尤韋可擬盤多毛孢代謝產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，本發(fā)明所述的牡蒿內生真菌是從貴州省貴陽市郊區(qū)采集的牡蒿植物活體中采用內生真菌分離技術分離獲得的，經(jīng)微生物分類學鑒定，命名為尤韋可擬盤多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)GMH31，該菌株已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登記號CCTCCNO:M2014303。本發(fā)明最顯著的特征是：該菌株發(fā)酵菌絲體能分泌多種天然活性成分，具有廣譜抗腫瘤等藥效作用，是新型天然活性藥物的重要微生物資源。
【專利說明】尤韋可擬盤多毛孢代謝產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物中的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，尤其是涉及一株來源于藥用植物牡蒿的擬盤多毛孢屬內生真菌尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31及其代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥中的應用。

【背景技術】
[0002]植物內生真菌(fungal endophyte)是指生活史的一定階段或全部階段生活與健康植物各組織合格器官內的真菌。它們與宿主植物通過互作形成了緊密的共生關系，可以促進植物的生長，提供植物應對脅迫的適應能力，有的植物內生真菌還具有藥用價值。從植物內生真菌中尋找和發(fā)現(xiàn)活性化合物已成為國內外研究的又一熱點。如中國專利文獻CN201310194836.5公開了一株龍膽中分離得到的內生真菌(Metarrhizium) LD421,可用于防治龍膽葉枯??；專利申請CN201210067829.4則公開了從銀杏根、莖、葉等組織中分離得到的內生真菌腐皮鐮孢菌T-7，對辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、蘋果腐爛病菌等具有很好的抑制作用。
[0003]牡蒿(Artemisia japonica)為菊科蒿屬植物,其味苦、微甘、性涼。民間又稱土紫胡(《陸川草本》)、胃痛靈、熊掌草，以全草入藥。具有清熱、涼血、解毒、健胃止血功效，主要用于治療感冒發(fā)熱，中暑、瘧疾、肺結核潮熱、高血壓病、五癆七傷、大小便不通和毒蛇咬傷等。同時也有記載牡蒿為藥食兩用植物，含有多種活性物質，具有免疫、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂保肝以及延緩衰老等多種生理功能。另外，牡蒿還可用于制備生物農藥，作為殺蟲劑使用。
[0004]目前在農業(yè)生產(chǎn)過程中控制農作物病蟲草害的主要手段是化學農藥防治，其對減輕病蟲草害，保證農作物豐產(chǎn)豐收起到積極的作用，但是由于自然界生物之間的相互制約相互依存，現(xiàn)在已不建議過分依賴化學農藥在進行病害的處理。因此，對植物內生真菌的研究，利用植物內生真菌與宿主植物生物活性共生的關系，來篩選具有高生物活性的內生真菌，進一步獲得活性產(chǎn)物，是今年來研究的一大熱點。但是，對于某一宿主植物，究竟何種內生真菌或哪幾類內生真菌具有抗病原微生物活性，且各內生真菌中哪種菌活性最高，分離純化是否容易，發(fā)酵過程是否復雜等等，都是需要進行大量研究加以證實的，目前尚未發(fā)現(xiàn)牡蒿內生真菌及其分離培養(yǎng)和抗病原微生物活性、藥用活性應用的具體報道。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對化學藥品不安全與微生物源藥品種類較少的不足，提供一種從藥用植物牡蒿中分離篩選出的內生真菌-尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis
uvicola)。
[0006]本發(fā)明所述內生真菌，是從貴州省貴陽市郊區(qū)的藥用植物牡蒿(Artemisiajaponica)中分離獲得的，命名為內生尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31，并對該菌株的發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行了多種生物活性研究。該發(fā)明為微生物源農藥和醫(yī)藥的進一步研制和開發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。
[0007]本發(fā)明技術方案如下:
[0008]本發(fā)明尤韋可擬盤多毛孢的分離、篩選與鑒定:
[0009]是于2011年8月在貴州省貴陽市郊區(qū)采集的牡蒿葉片中，經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)、發(fā)酵和活性測定等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類學鑒定為尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola),定名為尤韋可擬盤多毛抱(Pestalot1psis uvicola) GMH31。該菌株已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登記號CCTCCN0:M2014303，地址湖北省武漢市武昌珞珈山。
[0010]具體的分離培養(yǎng)方法為:
[0011](I)牡蒿植物組織的準備:采集牡蒿的葉組織，用自來水沖洗，除去樣品表面的表生微生物，然后放于干凈的紗布上風吹晾干；
[0012](2)表明消毒及無菌檢測:晾干后的組織塊剪成適宜大小，用滅菌蒸餾水沖洗干凈，葉片消毒采用75%乙醇浸泡l-2min、0.1% HgCl2溶液浸泡3_4min，然后用滅菌蒸餾水沖洗至消毒液無殘留，用滅菌濾紙吸干組織段表面殘留水滴后，切成直徑4?6_大小的組織切段；
