一種白頭翁植株再生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及白頭翁的再生方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 白頭翁 Pulsatilla chinensis (Bge) Regel 是毛茛科（Ranunculaceae)，白頭翁 (Pulsatillae)屬多年生草本植物，根入藥。主要分布于東北、西北、華北和華東等地。全草 含三萜皂苷，具有鎮(zhèn)靜、抑制腫瘤細(xì)胞、殺菌、殺精、預(yù)防愛(ài)滋病等功能，治療老年性癡呆效 果顯著，此外，還可作觀賞花丼美化環(huán)境，用于制造生物農(nóng)藥和除草劑。然而，野生資源的匱 乏嚴(yán)重影響中醫(yī)臨床用藥及制藥企業(yè)的生產(chǎn)，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)緩解這一狀況成為迫切需 要。
[0003] 植物離體再生通常是首先形成愈傷組織，然后分化出新的器官或胚，或不經(jīng)過(guò)愈 傷組織而直接發(fā)育形成新的器官或胚。然而，離體培養(yǎng)的植物組織有時(shí)會(huì)進(jìn)入一種特殊 而穩(wěn)定的狀態(tài)，外部形態(tài)上，它是一種致密的球形細(xì)胞團(tuán)，彼此獨(dú)立而又常聚生在一起，稱(chēng) 為分生結(jié)節(jié)（Meristematic nodule)，合適的條件下可直接再生芽、根、葉狀體等植物器 官。目前僅在啤酒花（Humulus lupulus)、楊樹(shù)（Populus)、桉樹(shù)（Eucalyptus spp.)、菊苣 (Cichorium intybus)及牡丹（PaeoniaXLemoinei'Golden era'）等植物中研宄較多。但 有關(guān)白頭翁分生結(jié)節(jié)途徑植株再生的研宄極少，因此，白頭翁的植株再生技術(shù)對(duì)于其在中 醫(yī)臨床及制藥中的應(yīng)用非常關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種以白頭翁的葉片、葉柄為外植體，通過(guò)分生結(jié)節(jié) 途徑誘導(dǎo)白頭翁植株再生方法，通過(guò)誘導(dǎo)的分生結(jié)節(jié)的組織解剖學(xué)的觀察證實(shí)白頭翁的外 植體可通過(guò)分生結(jié)節(jié)途徑可進(jìn)行器官分化和發(fā)生體細(xì)胞胚。
[0005] 一種白頭翁植株再生方法，包括以下步驟：
[0006] 選材：以野生白頭翁細(xì)嫩的葉片或葉柄為外植體；
[0007] 外植體消毒：流水沖洗后用洗滌劑溶液浸泡，再用自來(lái)水沖洗，濾紙吸干水分，在 超凈工作臺(tái)用次氯酸鈉溶液浸泡，再用滅菌水淋洗，用滅菌濾紙吸干表面水分，洗滌劑為常 用洗滌劑；
[0008] 不定芽誘導(dǎo)：葉柄切成段，葉片切成塊，分別用解剖刀均勻割劃至少兩刀，并分別 接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)；
[0009] 不定芽增殖：將不定芽均切成小塊兒接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周；
[0010] 生根誘導(dǎo)與移栽：將增殖培養(yǎng)基中白頭翁小植株轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)，然后移栽到基質(zhì)中。
[0011] 次氯酸鈉溶液為1 %的次氯酸鈉溶液。
[0012] 次氯酸鈉溶液中加入有吐溫20。
[0013] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基分別添加不同濃度0?3. Omg ? I71的玉米素（Zeatin)、 激動(dòng)素（Kinetin)和6-芐氨基嘌呤（e-BAhSOg*!/1的糖，0.8%的瓊脂，pH為5.8,吲哚乙 酸（IAA)濃度為0.05mg? L-1。
[0014] 不定芽誘導(dǎo)在24?26°C、16h ? cf1光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000 y mol ? m 1 ? s下培養(yǎng)。
[0015] 增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，同時(shí)加入濃度為1. 5mg? I71的玉米素和0. 05mg? L的 吲哚乙酸。
[0016] 生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基中加入0?3.Omg? I71萘乙酸。
[0017] 基質(zhì)選用丹麥品氏托普基質(zhì)珍珠巖按3 : 2配成，并進(jìn)行高壓滅菌。
[0018] 本文所用MS培養(yǎng)基基本組成如表1所示：
[0019] 表1 :MS培養(yǎng)基基本組成表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種白頭翁植株再生方法，其特征在于，包括以下步驟： 選材：以野生白頭翁細(xì)嫩的葉片或葉柄為外植體； 外植體消毒：流水沖洗后用常用洗滌劑溶液浸泡，再用自來(lái)水沖洗，濾紙吸干水分，在 超凈工作臺(tái)用次氯酸鈉溶液浸泡，再用滅菌水淋洗，用滅菌濾紙吸干表面水分； 不定芽誘導(dǎo)：葉柄切成段，葉片切成塊，分別用解剖刀均勻割劃至少兩刀，并分別接種 到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)； 不定芽增殖：將不定芽均切成小塊兒接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周； 生根誘導(dǎo)與移栽：將增殖培養(yǎng)基中白頭翁小植株轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然 后移栽到基質(zhì)中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述次氯酸鈉溶液為1 % 的次氯酸鈉溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述次氯酸鈉溶液中加 入吐溫20。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為： MS培養(yǎng)基添加有濃度為0?3. Omg ? I71的玉米素（Zeatin)或0?3. Omg ? 的激動(dòng)素 (Kinetin)，同時(shí)加有濃度為30g ? L-1的糖和0. 05mg ? L ―1的吲哚乙酸（IAA)、0. 8%的瓊脂， pH 為 5. 8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述不定芽誘導(dǎo)在24? 26°C、16h ? cf1光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000 ymol ? m 1 ? s下培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)基為MS培 養(yǎng)基，同時(shí)加入濃度為1. 5mg ? I71的玉米素和0. 05mg ? Lh的卩引噪乙酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS 培養(yǎng)基中加入〇?3. Omg ? L-1萘乙酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白頭翁植株再生方法，其特征在于，所述基質(zhì)選用丹麥品氏 托普基質(zhì)珍珠巖按3 : 2配成，并進(jìn)行高壓滅菌。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種白頭翁植株再生方法，步驟為：以野生白頭翁細(xì)嫩的葉片或葉柄為外植體；流水沖洗后用洗滌劑溶液浸泡，再用自來(lái)水沖洗，濾紙吸干水分，在超凈工作臺(tái)用次氯酸鈉溶液浸泡，再用滅菌水淋洗，用滅菌濾紙吸干表面水分；葉柄切成段，葉片切成塊，分別用解剖刀均勻割劃至少兩刀，并分別接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)；將不定芽均切成小塊兒接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周；將增殖培養(yǎng)基中白頭翁小植株轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移栽到基質(zhì)中。白頭翁外植體可通過(guò)分生結(jié)節(jié)途徑不僅可進(jìn)行器官分化，而且發(fā)生體細(xì)胞胚，這對(duì)植物離體再生新途徑的研究提供了新的理論依據(jù)。
【IPC分類(lèi)】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104521757
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410819807
【發(fā)明人】廉玉姬, 趙小梅
【申請(qǐng)人】臨沂大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月24日