專利名稱：合成的和嵌合的啟動(dòng)子、表達(dá)盒、質(zhì)粒、載體、含有它們的轉(zhuǎn)基因植物和種子以及其產(chǎn)生方法
專利說明合成的和嵌合的啟動(dòng)子、表達(dá)盒、質(zhì)粒、載體、含有 它們的轉(zhuǎn)基因植物和種子以及其產(chǎn)生方法 本發(fā)明涉及計(jì)劃具體用于植物生物技術(shù)領(lǐng)域的嵌合表達(dá)啟動(dòng)子。
一般而言，所述表達(dá)啟動(dòng)子是生物技術(shù)和遺傳操作領(lǐng)域已知的。在更具體的植物生物技術(shù)方面，將在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽的編碼基因的表達(dá)水平常常取決于所使用的啟動(dòng)子。常用的各種啟動(dòng)子由于其表達(dá)的組織特異性或表達(dá)強(qiáng)度，通常限于特定的應(yīng)用或組織。作為與例如源自nos基因的啟動(dòng)子相比相對(duì)強(qiáng)的啟動(dòng)子，可以提及例如花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子，這兩種啟動(dòng)子更尤其用于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。因此需要使得有可能克服采用目前的啟動(dòng)子的缺點(diǎn)的新型啟動(dòng)子。在公布號(hào)為WO 97/20056的PCT專利申請(qǐng)中已經(jīng)報(bào)道了滿足這一需要的嘗試，該專利申請(qǐng)描述了通過利用增強(qiáng)子在已知啟動(dòng)子中提高基因表達(dá)水平(即對(duì)啟動(dòng)子的活性有正效應(yīng))。增強(qiáng)子的核苷酸序列富含A和T堿基，這些堿基的總量組成超過50％的所述增強(qiáng)子的核苷酸序列。特別是，該申請(qǐng)的申請(qǐng)人建議利用源自豌豆質(zhì)體藍(lán)素(plastocyanine)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子區(qū)。
用于本說明書和權(quán)利要求書的表述具有以下含義-術(shù)語“核酸”是指DNA或RNA；-術(shù)語“核酸序列”是指從5’端讀至3’端的單鏈或雙鏈的核苷酸堿基的寡聚體或聚合物，它包括自我復(fù)制型質(zhì)粒、感染性或非感染性的基因和DNA或RNA聚合物、以及功能性或非功能性DNA或RNA。在用于本申請(qǐng)中的核苷酸符號(hào)中，除具體提及的以外，單鏈或雙鏈核苷酸序列的左手端均為5’端；
-短語“衍生的核酸序列”是指例如通過置換、缺失、添加、突變、斷裂和/或合成一個(gè)或更多個(gè)核苷酸而直接或間接從所提及的序列衍生的序列；-術(shù)語“啟動(dòng)子”或短語“啟動(dòng)子核酸序列”是指位于翻譯起始密碼子上游、并且涉及RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄蛋白的識(shí)別和結(jié)合的核酸區(qū)；-“植物啟動(dòng)子”是能夠在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；-“組成型啟動(dòng)子”是能夠在所述宿主生物的整個(gè)發(fā)育過程中，在該生物的所有組織或幾乎所有組織中表達(dá)與所述啟動(dòng)子以功能方式連接的核酸序列的啟動(dòng)子；-“特異性組織啟動(dòng)子”是指在所述宿主生物的某些特定組織中選擇性地表達(dá)與所述啟動(dòng)子以功能方式連接的核酸序列的啟動(dòng)子；-短語“以功能方式連接的”或“功能性連接的”是指一段核酸序列(例如一個(gè)啟動(dòng)子或一個(gè)調(diào)節(jié)或功能框)與另一段核酸序列(例如另一調(diào)節(jié)或功能框、或編碼待產(chǎn)生的蛋白的待表達(dá)的基因)的連接，使得所述序列在已經(jīng)引入其的細(xì)胞、基因組、載體或表達(dá)盒中發(fā)揮其原始功能，即使得它們?cè)谶@樣的環(huán)境中有功能。也應(yīng)該理解，就啟動(dòng)子而言，所述啟動(dòng)子的序列也包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和翻譯起始位點(diǎn)之間的轉(zhuǎn)錄的序列；-術(shù)語“表達(dá)盒”是指這樣的核苷酸序列，所述核苷酸序列能夠在與這種序列相容的宿主生物中指導(dǎo)編碼待產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因的表達(dá)。這樣的盒至少包括一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、以及任選的表達(dá)所需要的或可用于表達(dá)的其它因子；-術(shù)語“載體”是指表達(dá)系統(tǒng)，例如DNA包被的轟擊粒子、基于核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體和已被改變以運(yùn)送所述核酸的核酸分子、以及自主自我復(fù)制型環(huán)狀DNA，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒等。如果將重組細(xì)胞培養(yǎng)物或微生物稱為“表達(dá)載體”的宿主，則這包括染色體外環(huán)狀DNA(例如線粒體DNA或葉綠體DNA)和已經(jīng)整合到宿主染色體中的DNA，所述載體能夠或者作為整合到宿主基因組中的自主結(jié)構(gòu)通過在有絲分裂期間由所述細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制，或者維持在宿主的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中；-術(shù)語“質(zhì)?！笔侵改軌蛟诩?xì)胞中復(fù)制的自主環(huán)狀DNA分子，包括所謂的“表達(dá)”質(zhì)粒和所謂的“非表達(dá)”質(zhì)粒。如果一種重組細(xì)胞培養(yǎng)物或微生物被描述為是“表達(dá)質(zhì)?！钡乃拗鳎瑒t該術(shù)語既包括染色體外環(huán)狀DNA分子，又包括已經(jīng)整合到宿主染色體中的DNA。如果所述質(zhì)粒被宿主細(xì)胞保持，則所述質(zhì)?；蛘咴谟薪z分裂期間作為一種自主結(jié)構(gòu)由所述細(xì)胞穩(wěn)定地復(fù)制，或者整合到所述宿主的基因組中；-術(shù)語“異源序列”或“異源核酸序列”是指源自與其環(huán)境無關(guān)的來源或物種的序列，或者如果它源自同一環(huán)境，則其相對(duì)于其原來形式而言已經(jīng)被修飾?？梢酝ㄟ^例如用限制酶處理所述核酸，以產(chǎn)生能夠以功能方式連接至啟動(dòng)子的核酸片段，對(duì)所述核酸序列進(jìn)行修飾。還可以通過例如定向誘變的技術(shù)進(jìn)行所述修飾；-術(shù)語“框”是指負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)功能的核酸序列；-術(shù)語“樣(like)”是指與此術(shù)語相連的盒和/或核酸序列，包含與一種框和/或稱為參比序列的已知核酸序列具有一定的序列同一性或共有序列，優(yōu)選與所述參比序列具有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選具有至少75％的序列同一性，更特別具有至少90％的序列同一性。序列同一性的百分比以至少6個(gè)核苷酸堿基的對(duì)比窗為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算?？梢允褂眯蛄袑?duì)比算法確定對(duì)比窗，以測(cè)定與參比序列同源性，所述算法例如局部同源性算法、同源性序列對(duì)比算法和相似性檢索算法，這些算法還以計(jì)算機(jī)形式存在，稱為GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。通過比較參比序列與所述框和/或所述核酸序列獲得序列同一性的百分比；-術(shù)語“位于”是指已鑒定元件(例如“框”、限制位點(diǎn)或具有特定功能的密碼子)在核酸序列中的位置。以數(shù)字給出的位置是指所述元件在所述核酸序列中的起始位置，只是當(dāng)具體提及時(shí)，以所述核苷酸序列的閱讀方向即5′→3′方向提及；-術(shù)語“元件300”、“EM”、“胚乳基序”、“P框”或“谷醇溶蛋白樣”框是指編碼許多禾谷類貯藏蛋白并且參與玉米胚乳發(fā)育期間介導(dǎo)玉米醇溶蛋白基因同步表達(dá)的共同調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)節(jié)或功能基序或元件；-術(shù)語“G樣”框是指ACGT核心基序，在少數(shù)情況下其對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的功能貢獻(xiàn)已經(jīng)被限定，但其看來是啟動(dòng)子最大表達(dá)所必需的；-術(shù)語“增強(qiáng)子”框是指可以在相隔一定距離的地方以順式起作用的調(diào)節(jié)DNA序列，它與其方向以及是位于其靶啟動(dòng)子上游還是下游無關(guān)，并且它通?？梢杂啥鄠€(gè)短基序組成，所述基序結(jié)合反式因子的組合，以可能賦予誘導(dǎo)性、組織特異性或啟動(dòng)子活性的總體提高；-術(shù)語“GATA”框是指許多光調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子活性可能需要的調(diào)節(jié)或功能基序或元件；-術(shù)語“as1”或“激活序列1”框是指優(yōu)選源自CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)或功能基序或元件，它可以提供在根中的表達(dá)，它可以在啟動(dòng)子調(diào)節(jié)中通過與其它順式激活元件協(xié)同相互作用而起更為復(fù)雜的作用，而且它可以任選地是水楊酸誘導(dǎo)型；-術(shù)語“as2”或“激活序列2”框是指優(yōu)選源自CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)或功能基序或元件，它可以提供在光合作用組織中的表達(dá)，并且它可以具有轉(zhuǎn)錄激活劑的活性；-術(shù)語“禾谷類”框是指可能參與小麥種子中的特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)或功能基序或元件；-術(shù)語“富含GC”框是指富含G或C核苷酸的調(diào)節(jié)或功能基序或元件，例如源自雙粒病毒組的基序或元件；-術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指通過遺傳操作技術(shù)獲得的植物，并包括通過這些技術(shù)所獲得的整株植物、在其基因組中已經(jīng)整合了這類操作或表達(dá)這類操作的再生植物、其后代以及植物器官，例如根、莖和葉。按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以具有不同的倍性水平，特別可以是多倍體、二倍體或單倍體；-術(shù)語“繁殖體”是指植物細(xì)胞團(tuán)塊或一類植物細(xì)胞，它可以具有或沒有一定的結(jié)構(gòu)，它能夠再生完整植株，例如外植體、愈傷組織、莖、葉、根、插條和甚至種子。
本發(fā)明的申請(qǐng)人已經(jīng)采用了不同于先前討論的PCT申請(qǐng)的申請(qǐng)人所采用的方法。具體地說，本發(fā)明的申請(qǐng)人已經(jīng)令人驚奇地成功制得嵌合啟動(dòng)子，所述嵌合啟動(dòng)子使得有可能滿足上述需求，特別是使得有可能在宿主細(xì)胞中、特別是在植物細(xì)胞中，相對(duì)于最常用的現(xiàn)有啟動(dòng)子而言提高編碼要產(chǎn)生的多肽的基因或核酸序列的表達(dá)水平。而且本申請(qǐng)人同時(shí)已經(jīng)成功地制得各種各樣的啟動(dòng)子，以便能夠按照本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想的用途及其實(shí)現(xiàn)環(huán)境選擇適宜于使用、并因此使得能夠以某種方式控制待表達(dá)的、編碼需要產(chǎn)生的多肽的待表達(dá)基因的表達(dá)水平的啟動(dòng)子。應(yīng)用這一原理的一個(gè)實(shí)例是使用本發(fā)明較弱的啟動(dòng)子之一，以指導(dǎo)和/或控制蛋白或酶的表達(dá)，所述蛋白或酶例如為用于植物選擇的因子，例如對(duì)抗生素或除草劑的抗性，或例如裝配更重要的蛋白所需的輔酶或輔因子；并且使用按照本發(fā)明的一種較強(qiáng)的啟動(dòng)子，例如以控制具有治療效應(yīng)的多肽的表達(dá)。
本發(fā)明的再一優(yōu)點(diǎn)是，按照本發(fā)明制備的啟動(dòng)子既允許在種子中進(jìn)行特異性表達(dá)，又允許進(jìn)行去調(diào)節(jié)，以便適合在其它器官例如葉、莖和植物維管系統(tǒng)中的表達(dá)，因此，本發(fā)明的一個(gè)主要的主題是嵌合啟動(dòng)子，所述嵌合啟動(dòng)子包含至少一個(gè)衍生自高分子量小麥麥谷蛋白編碼基因的核酸序列，最好是衍生自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的小麥Dx5或Bx7基因的核酸序列。
優(yōu)選所述嵌合啟動(dòng)子包含至少一個(gè)衍生自高分子量小麥麥谷蛋白編碼基因、序列鑒定號(hào)為SEQ.ID01的核酸序列。
更優(yōu)選衍生自高分子量小麥麥谷蛋白的編碼基因的核酸序列對(duì)應(yīng)于選自以下的序列鑒定號(hào)的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
另外，本申請(qǐng)人注意到，有可能通過采用衍生自以上限定的高分子量小麥麥谷蛋白編碼基因的核酸序列，將一定數(shù)目的調(diào)節(jié)或功能框組合，構(gòu)建啟動(dòng)子，特別是在雙子葉植物和單子葉植物中均具有有利啟動(dòng)子活性的植物啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題是嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，它包含一段衍生自高分子量小麥麥谷蛋白編碼基因的核酸序列，并且它在3’位置包含一個(gè)“TATA”框和一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)。
優(yōu)選所述啟動(dòng)子也包含至少一個(gè)在所述“TATA”框和所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)上游5’位置中功能性連接的“增強(qiáng)子”框。
更優(yōu)選所述啟動(dòng)子也包含至少一個(gè)在所述“增強(qiáng)子”框上游5’位置中功能性連接的“G樣”框。
甚至更優(yōu)選所述啟動(dòng)子也包含至少一個(gè)在所述“增強(qiáng)子”框上游5’位置中功能性連接的“P樣”框。
有利的是，所述啟動(dòng)子也包含至少一個(gè)在至少所述“增強(qiáng)子”框上游5’位置中功能性連接的“GATA”框。
優(yōu)選所述啟動(dòng)子也包含至少一個(gè)在所述“增強(qiáng)子”框上游5’位置中功能性連接的禾谷類框。
甚至更優(yōu)選所述啟動(dòng)子在所述“增強(qiáng)子”框上游5’位置中也包含兩個(gè)連續(xù)的功能性連接的禾谷類框。
按照本發(fā)明啟動(dòng)子的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，它們也包含在所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5’位置中功能性連接的至少一個(gè)“as1”框或至少一個(gè)“as2”框、或一個(gè)“as1/as2”或“as2/as1”的框組合或這些框的重復(fù)排列(repeat permutation)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述“as1”框、“as2”框、“as1/as2”或“as2/as1”框組合或它(它們)的重復(fù)排列功能性地連接于所述增強(qiáng)子框下游3’位置中。
按照本發(fā)明的再一優(yōu)選實(shí)施方案，所述啟動(dòng)子也包含一個(gè)功能性連接于所述“增強(qiáng)子”框上游的“GC”框。
特別優(yōu)選所述啟動(dòng)子包含兩個(gè)在所述“增強(qiáng)子[lacuna]”框上游5’位置中功能性連接的“禾谷類”框，而所述“增強(qiáng)子[lacuna]”框本身功能性連接于“as2/as1”框上游5’位置中。
按照本發(fā)明啟動(dòng)子的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，它們包含至少一個(gè)以反向功能性連接和/或在所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游3’位置中功能性連接的選自以下組的元件“增強(qiáng)子”框、“G樣”框、“P樣”框、“GATA”框、“禾谷類”框、任選重復(fù)的“as1”框、“as2”框和/或“as1/as2”或“as2/as1”框組合以及“富GC”框。
最后，按照本發(fā)明的嵌合啟動(dòng)子有利地包含至少一個(gè)選自以下的核酸序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
本發(fā)明再一主題是表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含至少一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列，所述啟動(dòng)子核酸序列衍生自高分子量小麥麥谷蛋白的編碼基因，并且以功能方式與待表達(dá)的、編碼所要產(chǎn)生的多肽的核酸序列連接，而所述核酸序列本身連接于一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止核酸序列。
優(yōu)選該表達(dá)盒包含至少一個(gè)衍生自序列鑒定號(hào)為SEQ.ID01的高分子量小麥麥谷蛋白編碼基因的啟動(dòng)子核酸序列。
甚至更優(yōu)選所述表達(dá)盒包含至少一個(gè)衍生自高分子量小麥麥谷蛋白的編碼基因、選自以下序列鑒定號(hào)的啟動(dòng)子核酸序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
本發(fā)明的另一主題是分離的啟動(dòng)子核酸序列，其特征在于，它對(duì)應(yīng)于衍生自序列鑒定號(hào)為SEQ.ID01的一段序列。
優(yōu)選所述分離的啟動(dòng)子核酸序列對(duì)應(yīng)于選自以下序列鑒定號(hào)的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
本發(fā)明的另一主題是包含啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列的載體，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列能夠啟動(dòng)編碼要產(chǎn)生的多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，所述載體的特征在于，所述啟動(dòng)子或所述啟動(dòng)子核酸序列對(duì)應(yīng)于如上限定的嵌合啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列。
優(yōu)選所述載體選自鑒定號(hào)為pMRT1207、pMRT1177、pMRT1178、pMRT1179、pMRT1180和pMRT1181的雙元載體。
本發(fā)明的再一主題是轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)在其基因組中穩(wěn)定整合了至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)如上限定的啟動(dòng)子核酸序列。
最好是所述轉(zhuǎn)基因植物選自雙子葉植物物種，例如馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油料種子、甜菜或向日葵；或單子葉植物物種，例如小麥、大麥、燕麥、水稻或玉米。
本發(fā)明的另一主題是如上限定的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體，該繁殖體最好是種子。
本發(fā)明的再一主題是含有如上限定的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列的細(xì)胞，所述細(xì)胞最好是植物細(xì)胞。
在本發(fā)明的優(yōu)選主題中，還有在細(xì)胞中表達(dá)編碼待產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟-用包含如上限定的至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；-在允許編碼所述多肽的核酸序列或基因表達(dá)的條件下制備所述細(xì)胞的培養(yǎng)物。