[0013](3)內生真菌的分離純化:將步驟(2)消毒后的組織切段接種于含有硫酸鏈霉素(100 μ g.mL—1)和青霉素(50 μ g.mL—1)的PDA培養(yǎng)基平板上，封口后于25_30°C恒溫培養(yǎng)2?7天，至菌絲體從組織塊中長出，采用尖端菌絲挑取法，將菌絲轉移至純化PDA培養(yǎng)基平板上，于25-30°C下進行純化培養(yǎng)5?9天，長出完整菌落，即為牡蒿內生真菌。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(3)中培養(yǎng)溫度為28°C，平板培養(yǎng)，純化培養(yǎng)時間為7天。
[0015]該牡蒿內生真菌命名為尤韋可擬盤多毛孢GMH31，其固體培養(yǎng)特征為:菌落在PDA平板上28°C培養(yǎng)8-9天擴展至直徑為9cm，菌落白色棉絮狀，輪狀擴展不明顯，背面淡橘黃色，無輪紋，子實體墨汁狀，顆粒較大，分布比較稀疏。顯微形態(tài)特征:分生孢子盤黑色，近球狀，初埋生寄主表皮下，成熟后突破表皮外露，呈粒點狀；分生孢子5細胞，兩端細胞無色(呈圓錐形或三角形)，中間細胞呈橄欖色至褐色(9.7?12.6 μ m)，近紡錘形，直立，壁厚，大小為19.7?23.5X5.5?6.6 μ m ;附屬絲著生于分生孢子的頂端，為2?3根,角度開張，較細長，長度為5.9?6.5 μ m,底部無色,三角形,尾絲短或無。見圖1、圖2。
[0016]菌株GMH31的分子生物學特征:采用分子生物學PCR技術，DNA序列測定分析，菌株GMH31的ITS rDNA基因組由495個堿基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎構建系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌為尤韋可擬盤多毛孢，見圖3。
[0017]本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株發(fā)酵液代謝產(chǎn)物防治植物真菌病害的方法。
[0018]上述目的通過以下技術方案來實現(xiàn):
[0019]一種防治獼猴桃褐腐病和辣椒疫病等植物真菌病害的微生物代謝產(chǎn)物的制備方法，按以下步驟進行:
[0020](I)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；
[0021](2)液體發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液10mL ;配制后121^滅菌20!^11，待冷卻至401:在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 土 1°C條件下，靜置發(fā)酵培養(yǎng)28-35天；
[0022](3)發(fā)酵液提取:發(fā)酵完畢后收集發(fā)酵液，加入1-3倍體積的乙酸乙酯萃取，取下層溶液，再用1-2倍體積的正丁醇萃取，分層后取上層液，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇發(fā)酵液萃取物。
[0023]本發(fā)明的再一目的是提供該菌株發(fā)酵菌絲體代謝產(chǎn)物在制備抗腫瘤等藥物中的應用。
[0024]上述目的通過以下技術方案來實現(xiàn):
[0025]一種具有抗腫瘤活性的菌絲體代謝產(chǎn)物的制備方法，按以下步驟進行:
[0026](I)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；
[0027](2)液體發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液10mL ;配制后121^滅菌20!^11，待冷卻至401:在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 土 1°C條件下，靜置發(fā)酵培養(yǎng)28-35天；
[0028](3)菌絲體提取:發(fā)酵完畢后收集菌絲體，加入濃度為30-90%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小于等于0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取2-5次，然后在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取2-5次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
[0029]本發(fā)明的有益效果:
[0030]一是本發(fā)明從藥用植物牡蒿葉片中分離篩選出代謝物對部分植物真菌病害病原菌和腫瘤細胞具有較強抑制作用的尤韋可擬盤多毛孢GMH31，這為農業(yè)上防治植物真菌病害病原菌和醫(yī)藥上抗惡性腫瘤新藥源的開拓提供了一種微生物菌株。
[0031]二是本發(fā)明提供了利用尤韋可擬盤多毛孢GMH31發(fā)酵獲得活性發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的方法；該代謝產(chǎn)物可應用于植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。
[0032]三是本發(fā)明提供了利用尤韋可擬盤多毛孢GMH31發(fā)酵獲得活性菌絲體代謝產(chǎn)物的方法；該代謝產(chǎn)物可應用于抗腫瘤藥物的制備，為醫(yī)用藥物新來源的開發(fā)增添了新的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為尤韋可擬盤多毛抱(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的平板圖。
[0034]圖2為尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的分生孢子圖。
