三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三葉崖爬藤(Tetrastlgma hemsleyanum Diels et Gilg)是中國(guó)特有的珍稀藥用植物，主要以塊根入藥，性涼、無(wú)毒、味甘微苦，在小兒高熱、扁桃體炎、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性腦膜炎等方面療效顯著，還在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦科疾病血崩、白帶、血液病、心腦血管疾病、毒蛇咬傷、癰疽、肛裂及抗艾滋病毒和抗腫瘤等臨床治療方面有很好的療效，有“植物青霉素”之稱。已研究發(fā)現(xiàn)三葉青的黃酮提取物對(duì)H-22、SMMC-7721和H印G2肝癌細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、SGC—7901人胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞和HT-29細(xì)胞、艾氏瘤、S180肉瘤瘤株、白血病細(xì)胞株系HL60、K562、人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞、人宮頸癌Hela229細(xì)胞、人胃腺癌AGS細(xì)胞、人膀胱癌5637細(xì)胞均有一定的抑制或促凋亡作用，具有保肝護(hù)肝、抗病毒、消炎鎮(zhèn)痛解熱等藥理作用，對(duì)關(guān)節(jié)炎、痛經(jīng)也有一定的治療作用。
[0003]三葉青因其藥理研究發(fā)現(xiàn)和顯著的臨床療效，醫(yī)學(xué)需求在持續(xù)增強(qiáng)，但由于人為過(guò)度采掘，導(dǎo)致現(xiàn)有野生資源已處于瀕危狀態(tài)，被列為浙江省瀕危植物目錄。因此，對(duì)三葉青資源的保護(hù)和可持續(xù)利用刻不容緩。
[0004]目前，三葉青的馴化栽培、離體扦插及組培快繁技術(shù)問(wèn)題都已基本解決，但其人工栽培中藥用部位葫蘆塊根塊根生產(chǎn)技術(shù)存在嚴(yán)重的瓶頸制約。因此，為切實(shí)保護(hù)三葉青有限的野生資源和人工栽培資源，解決市場(chǎng)供需矛盾，利用生物技術(shù)手段來(lái)生產(chǎn)三葉青藥用功能成分的研究顯得尤為迫切。而不定根培養(yǎng)技術(shù)作為新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)具有次生代謝物產(chǎn)量穩(wěn)定、快速而成為根用類藥用植物生產(chǎn)次生代謝物的主要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其能獲得高生物量和黃酮含量的不定根，且可以周年生產(chǎn)，不受季節(jié)和氣候因素的限制。
[0006]本發(fā)明通過(guò)對(duì)三葉青葉片誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)、增殖、高效培養(yǎng)生產(chǎn)組培次生代謝物黃酮類化合物的關(guān)鍵技術(shù)研究，形成三葉青組培不定根培養(yǎng)黃酮類化合物的技術(shù)方案，為今后工業(yè)化生產(chǎn)三葉青中抗腫瘤功能物質(zhì)黃酮類化合物打好基礎(chǔ)，以期為后續(xù)開發(fā)抗腫瘤藥物生產(chǎn)解決原料需求問(wèn)題。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
[0008]三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其按如下步驟進(jìn)行:
[0009](I)愈傷組織的誘導(dǎo):將從三葉青植株上摘取的葉片沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用乙醇消毒后轉(zhuǎn)入升汞消毒，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次(如5?6次)，切割后正面朝上平放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天(如30d);
[0010](2)愈傷組織的增殖:將步驟(I)獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上，27±1°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天(如30d);
[0011](3)愈傷組織分化不定根的誘導(dǎo):將步驟(2)獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天(如30d);
[0012](4)不定根的繁殖:將步驟(3)獲得的不定根在超凈工作臺(tái)上切割成一定長(zhǎng)度(如Icm左右)，接種于不定根增殖的液體培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。
[0013]優(yōu)選的，步驟(I)中，乙醇濃度為75%，浸泡葉片30 s，轉(zhuǎn)入0.1 %升萊浸泡消毒1min，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+30g.L—1 蔗糖+2.0mg.L—k-BA+0.2mg.L_1NAA+6.5g.L-1 瓊脂。
[0014]優(yōu)選的，步驟(2)中，愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+30g.L—1蔗糖+2.0mg.L^6-BA+0.2mg.L_1NAA+6.5g.L—1 瓊脂。
[0015]優(yōu)選的，步驟(3)中，作為誘導(dǎo)不定根的愈傷組織材料以在步驟(2)的增殖培養(yǎng)上繼代增殖5次為宜，不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為3/4MS+20g.L—1鹿糖+l.0mg.L^NAA+e.Sg.L—1瓊月旨，培養(yǎng)周期30d，培養(yǎng)溫度27±1°C黑暗培養(yǎng)。