最好是，待產(chǎn)生的所述多肽是酶或蛋白，或是蛋白的衍生物，它在體外和/或人體內(nèi)和/或動(dòng)物體內(nèi)有活性，所述活性包括消化活性、胰腺活性、膽汁活性、抗病毒活性、抗炎活性、肺部活性、抗微生物活性、營(yíng)養(yǎng)活性、化妝品活性和結(jié)構(gòu)活性、在血液、心血管、眼、抗原性和免疫刺激活性方面的活性、以及在腦中的活性。這類蛋白的實(shí)例是例如胰島素、干擾素、胃、胰腺或膽汁脂酶、彈性蛋白酶、諸如α-1抗胰蛋白酶的抗蛋白酶、諸如膠原蛋白的結(jié)構(gòu)形成蛋白、諸如乳鐵蛋白的運(yùn)鐵蛋白、血液衍生蛋白諸如人血紅蛋白或人白蛋白、和血液輔因子，以及諸如超氧化物歧化酶的抗氧化劑。
優(yōu)選用于該方法中的所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
甚至更優(yōu)選所述細(xì)胞是選自微生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的細(xì)胞，甚至更優(yōu)選是植物細(xì)胞。
最后，本發(fā)明的另一主題是獲得如上限定的轉(zhuǎn)基因植物或繁殖體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟-用包含如上限定的至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；-選擇整合了所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列的植物細(xì)胞；-或者在培養(yǎng)物中，或者通過再生嵌合的或轉(zhuǎn)基因的整株植株，繁殖所述經(jīng)轉(zhuǎn)化并經(jīng)選擇的植物細(xì)胞。
在


圖1中，它們是包含始于完整啟動(dòng)子的一系列缺失的構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子源自小麥并且編碼一種高分子量小麥麥谷蛋白的Dx5基因；和包含元件重復(fù)序列的一系列構(gòu)建體，所述元件包含與一個(gè)“G樣”框結(jié)合的一個(gè)“增強(qiáng)子”框。
-圖2圖解說明按照本發(fā)明的其它合成和嵌合的啟動(dòng)子的構(gòu)建體，含有包含混合“as2/as1”框的調(diào)節(jié)和/或功能元件的插入；-圖3圖解說明按照本發(fā)明的其它合成和嵌合的啟動(dòng)子的構(gòu)建體，含有包含混合“as2/as2/as1”框的調(diào)節(jié)和/或功能元件的插入；-圖4圖解說明按照本發(fā)明的其它合成和嵌合的啟動(dòng)子的構(gòu)建體，含有包含單獨(dú)的或結(jié)合“as2/as1”框的混合“禾谷類”框的調(diào)節(jié)和/或功能元件的插入和一種包含“富GC”框的構(gòu)建物，所述“禾谷類”框源自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的Bx7基因；-圖5代表已經(jīng)用載體轉(zhuǎn)化并且在組織化學(xué)分析后的煙草葉照片，所述載體含有功能性連接于GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)編碼基因的上述啟動(dòng)子或[lacuna]核酸序列，藍(lán)色斑點(diǎn)顯示存在用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并且因此顯示存在所述啟動(dòng)子的活性；-圖6和圖7是在玉米胚乳中瞬時(shí)表達(dá)后與各種構(gòu)建體相關(guān)的啟動(dòng)子活性比較的圖。轟擊后3天，研磨所述胚乳，然后通過離心澄清粗提取物。通過發(fā)光術(shù)對(duì)一等份粗提取物測(cè)量β-葡糖醛酸糖苷酶活性和螢光素酶活性，然后確定GUS活性/LUC活性之比。直方圖對(duì)應(yīng)于相同構(gòu)建體的平均比率+/-平均標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。
-圖8顯示在傳粉后30天(30 DAP)玉米胚乳中穩(wěn)定表達(dá)中MPr1139、MPr1200和MPr1131的啟動(dòng)子活性與512γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子活性比較的圖。分別通過發(fā)光術(shù)和光譜測(cè)定法，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白總量。直方圖對(duì)應(yīng)于每株植株的逐粒種子測(cè)定的GUS活性/總蛋白的平均比率+/-平均標(biāo)準(zhǔn)誤。標(biāo)明了每個(gè)轉(zhuǎn)化體的名稱。
-圖9顯示在玉米胚乳的穩(wěn)定表達(dá)中由啟動(dòng)子MPr1139控制的時(shí)間(temporal)β-葡糖醛酸糖苷酶活性。通過發(fā)光術(shù)和光譜測(cè)定法，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白總量。直方圖對(duì)應(yīng)于植株151.C1不同發(fā)育階段的逐粒種子測(cè)定的GUS活性/總蛋白的平均比率+/-平均標(biāo)準(zhǔn)誤。
-
圖10a顯示13 DAP時(shí)一粒玉米種子的縱向切片，
圖10b顯示20 DAP時(shí)一粒玉米種子的縱向切片，而
圖10c是一粒解剖的玉米種子的頂部平面圖。所有圖表明在玉米種子的穩(wěn)定表達(dá)中通過組織化學(xué)染色(藍(lán)色)顯現(xiàn)的在啟動(dòng)子MPr1139控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，而字母表示如下E(胚)；Em(胚乳)；AC(糊粉細(xì)胞)；P(粒殼)。
-
圖11顯示一曲線圖，比較傳粉后18天(18 DAP)時(shí)第一代玉米種子(T1)與第二代轉(zhuǎn)基因玉米種子(T2)中的MPr1139啟動(dòng)子活性。分別通過發(fā)光術(shù)和光譜測(cè)定法，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白總量。直方圖對(duì)應(yīng)于每株植株逐粒種子測(cè)定的GUS活性/總蛋白的平均比率+/-平均標(biāo)準(zhǔn)誤。標(biāo)明了每個(gè)轉(zhuǎn)化體的名稱。
-
圖12顯示一曲線圖，比較了在溫室適應(yīng)后3周玉米葉片的穩(wěn)定表達(dá)中MPr1139、MPr1200和MPr1131的啟動(dòng)子活性與512γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子的活性。分別通過發(fā)光術(shù)和光譜測(cè)定法，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白總量。直方圖對(duì)應(yīng)于在不同玉米葉片的葉片中測(cè)定的GUS活性/總蛋白的比率。標(biāo)明了每個(gè)轉(zhuǎn)化體的名稱。
-
圖13顯示一曲線圖，比較了在溫室適應(yīng)后發(fā)育11周階段時(shí)煙草葉片的穩(wěn)定表達(dá)中MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139的啟動(dòng)子活性與參比啟動(dòng)子CaMV D35S和HMWG-Dx5的啟動(dòng)子活性。分別通過發(fā)光術(shù)和光譜測(cè)定法，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白總量。直方圖對(duì)應(yīng)于在不同煙草植物的葉片中測(cè)定的GUS活性/總蛋白的比率。
-
圖14顯示一曲線圖，比較了在第一代成熟煙草種子的穩(wěn)定表達(dá)中MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139的啟動(dòng)子活性promotrice與參比啟動(dòng)子CaMV D35S的啟動(dòng)子活性。分別通過發(fā)光術(shù)和光譜測(cè)定法，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白總量。直方圖對(duì)應(yīng)于在不同煙草植物的種子中測(cè)定的GUS活性/總蛋白的比率。
在以下詳細(xì)描述中，按照供應(yīng)商N(yùn)ew England Biolabs的建議，進(jìn)行用限制性酶和DNA修飾酶進(jìn)行的酶處理。借助于“QIAquick PCRPurification”(QIAGEN)或“Concert Rapid PCR純化系統(tǒng)”(GIBCOBRL Life Technologies)或如有具體說明，借助于“QIAquick凝膠提取系統(tǒng)”(QIAGEN)或“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”(GIBCO BRL LifeTechnologies)試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明，在每種酶處理后，系統(tǒng)純化所述DNA。所用的“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀由PerkinElmer Applied Biosystems出售。
實(shí)施例實(shí)施例1用于比較的構(gòu)建體(對(duì)照)為了能夠比較本專利中描述的嵌合啟動(dòng)子，將編碼b-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1986)、含有馬鈴薯patatin基因ST-LS1的內(nèi)含子IV2的序列(Vancanneyt等，1990)的uidA基因(uidA-IV2)置于Promega Corp.(Madison，USA)出售的質(zhì)粒pGEM3Z中所述參比啟動(dòng)子之一和根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂堿合酶基因終止子(term-nos)的控制之下。
1.1.陰性對(duì)照pMRT1144的構(gòu)建缺乏任何啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒pMRT1144用作陰性對(duì)照。它衍生自質(zhì)粒pGEM3Z，在其中已經(jīng)引入了序列“uidA-IV2/term-nos”。
首先，5μg質(zhì)粒pBI221(Clonetech，CA，USA)用限制性酶EcoRI和BamHI于37℃消化1小時(shí)。然后借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離在胭脂堿合酶終止子控制下的uidA序列。
在平行實(shí)驗(yàn)中，5μg質(zhì)粒pGEM3Z用限制性酶對(duì)EcoRI和BamHI于37℃消化1小時(shí)。然后借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離所述載體片段，然后用40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)在緩沖液3(1X)存在下于37℃去磷酸化1小時(shí)。
在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，用如此處理的50ng“uidA-IV2/term-nos”片段和100ng質(zhì)粒pGem3Z在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。該反應(yīng)由10℃30秒的一個(gè)循環(huán)和200個(gè)相同的循環(huán)構(gòu)成，所述每個(gè)相同的循環(huán)由以下步驟組成30℃30秒、10℃30秒和30℃30秒。用所有所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB，10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用胰胨、5g/l酵母提取物、10g/lNaCl，pH7.2和15g/l瓊脂)上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法(Bimboim和Doly，1983)進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。所得的質(zhì)粒稱為pGEM3Z/uidA/term-nos。
其次，為了將馬鈴薯patatin基因的192bp內(nèi)含子IV2插入pGEM3Z/uidA/term-nos的uidA編碼序列中，切下該基因的內(nèi)部部分(710 bp SnaBI/BstBI片段)，然后用含內(nèi)含子IV2的等同序列(902 bpSnaBI/BstBI片段)取代。
為了完成這一步，10μg質(zhì)粒pGEM3Z/uidA/term-nos用SnaBI(位于uidA基因的ATG起始密碼子下游位置+383bp的限制位點(diǎn))于37℃消化1小時(shí)，然后用BstBI(位于位置+1093bp的位點(diǎn))于65℃消化1小時(shí)。借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離由此缺失所述710bp片段的質(zhì)粒，然后用40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)在緩沖液3(1X)存在下于37℃去磷酸化1小時(shí)。
通過用限制性酶SnaBI(位于uidA基因的ATG起始密碼子下游位置+383bp的限制位點(diǎn))將10μg質(zhì)粒p35S GUS INT(Vancanneyt等，1990)于37℃消化1小時(shí)，然后用限制性酶BstBI(位于位置+1285bp的位點(diǎn))于37℃消化1小時(shí)，獲得對(duì)應(yīng)于內(nèi)含子IV2序列后接uidA序列的902bp BstBI/SnaBI片段。然后借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1％瓊脂糖凝膠上分離所述902bp片段。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此處理的100ng載體pGEM3Z/uidA/term-nos片段和50ng所述902bp BstBI/SnaBI片段在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。所得的質(zhì)粒稱為pMRT1144。
1.2.陽性對(duì)照pMRT1218的構(gòu)建為了具有玉米胚乳SN 87 165(L2)中的啟動(dòng)子的參比序列，將Reina等(1990)描述的質(zhì)粒p63中含有的1.7kb完整的g-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子(Prg-zein)置于序列uidA-IV2/term-nos的上游。
通過用限制性酶HindIII和BamHI將15μg質(zhì)粒p63于37℃消化1小時(shí)，獲得1.7 kb g-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離由此釋放的1.7kbPrg-zein片段。
在平行實(shí)驗(yàn)中，也用限制性酶HindIII和BamHI將10μg質(zhì)粒pMRT1126(描述于實(shí)施例3的3.4一節(jié))于37℃消化1小時(shí)。然后借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離所述載體片段，然后用40 U牛小腸堿性磷酸酶(New EnglandBiolabs)在緩沖液3(1X)存在下于37℃去磷酸化1小時(shí)。
如上所還，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此處理的50ng g-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子片段和100ng質(zhì)粒pMRT1126在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。所得的質(zhì)粒稱為pMRT1218。
1.3.陽性對(duì)照pMRT1092的構(gòu)建為了具有煙草(Nicotiana tabacum L.，PBD6栽培品種)光合作用組織中的啟動(dòng)子的參比序列，將花椰菜花葉病毒的雙35S啟動(dòng)子(CaMVPrD35S)置于序列uidA-IV2/term-nos的上游。
首先，如1.1一節(jié)中所述，將馬鈴薯patatin基因的192bp內(nèi)含子IV2插入uidA編碼序列的位置+383bp。為了做到這一點(diǎn)，1μg質(zhì)粒pBI221(Clontech，CA，USA)用SnaBI于37℃消化1小時(shí)30分鐘，然后用BstBI于65℃消化1小時(shí)30分鐘。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離缺乏710bp片段的質(zhì)粒，然后在Qiaquick親和柱上純化。在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，用20ng量的BstBI/SnaBI pBI221載體和80ng如上所述源自p35SGUS INT的902bp BstBI/SnaBI片段在10μl反應(yīng)混合物中于18℃連接過夜。用一半的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。所得的質(zhì)粒稱為pBI221/uidA-IV2。
其次，用序列“CaMV PrD35S”取代質(zhì)粒pBI221/uidA-IV2中存在的CaMV 35S啟動(dòng)子序列。質(zhì)粒pBI221/uidA-IV2用HindIII于37℃小時(shí)消化10小時(shí)30分鐘，然后用Klenow片段(New England Biolabs)于37℃處理30分鐘，將粘性末端制成平端。然后該反應(yīng)產(chǎn)物用BamHI于37℃消化過夜。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離對(duì)應(yīng)于缺失828bp CaMV35S啟動(dòng)子片段的載體的質(zhì)粒DNA片段，然后在Qiaquick親和柱上純化。
在平行實(shí)驗(yàn)中，由質(zhì)粒pJIT163D中獲得CaMV D35S啟動(dòng)子。該質(zhì)粒衍生自質(zhì)粒pJIT163，質(zhì)粒pJIT163本身衍生自質(zhì)粒pJIT160(Guérineau和Mullineaux，1993)。質(zhì)粒pJIT163在多接頭的HindIII和SalI位點(diǎn)之間具有一個(gè)ATG密碼子。為了缺失該ATG，并獲得質(zhì)粒pJIT163D，pJIT163質(zhì)粒DNA用HindIII和SalI消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上純化，電洗脫，在1/10體積的3M乙酸鈉pH4.8和2.5體積無水乙醇存在下于-80℃下沉淀30分鐘，將其于12,000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，經(jīng)過Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘，通過用1體積苯酚抽提、然后用1體積苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1v/v/v)抽提，最后用1體積氯仿/異戊醇(24/1v/v)抽提而去蛋白，在1/10體積3M乙酸鈉pH4.8和2.5體積無水乙醇存在下于-80℃進(jìn)行沉淀30分鐘，然后將其于12,000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，最后在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和2.5單位T4 DNA連接酶(Amersham)存在下于14℃連接16小時(shí)。轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。接著，將10μg質(zhì)粒pJIT163D用KpnI(位于該啟動(dòng)子5’的位點(diǎn))于37℃消化10小時(shí)30分鐘，然后用6單位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)于37℃處理30分鐘，將粘性末端制成平端。然后該反應(yīng)產(chǎn)物用BamHI于37℃消化過夜。在1％瓊脂糖凝膠上分離所產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)于CaMV D35S啟動(dòng)子的761bp DNA片段，然后在Qiaquick親和柱上純化。在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，用10ng的質(zhì)粒載體和100ng所述761bp片段在10μl反應(yīng)混合物中于18℃連接過夜。用一半的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。所得的質(zhì)粒稱為pMRT1092。
1.3.參比質(zhì)粒pCaMV35Sluc的描述在瞬時(shí)表達(dá)中用作內(nèi)部參比的質(zhì)粒是pCaMV35Sluc(Torrent等，1997)，它含有在CaMV 35S啟動(dòng)子和RNA終止子控制下的螢光素酶(luc)報(bào)道基因的表達(dá)盒。
實(shí)施例2.
