一種桂花幼胚培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)中離體快繁的育種方法，具體地說，涉及一種桂花幼胚培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桂n Osmamthus fragrans )是我國十大傳統(tǒng)名花之一,其花期正值我國傳統(tǒng)佳節(jié)中秋節(jié)，開花時香聞數(shù)里，有“獨占三秋壓群芳”之譽，在庭院綠化和香料生產(chǎn)中具有重要的地位和影響。桂花在我國的栽培歷史悠久，在南嶺以北至秦嶺淮河流域以南的廣大地區(qū)均有栽培，并形成了蘇州、咸寧、成都、杭州和桂林等歷史上著名的“五大桂花產(chǎn)區(qū)”。2004年從我國取得“國
際桂花登錄權(quán)威”以后，我國桂花的生產(chǎn)、開發(fā)、推廣應用正呈現(xiàn)出日新月異的面貌，桂花產(chǎn)業(yè)有了長足發(fā)展，面積快速增長，品種日益豐富，市場銷售持續(xù)火爆。
[0003]桂花可以采用播種、嫁接、扦插、壓條等方法繁殖。然而這些方式也存在一定的局限性。播種繁殖的種子需經(jīng)過生理后熟期，繁殖所用時間較長。扦插、壓條等方式耗費人力物力大、繁殖效率較低而且容易受到氣候的影響，這些因素極大限制了桂花的應用和進一步開發(fā)。自然條件下，桂花果實成熟后種子一般要第二年才能萌發(fā)，木質(zhì)化種殼對水分的阻礙以及胚乳的包裹作用可能是導致桂花種子休眠的原因。一般來說，種子休眠與萌發(fā)不僅與植物內(nèi)源激素的絕對含量有關(guān)，還與各類激素之間的平衡有關(guān)。處于休眠的種子大多數(shù)可通過直接或間接調(diào)節(jié)激素水平來實現(xiàn)人工控制。目前關(guān)于桂花幼胚培養(yǎng)的研究報道較少，而且還存在一些不一致的觀點，還沒有形成較成熟完善的理論體系。因此，很有必要建立桂花幼胚培養(yǎng)技術(shù)體系，為構(gòu)建桂花再生體系積累經(jīng)驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種桂花幼胚培養(yǎng)方法，本發(fā)明以“籽丹”桂未成熟果實為外植體，經(jīng)過外植體消毒、幼胚培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等步驟建立了桂花離體幼胚的培養(yǎng)技術(shù)體系，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種桂花幼胚培養(yǎng)方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒處理:選取桂花飽滿健康的未成熟果實，采摘后先在2?4°C條件下進行低溫預處理I?5天后用洗潔精水溶液浸泡5?1min,然后用自來水沖洗10?30min。剝?nèi)スぁ⒐?，將獲得的種子先用吐溫清水洗I次后用自來水沖洗5?7次，擦干表面水分后在超凈工作臺中以70%?80%乙醇浸泡5?10s，0.1%升汞溶液消毒8?20min，再用無菌水清洗3?5次后用無菌濾紙擦干后備用。
[0006](2)幼胚培養(yǎng):將步驟(I)處理后種子置于無菌濾紙上用已消毒的鑷子和解剖刀剖開種皮取出幼胚接種于幼胚培養(yǎng)基上進行幼胚培養(yǎng)，接種后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至幼胚萌發(fā)。
[0007](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所獲得的長出2?3對真葉的幼苗在根頸以下0.6?1.2cm處剪斷主根后接種到生根培養(yǎng)基上進行促根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28 °C的條件下培養(yǎng)至生根。
[0008](4)煉苗移栽:待幼苗長至6?9cm高后置于自然光照下煉苗5?7天后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至草炭土基質(zhì)中，一周之內(nèi)避免陽光照射，并向基質(zhì)和葉片施用1/4MS大量元素營養(yǎng)液，保持濕度。7天后逐漸撤去遮蔭物，并逐步減少營養(yǎng)液施用次數(shù)，待幼苗成活后再移栽大田。
[0009]上述步驟(2)所述的幼胚培養(yǎng)基為:Β5+0.5?1.5mg/L6-BA+l?5mg/L GA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0010]上述步驟(3)所述的生根培養(yǎng)基為:B5+1?4mg/L NAA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點是:通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)離體胚，以破除桂花種子休眠，實現(xiàn)較高的種子萌發(fā)率。本發(fā)明以“籽丹”桂未成熟果實為外植體，經(jīng)過外植體消毒、幼胚培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等步驟建立了桂花離體幼胚的培養(yǎng)技術(shù)體系，以期為建立桂花再生體系、利用基因工程和細胞工程改良桂花品種奠定基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0012]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0013]實施例1:
(I)外植體消毒處理:選取桂花飽滿健康的未成熟果實，采摘后先在2°c條件下進行低溫預處理3天后用洗潔精水溶液浸泡5min，然后用自來水沖洗25min。剝?nèi)ス?、果?將獲得的種子先用吐溫清水洗I次后用自來水沖洗5次，擦干表面水分后在超凈工作臺中以75%乙醇浸泡8s，0.1%升汞溶液消毒lOmin，再用無菌水清洗5次后用無菌濾紙擦干后備用。
[0014](2)幼胚培養(yǎng):將步驟(I)處理后種子置于無菌濾紙上用已消毒的鑷子和解剖刀剖開種皮取出幼胚接種于幼胚培養(yǎng)基上進行幼胚培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時，光照強度為20001χ，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)3天后幼胚兩片子葉開始分開，5天后幼胚體積明顯增大，7天后就有約一半的桂花幼胚從胚軸開始轉(zhuǎn)綠，有的子葉也開始變綠，15天后，絕大多數(shù)成活幼胚的胚軸和子葉都變綠，此后，子葉伸展長大，并開始抽出真葉。所述的幼胚培養(yǎng)基為:B5+L 2mg/L6-BA+3mg/L GA+3.5%蔗糖+(λ 35%瓊脂+(λ 05%活性炭，pH值為 5.8。