[0016]優(yōu)選的，步驟(4)中，不定根增殖培養(yǎng)基為l/2MS+30g.L—1鹿糖+2.0mg.IZ1IBA+0.8mg.L^NAA+0.Smg.L—k-BA+苯丙氨酸60mg.^+6.58.L—1瓊脂，培養(yǎng)方式為黑暗培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)入全光照培養(yǎng)15d。
[0017]本發(fā)明采用三葉青葉片誘導(dǎo)出愈傷組織、再利用愈傷組織誘導(dǎo)不定根然后進(jìn)行擴(kuò)繁，達(dá)到不定根的高生物量和黃酮含量。
[0018]利用本發(fā)明技術(shù)方案不定根的誘導(dǎo)率達(dá)到99.0%，平均單個(gè)愈傷塊分化的不定根數(shù)量達(dá)到13.77根，平均單個(gè)愈傷塊分化的不定根質(zhì)量達(dá)到30.70mg，一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)不定根鮮重增長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到9.35 ± 1.05倍，總黃酮含量經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定達(dá)到69.03±1.39mg.g—1.DW—1。為今后工業(yè)化生產(chǎn)三葉青中抗腫瘤功能物質(zhì)黃酮類化合物奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)可解決三葉青原料的供需矛盾問(wèn)題。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明。
[0020]本實(shí)施例三葉青不定根誘導(dǎo)及繁殖方法，其按如下步驟進(jìn)行:
[0021](I)愈傷組織的誘導(dǎo):將從三葉青植株上摘取的葉片沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用乙醇消毒后轉(zhuǎn)入升汞消毒，然后用無(wú)菌水沖洗5?6次，切割成0.5cmX0.5cm左右大小，正面朝上平放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1°C黑暗培養(yǎng)30d。本步驟中，乙醇的濃度為75%，浸泡葉片30s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞浸泡消毒lOmin，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+30g.L—1蔗糖+2.0mg.L^6-BA+
0.2mg.L_1NAA+6.5g.L—1 瓊脂。
[0022](2)愈傷組織的增殖:將步驟(I)獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上，27±1°C黑暗培養(yǎng)30d。本步驟中，愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+30g.L—1蔗糖+2.0mg.L_16-BA+0.2mg.L_1NAA+6.5g.L—1 瓊脂。
[0023](3)愈傷組織分化不定根的誘導(dǎo):將步驟(2)獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1°C黑暗培養(yǎng)30d。本步驟中，作為誘導(dǎo)不定根的愈傷組織材料以在步驟(2)的增殖培養(yǎng)上繼代增殖5次為宜，不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為3/4MS+20g.L—1鹿糖+l.0mg.L^NAA+e.Sg.L—1瓊脂，培養(yǎng)周期30d，培養(yǎng)溫度27±1°C黑暗培養(yǎng)。
[0024](4)不定根的繁殖:將步驟(3)獲得的不定根在超凈工作臺(tái)上切割成Icm左右長(zhǎng)度，接種于不定根增殖的液體培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。本步驟中，不定根增殖培養(yǎng)基為l/2MS+30g.L—1 蔗糖+2.0mg.L_1IBA+0.8mg.L_1NAA+0.5mg.L—k-BA+苯丙氨酸60mg.^+6.58.L—1瓊脂，培養(yǎng)方式為黑暗培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)入全光照培養(yǎng)15d。
[0025]本發(fā)明以三葉青葉片為材料誘導(dǎo)出愈傷組織，再通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)分化出不定根，以此不定根為材料進(jìn)行擴(kuò)繁并合成黃酮類化合物，技術(shù)流程清晰，通過(guò)該技術(shù)方法，不定根的誘導(dǎo)率達(dá)到99.0%，平均單個(gè)愈傷塊分化的不定根數(shù)量達(dá)到13.77根，平均單個(gè)愈傷塊分化的不定根質(zhì)量達(dá)到30.70mg，一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)不定根鮮重增長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到9.35± 1.05倍，總黃酮含量經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定達(dá)到69.03±1.39mg.g—1.Dff^10