含有高分子量小麥麥谷蛋白基因的完整啟動(dòng)子序列和缺失或重復(fù)啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒的構(gòu)建六倍體普通小麥Cheyenne栽培品種(Triticum aestivum L.cvCheyenne)的編碼Dx5亞基(也稱為GluD1-1b)的高分子量麥谷蛋白基因的完整啟動(dòng)子(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))(Anderson等，1989)，對(duì)應(yīng)于范圍為位置-378bp至位置+39bp的417bp序列(登錄號(hào)X12928)，在該序列上鑒定了不同的潛在調(diào)節(jié)序列，將其相對(duì)于+1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以5’一側(cè)向3’一側(cè)列出(圖I)-一個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框，從位置-357延伸至位置-350bp，-兩個(gè)GATA框，從位置-309延伸至位置-306bp，以及從位置-292延伸至位置-289bp，-一個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框，從位置-252延伸至位置-246bp，-一個(gè)8bp“G樣”框，從位置-218延伸至位置-211bp，-一個(gè)38bp激活元件，從位置-186延伸至位置-149bp，由推定的順式激活基序的嵌合體組成·一個(gè)谷醇溶蛋白框，從位置-182延伸至位置-176bp，·一個(gè)具有不完全對(duì)稱性的序列，從位置-178延伸至位置-161bp，·在位置-176和-163bp之間的一個(gè)五核苷酸GCTCC的正向重復(fù)序列，·一個(gè)“E”框，從位置-172延伸至位置-167[lacuna]，·在位置-169和-158bp之間的一個(gè)五核苷酸TTGCT的正向重復(fù)序列，-一個(gè)“TATA”框，從位置-30至-24具有共有序列TATAAAA[lacuna]，-+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(位置1)，-一個(gè)5’非翻譯區(qū)，范圍為從位置+1至位置+39bp。
為了研究上述各種推定的順式激活元件的作用，對(duì)HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)進(jìn)行詳細(xì)的功能分析。將uidA-IV2報(bào)道基因置于完整的HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的控制之下以及置于合成HMWG-Dx5(SEQ.ID01)啟動(dòng)子的控制之下，所述合成HMWG-Dx5(SEQ.ID01)啟動(dòng)子或者具有越來越多的5’區(qū)缺失、或內(nèi)部缺失或一個(gè)內(nèi)部部分的重復(fù)。
2.1.質(zhì)粒pMRT1125的構(gòu)建質(zhì)粒pMRT1125是將所述高分子量麥谷蛋白基因(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)，圖I)的完整啟動(dòng)子克隆在uidA-IV2報(bào)道基因上游的結(jié)果，并且構(gòu)建在該專利中描述的所有合成HMWG-Dx5(SEQ.ID01)啟動(dòng)子的參比構(gòu)建體。通過按照常規(guī)克隆技術(shù)將表達(dá)盒“PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)/uidA/term-nos”引入到pUC19質(zhì)粒(Stratagene)中，獲得由Anderson等描述的HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)。將10μg所得的質(zhì)粒(pPUC19-HMWG)用EcoRI于37℃水解1小時(shí)，然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M二硫蘇糖醇(DTT)存在下，用20 U Klenow片段(New EnglandBiolabs)于37℃作用30分鐘。然后所述DNA用BamHI于37℃消化1小時(shí)，借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由此釋放和處理的HMWG-Dx5啟動(dòng)子片段(SEQ.ID01)。
在平行實(shí)驗(yàn)中，由質(zhì)粒pMRT1097(未公布的法國(guó)專利申請(qǐng)F(tuán)R9903635)制備所述載體片段。將20μg質(zhì)粒pMRT1097用SphI于37℃消化1小時(shí)，并且用6單位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)于37℃處理30分鐘，將如此線性化的載體pMRT1097的粘性末端制成平端。然后該反應(yīng)產(chǎn)物用BamHI水解，借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離所述載體片段，然后40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)在緩沖液3(1X)存在下，于37℃去磷酸化1小時(shí)。所得的克隆載體稱為pGEM3Z-1。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此處理的HMWG-Dx5啟動(dòng)子片段(SEQ.ID01)和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1在10μl反應(yīng)混合物中于16℃連接過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1125，并且通過測(cè)序確證了HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)(在
圖1中用圖顯示)。
2.2.MPr1128啟動(dòng)子的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-238上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框和所述兩個(gè)GATA框，從PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)衍生MPR1128啟動(dòng)子(SEQ.ID04)。在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’各100pmol，通過PCR從5ng pMRT1125基質(zhì)DNA(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))擴(kuò)增所述啟動(dòng)子片段。在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于50℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離衍生自該擴(kuò)增的DNA片段，用EcoRI于37℃水解1小時(shí)，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mMTris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。然后將如此處理的DNA用BamHI于37℃消化1小時(shí)。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此處理的MPR1128啟動(dòng)子片段(SEQ.ID04)和50ng質(zhì)粒pGEM3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在10μl反應(yīng)混合物中于16℃連接過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1128，并且通過測(cè)序確證了在圖I中圖示的MPR1128啟動(dòng)子序列(SEQ.ID04)。
2.3.MPr1127啟動(dòng)子(SEQ.ID03)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-205上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框和所述兩個(gè)GATA框以及“G”框，從HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)衍生MPr1127啟動(dòng)子(SEQ.ID03)。以與MPR1128啟動(dòng)子(SEQ.ID04)相同的方式(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))，通過PCR擴(kuò)增和處理所述啟動(dòng)子片段，只是使用的兩種寡脫氧核苷酸是含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1127，并且通過測(cè)序確證了在圖I中圖示的MPr1127啟動(dòng)子序列(SEQ.ID03)。
2.4.MPr1126啟動(dòng)子(SEQ.ID02)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-142上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框、兩個(gè)GATA框、“G”框和所述激活元件，從HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)衍生MPr1126啟動(dòng)子(SEQ.ID02)。以與MPR1128啟動(dòng)子(SEQ.ID04)相同的方式(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))，通過PCR擴(kuò)增和處理所述啟動(dòng)子片段，只是所使用的兩種寡脫氧核苷酸是含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1126，并且通過測(cè)序確證了在圖I中圖示的MPr1126啟動(dòng)子序列(SEQ.ID02)。
2.5.MPr1183中間啟動(dòng)子的構(gòu)建通過將XbaI限制位點(diǎn)插入MPR1128啟動(dòng)子(SEQ.ID04)(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))上游，得到MPr1183啟動(dòng)子。在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)存在下，借助于兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI和XbaI限制位點(diǎn)的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’各100pmol，通過PCR從5ng pMRT1128基質(zhì)DNA擴(kuò)增所述啟動(dòng)子片段。在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于50℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。
借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離衍生自該擴(kuò)增的DNA片段，用EcoRI于37℃水解1小時(shí)，然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(NeWEngland Biolabs)于37℃作用30分鐘，并用BamHI于37℃消化1小時(shí)。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此處理的MPR1128啟動(dòng)子片段和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在10μl反應(yīng)混合物中于16℃連接過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，在dNTPs各15nmol、Taq DNA聚合酶緩沖液(1X)、75nmol MgCl2和1.25U Taq DNA聚合酶(Promega Corp.)存在下，在50μl反應(yīng)體積中，通過PCR借助于以下兩種寡脫氧核苷酸各25pmol進(jìn)行分析5’ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’。在“GeneAmpPCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性30秒，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1183，并且通過測(cè)序確證了MPr1183啟動(dòng)子序列。
2.6.MPr1197啟動(dòng)子(SEQ.ID16)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-57bp上游的啟動(dòng)子序列，從MPr1183(描述于實(shí)施例2的2.5一節(jié))衍生MPr1197啟動(dòng)子(SEQ.ID16)，構(gòu)成本專利中研究的最小HMWG-Dx5(SEQ.ID01)啟動(dòng)子。
為了完成這一步，連續(xù)用XbaI和NcoI將5μg質(zhì)粒pMRT1183于37℃消化1小時(shí)。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離由此缺失MPr1183啟動(dòng)子的XbaI/NcoI片段的載體pMRT1183，然后在dNTPs各60nmol、12μl 550mMTris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用150ng如此修飾的質(zhì)粒在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并通過酶消化進(jìn)行確證。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1197，在圖I中圖式說明了MPr1197啟動(dòng)子序列(SEQ.ID16)。
2.7.MPr1198啟動(dòng)子(SEQ.ID17)的構(gòu)建通過缺失從位置-59延伸至位置-135bp的內(nèi)部啟動(dòng)子序列，從MPR1128啟動(dòng)子(SEQ.ID04)(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))衍生MPr1198啟動(dòng)子(SEQ.ID17)，該序列缺乏以上鑒定的順式激活元件。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U VentDNA聚合酶(NeW England Biolabs)存在下，借助于兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI和XbaI限制位點(diǎn)的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有NcoI限制位點(diǎn)的5’CATgCCATggCCAACACAAAAgAAgCTgg 3’各100pmol，通過PCR從5ng pMRT1128基質(zhì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增一個(gè)片段，將所擴(kuò)增的片段融合于pMRT1183(描述于實(shí)施例2的2.5一節(jié))的NcoI限制位點(diǎn)，構(gòu)建MPr1198啟動(dòng)子。在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性10分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述擴(kuò)增得到的DNA片段，將其連續(xù)用NcoI和XbaI于37℃水解1小時(shí)。
在平行實(shí)驗(yàn)中，通過缺失位于NcoI限制位點(diǎn)5’的MPr1183啟動(dòng)子區(qū)，由質(zhì)粒pMRT1183制備所述載體片段。為了完成這一步，連續(xù)用XbaI和NcoI將5μg質(zhì)粒pMRT1183于37℃消化1小時(shí)，借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離pMRT1183的所述載體片段，然后在緩沖液3(1X)存在下，用40 U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用50ng所述啟動(dòng)子片段和100ng如此處理的質(zhì)粒在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并用酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1198，通過測(cè)序確證了在圖I中圖示的MPr1198啟動(dòng)子序列(SEQ.ID17)。
2.8.MPr1216啟動(dòng)子(SEQ.ID21)的構(gòu)建通過重復(fù)從核苷酸-225延伸至-136bp的序列，該序列包含所述“G”框和所述激活元件，從MPR1128(SEQ.ID04)(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))衍生MPr1216啟動(dòng)子(SEQ.ID21)。
該序列的構(gòu)建通過在載體pGEM3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))中克隆以下兩種啟動(dòng)子片段來進(jìn)行-“MPr1216(SEQ.ID21)5’片段”，該序列通過PCR合成，即在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有XbaI限制位點(diǎn)的5’gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3’各100pmol，通過PCR從5ng pMRT1128基質(zhì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性10分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述PCR擴(kuò)增得到的DNA片段，將其用EcoRI于37℃水解1小時(shí)。在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2緩沖液和6μl1M DTT存在下，所述DNA片段用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘，并用XbaI于37℃消化1小時(shí)。-“MPr1216(SEQ.ID21)3’片段”，借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離用限制性酶XbaI和BamHI水解5μg質(zhì)粒pMRT1183所獲得的該片段。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此處理的50ng“MPr1216(SEQ.ID21)5’片段”和50ng“MPr1216(SEQ.ID21)3’片段”和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各10 pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1216，通過測(cè)序確證了在圖I中圖示的MPr1216啟動(dòng)子序列(SEQ.ID21)。
2.9.MPr1217啟動(dòng)子(SEQ.ID22)的構(gòu)建通過正向重復(fù)三次從核苷酸-225延伸至-136bp的序列，該序列包含所述“G”框和所述激活元件，從MPR1128(SEQ.ID04)(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))衍生MPr1217啟動(dòng)子(SEQ.ID22)。
將通過在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2UVent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pml的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI和XbaI限制位點(diǎn)的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有XbaI限制位點(diǎn)的5’gCTCTAgACCAACACAAAAgAagCTgg 3’，通過PCR從5ng基質(zhì)DNA合成的兩個(gè)相同的啟動(dòng)子片段，插入pMRT1183(描述于實(shí)施例2的2.5一節(jié))的XbaI限制位點(diǎn)中，構(gòu)建MPr1217啟動(dòng)子(SEQ.ID22)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性10分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘30秒，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述PCR擴(kuò)增得到的DNA片段，將其用XbaI于37℃水解1小時(shí)。
在平行實(shí)驗(yàn)中，通過于37℃對(duì)位于MPr1183 5’的XbaI限制位點(diǎn)酶促消化1小時(shí)，由10μg質(zhì)粒pMRT1183制備所述載體片段。如此線性化的所述載體片段在緩沖液3(1X)存在下，用40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在1X T4DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，用50ng啟動(dòng)子片段和100ng如此制備的載體片段在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各10pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1217，通過測(cè)序確證的在圖I中圖示的MPr1217啟動(dòng)子序列(SEQ.ID22)，在“G”樣框上游4bp的位置-317[lacuna]缺失一個(gè)C。
實(shí)施例3含嵌合啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒的構(gòu)建3.1.MPr1130啟動(dòng)子(SEQ.ID05)的構(gòu)建通過在PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)的位置-65bp，插入對(duì)應(yīng)于CaMV 35S的重復(fù)的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的55bp序列，產(chǎn)生MPr1130啟動(dòng)子(SEQ.ID05)。通過將經(jīng)PCR合成的“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”和“MPr1130(SEQ.ID05)3’片段”重疊延伸而進(jìn)行剪接，構(gòu)建MPr1130啟動(dòng)子(SEQ.ID05)。
在dNTPs各10nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各20pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有對(duì)應(yīng)于CaMV35S的重復(fù)的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的55 bp序列的5’TgCgTCATCCCTTACgTCAgTggAgATATCACATCAATCTTgATATCACATCAATCACggTgAggTTTgTTTAgCCTAAg 3’，通過PCR從5ng pUC19-HMWG基質(zhì)DNA(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在50μl反應(yīng)體積中擴(kuò)增“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmpPCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。在dNTPs各20nmol存在下，40μl所述PCR反應(yīng)介質(zhì)然后經(jīng)過12.5U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用10分鐘。借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離如此處理的PCR產(chǎn)物。