[0035]圖3為尤韋可擬盤多毛抱(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的基因樹圖。

【具體實施方式】
[0036]為了使本領域普通技術人員更好的理解本發(fā)明，本 申請人:進行了一系列實驗研究，以證明本發(fā)明的效果。
[0037]下面，舉出實施例對本發(fā)明進一步描述，但本發(fā)明并不限于下述的實施例。
[0038]實施例1:(尤韋可擬盤多毛孢GMH31的分離與篩選)
[0039]本發(fā)明于2011年8月在貴州省貴陽市郊區(qū)采集藥用植物——牡蒿的健康葉片，經(jīng)表面消毒、內生真菌分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌活性菌株和腫瘤細胞株的篩選等步驟，從中獲得尤韋可擬盤多毛孢GMH31，保存。
[0040]具體的分離培養(yǎng)方法為:(I)牡蒿植物組織的準備:采集牡蒿的葉組織，用自來水沖洗，除去樣品表面的表生微生物，然后放于干凈的紗布上風吹晾干；
[0041](2)表明消毒及無菌檢測:晾干后的組織塊剪成適宜大小，用滅菌蒸餾水沖洗干凈，葉片消毒采用75%乙醇浸泡lmin、0.1 % HgCl2溶液浸泡3min，然后用滅菌蒸餾水沖洗至消毒液無殘留，用滅菌濾紙吸干組織段表面殘留水滴后，切成直徑4?6_大小的組織切段；
[0042](3)內生真菌的分離純化:將步驟(2)消毒后的組織切段接種于含有硫酸鏈霉素(100 μ g -πιΓ1)和青霉素(50 μ g -πιΓ1)的PDA培養(yǎng)基平板上，封口后于28°C恒溫培養(yǎng)5天，至菌絲體從組織塊中長出，采用尖端菌絲挑取法，將菌絲轉移至純化PDA培養(yǎng)基平板上，于28°C下進行純化培養(yǎng)7天，長出完整菌落，即為牡蒿內生真菌。
[0043]尤韋可擬盤多毛孢GMH31抑菌活性測定:
[0044]取經(jīng)0.22 μ m膜過濾的發(fā)酵液ImL于無菌培養(yǎng)皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放I個直徑為7mm的獼猴桃褐腐病菌(Sclerotinia sclerot1rum)或辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)等供試菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)72h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率:1(%)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/ (對照菌落直徑-7) ] X 100%。
[0045]測定結果表明:尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產(chǎn)物對獼猴桃褐腐病菌和辣椒疫霉菌的抑制率分別為82.8%和86.9%。
[0046]尤韋可擬盤多毛孢GMH31抑制腫瘤細胞株生長測定:
[0047]將腫瘤細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ L，標準條件培養(yǎng)12h后，分別加入含有對照或發(fā)酵菌絲體提取物的培養(yǎng)液(濃度分別為20 μ g/mL和200 μ g/mL)。標準條件分別培養(yǎng)12、24、48、72、96h，于培養(yǎng)結束前4h，各孔加入0.5%的MTT溶液20 μ L。培養(yǎng)結束后，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L終止反應，于自動酶標儀上，測定各孔在波長492nm處的光密度值(0D值)，計算細胞抑制率:1 (% ) = [I —加藥孔OD值/對照孔OD值]X 100%。抑制率>50%的為具有腫瘤細胞毒活性的菌株。
[0048]測定結果表明:濃度為20 μ g/mL的尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產(chǎn)物，在72h時，對小鼠腹水型肝癌細胞H22、小鼠腹水型宮頸癌細胞U14和小鼠腹水型肉瘤細胞S18tl的抑制率分別為 86.1%,92.4%和 77.9%。
[0049]實施例2:(尤韋可擬盤多毛孢GMH31發(fā)酵代謝產(chǎn)物的制備方法)
[0050]按以下步驟進行:
[0051](I)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；
[0052](2)液體發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7H200.3g，每 300mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液10mL ;配制后121^滅菌20!^11，待冷卻至401:在無菌條件下挑取I直徑為7mm的菌餅，在28 ± I °C條件下，靜置發(fā)酵培養(yǎng)30天；
[0053](3)發(fā)酵液提取:發(fā)酵完畢后收集發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層溶液，再用等體積正丁醇萃取，分層后取上層液，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇發(fā)酵液萃取物；
[0054](4)菌絲體提取:發(fā)酵完畢后收集菌絲體，加入濃度為80%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小于等于0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取4次，然后在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取4次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