[0026]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而并非作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對(duì)以上實(shí)施例的變化、變型都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行: (1)愈傷組織的誘導(dǎo):將從三葉青植株上摘取的葉片沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用乙醇消毒后轉(zhuǎn)入升汞消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，后切割，正面朝上平放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27 ± 1°C黑暗培養(yǎng)； (2)愈傷組織的增殖:將步驟(I)獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上，27 土 1°C黑暗培養(yǎng)； (3)愈傷組織分化不定根的誘導(dǎo):將步驟(2)獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27 ± 1°C黑暗培養(yǎng)； (4)不定根的繁殖:將步驟(3)獲得的不定根在超凈工作臺(tái)上切割成設(shè)定的長(zhǎng)度，接種于不定根增殖的液體培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。2.如權(quán)利要求1所述三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是:步驟(I)中，乙醇濃度為75%，浸泡葉片30s，轉(zhuǎn)入0.1 %升汞浸泡消毒lOmin。3.如權(quán)利要求1或2所述三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是:步驟(I)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+30g.L—1 蔗糖+2.0mg.L—k-BA+0.2mg.L^NAA+e.Sg.L—1 瓊脂。4.如權(quán)利要求1所述三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是:步驟(2)中，愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+30g.L—1 蔗糖+2.0mg.L—k-BA+0.2mg.L^NAA+e.Sg.L—1 瓊脂。5.如權(quán)利要求1所述葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是:步驟(3)中，作為誘導(dǎo)不定根的愈傷組織材料以在步驟(2)的增殖培養(yǎng)上繼代增殖5次為宜，培養(yǎng)周期30d，培養(yǎng)溫度27±1°C黑暗培養(yǎng)，不定根誘導(dǎo)率達(dá)到99.0%，平均單個(gè)愈傷塊分化的不定根數(shù)量達(dá)到13.77根，平均單個(gè)愈傷塊分化的不定根質(zhì)量達(dá)到30.70mg。6.如權(quán)利要求1或5所述葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是:步驟(3)中，不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為3/4MS+20g.L—1 鹿糖+l.0mg.L^NAA+e.Sg.L—1 瓊脂。7.如權(quán)利要求1所述葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，其特征是:步驟(4)中，不定根增殖培養(yǎng)基為l/2MS+30g.L—1 蔗糖+2.0mg.L_1IBA+0.8mg.L-xNAA+0.5mg.L—S-BA+苯丙氨酸60mg.L—46.58.L—1瓊脂，培養(yǎng)方式為黑暗培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)入全光照培養(yǎng)15d，一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)不定根鮮重增長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到9.35 ± 1.05倍，總黃酮含量經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定達(dá)5j69.03±1.39mg.g-1.DW—1。
【專利摘要】本發(fā)明公開了三葉青不定根的誘導(dǎo)及繁殖方法，按如下步驟進(jìn)行：（1）愈傷組織的誘導(dǎo)：將從三葉青植株上摘取的葉片沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用乙醇消毒后轉(zhuǎn)入升汞消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，后切割，正面朝上平放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1？℃黑暗培養(yǎng)。（2）愈傷組織的增殖：將步驟（1）獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上，27±1？℃黑暗培養(yǎng)。（3）愈傷組織分化不定根的誘導(dǎo)：將步驟（2）獲得的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上切割成小塊，接種于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，27±1？℃黑暗培養(yǎng)。（4）不定根的繁殖：將步驟（3）獲得的不定根在超凈工作臺(tái)上切割成設(shè)定的長(zhǎng)度，接種于不定根增殖的液體培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105494092
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510894222
【發(fā)明人】錢麗華, 馬華升, 姜慧燕, 張樂(lè), 王賢波, 劉洋
【申請(qǐng)人】杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月8日