以與“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”的相同方式，合成并處理“MPr1130(SEQ.ID05)3’片段”，只是所用的兩種寡脫氧核苷酸是具有對(duì)應(yīng)于CaMV 35S的重復(fù)的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的55bp序列的5’ATTgATgTgATATCAAgATTgATgTgATATCTCCACTgACgTAAgggATgACgCACACgCAgCCATggTCCTgAACCTTC 3’和含有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’。
然后通過重疊延伸，裝配所述“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”和所述“MPr1130(SEQ.ID05)3’片段”，產(chǎn)生“MPr1130片段(SEQ.ID05)”。為了完成這一步，在dNTPs各10nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各20pmol的寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，用各7.5μl的如此處理的所述兩種PCR產(chǎn)物在50μl反應(yīng)體積中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離如此合成的“MPr1130片段(SEQ.ID05)”。然后該片段用EcoRI于37℃水解1小時(shí)，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。最后用BamHI于37℃消化MPr1130片段(SEQ.ID05)1小時(shí)。
在1μl T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，用100ng如此處理的“MPr1130片段(SEQ.ID05)”和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在10μl反應(yīng)混合物中，于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各25pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1130，通過測(cè)序確證了在圖III中圖示的MPr1130啟動(dòng)子序列(SEQ.ID05)。
3.2.MPr1131啟動(dòng)子(SEQ.ID06)的構(gòu)建通過在PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))的位置-65bp，插入對(duì)應(yīng)于CaMV 35S的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的38bp序列，產(chǎn)生MPr1131啟動(dòng)子(SEQ.ID06)。通過將經(jīng)PCR合成的“MPr1131(SEQ.ID06)5’片段”和“MPr1131(SEQ.ID06)3’片段”重疊延伸而進(jìn)行剪接，構(gòu)建MPr1131啟動(dòng)子(SEQ.ID06)。
以與“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”(描述于實(shí)施例3的3.1一節(jié))相同的方式，合成并處理“MPr1131(SEQ.ID06)5’片段”，只是所用的兩種寡脫氧核苷酸是含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有對(duì)應(yīng)于CaMV35S的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的38bp序列的5’TgCgTCATCCCTTACgTCAgTggAgATATCACATCAATCACggTgAggTTTgTTTAgCCTAAg 3’。
以與“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”(描述于實(shí)施例3的3.1一節(jié))的相同方式，合成并處理“MPr1131(SEQ.ID06)3’片段”，只是所用的兩種寡脫氧核苷酸是具有對(duì)應(yīng)于CaMV 35S的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的38bp序列的5’ATTgATgTgATATCTCCACTgACgTAAgggATgACgCACACgCAgCCATggTCCTgAACCTTC 3’和含有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’。
然后通過重疊延伸，裝配所述“MPr1131(SEQ.ID06)5’片段”和所述“MPr1131(SEQ.ID06)3’片段”，產(chǎn)生“MPr1131片段(SEQ.ID06)”。為了完成這一步，在dNTPs各10nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各20pmol的寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，用各7.5μl的如此處理的所述兩種PCR產(chǎn)物，在50μl反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離如此合成的“MPr1131片段(SEQ.ID06)”。然后該片段用EcoRI于37℃水解1小時(shí)，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。最后用BamHI于37℃消化MPr1131片段(SEQ.ID06)1小時(shí)。
在1μl T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，用100ng如此處理的“MPr1130片段(SEQ.ID05)”和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在10μl反應(yīng)混合物中，于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各25 pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1131，通過測(cè)序確證了在圖II中圖示的MPr1131啟動(dòng)子序列(SEQ.ID06)。
3.3.MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-293上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框和兩個(gè)GATA框，從MPr1130啟動(dòng)子(SEQ.ID05)(描述于實(shí)施例3的3.1一節(jié))衍生MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR從5ng pMRT1130基質(zhì)DNA擴(kuò)增所述啟動(dòng)子片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行1分鐘。
借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在2％瓊脂糖凝膠上分離由所述擴(kuò)增得到DNA片段，該片段用EcoRI于37℃水解1小時(shí)，然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(NewEngland Biolabs)于37℃作用30分鐘。然后，如此處理的DNA片段用BamHI于37℃消化1小時(shí)。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此處理的MPR1135啟動(dòng)子片段(SEQ.ID09)和50ng質(zhì)粒pGEM3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在10μl反應(yīng)混合物中，于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各25pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTITgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1135，通過測(cè)序確證了在圖III中圖示的MPr1135啟動(dòng)子序列(SEQ.ID09)。
3.4.MPr1138啟動(dòng)子(SEQ.ID012)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-276上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框和兩個(gè)GATA框，從MPr1131啟動(dòng)子(SEQ.ID06)(描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié))衍生MPr1138啟動(dòng)子(SEQ.ID12)。
以與MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)(描述于實(shí)施例3的3.3一節(jié))相同的方式，通過PCR從5ng pMRT1131基質(zhì)DNA擴(kuò)增、處理并獲得所述啟動(dòng)子片段。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1138，通過測(cè)序確證了在圖II中圖示的MPr1138啟動(dòng)子序列(SEQ.ID12)。
3.5.MPr1137啟動(dòng)子(SEQ.ID11)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-243上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框、兩個(gè)GATA框和“G”樣框，從MPr1131啟動(dòng)子(SEQ.ID06)(描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié))衍生MPr1137啟動(dòng)子(SEQ.ID11)。
以與MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)(描述于實(shí)施例3的3.3一節(jié))相同的方式，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’，通過PCR從5ng pMRT1131基質(zhì)DNA擴(kuò)增、處理并獲得所述啟動(dòng)子片段。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1137，通過測(cè)序確證了在圖II中圖示的MPr1137啟動(dòng)子序列(SEQ.ID11)。
3.6.MPr1134啟動(dòng)子(SEQ.ID08)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-260上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框、兩個(gè)GATA框和“G”樣框，從MPr1130啟動(dòng)子(SEQ.ID05)(描述于實(shí)施例3的3.1一節(jié))衍生MPr1134啟動(dòng)子(SEQ.ID08)。
以與MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)(描述于實(shí)施例3的3.3一節(jié))相同的方式，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’，通過PCR從5ng pMRT1130基質(zhì)DNA擴(kuò)增、處理并獲得所述啟動(dòng)子片段。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1134，通過測(cè)序確證了在圖III中圖示的MPr1134啟動(dòng)子序列(SEQ.ID08)。
3.7.MPr1136啟動(dòng)子(SEQ.ID10)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-180上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框、兩個(gè)GATA框、“G”樣框和激活元件，從MPr1131啟動(dòng)子(SEQ.ID06)(描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié))衍生MPr1136啟動(dòng)子(SEQ.ID10)。
以與MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)(描述于實(shí)施例3的3.3一節(jié))相同的方式，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR從5ng pMRT1131基質(zhì)DNA擴(kuò)增、處理并獲得所述啟動(dòng)子片段。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1136，通過測(cè)序確證了在圖II中圖示的MPr1136啟動(dòng)子序列(SEQ.ID10)。
3.8.MPr1133啟動(dòng)子(SEQ.ID07)的構(gòu)建通過缺失位于核苷酸-197上游的序列，該序列包含兩個(gè)谷醇溶蛋白“樣”框、兩個(gè)GATA框、“G”樣框和激活元件，從MPr1130啟動(dòng)子(SEQ.ID05)(描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié))衍生MPr1133啟動(dòng)子(SEQ.ID07)。
以與MPr1135啟動(dòng)子(SEQ.ID09)(描述于實(shí)施例3的3.3一節(jié))相同的方式，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR從5ng pMRT1130基質(zhì)DNA擴(kuò)增、處理并獲得所述啟動(dòng)子片段。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1133，通過測(cè)序確證了在圖III中圖示的MPr1133啟動(dòng)子序列(SEQ.ID07)。
3.9.MPr1139啟動(dòng)子(SEQ.ID13)的構(gòu)建通過在MPr1131(SEQ.ID06)(描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié))的位置-405bp，插入一段61bp的序列，該序列包括六倍體小麥普通小麥Cheyenne栽培品種的編碼Bx7亞基的高分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子(PrHMWG-Bx7)(Anderson等，1998)的“禾谷類”框的重復(fù)，產(chǎn)生MPr1139啟動(dòng)子(SEQ.ID13)。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)和兩個(gè)上述的“禾谷類”框的5’TACgAATTCCTCgACATggTTAgAAgTTTTgAgTgCCgCCACTACTCgACATggTTAgAAgTTTTgAgTggCCgTAgATTTgC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR從5ng pMRT1131基質(zhì)DNA擴(kuò)增MPr1139啟動(dòng)子(SEQ.ID13)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行1分鐘。
借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒，在2％瓊脂糖凝膠上分離由所述擴(kuò)增得到DNA片段，該片段用EcoRI于37℃水解1小時(shí)。然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2緩沖液和6μl 1MDTT存在下，所述DNA片段用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘，然后用BamHI于37℃消化1小時(shí)。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此處理的MPr1139啟動(dòng)子片段(SEQ.ID13)和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))在10μl反應(yīng)混合物中，于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各25pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1139，通過測(cè)序確證了在圖IV中圖示的MPr1139啟動(dòng)子序列(SEQ.ID13)。
3.10.MPr1200啟動(dòng)子(SEQ.ID19)的構(gòu)建通過在MPr1138(SEQ.ID12)(描述于實(shí)施例3的3.4一節(jié))的位置-263bp，插入一段79bp的序列，該序列包括六倍體小麥普通小麥Cheyenne栽培品種的編碼Bx7亞基的高分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子(PrHMWG-Bx7)(Anderson等，1998)的“禾谷類”框的重復(fù)，產(chǎn)生MPr1200啟動(dòng)子(SEQ.ID19)。
MPr1200啟動(dòng)子(SEQ.ID19)的構(gòu)建通過在載體pGEM3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))中克隆以下兩種啟動(dòng)子片段來進(jìn)行-“MPr1200(SEQ.ID19)5’片段”，該序列通過PCR合成，即在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’TACgAATTCCTCgACATgg 3’和具有XbaI限制位點(diǎn)的5’gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3’，通過PCR從5ng pMRT1139基質(zhì)DNA(描述于實(shí)施例3的3.9一節(jié))進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性10分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述PCR擴(kuò)增得到的DNA片段，將其用EcoRI于37℃水解1小時(shí)。在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，所述DNA片段用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘，然后用XbaI于37℃消化1小時(shí)。-“MPr1200(SEQ.ID19)3’片段”，該序列通過PCR合成，即在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在與“MPr1200(SEQ.ID19)5’片段”相同的條件下，在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)和XbaI限制位點(diǎn)的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR從5ng pMRT1138基質(zhì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述PCR擴(kuò)增得到的DNA片段，將其連續(xù)用XbaI和BamHI于37℃水解1小時(shí)。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此處理的50ng“MPr1200(SEQ.ID19)5’片段”、50ng“MPr1200(SEQ.ID19)3’片段”和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各10pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1200，通過測(cè)序確證了在圖IV中圖示的MPr1200啟動(dòng)子序列(SEQ.ID19)。
3.11.MPr1213啟動(dòng)子(SEQ.ID20)的構(gòu)建通過在MPR1128(SEQ.ID04)(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))的位置-225bp上游，插入一段79bp的序列，該序列包括六倍體小麥普通小麥Cheyenne栽培品種的編碼Bx7亞基的高分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子(PrHMWG-Bx7)(Anderson等，1998)的“禾谷類”框的重復(fù)，產(chǎn)生MPr1213啟動(dòng)子(SEQ.ID20)。
MPr1213啟動(dòng)子(SEQ.ID20)的構(gòu)建通過在載體pGEM3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))中克隆以下兩種啟動(dòng)子片段來進(jìn)行-“MPr1213(SEQ.ID20)5’片段”，該序列通過PCR合成，即在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有EcoRI限制位點(diǎn)的5’TACgAATTCCTCgACATgg 3’和具有XbaI限制位點(diǎn)的5’gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3’，通過PCR從5ng pMRT1139基質(zhì)DNA(描述于實(shí)施例3的3.9一節(jié))進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性10分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行5分鐘。借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述PCR擴(kuò)增得到的DNA片段，將其用EcoRI于37℃水解1小時(shí)。在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，所述DNA片段用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘，并用XbaI于37℃消化1小時(shí)。-“MPr1213(SEQ.ID20)3’片段”，借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離用XbaI和BamHI限制性酶水解5μg質(zhì)粒pMRT1183(描述于實(shí)施例2的2.5一節(jié))所獲得的該片段。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此處理的50ng“MPr1213(SEQ.ID20)5’片段”和50ng“MPr1213(SEQ.ID20)3’片段”和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各10pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’TACgAATTCCTCgACATgg 3’和5’gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1213，通過測(cè)序確證了在圖IV中圖示的MPr1213啟動(dòng)子序列(SEQ.ID20)。
3.12.MPr1199啟動(dòng)子(SEQ.ID18)的構(gòu)建通過在MPR1128(SEQ.ID04)(描述于實(shí)施例2的2.2一節(jié))的位置-224bp，插入一段27bp的序列，該序列包括玉米條紋病毒(MSV)的基因間隔區(qū)的“富GC”元件(Fenoll等，1990)，產(chǎn)生MPr1199啟動(dòng)子(SEQ.ID18)。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶緩沖液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的兩種寡脫氧核苷酸-含有上述“富GC”元件以及EcoRI和XabI限制位點(diǎn)的5’ATCGGAATTCAAATGGGCCGGACCGGGCCGGCCCAGCGCCGATTACGTGGCTTTAGC 3’和具有BamHI限制位點(diǎn)的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR從5ngpMRT1128基質(zhì)DNA擴(kuò)增MPr1199啟動(dòng)子(SEQ.ID18)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行。在于94℃變性5分鐘后，所述DNA經(jīng)過25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成于94℃變性1分鐘，于55℃雜交1分鐘和于72℃延伸1分鐘30秒。在最后一個(gè)循環(huán)中，延伸反應(yīng)于72℃繼續(xù)進(jìn)行1分鐘。