[0015](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所獲得的長出2?3對真葉的幼苗在根頸以下0.6?1.2cm處剪斷主根后接種到生根培養(yǎng)基上進行促根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)2天，然后置于每天光照11小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)31天后，生根率達94.7%,生根幼苗平均生根數(shù)量為4.8條。所述的生根培養(yǎng)基為:B5+2mg/LNAA+2.0%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0016](4)煉苗移栽:待幼苗長至6?9cm高后置于自然光照下煉苗5天后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至草炭土基質(zhì)中，一周之內(nèi)避免陽光照射，并向基質(zhì)和葉片施用1/4MS大量元素營養(yǎng)液，保持濕度。7天后逐漸撤去遮蔭物，并逐步減少營養(yǎng)液施用次數(shù)，待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率為92%。
[0017]實施例2:
(I)外植體消毒處理:選取桂花飽滿健康的未成熟果實，采摘后先在4°C條件下進行低溫預處理5天后用洗潔精水溶液浸泡8min，然后用自來水沖洗20min。剝?nèi)ス?、果?將獲得的種子先用吐溫清水洗I次后用自來水沖洗5次，擦干表面水分后在超凈工作臺中以75%乙醇浸泡6s，0.1%升汞溶液消毒12min，再用無菌水清洗5次后用無菌濾紙擦干后備用。
[0018](2)幼胚培養(yǎng):將步驟(I)處理后種子置于無菌濾紙上用已消毒的鑷子和解剖刀剖開種皮取出幼胚接種于幼胚培養(yǎng)基上進行幼胚培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)4天后幼胚兩片子葉開始分開，57天后幼胚體積明顯增大，9天后就有約一半的桂花幼胚從胚軸開始轉(zhuǎn)綠，有的子葉也開始變綠，18天后，絕大多數(shù)成活幼胚的胚軸和子葉都變綠，此后，子葉伸展長大，并開始抽出真葉。所述的幼胚培養(yǎng)基為:B5+1.5mg/L6-BA+3.5mg/L GA+3.0% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.07% 活性炭，pH 值為 5.6。
[0019](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所獲得的長出2?3對真葉的幼苗在根頸以下0.6?1.2cm處剪斷主根后接種到生根培養(yǎng)基上進行促根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照11小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)30天后，生根率達94%，生根幼苗平均生根數(shù)量為5.3條。所述的生根培養(yǎng)基為:B5+3.5mg/LNAA+2.0%蔗糖+0.35%瓊脂+0.07%活性炭，pH值為5.6。
[0020](4)煉苗移栽:待幼苗長至6?9cm高后置于自然光照下煉苗5天后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至草炭土基質(zhì)中，一周之內(nèi)避免陽光照射，并向基質(zhì)和葉片施用1/4MS大量元素營養(yǎng)液，保持濕度。7天后逐漸撤去遮蔭物，并逐步減少營養(yǎng)液施用次數(shù)，待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率為91%。
【主權(quán)項】
1.一種桂花幼胚培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體消毒處理:選取桂花飽滿健康的未成熟果實，采摘后先在2?4°C條件下進行低溫預處理I?5天后用洗潔精水溶液浸泡5?1min,然后用自來水沖洗10?30min,剝?nèi)ス?、果肉，將獲得的種子先用吐溫清水洗I次后用自來水沖洗5?7次，擦干表面水分后在超凈工作臺中以70%?80%乙醇浸泡5?10s，0.1%升汞溶液消毒8?20min，再用無菌水清洗3?5次后用無菌濾紙擦干后備用； (2)幼胚培養(yǎng):將步驟(I)處理后種子置于無菌濾紙上用已消毒的鑷子和解剖刀剖開種皮取出幼胚接種于幼胚培養(yǎng)基上進行幼胚培養(yǎng)，接種后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至幼胚萌發(fā)； (3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所獲得的長出2?3對真葉的幼苗在根頸以下0.6?1.2cm處剪斷主根后接種到生根培養(yǎng)基上進行促根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根； (4)煉苗移栽:待幼苗長至6?9cm高后置于自然光照下煉苗5?7天后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至草炭土基質(zhì)中，一周之內(nèi)避免陽光照射，并向基質(zhì)和葉片施用1/4MS大量元素營養(yǎng)液，保持濕度，7天后逐漸撤去遮蔭物，并逐步減少營養(yǎng)液施用次數(shù)，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桂花幼胚培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)所述的幼胚培養(yǎng)基為:B5+0.5 ?1.5mg/L6-BA+l ?5mg/L GA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桂花幼胚培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)所述的生根培養(yǎng)基為:B5+1 ?4mg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
【專利摘要】一種桂花幼胚培養(yǎng)方法，涉及桂花（Osmamthus fragrans）通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)離體胚，以破除桂花種子休眠，實現(xiàn)較高的種子萌發(fā)率。本發(fā)明以“籽丹”桂未成熟果實為外植體，經(jīng)過外植體消毒、幼胚培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等步驟建立了桂花離體幼胚的培養(yǎng)技術(shù)體系，以期為建立桂花再生體系、利用基因工程和細胞工程改良桂花品種奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104663444
【申請?zhí)枴緾N201510087221
【發(fā)明人】楊惠才
【申請人】楊惠才
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月25日