-4000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清，532nm處比色。結(jié)果計算測定管吸光度一測定空白管吸光度血清中MDA含量=_X標(biāo)準(zhǔn)品濃度X樣品稀釋倍數(shù)(nmol/ml)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度測定管吸光度一測定空白管吸光度標(biāo)準(zhǔn)品樣品稀組織蛋組織中MDA含量=-X濃度X釋倍數(shù)+白含量(nmol/mgprot)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度實驗證明，黃貧能提高機體抗氧化能力，改善健康狀況，提高產(chǎn)奶量。權(quán)利要求1、一種提高母體泌乳期機體抗氧化能力的中草藥添加劑，其特征在于中草藥添加劑包括中草藥黃芪，將黃芪60～65℃烘干，過40目篩粉碎后得到黃芪原粉添加劑。2、一種提高母體泌乳期機體抗氧化能力的中草藥添加劑的應(yīng)用方法，其特征在于將6065'C烘干后的黃芪過40目篩粉碎，得到的黃芪原粉按1%的量均勻添加到泌乳大鼠、母豬飼糧或泌乳奶牛精料補充料中。全文摘要本發(fā)明提供了一種提高母體泌乳期機體抗氧化能力的中草藥添加劑及其應(yīng)用方法。將黃芪烘干、粉碎后按1％的量均勻添加到泌乳大鼠、母豬飼糧或泌乳奶牛精料補充料中。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是先用大鼠作為模型動物，在幾種促乳中草藥中篩選出具有穩(wěn)定抗氧化效果的中草藥，然后再在泌乳大鼠、母豬和奶牛進行試驗。最后發(fā)現(xiàn)在泌乳大鼠和母豬飼糧以及奶牛精料補充料中添加1％黃芪抗氧化效果最好，提高了大鼠、母豬和奶牛泌乳中后期血清和心肌中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力水平，顯著降低了泌乳后期血清、肝臟、腎臟和心肌中丙二醛水平(P＜0.05或P＜0.01)。其應(yīng)用后能改善哺乳動物健康狀況，具有很好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。文檔編號A23K1/18GK101411401SQ20081020962公開日2009年4月22日申請日期2008年12月5日優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日發(fā)明者單安山,石寶明申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)