借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離由所述擴(kuò)增得到DNA片段，該片段用EcoRI于37℃水解1小時(shí)。然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，所述片段用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘，然后用BamHI于37℃消化1小時(shí)。
在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在上述條件下，用100ng如此處理的MPr1199啟動(dòng)子片段(SEQ.ID18)和50ng質(zhì)粒pGem3Z-1(描述于實(shí)施例2的2.1一節(jié))通過PCR循環(huán)進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，借助于各25pmol的兩種寡脫氧核苷酸5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通過PCR進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1199mut；通過測(cè)序確證的相應(yīng)的MPr1199(SEQ.ID18)mut啟動(dòng)子序列，在非翻譯前導(dǎo)序列中的位置+27[lacuna]具有一個(gè)突變。為了重新建立未突變的MPr1199序列(SEQ.ID18)，克隆從位置-251延伸至-58bp的“MPr1199(SEQ.ID18)5’片段”，以取代從位置-225延伸至-58bp的“MPr11835’片段”。
為了完成這一步，用EcoRI將10μg質(zhì)粒pMRT1199mut于37℃消化1小時(shí)，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。在用NcoI于37℃消化1小時(shí)后，借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在1.5％瓊脂糖凝膠上分離“MPr1199(SEQ.ID18)5’片段”。
在平行實(shí)驗(yàn)中，用XbaI將5μg質(zhì)粒pMRT1183(描述于實(shí)施例2的2.5一節(jié))于37℃消化1小時(shí)，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH 7.5/500mM MgCl2緩沖液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。在用NcoI消化后，借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離如此缺失“MPR11835’片段”的載體pMRT1183，然后在緩沖液3(1X)存在下，用40U牛小腸堿性磷酸酶(New EnglandBiolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，在T4DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用100ng“MPr1199(SEQ.ID18)mut 5’片段”和50ng如此處理的質(zhì)粒pMRT1183在10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并通過酶消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1199，在圖IV中圖示了MPr1199啟動(dòng)子序列(SEQ.ID18)。
實(shí)施例4用于煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的含MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1092啟動(dòng)子的雙元質(zhì)粒的構(gòu)建4.1.雙元質(zhì)粒pMRT1177的構(gòu)建通過將pMRT1130(描述于實(shí)施例3的3.一節(jié))的表達(dá)盒“MPr1130(SEQ.ID05)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1118(未公布的專利申請(qǐng)F(tuán)R 9911112)的EcoRI位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1177。
為了完成這一步，連續(xù)用EcoRI和XmnI于37℃將10μg質(zhì)粒pMRT1130消化1小時(shí)。然后，借助于“ConcertRapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離所述表達(dá)盒。
在平行實(shí)驗(yàn)中，用EcoRI將10μg雙元質(zhì)粒pMRT1118于37℃消化1小時(shí)。然后，在緩沖液3(1X)存在下，用40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃將所述線性化載體片段去磷酸化1小時(shí)。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用50ng所述表達(dá)盒和100ng如此處理的質(zhì)粒pMRT1118在10μl反應(yīng)混合物中，于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并且用酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1177，按照Holsters等(1978)描述的技術(shù)，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。通過在補(bǔ)充利福平(50mg/l)和卡那霉素(50mg/l)的2YT培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用胰胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl，pH7.2和15g/l瓊脂)上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照通過將溶菌酶(25mg/ml)加入細(xì)胞再懸浮緩沖液中而修改的堿裂解法進(jìn)行提取。用酶促消化分析質(zhì)粒DNA，所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1177。
4.2.雙元質(zhì)粒pMRT1178的構(gòu)建如實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述，通過將表達(dá)盒“MPr1131(SEQ.ID06)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1118的EcoRI位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1178，只是從質(zhì)粒pMRT1131(描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié))分離所述表達(dá)盒。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1178，按照以上實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1178。
4.3.雙元質(zhì)粒pMRT1179的構(gòu)建如實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述，通過將表達(dá)盒“MPr1135(SEQ.ID09)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1118的EcoRI位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1179，只是從質(zhì)粒pMRT1135(描述于實(shí)施例3的3.3一節(jié))分離所述表達(dá)盒。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1179，按照以上實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1179。
4.4.雙元質(zhì)粒pMRT1180的構(gòu)建如實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述，通過將表達(dá)盒“MPr1138(SEQ.ID12)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1138的EcoRI位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1180，只是從質(zhì)粒pMRT1138(描述于實(shí)施例3的3.4一節(jié))分離所述表達(dá)盒。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1180，按照以上實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1180。
4.5.雙元質(zhì)粒pMRT1181的構(gòu)建如實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述，通過將表達(dá)盒“MPr1139(SEQ.ID13)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1118的EcoRI位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1181，只是從質(zhì)粒pMRT1139(描述于實(shí)施例3的3.9一節(jié))分離所述表達(dá)盒。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1181，按照以上實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1181。
4.6.雙元質(zhì)粒pMRT1182的構(gòu)建通過將CaMV PrD35S啟動(dòng)子片段和序列uidA-IV2/term-nos插入雙元質(zhì)粒pMRT1118中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1182。
通過連續(xù)用KpnI和HindIII于37℃將10μg質(zhì)粒pJIT163D消化1小時(shí)，分離CaMVPrD35S。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離對(duì)應(yīng)于CaMVPrD35S的743bp片段，然后借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒將其純化。
通過用HindIII和EcoRI于37℃將4μg質(zhì)粒pMRT1092消化1小時(shí)，獲得序列uidA-IV2/term-nos。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離對(duì)應(yīng)于序列uidA-IV2/term-nos的2.2kb片段，然后借助于“QIAquick凝膠提取”試劑盒將其純化。
在平行實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)用KpnI和EcoRI將10μg雙元質(zhì)粒pMRT1118于37℃消化1小時(shí)。然后，在緩沖液3(1X)存在下，用40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃將所述線性化載體片段去磷酸化1小時(shí)。
在T4 DNA連接酶緩沖液(1X)和400單位T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)存在下，在100ng雙元質(zhì)粒、50ng所述CaMVPrD35S片段和50 ng對(duì)應(yīng)于序列uidA-IV2/term-nos的片段存在下，在20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行連接反應(yīng)。如上所述在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中通過PCR循環(huán)進(jìn)行所述溫育。用一半的所述連接反應(yīng)介質(zhì)轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并且用酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1182，按照以上實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404中。所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1182。
實(shí)施例5用于玉米穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的含MPr1139啟動(dòng)子(SEQ.ID13)的雙元質(zhì)粒pMRT1207的構(gòu)建通過將pMRT1139的表達(dá)盒“MPr1139(SEQ.ID13)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1195(未公布的專利申請(qǐng)F(tuán)R9911112)的HpaI位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1207。
為了完成這一步，連續(xù)用EcoRI和XmnI于37℃將7μg質(zhì)粒pMRT1139消化1小時(shí)。然后，借助于“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.7％瓊脂糖凝膠上分離所述表達(dá)盒，并且在dNTPs各60nmol、12μl MgCl2緩中液(500mM)和6μl DTT(IM)存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。
在平行實(shí)驗(yàn)中，用HpaI將5μg雙元質(zhì)粒pMRT1195于37℃消化1小時(shí)。然后，在緩沖液3(1X)存在下，用40U牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃將所述線性化載體片段去磷酸化1小時(shí)。
如上所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，通過PCR循環(huán)，用100ng所述表達(dá)盒和10ng如此處理的質(zhì)粒pMRT1195進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已經(jīng)預(yù)先制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5a細(xì)菌。通過在補(bǔ)充卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并且用酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒稱為pMRT1207，按照實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404-pSB1中，該菌株衍生自根癌土壤桿菌菌株LBA4404，按照上述用于產(chǎn)生A1177的方案，在質(zhì)粒pSB1(未公布的專利申請(qǐng)F(tuán)R9911112)整合后，而得到根癌土壤桿菌菌株LBA4404-pSB1。通過在補(bǔ)充利福平(50mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和四環(huán)素(5mg/l)的2YT培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照通過將溶菌酶(25mg/ml)加入細(xì)胞再懸浮緩沖液中而修改的堿裂解法進(jìn)行提取。用酶促消化分析質(zhì)粒DNA，所獲得的土壤桿菌克隆稱為A1207。
實(shí)施例6在玉米和煙草中不同啟動(dòng)子在瞬時(shí)表達(dá)中活性的測(cè)定和比較6.1植物提取物的制備6.1.1.玉米種子的產(chǎn)生和制備在24℃、60％濕度和16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗的光周期的人工氣候室中，培育玉米植株，在從所述玉米植株取出的玉米胚乳SN 87 165(L2)上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
在傳粉后12天(DAP)，取下玉米，將其在攪拌下在20％domestos浴中消毒5分鐘。在除去domestos并且在無菌去離子水中連續(xù)漂洗后，在無菌條件下小心地除去粒殼和糊粉細(xì)胞層。制備如此提取的胚乳的切向切片，并將其置于浸泡在基本murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS5524，Sigma)中的濾紙上。
6.1.2.煙草的體外培養(yǎng)、葉片的制備在6周大的煙草(Nicotiana tabacum L.)栽培品種PBD6的葉片上，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。煙草栽培品種PBD6的成熟種子在次氯酸鈣(70 g/l)的飽和溶液中消毒10分鐘，然后在無菌去離子水中漂洗3次，每次5分鐘。將經(jīng)消毒的種子置于MS20培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)上，并且在培養(yǎng)室(24℃恒溫、光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中溫育6周。
為了在通過基因槍法進(jìn)行轉(zhuǎn)化期間最大限度地減小對(duì)葉肉細(xì)胞的破壞，在轉(zhuǎn)化之前24小時(shí)從6周大的PBD6煙草植株取下2片主要葉片，葉片上表面(upper side)面向上置于BY3溫和質(zhì)壁分離培養(yǎng)基(4.4g/l MS-5519鹽、100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素、200mg/l KH2PO4、30g/l蔗糖、45.5g/l山梨醇、1mg/l 2，4-D、8g/l瓊脂，pH5.8)上，并且置于培養(yǎng)室(25℃恒溫、光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中。
6.2.鎢微?；蚪鹞⒘Ｉ系馁|(zhì)粒DNA的吸收通過基因槍進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要將DNA預(yù)先沉積到由鎢或金制成的球形微粒上，并且在無水乙醇(99.98％，含有低于0.02％的水)中消毒10分鐘，在無菌去離子水中洗滌4次，并且于-20℃保存在50％甘油溶液中最多達(dá)4周。
將轉(zhuǎn)化期間所用的所有對(duì)照和受試質(zhì)粒的濃度調(diào)至1mg/ml。在采用發(fā)光術(shù)測(cè)定(luminometric assay)評(píng)估所研究的啟動(dòng)子活性的每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，用一種內(nèi)部參比對(duì)照(pCaMV35Sluc)進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，以便將不同實(shí)驗(yàn)之間的GUS活性的變化歸一化(Leckie等，1994)。然而，當(dāng)用組織化學(xué)測(cè)定測(cè)量所研究的啟動(dòng)子活性時(shí)，不用所述參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。
在無菌層流室中將所述DNA包被到如此制備的微粒上。將1.8mg等份的無菌微粒在30μl 50％甘油中的懸浮液通過渦旋劇烈混合1分鐘，然后與20μl含有5μg待測(cè)試質(zhì)粒之一和2μg參比質(zhì)粒pCaMV35Sluc的DNA懸浮液一起混合10秒。然后加入20μl 2.5MCaCl2，并且劇烈混合10秒。接著，將20μl 0.1M亞精胺加入混合物中，將所有該混合物通過渦旋再攪拌30秒。通過將該混合物在冰上保溫15分鐘，繼續(xù)將所述DNA包被到所述珠粒上，然后將包被的珠粒低速離心5秒，并且在無水乙醇中洗滌2次。將如此包被的微粒沖重新懸浮于32μl無水乙醇中，通過渦旋劇烈混合15秒，然后立即作為4個(gè)相同的等份分配到已經(jīng)按照生產(chǎn)商的建議(Bio-Rad，Hercule，USA)制備的PDS-1000/He基因槍(Biolistic)系統(tǒng)的無菌“微載體”盤上?！皫в形⒘３练e物的微載體支持體/微載體”裝置干燥5分鐘。
6.3.通過基因槍法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物提取物6.3.1.轟擊玉米胚乳和瞬時(shí)表達(dá)用PDS-1000/He基因槍系統(tǒng)，按照供應(yīng)商(Bio-Rad，Hercule，USA)關(guān)于該設(shè)備各種元件的處理和裝配的一般建議，對(duì)玉米胚乳進(jìn)行轟擊。按照以下射擊特征，用直徑為0.6μm的鎢微粒連續(xù)2次轟擊每個(gè)胚乳-選擇用以加速微粒的氦壓為6200kPa(900psi)，-將植物樣品置于距離珠粒加速區(qū)6cm之處，-在27mm汞的減壓氛圍下進(jìn)行射擊。
在轟擊后，將胚乳留在相同條件下，在26℃培養(yǎng)室中于黑暗中溫育24小時(shí)，以使得可以瞬時(shí)表達(dá)引入所述細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因。
6.3.2.轟擊煙草葉片組織和瞬時(shí)表達(dá)除以下兩點(diǎn)以外，以與轟擊玉米胚乳的相同方式，對(duì)煙草葉片進(jìn)行轟擊-用直徑為1μm的金微粒轟擊樣品，-將樣品置于距離珠粒加速區(qū)9cm之處。
在轟擊后，將葉片留在相同條件下，在培養(yǎng)室(25℃恒溫、光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中溫育48小時(shí)，以使得可以瞬時(shí)表達(dá)引入所述細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因。
6.4.通過組織化學(xué)染色顯示并評(píng)估各種啟動(dòng)子的活性6.4.1.β-葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)的顯示如Jeffersson等(1987)所述，通過組織化學(xué)染色進(jìn)行b-葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)的顯示。在培養(yǎng)室中溫育期后，在0.1M磷酸緩沖液、0.05％Triton X100，pH 7.0中的β-葡糖醛酸糖苷酶底物X-Gluc(500mg/l 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸)存在下，將植物提取物于37℃溫育24小時(shí)。
染色后，直接分析玉米胚乳，或?qū)⑵溆?℃無菌保存數(shù)周，而使煙草葉片連續(xù)2次通過95％乙醇浴，時(shí)間分別為3小時(shí)和12小時(shí)，使煙草葉片除色素，然后在蒸餾水中漂洗，并且干燥兩張玻璃紙之間的平面。
通過估計(jì)每種植物提取物上顯示的藍(lán)色斑點(diǎn)的數(shù)目和強(qiáng)度，評(píng)估不同構(gòu)建體的啟動(dòng)子活性。
6.4.2.在玉米胚乳中所述啟動(dòng)子活性的定量評(píng)估b-葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)的組織化學(xué)顯示，使得有可能鑒定出三類啟動(dòng)子-用pMRT1197、pMRT1126、pMRT1127和pMRT1199構(gòu)建體轟擊的胚乳，系統(tǒng)地表現(xiàn)出低于10個(gè)的多個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)。在用pMRT1197構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的胚乳上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明MPr1197(SEQ.ID16)的96 bp序列構(gòu)成了HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的最小啟動(dòng)子序列，它能夠在玉米胚乳中指導(dǎo)基本的轉(zhuǎn)錄活性。在用缺乏啟動(dòng)子序列的pMPRT1144構(gòu)建體(陰性對(duì)照)轟擊的胚乳上沒有藍(lán)色斑點(diǎn)，證明了歸入該類別的啟動(dòng)子的功能性。