[0055]以下實施例3中所述的尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產(chǎn)物為實施例2下方法(3)中所制備的正丁醇發(fā)酵液萃取物；所述產(chǎn)品的百分含量為質量/體積百分比。
[0056]實施例3:(尤韋可擬盤多毛孢GMH31發(fā)酵液代謝產(chǎn)物對獼猴桃褐腐病菌和辣椒疫霉菌的抑制作用)
[0057](I)準確稱取尤韋可擬盤多毛孢GMH31正丁醇發(fā)酵液萃取物0.1g,加入1mL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為10g/L的母液；
[0058](2)抑菌活性測定:取上述母液分別稀釋成濃度為1000mg/L和500mg/L的溶液，取各濃度溶液ImL于無菌培養(yǎng)皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻(尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產(chǎn)物終濃度為100mg/L和50mg/L)，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放I個直徑為7mm的獼猴桃褐腐病菌和辣椒疫霉菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)36h，以常規(guī)化學藥劑和無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率:1(%)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/ (對照菌落直徑-7) ] X 100 %。
[0059](3)本發(fā)明產(chǎn)品與常規(guī)農藥防治效果對比試驗:試驗結果見表1。從表1看出，尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產(chǎn)物抑制效果較常規(guī)化學藥劑略優(yōu)，且安全。
[0060]表1尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產(chǎn)物對供試病原真菌的抑制效果
[0061]

【權利要求】
1.尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psisuvicola)GMH31代謝產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述的尤韋可擬盤多毛孢GMH31在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏登記號為CCTCCNO:M2014303。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述代謝產(chǎn)物按以下方法制備: (1)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用； (2)液體發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2P040.5g、CaC0315g、MgS04.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液10mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 土 1°C條件下，靜置發(fā)酵培養(yǎng)28-35天； (3)菌絲體提取:發(fā)酵完畢后收集菌絲體，加入濃度為30-90%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小于等于0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取2-5次，然后在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取2-5次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述代謝產(chǎn)物按以下方法制備: (1)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用； (2)液體發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖20g、酵母膏 5g、蛋白胨 10g、KH2P040.5g、CaC0315g、MgS04.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液10mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 °C條件下，靜置發(fā)酵培養(yǎng)30天； (3)菌絲體提取:發(fā)酵完畢后收集菌絲體，加入濃度為80%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小于等于0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取3次，然后在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取3次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述腫瘤細胞為小鼠腹水型肝癌細胞H22、小鼠腹水型宮頸癌細胞U14或小鼠腹水型肉瘤細胞S180。
【文檔編號】A01N63/04GK104161777SQ201410335854
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權日:2014年7月15日
【發(fā)明者】錢一鑫, 康冀川, 王魯 申請人:貴州大學