-用pMRT1128、pMRT1213、pMRT1216、pMRT1217、pMRT1136、pMRT1137、pMRT1135和pMRT1138構(gòu)建體轟擊的胚乳，表現(xiàn)出的藍(lán)色斑點(diǎn)平均數(shù)等于用pMRT1125(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))和pMRT1218(Pre-zein，陽性對(duì)照)構(gòu)建體轟擊的胚乳表現(xiàn)出的藍(lán)色斑點(diǎn)平均數(shù)。
-最后，用pMRT1130、pMRT1131、pMRT1139和pMRT1200構(gòu)建體轟擊的胚乳表現(xiàn)出強(qiáng)的彌散的藍(lán)色染色，這使得難以對(duì)藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，但這得出暗示MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)啟動(dòng)子在傳粉后12天時(shí)在玉米胚乳中的活性非常高。
6.4.3.煙草葉片中所述啟動(dòng)子活性的定量評(píng)估在用pMRT1125(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))、pMRT1130、pMRT1131、pMRT1133、pMRT1134、pMRT1135、pMRT1136、pMRT1137、pMRT1138和pMRT1092(CaMV PrD35S，陽性對(duì)照)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的煙草葉片上進(jìn)行的組織化學(xué)測(cè)定的結(jié)果在圖5中給出，所述結(jié)果使得有可能將所研究的啟動(dòng)子分為4類。在用pMRT1125(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))構(gòu)建體轟擊的葉片上沒有觀察到藍(lán)色斑點(diǎn)。用pMRT1133、pMRT1134、pMRT1136和pMRT1137構(gòu)建體轟擊的葉片表現(xiàn)出藍(lán)色斑點(diǎn)的平均數(shù)在50和100之間。用pMRT1135、pMRT1138和pMRT1139構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的葉片(結(jié)果未顯示)表現(xiàn)出相當(dāng)多數(shù)目的藍(lán)色斑點(diǎn)，這與在用參比構(gòu)建體pMRT1092(CaMV PrD35S)轟擊的葉片上觀察到的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)相當(dāng)。最后，用pMRT1130和pMRT1131構(gòu)建體轟擊的葉片表現(xiàn)出的彌散的強(qiáng)藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)目比用參比構(gòu)建體pMRT1092(CaMV PrD35S)轟擊的葉片上的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)多得多。
根據(jù)這些結(jié)果，可以得出幾點(diǎn)基本信息-CaMV 35S as-1和as-2激活序列將HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.OD01)在煙草葉片中的活性去調(diào)節(jié)，-CaMV 35S as-1和as-2激活序列與HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)中存在的順式調(diào)節(jié)基序協(xié)同作用。“G”樣框看來是這種聯(lián)合控制的關(guān)鍵元件之一。GATA框與“G”樣框和CaMV 35S as-1和as-2激活序列結(jié)合，大概負(fù)責(zé)MPr1130(SEQ.ID05)和MPr1131(SEQ.ID06)的非常高的活性，-將CaMV 35S as-2激活序列重復(fù)不提供顯著的額外的正效應(yīng)，-“禾谷類框”與CaMV 35S as-1和as-2激活序列結(jié)合，看來提供在煙草葉片中的負(fù)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。
總之，由于CaMV D35S啟動(dòng)子在文獻(xiàn)中常常被報(bào)道為是一種嵌合啟動(dòng)子，它提供GUS報(bào)道基因的啟動(dòng)子活性的增加，其提供的活性比CaMV 35S啟動(dòng)子所提供的活性高約8-12倍(Kay等，1987)，因此MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1139(SEQ.ID13)、MPr1130(SEQ.ID05)和MPr1131(SEQ.ID06)啟動(dòng)子肯定是迄今描述的在煙草葉片中活性最強(qiáng)的嵌合啟動(dòng)子。
在煙草葉片中活性較弱的MPr1133(SEQ.ID07)、MPr1134(SEQ.ID08)、MPr1136(SEQ.ID10)和MPr1137(SEQ.ID11)啟動(dòng)子也有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兛梢灾笇?dǎo)抗性基因的表達(dá)，以允許以與例如“nos”型啟動(dòng)子相同的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的選擇。
6.5.通過β-葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)的發(fā)光術(shù)測(cè)定定量測(cè)定玉米胚乳中各種啟動(dòng)子的活性將先前通過基因槍法轉(zhuǎn)化的胚乳在液氮中冷凍，并且借助于固定在鉆子上的玻棒進(jìn)行研磨。然后以每250mg組織1ml緩沖液的比率，將粉末在提取緩沖液(25mM Tris磷酸鹽，pH7.8、2mM二硫蘇糖醇、2mM 1，2-二氨基環(huán)己烷、N，N，N’N’-四乙酸、10％甘油、 1％Triton X100)中解凍。在通過以16060g離心5分鐘進(jìn)行澄清之前，將混合物勻漿，然后于4℃溫育1小時(shí)。
借助于“GUS-光化學(xué)發(fā)光報(bào)道基因測(cè)定”檢測(cè)試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)，按照生產(chǎn)商的建議，在10μl澄清的粗提取物上測(cè)定GUS活性。用Lumat LB 9507發(fā)光計(jì)(EGG-Berthold，Bad Wildbad，德國(guó))進(jìn)行光發(fā)射的測(cè)量。
在平行實(shí)驗(yàn)中，借助于“螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)”檢測(cè)試劑盒(PromegaCorp.，Madison，USA)，按照生產(chǎn)商的建議，在10μl澄清的粗提取物上測(cè)定螢光素酶活性。借助于置于4℃冷房中的Lumat LB 9507發(fā)光計(jì)進(jìn)行光發(fā)射的測(cè)量。
結(jié)果在圖6和圖7中給出。對(duì)于每種測(cè)定(3個(gè)半個(gè)胚乳＝一個(gè)粗提取物)，計(jì)算用發(fā)光計(jì)測(cè)定的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和螢光素酶活性之間的比率。確定每種構(gòu)建體的至少5個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。
為了分析該專利中描述的對(duì)每種所述啟動(dòng)子進(jìn)行的各種修飾的效應(yīng)，將所述啟動(dòng)子分為兩個(gè)不同的組。組I(圖6)由使得有可能對(duì)HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)進(jìn)行詳細(xì)的功能分析的啟動(dòng)子組成，而組II(圖7)含有使得有可能確定在該專利中研究的不同順式激活元件結(jié)合HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的效應(yīng)的啟動(dòng)子。
組I含有MPr1128、MPr1127(SEQ.ID03)、MPr1126(SEQ.ID02)、MPr1197(SEQ.ID16)、MPr1198(SEQ.ID17)、MPr1216(SEQ.ID21)和MPr1217(SEQ.ID22)啟動(dòng)子、HMWG-Dx5參比啟動(dòng)子(SEQ.ID01)和缺乏啟動(dòng)子序列的參比構(gòu)建體pMRT1144(陰性對(duì)照)(圖6)。發(fā)光術(shù)測(cè)定的結(jié)果使得有可能得出幾種觀察結(jié)果-逐漸缺失HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的5’區(qū)導(dǎo)致這些啟動(dòng)子提供的平均相對(duì)活性的逐漸降低。完整的417 bp的PrHMWG-Dx5啟動(dòng)子序列(SEQ.ID01)因此看來是為了提供HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)最大活性所需的。
-在MPR1128(SEQ.ID04)和PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)啟動(dòng)子之間記錄的活性的輕微差異表明，位于核苷酸-238上游的序列不含負(fù)責(zé)HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)活性的主要順式激活元件。
-MPR1128(SEQ.ID04)和MPr1127(SEQ.ID03)啟動(dòng)子之間的活性的顯著降低所得到的提示是，位于核苷酸-205上游、含有一個(gè)“G”樣框的序列對(duì)于HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)活性起重要作用。
-MPr1127(SEQ.ID03)和MPr1126(SEQ.ID02)啟動(dòng)子之間記錄的活性的輕微差異不能得到關(guān)于所述增強(qiáng)子元件的真正作用的結(jié)論。
-MPr1197(SEQ.ID16)啟動(dòng)子的活性非常弱，但比用不含啟動(dòng)子的pMRT1144構(gòu)建體獲得的活性強(qiáng)，這表明96bp的最小PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)序列提供基本的轉(zhuǎn)錄水平。
-與MPR1128(SEQ.ID04)相比MPr1198(SEQ.ID17)的活性弱，表明從核苷酸-59延伸至核苷酸-135的PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)序列雖然缺乏推定的順式激活元件，但在HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的活性中起主要作用。這一結(jié)果暗示，所述反式激活因子對(duì)“G”框和對(duì)所述激活元件的功能性以及作為結(jié)果的可及性，取決于它們與TATA框分開的距離。
-將帶有“G”框和所述激活元件的從核苷酸-136延伸至核苷酸-225的MPR1128(SEQ.ID04)序列重復(fù)，在MPr1216啟動(dòng)子(SEQ.ID21)上提供b-葡糖醛酸糖苷酶活性，該活性至少與PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)所指導(dǎo)的活性一樣高。相反，在MPr1217啟動(dòng)子(SEQ.ID22)中將這一相同的序列三份復(fù)制，沒有任何額外的相加作用。
組II含有MPr1128、MPr1213(SEQ.ID20)、MPr1199(SEQ.ID18)、MPr1136(SEQ.ID10)、MPr1137(SEQ.ID11)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)啟動(dòng)子、HMWG-Dx5參比啟動(dòng)子(SEQ.ID01)和用作陽性對(duì)照的g-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子(圖7)。利用用與組I啟動(dòng)子的相同方式，所述發(fā)光術(shù)測(cè)定的結(jié)果使得有可能得出幾種觀察結(jié)果-在HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)和HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)衍生物的位置-65bp融合CaMV 35S as-2(Lam和Chua，1989)和as-1(Lam等，1989)激活序列，非常強(qiáng)地增強(qiáng)了所產(chǎn)生的MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1136(SEQ.ID10)、MPr1137(SEQ.ID11)、MPr1135(SEQ.ID09)和MPr1138(SEQ.ID12)啟動(dòng)子的活性。作為說明，MPr1131(SEQ.ID06)和MPr1130(SEQ.ID05)啟動(dòng)子的活性比HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)分別高3.2倍和3.8倍。
-CaMV 35S as-2和as-1激活序列與HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的順式激活元件協(xié)同作用。MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1137(SEQ.ID11)和MPr1136(SEQ.ID10)啟動(dòng)子活性的逐漸降低分別與HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的逐漸5’缺失同時(shí)發(fā)生，證實(shí)了這一點(diǎn)。
-將MPr1130(SEQ.ID05)和MPr1135(SEQ.ID09)啟動(dòng)子分別與MPr1131(SEQ.ID06)和MPr1138(SEQ.ID12)啟動(dòng)子比較，表明將CaMV 35S as-2激活序列重復(fù)不產(chǎn)生顯著的相加激活效應(yīng)。
-在MPr1131(SEQ.ID06)和MPr1138(SEQ.ID12)啟動(dòng)子上游融合六倍體小麥普通小麥Cheyenne栽培品種的編碼Bx7亞基的高分子量麥谷蛋白基因(Anderson等，1998)啟動(dòng)子的“禾谷類框”，大大提高了所產(chǎn)生的MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)啟動(dòng)子的活性。作為說明，MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)的活性比HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的活性高大約5.5倍。
-對(duì)應(yīng)于在MPr1128啟動(dòng)子上游融合“禾谷類框”的MPr1213(SEQ.ID20)的活性弱，暗示“禾谷類框”與CaMV 35S as-2和as-1激活序列協(xié)同作用，以便增強(qiáng)MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)啟動(dòng)子的活性。
-最后，在MPR1128(SEQ.ID04)啟動(dòng)子上游融合玉米條紋病毒(MSV)的基因間隔區(qū)的“富GC”元件，不導(dǎo)致所產(chǎn)生的MPr1199啟動(dòng)子(SEQ.ID18)活性的增加。相反，“富含GC”元件看來提供輕微的抑制效應(yīng)。
總之，由于MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)啟動(dòng)子的活性比通常用于植物生物技術(shù)中以指導(dǎo)高水平蛋白表達(dá)的Prg-zein啟動(dòng)子的活性分別高4倍和3.9倍，因此毫無疑問，MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)啟動(dòng)子是能夠提高異源蛋白在玉米胚乳中表達(dá)水平的強(qiáng)有力的工具。此外，注意到MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1137(SEQ.ID11)和MPr1136(SEQ.ID10)啟動(dòng)子在玉米胚乳中提供b-葡糖醛酸糖苷酶活性，其提供的活性至少與用Prg-zein啟動(dòng)子獲得的活性一樣高。最后，效力較低的啟動(dòng)子也是非常有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兛梢杂靡蕴峁?duì)抗性基因或酶蛋白編碼基因的表達(dá)控制。
實(shí)施例7在玉米和煙草中不同啟動(dòng)子在穩(wěn)定表達(dá)中活性的表達(dá)和評(píng)估7.1用根癌土壤桿菌穩(wěn)定地基因轉(zhuǎn)化玉米所用的技術(shù)由Ishida等(1996)描述。長(zhǎng)度為1.0-1.2mm(傳粉后9-14天)的未成熟胚在LS-inf培養(yǎng)基中洗滌，然后浸入按照Ishida等(1996)所述而制備的土壤桿菌懸浮液中，渦旋混合30秒，并且于室溫下溫育5分鐘。如此處理的未成熟胚于25℃、黑暗中在LS-AS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充5mg/1膦絲菌素和250mg/l頭孢噻肟的LSD 1.5培養(yǎng)基上，于25℃黑暗中培養(yǎng)2周，最后將其置于補(bǔ)充10mg/1膦絲菌素和250mg/1頭孢噻肟的LSD1.5培養(yǎng)基上，于25℃黑暗中培養(yǎng)3周。分離如此產(chǎn)生的I型愈傷組織，將其斷裂，并轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充10mg/l膦絲菌素和250mg/1頭孢噻肟的LSD1.5培養(yǎng)基上，于25℃黑暗中培養(yǎng)3周。然后，分離已經(jīng)增殖的I型愈傷組織，并且將其置于補(bǔ)充5mg/1膦絲菌素和250mg/l頭孢噻肟的LSZ培養(yǎng)基上，于25℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期下培養(yǎng)2-3周。然后將再生的小植株轉(zhuǎn)移至LSF 1/2培養(yǎng)基上，于25℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期下培養(yǎng)1-2周，然后將其轉(zhuǎn)移至人工氣候室和轉(zhuǎn)移至溫室。
7.2用根癌土壤桿菌穩(wěn)定地基因轉(zhuǎn)化煙草按照Horsch等(1985)描述的方法，用重組土壤桿菌體外感染從6周大煙草小植株分離的葉圓盤，進(jìn)行煙草(Nicotiana tabacum L.，PBD6栽培品種)的轉(zhuǎn)化。
在光強(qiáng)為200μE.m-2.s-1、光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗并且溫度為25℃的空調(diào)區(qū)中，制備所有的體外培養(yǎng)物。
除初始共培養(yǎng)步驟外，再生、發(fā)育和生根步驟均在補(bǔ)充制菌劑即400mg/l augmentin和選擇劑即200mg/l或100mg/l卡那霉素的不同選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行。
所用的不同步驟和培養(yǎng)基如下-在將土壤桿菌在補(bǔ)充終濃度為6mM的CaCl2和合適的抗生素的5ml 2YT培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用胰胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl，pH 7.2)中于28℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)后，于28℃過夜制備在補(bǔ)充CaCl2和抗生素的10ml 2YT培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。然后將培養(yǎng)物以3000g離心10分鐘，將細(xì)菌重懸于10ml液體MS30(4.4g/l由SIGMA出售的M0404，補(bǔ)充30g/l蔗糖，pH5.7)中。
-通過使從體外小植株葉片切下的約1cm2葉片外植體與液體MS30中稀釋10倍的土壤桿菌懸浮液接觸20分鐘，進(jìn)行共培養(yǎng)。然后，將如此處理的外植體在濾紙上快速干燥，并將其置于空調(diào)區(qū)中的固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(CM)(MS30，1mg/l芐氨基嘌呤(BAP)、0.1mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、8g/l瓊脂)上48小時(shí)。
-然后將經(jīng)處理的外植體置于固體再生培養(yǎng)基(固體CM，400mg/l augmentin、200mg/l卡那霉素)。2周后將外植體在相同培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。
-2周后，將芽在固體發(fā)育培養(yǎng)基(4.4g/l由SIGMA出售的M0404，補(bǔ)充20g/l蔗糖，pH5.7(液體MS20)、400mg/l augmentin、100mg/l卡那霉素、8g/l瓊脂)上傳代培養(yǎng)。
-2周后，將轉(zhuǎn)化的小植株在與所述發(fā)育培養(yǎng)基相同的固體生根培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。生根持續(xù)2-3周，在生根結(jié)束時(shí)，將小植株移至人工氣候室的瞬間(jiffy)花盆中達(dá)10天(光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，23℃和70％的濕度)，然后轉(zhuǎn)移至溫室。
7.3.測(cè)量玉米植株和煙草植株中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性為了測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性，將取自轉(zhuǎn)基因植物的樣品在液氮中冷凍，并且借助于固定在鉆子上的玻棒進(jìn)行研磨。然后以每250mg組織1ml緩沖液的比率，將粉末重懸于提取緩沖液(25mM Tris磷酸鹽，pH7.8、2mM二硫蘇糖醇、2mM 1，2-二氨基環(huán)己烷、N，N，N’N’-四乙酸、10％甘油、1％Triton X100)中。在通過以16060 g離心5分鐘進(jìn)行澄清之前，將混合物勻漿，然后于4℃溫育1小時(shí)。
借助于“GUS-光化學(xué)發(fā)光報(bào)道基因測(cè)定”檢測(cè)試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)，按照生產(chǎn)商的建議，在10μl澄清的粗提取物上測(cè)定GUS活性。用Lumat LB 9507發(fā)光計(jì)(EGG-Berthold，Bad Wildbad，德國(guó))進(jìn)行光發(fā)射的測(cè)量。
用“Bio-Rad蛋白測(cè)定”試劑(Bio-Rad，Munich，德國(guó))，按照Bradford技術(shù)(1976)，測(cè)量所述粗提取物中存在的總蛋白的量。
7.4.在玉米胚乳和葉片中的穩(wěn)定表達(dá)和嵌合啟動(dòng)子活性7.4.1.在種子中的表達(dá)將在玉米胚乳的穩(wěn)定表達(dá)中由嵌合HMWG啟動(dòng)子控制的β-葡糖醛酸糖苷酶活性與由參比啟動(dòng)子512γ-玉米醇溶蛋白控制的β-葡糖醛酸糖苷酶活性進(jìn)行比較，已知參比啟動(dòng)子512γ-玉米醇溶蛋白在玉米胚乳中的活性高(Marzabal等，1998)。每個(gè)玉米穗軸研究6粒種子，在生長(zhǎng)的不同階段，從玉米穗軸頂部開始向基部取種子。作為說明，30DAP階段對(duì)應(yīng)于在傳粉后30天取出的玉米種子。按照實(shí)施例7的7.3一節(jié)描述的方法，測(cè)量每粒種子的β-葡糖醛酸糖苷酶活性的發(fā)光量。
如圖8中報(bào)道的結(jié)果反映了在30 DAP收獲的成熟玉米種子中在穩(wěn)定表達(dá)期間在所述嵌合HMWG-Dx5衍生啟動(dòng)子(MPr1139、MPr1200和MPr1131)和參比啟動(dòng)子512γ-玉米醇溶蛋白控制之下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。對(duì)每個(gè)植株群體活性的比較給出了對(duì)不同啟動(dòng)子的相應(yīng)強(qiáng)度的良好說明。在啟動(dòng)子MPr1139、MPr1200和MPr1131控制之下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性平均為參比啟動(dòng)子512γ-玉米醇溶蛋白控制下活性的約1.5-2倍。然而，分別在啟動(dòng)子MPr1139和MPr1131控制下表達(dá)GUS蛋白的植株302.A3和347.H1的種子，表現(xiàn)出的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，比由參比啟動(dòng)子512γ-玉米醇溶蛋白控制的活性分別高7倍和14倍。注意到在啟動(dòng)子MPr1139、MPr1200和MPr1131控制下表達(dá)GUS蛋白的植物中，在β-葡糖醛酸糖苷酶活性方面沒有顯著差異。然而，在每個(gè)植株群體中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的變化相當(dāng)大。已經(jīng)在大多數(shù)引入植物的基因中觀察到的這種現(xiàn)象可以解釋為所述轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)和拷貝數(shù)。在發(fā)育的13DPA階段和18DAP階段進(jìn)行發(fā)光術(shù)測(cè)定(結(jié)果未顯示)，表明β-葡糖醛酸糖苷酶活性隨時(shí)間變化，但是30DAP階段產(chǎn)生最高β-葡糖醛酸糖苷酶活性的啟動(dòng)子也是分別在發(fā)育的較早階段中13DAP和18DAP時(shí)的最強(qiáng)啟動(dòng)子。因此，在發(fā)育期間維持所述啟動(dòng)子的分類。圖9所示的直方圖顯示在啟動(dòng)子MPr1139控制下β-葡糖醛酸糖苷酶活性的時(shí)間波動(dòng)。這些結(jié)果表明，GUS活性從10DAP開始可檢測(cè)到，在16DAP和28DAP之間達(dá)到穩(wěn)定水平，此后下降直至30DAP。在12DAP和20DAP之間的發(fā)育期中也觀察到從取自夏季的植株獲得的GUS活性穩(wěn)定水平(結(jié)果未顯示)。在取自13DAP(
圖10a)、18DAP(
圖10b)的玉米種子的縱向切片上、或在解剖的玉米種子(
圖10c)上進(jìn)行的組織化學(xué)試驗(yàn)表明，在玉米種子中啟動(dòng)子MPr1139特異性地在胚乳中表達(dá)，在胚、糊粉或粒殼中檢測(cè)不到任何染色。此外，
圖11中描述的直方圖表明，MPr1139的表達(dá)是穩(wěn)定的，或甚至在第二代(T2)中更強(qiáng)。
根據(jù)上述數(shù)據(jù)，可以總結(jié)出以下信息-與啟動(dòng)子序列HMWG-Dx5融合的CaMV 35S啟動(dòng)子的激活序列as-1和as-2看來是玉米胚乳中非常強(qiáng)的順式激活元件。
-CaMV 35S啟動(dòng)子的激活序列as-1和as-2沒有將玉米種子中的所述HMWG-Dx5啟動(dòng)子的活性去調(diào)節(jié)(
圖10)。
-在玉米種子中禾谷類框在穩(wěn)定表達(dá)中沒有顯著的順式調(diào)節(jié)效應(yīng)，啟動(dòng)子MPr1131的活性至少與啟動(dòng)子MPr1139一樣。
-位于“G”框上游、從核苷酸-238延伸至-378bp的啟動(dòng)子序列HMWG-Dx5在衍生自HMWG的嵌合啟動(dòng)子中不起重要的調(diào)節(jié)作用，在玉米種子的穩(wěn)定表達(dá)中啟動(dòng)子MPr1200的活性至少與啟動(dòng)子MPr1139一樣。
總之，最佳表達(dá)子302.A3和347.H1的衍生自HMWG的嵌合啟動(dòng)子(MPr1139、MPr1131和MPr1200)的活性，平均大約是參比啟動(dòng)子512γ-玉米醇溶蛋白活性的1.5-2倍或甚至更高，不容質(zhì)疑，所述嵌合啟動(dòng)子是能夠提高異源蛋白在玉米胚乳中表達(dá)的非常有用的工具。按照本發(fā)明的衍生自HMWG的嵌合啟動(dòng)子也可以用來在單子葉植物種子中超量表達(dá)內(nèi)源蛋白，因此有農(nóng)業(yè)價(jià)值，例如用于產(chǎn)生與淀粉生產(chǎn)相關(guān)的水稻或小麥。
7.4.2.在葉片中的穩(wěn)定表達(dá)通過在玉米葉片中的穩(wěn)定表達(dá)，測(cè)量在啟動(dòng)子MPr1139、MPr1131和MPr1200控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。按照實(shí)施例7的7.3一節(jié)中描述的方法，從兩個(gè)葉圓盤進(jìn)行β-葡糖醛酸糖苷酶活性的發(fā)光術(shù)測(cè)量，每個(gè)葉圓盤的直徑為2厘米，取自在溫育中適應(yīng)后3周的玉米植株。
每個(gè)植株群體的活性比較表明，由嵌合啟動(dòng)子MPr1139、MPr1200和MPr1131控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，比在512γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)GUS蛋白的植株中測(cè)量的背景噪聲最多高30倍(
圖12)，還表明的結(jié)果是，啟動(dòng)子MPr1139、MPr1200和MPr1131在溫室適應(yīng)后3周的發(fā)育階段的玉米植株的葉片中略有活性或根本無活性。然而，在體外培養(yǎng)的生根期間，在處于衍生自HMWG的所述嵌合啟動(dòng)子控制下表達(dá)GUS蛋白的原始轉(zhuǎn)化體(小植株)的葉片上進(jìn)行的組織化學(xué)試驗(yàn)，系統(tǒng)地顯示出藍(lán)色染色(結(jié)果未顯示)。
這些結(jié)果是非常有趣的，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)基因玉米的葉片中，啟動(dòng)子MPr1139、MPr1200和MPr1131的活性低，但足以進(jìn)行早期試驗(yàn)，而沒有任何主要的毒性風(fēng)險(xiǎn)。
7.5.在煙草葉片和種子中嵌合啟動(dòng)子的穩(wěn)定表達(dá)活性7.5.1在葉片中的穩(wěn)定表達(dá)在煙草葉片中，將在啟動(dòng)子MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139控制下的穩(wěn)定表達(dá)β-葡糖醛酸糖苷酶活性與由CaMV D35S啟動(dòng)子控制的活性進(jìn)行比較。按照實(shí)施例7的7.3一節(jié)中描述的方法，在溫室適應(yīng)后2、5、8和11周的發(fā)育階段由兩個(gè)葉圓盤進(jìn)行β-葡糖醛酸糖苷酶活性的發(fā)光術(shù)測(cè)量，每個(gè)葉圓盤的直徑為2厘米，取自位于原始轉(zhuǎn)化體上部1/3的基部的不同葉片。為了限制主要通過隨機(jī)整合而引入的所述報(bào)道基因表達(dá)程度以及所述表達(dá)盒拷貝數(shù)的變異，每種構(gòu)建物研究10-30個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。
示于
圖13的結(jié)果反映出在溫室適應(yīng)后11周時(shí)，在煙草葉片中在衍生自HMWG的所述嵌合啟動(dòng)子和參比啟動(dòng)子HMWG-Dx5和CaMVD35S的β-葡糖醛酸糖苷酶活性的穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)每個(gè)植株群體的活性比較提供了對(duì)所述不同啟動(dòng)子相應(yīng)強(qiáng)度的良好說明。在由衍生自HMWG的本發(fā)明的嵌合啟動(dòng)子控制的β-葡糖醛酸糖苷酶活性顯著高于在HMWG-Dx5啟動(dòng)子控制下測(cè)量的活性，但比在CaMVD35S啟動(dòng)子控制下的活性低大約5-10倍。在所述不同HMWG嵌合啟動(dòng)子中，除啟動(dòng)子Mpr1139活性略低外，沒有觀察到任何顯著的活性差異。在溫室適應(yīng)后2、5和8周發(fā)育階段進(jìn)行的發(fā)光術(shù)測(cè)定(結(jié)果未顯示)表明，在任何特定植株中β-葡糖醛酸糖苷酶活性隨時(shí)間而增加，而與所用的啟動(dòng)子無關(guān)。然而，在11周發(fā)育階段最強(qiáng)的啟動(dòng)子在發(fā)育早期(在溫室適應(yīng)后2、5和8周)也提供最高的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。因此，在11周階段的所述啟動(dòng)子的分類也適用于煙草中的所有其它發(fā)育階段。
從該數(shù)據(jù)可明顯看出，衍生自HMWG的所述嵌合啟動(dòng)子是有功能的，但在煙草葉片的穩(wěn)定表達(dá)中僅有弱活性。本申請(qǐng)人的結(jié)論是，所述激活序列as-1和as-2將HMWG-Dx5啟動(dòng)子在煙草葉片中的活性去調(diào)節(jié)，但不提供與HMWG-Dx5啟動(dòng)子序列中存在的順式調(diào)節(jié)序列相關(guān)的強(qiáng)激活效應(yīng)。
為了解釋這些結(jié)果與在瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中所獲得的結(jié)果中的這種明顯的矛盾，提出兩種假說-衍生自HMWG的所述嵌合啟動(dòng)子由煙草葉片的基因槍轉(zhuǎn)化期間的損傷和/或脅迫誘導(dǎo)；-在穩(wěn)定的煙草表達(dá)中，衍生自HMWG的所述嵌合啟動(dòng)子基本上在發(fā)育的每一早期階段中都表達(dá)。再生步驟期間在體外原始煙草轉(zhuǎn)化體(小植株)的葉片上進(jìn)行的組織化學(xué)試驗(yàn)表明衍生自HMWG的所述嵌合啟動(dòng)子的β-葡糖醛酸糖苷酶活性高(結(jié)果未顯示)。
衍生自HMWG的嵌合啟動(dòng)子即MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139盡管在煙草葉片的穩(wěn)定表達(dá)中活性弱，但可以例如用于控制涉及所述植物代謝的生物合成途徑中的酶的表達(dá)。它們也可以用來控制賦予植物抗性的基因的表達(dá)，所述抗性例如是對(duì)可用作選擇劑的抗生素或除草劑的抗性。
7.5.2.在煙草種子中的穩(wěn)定表達(dá)通過發(fā)光術(shù)，在取自每種構(gòu)建物獨(dú)立獲得的10-30個(gè)獨(dú)立的原始轉(zhuǎn)化體的成熟T1煙草種子(每個(gè)轉(zhuǎn)化體100mg)中，測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在特定構(gòu)建體中所述活性在植株與植株之間不同(參見
圖14)，這可以用在基因組中的位置效應(yīng)和所述轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)來解釋。
所述結(jié)果表明，衍生自HMWG的某些嵌合啟動(dòng)子可以在煙草種子中啟動(dòng)β-葡糖醛酸糖苷酶活性，所述活性至少與CaMV D35S啟動(dòng)子一樣高。實(shí)際上，所述啟動(dòng)子可以如下分類-啟動(dòng)子MPr1130、MPr1131和Mpr1139，它們促進(jìn)β-葡糖醛酸糖苷酶活性的程度與CaMV D35S啟動(dòng)子的相同；-啟動(dòng)子MPr1135和MPr1138，它們?cè)跓煵莘N子中的活性是CaMV D35S啟動(dòng)子的2倍。
所獲得的結(jié)果表明-CaMV 35S啟動(dòng)子的激活序列as-1和as-2提供衍生自HMWG、僅含一個(gè)“G樣”框和所述“增強(qiáng)子”元件的啟動(dòng)子序列中的重要的順式激活效應(yīng)，如在啟動(dòng)子MPr1135和MPr1138中觀察到的。因此，CaMV 35S啟動(dòng)子的激活序列as-1和as-2與HMWG-Dx5啟動(dòng)子中存在的順式調(diào)節(jié)元件協(xié)同作用。所述“G樣”框和所述“增強(qiáng)子”元件看來是煙草種子中這種聯(lián)合控制中的關(guān)鍵元件。
-位于所述“G”框上游從核苷酸-378延伸至-238的HMWG-Dx5啟動(dòng)子序列賦予啟動(dòng)子MPr1130、MPr1131和MPr1139在煙草種子中的負(fù)順式調(diào)節(jié)效應(yīng)。
-CaMV啟動(dòng)子的激活序列as-2的重復(fù)在煙草種子中不提供任何明顯的正相加相應(yīng)。實(shí)際上，MPr1130相對(duì)于Mpr1131沒有獲得任何活性差異，MPr1135相對(duì)于MPr1138也沒有獲得任何活性差異。
-所述“禾谷類”框在煙草種子中不提供任何明顯的相加順式激活效應(yīng)，因?yàn)閱?dòng)子MPr1131和MPr1139獲得的結(jié)果是相似的。
啟動(dòng)子MPr1135和MPr1138在煙草種子的穩(wěn)定表達(dá)中是高活性的，它們是用于控制異源蛋白在雙子葉植物中表達(dá)、例如在農(nóng)業(yè)上非常有價(jià)值的那些植物中表達(dá)的強(qiáng)有力的工具。
實(shí)施例8用于煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、包含HMWG-Dx5啟動(dòng)子(SEQ.ID01)的雙元質(zhì)粒pMRT1231的構(gòu)建通過將來自pMRT1125的表達(dá)盒“HMWG-Dx5(SEQ.ID01)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1195的限制位點(diǎn)HpaI中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1231。pMRT1195描述于將公布的法國(guó)專利申請(qǐng)F(tuán)R9911112中，所述申請(qǐng)通過引用而將與相關(guān)信息相關(guān)的內(nèi)容結(jié)合到本文中。
為了完成這一步，連續(xù)用EcoRI和XmnI于37℃將7μg質(zhì)粒pMRT1125消化1小時(shí)。然后，用“Concert Rapid凝膠提取系統(tǒng)”試劑盒，在0.7％瓊脂糖凝膠上分離所述表達(dá)盒，并且在dNTPs各60nmol、12μl MgCl2(500 mM)和6μl DTT(1M)存在下，用20單位Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分鐘。
在平行實(shí)驗(yàn)中，用HpaI將5μg雙元質(zhì)粒pMRT1195于37℃消化1小時(shí)。然后，在緩沖液3存在下，用40單位牛小腸堿性磷酸酶(NewEngland Biolabs)于37℃將所述線性化載體片段去磷酸化1小時(shí)。
如先前所述，在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中，通過連續(xù)的PCR循環(huán)，用100ng所述表達(dá)盒和10ng以上獲得的pMRT1195質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)。用所有的所述連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化預(yù)先制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)充卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照堿裂解法進(jìn)行提取，并且通過酶促消化進(jìn)行分析。
所獲得的質(zhì)粒命名為pMRT1231，然后按照先前實(shí)施例4的4.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404-pSB1中，該菌株按照最近描述的用于獲得A1177菌株的方案，在pSB1質(zhì)粒整合后由根癌土壤桿菌菌株LBA4404衍生得到。pSB1質(zhì)粒描述于將公布的法國(guó)專利申請(qǐng)F(tuán)R9911112中，所述申請(qǐng)的相關(guān)信息的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。通過在補(bǔ)充利福平(50mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和四環(huán)素(5mg/ml)的2YT培養(yǎng)基上選擇而獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，按照通過將溶菌酶(25mg/l)加入細(xì)胞再懸浮緩沖液中而修改的堿裂解法進(jìn)行提取。用酶促消化分析所獲得的質(zhì)粒DNA，所獲得的土壤桿菌命名為A1231。
按照實(shí)施例7的7.2一節(jié)的描述，進(jìn)行煙草的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，只是用于再生培養(yǎng)基和發(fā)育培養(yǎng)基中的所述選擇劑分別是0.5(0，5)mg/l和2mg/l的草銨膦。
實(shí)施例9用于玉米穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化、包括啟動(dòng)子MPr1131、MPr1200和512γ-zein的雙元質(zhì)粒的構(gòu)建9.1.雙元質(zhì)粒pMRT1263的構(gòu)建通過將表達(dá)盒“MPr1131(SEQ.ID06)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1195的限制位點(diǎn)HpaI中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1263。質(zhì)粒pMRT1195描述于尚未公布的法國(guó)專利申請(qǐng)F(tuán)R9911112中，所述申請(qǐng)的相關(guān)信息通過引用結(jié)合到本文中。如實(shí)施例5所述進(jìn)行所述插入，只是所述表達(dá)盒從描述于實(shí)施例3的3.2一節(jié)中的質(zhì)粒pMRT1131中分離。
所獲得的質(zhì)粒命名為pMRT1263，按照先前實(shí)施例5的5.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404-pSB1中。所獲得的土壤桿菌克隆命名為A1263。
9.2.雙元質(zhì)粒pMRT1266的構(gòu)建通過將表達(dá)盒“MPr1200(SEQ.ID19)/uidA-IV2/term-nos”插入雙元質(zhì)粒pMRT1195的HpaI限制位點(diǎn)中，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1266。質(zhì)粒pMRT1195描述于尚未公布的法國(guó)專利申請(qǐng)F(tuán)R9911112中，其相關(guān)信息通過引用結(jié)合到本文中。如實(shí)施例5所述進(jìn)行所述插入，只是所述表達(dá)盒從描述于實(shí)施例3的3.10一節(jié)中的質(zhì)粒pMRT1200中分離。
所獲得的質(zhì)粒命名為pMRT1266，按照先前實(shí)施例5的5.1一節(jié)中所述的方案，將其轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404-pSB1中。所獲得的土壤桿菌克隆命名為A1266。
9.3.雙元質(zhì)粒pMRT1209的構(gòu)建為了在玉米胚乳SN87 165(L2)的穩(wěn)定表達(dá)中有一參比啟動(dòng)子序列，如先前實(shí)施例5中所述，將Marzabal等(1998)描述的526γ-玉米醇溶蛋白質(zhì)粒中含有的啟動(dòng)子512γ-zein和nos終止子控制下的uidA基因，插入雙元質(zhì)粒pMRT1195中，只是所述表達(dá)盒從526γ-zein質(zhì)粒中分離。
將所獲得的質(zhì)粒pMRT1209，按照實(shí)施例5的5.1一節(jié)中所述的方案，轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株LBA4404-pSB1中。所獲得的土壤桿菌克隆命名為A1209。
所引用的參考文獻(xiàn)Anderson O.D.，Green F.C.，Yip R.E.，Halford N.G.，Shewry P.R.和Malpica-Romero J-M.(1989).得自六倍體面包小麥普通小麥Cheyenne栽培品種D基因組的兩個(gè)高分子量麥谷蛋白基因的核苷酸序列。Nucleic Acids Research 17.461-462。
Anderson O.D.，Abraham-Pierce F.A.和Tam A.(1998).在小麥高分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子序列中的保守性在基因座和GLU-B1-1基因座的等位基因中的比較。Theor Appl Genet 96，568-576。
Birnboim H.C.和Doly J.(1979).用于篩選重組質(zhì)粒DNA的快速堿提取法。Nuc.Ac.Res.7，1513。
Bradfbrd M.(1976).用于利用蛋白-染料結(jié)合的原理檢測(cè)微克量蛋白的快速而靈敏的方法。Anal.Biochem.72，248-254。
Fenoll C.，Schwarz J.J.，Black D.M.，Schneider M.和Howell S.H.(1990).玉米條紋病毒的基因間隔區(qū)含有一個(gè)激活右向轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合玉米核因子的富GC元件。PMB 15，865-877。
Guérineau和Mullineaux(1993).載于Plant molecular biologylabfax，Croy R.R.D.(編著)，BioS Scientific Publishers，BlackwellScientific Publications。
Jefferson R.A.，Burgess S.M.和Hirsh D(1986).作為基因融合標(biāo)記的β-葡糖醛酸糖苷酶。Proc.Nat.Acad.Sci.USA，83，8447-8451。
Jefferson R.A.，Kavanagh T.A.和Bevan M.W.(1987).GUS融合體在高等植物中作為靈敏的通用基因融合標(biāo)記的β-葡糖醛酸糖苷酶。EMBO J.6，3901-3907。
Holsters M.，Dewaele D.，Depicker A.，Messenf E.，Van Montagu M.和Schell J.(1978).根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化。Mol.Gen.Genet.136，181-187。
Horsch R.B.，F(xiàn)ry J.E.，Hoffmann N.L.，Eiholtz D.，Rogers S.G.和Fraley R.T.(1985).一種將基因轉(zhuǎn)移到植物中的簡(jiǎn)單而通用的方法。Science 227，129-1231。
Kay R.，Chan A.，Daly M.和McPherson J.(1987).重復(fù)CaMV 35S啟動(dòng)子序列產(chǎn)生一種用于植物基因的強(qiáng)增強(qiáng)子。Science 236，1299-1302。
Lam E.，Benfey P.N.，Gilmartin P.M.，F(xiàn)ang R.X.和Chua N.H.(1989).定點(diǎn)突變改變體外因子的結(jié)合并且改變轉(zhuǎn)基因植物中的啟動(dòng)子表達(dá)模式。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，7890-7894。
Lam E.和Chua N.H.(1989).ASF-2一種結(jié)合于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和Cab啟動(dòng)子中保守的GATA基序的因子。Plant Cell，1，1147-1156。
Leckie L.，Devoto A.和De Lorenzo G.(1994).根據(jù)來自相同細(xì)胞提取物的LUC活性將GUS歸一化降低了轉(zhuǎn)化變異性。Biotechniques17，52-56。
Murashige T.和Skoog F.(1962).一種改進(jìn)的用于煙草組織培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的培養(yǎng)基。Physiol.Plant.15，473-497。
Reina M.，Ponte I.，Guillen P.，Boronat A.和Palau J.來自玉蜀黍W64 A的編碼Zc2蛋白的基因組克隆的序列分析。Nucleic AcidsResearch 18，6426。
Torrent M.，Alvarez I.，Geli M.I.，Dalcol I.和Ludevid D.(1997).富賴氨酸修飾的g-玉米醇溶蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的玉米胚乳中的蛋白體積累。Plant Mol.Biol.34，139-149。
Vancanneyt G.，Schmidt R.，O’Connor-Sanchez A.，Willmitzer L.和Rocha-Sosa M.(1990).含內(nèi)含子的標(biāo)記基因的構(gòu)建剪接轉(zhuǎn)基因植物中的內(nèi)含子及其在監(jiān)測(cè)土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化中的早期事件中的應(yīng)用。Mol.Gen.Genet.220，245-250。
Marzabal P.，Busk P.K.，Ludevid M.D.和Torrent M.(1998).g-玉米醇溶蛋白基因的雙因子胚乳框Pb3和GZM順式作用元件的表征和功能。The Plant Journal 16(1)，41-52。
序列表<110>MERISTEM THERAPEUTICS<120>合成的和嵌合的啟動(dòng)子、表達(dá)盒、質(zhì)粒、載體、含有它們的轉(zhuǎn)基因植物和種子以及其產(chǎn)生方法<130>PrHMWG1<140><141><160>37<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>417<212>DNA<213>普通小麥(Triticum aestivum)<220><221>misc_feature<222>(22)..(29)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(70)..(73)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(87)..(90)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(127)..(133)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(161)..(168)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(193)..(230)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(349)..(355)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(379)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>1agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300aaacctcacc gtgcacgcag ccatggtcct gaaccttcac ctcgtcccta taaaagccta 360gccaaccttc acaatcttat catcacccac aacaccgagc accacaaact agagatc417<210>2<211>181<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1126啟動(dòng)子<220><221>TATA信號(hào)<222>(113)..(119)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(143)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>2gtgttggcaa actgcgcttt tccaaccgat tttgttcttc tcgcgctttc ttcttaggct 60aaacaaacct caccgtgcac gcagccatgg tcctgaacct tcacctcgtc cctataaaag 120cctagccaac cttcacaatc ttatcatcac ccacaacacc gagcaccaca aactagagat 180c 181<210>3<211>244<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1127啟動(dòng)子<220><221>增強(qiáng)子<222>(20)..(57)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(176)..(182)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(206)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>3gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc tccttgctta tccagcttct 60tttgtgttgg caaactgcgc ttttccaacc gattttgttc ttctcgcgct ttcttcttag 120gctaaacaaa cctcaccgtg cacgcagcca tggtcctgaa ccttcacctc gtccctataa 180aagcctagcc aaccttcaca atcttatcat cacccacaac accgagcacc acaaactaga 240gatc 244<210>4<211>277<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1128啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(21)..(28)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(53)..(90)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(209)..(215)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(239)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>4cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat ctgttttgca 60aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg cgcttttcca 120accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc gtgcacgcag 180ccatggtcct gaaccttcac ctcgtcccta taaaagccta gccaaccttc acaatcttat 240catcacccac aacaccgagc accacaaact agagatc 277<210>5<211>472<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1130啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(22)..(29)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(70)..(73)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(87)..(90)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(127)..(133)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(161)..(168)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(193)..(230)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(314)..(368)<223>As2/As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(404)..(410)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(434)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>5agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300aaacctcacc gtgattgatg tgatatcaag attgatgtga tatctccact gacgtaaggg 360atgacgcaca cgcagccatg gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa 420ccttcacaat cttatcatca cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tc 472<210>6<211>455<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1131啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(22)..(29)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(70)..(73)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(87)..(90)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(127)..(133)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(161)..(168)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>()..)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>()..)<223>As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>()..(393)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>()<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>6agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300aaacctcacc gtgattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acacgcagcc 360atggtcctga accttcacct cgtccctata aaagcctagc caaccttcac aatcttatca 420tcacccacaa caccgagcac cacaaactag agatc455<210>7<211>332<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1135啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(21)..(28)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(53)..(90)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(174)..(228)<223>As2/As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(264)..(270)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(294)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>7cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat ctgttttgca 60aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg cgcttttcca 120accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc gtgattgatg 180tgatatcaag attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca cgcagccatg 240gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa ccttcacaat cttatcatca 300cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tc 332<210>8<211>219<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1136啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(78)..(115)<223>As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(151)..(157)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(181)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>8gtgttggcaa actgcgcttt tccaaccgat tttgttcttc tcgcgctttc ttcttaggct 60aaacaaacct caccgtgatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacacgc 120agccatggtc ctgaaccttc acctcgtccc tataaaagcc tagccaacct tcacaatctt 180atcatcaccc acaacaccga gcaccacaaa ctagagatc219<210>9<211>282<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr11137啟動(dòng)子<220><221>增強(qiáng)子<222>(20)..(57)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(141)..(178)<223>As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(214)..(220)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(244)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>9gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc tccttgctta tccagcttct 60tttgtgttgg caaactgcgc ttttccaacc gattttgttc ttctcgcgct ttcttcttag 120gctaaacaaa cctcaccgtg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 180cgcagccatg gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa ccttcacaat 240cttatcatca cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tc282<210>10<211>315<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1138啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(21)..(28)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(53)..(90)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(174)..(211)<223>As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(247)..(253)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(277)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>10cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat ctgttttgca 60aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg cgcttttcca 120accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc gtgattgatg 180tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acacgcagcc atggtcctga accttcacct 240cgtccctata aaagcctagc caaccttcac aatcttatca tcacccacaa caccgagcac 300cacaaactag agatc 315<210>11<211>505<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1139啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(4)..(26)<223>禾谷類框<220><221>misc_feature<222>(39)..(61)<223>禾谷類框<220><221>misc_feature<222>(120)..(123)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(137)..(140)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(72)..(79)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(177)..(183)<223>谷醇溶蛋白樣框<220><221>misc_feature<222>(211)..(218)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(243)..(280)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(364)..(401)<223>As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(437)..(443)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(467)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>11ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc cactactcga catggttaga agttttgagt 60ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac cccaagaagg 120ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca cacttctgca 180aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat 240ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg 300cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc 360gtgattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acacgcagcc atggtcctga 420accttcacct cgtccctata aaagcctagc caaccttcac aatcttatca tcacccacaa 480caccgagcac cacaaactag agatc 505<210>12<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1197啟動(dòng)子<220><221>TATA信號(hào)<222>(28)..(34)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(58)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400> 12catggtcctg aaccttcacc tcgtccctat aaaagcctag ccaaccttca caatcttatc 60atcacccaca acaccgagca ccacaaacta gagatc 96<210>13<211>187<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1198啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(8)..(15)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(40)..(77)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(119)..(125)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(149)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>13acgccgatta cgtggcttta gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc 60tccttgctta tccagcttct tttgtgttgg ccatggtcct gaaccttcac ctcgtcccta 120taaaagccta gccaaccttc acaatcttat catcacccac aacaccgagc accacaaact 180agagatc 187<210>14<211>290<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1199啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(6)..(25)<223>富GC框<220><221>misc_feature<222>(34)..(41)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(66)..(103)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(222)..(228)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(252)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>14caaatgggcc ggaccgggcc ggcccagcgc cgattacgtg gctttagcag actgtccaaa 60aatctgtttt gcaaagctcc aattgctcct tgcttatcca gcttcttttg tgttggcaaa 120ctgcgctttt ccaaccgatt ttgttcttct cgcgctttct tcttaggcta aacaaacctc 180accgtgcacg cagccatggt cctgaacctt cacctcgtcc ctataaaagc ctagccaacc 240ttcacaatct tatcatcacc cacaacaccg agcaccacaa actagagatc290<210>15<211>381<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1200<220><221>misc_feature<222>(4)..(26)<223>禾谷類框<220><221>misc_feature<222>(39)..(61)<223>禾谷類框<220><221>misc_feature<222>(87)..(94)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(119)..(156)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(240)..(277)<223>As2/As1框<220><221>TATA信號(hào)<222>(313)..(319)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(343)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>15ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc cactactcga catggttaga agttttgagt 60ggccgtagat ttgctctaga cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt 120tttgcaaagc tccaattgct ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggc aaactgcgct 180tttccaaccg attttgttct tctcgcgctt tcttcttagg ctaaacaaac ctcaccgtga 240ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacac gcagccatgg tcctgaacct 300tcacctcgtc cctataaaag cctagccaac cttcacaatc ttatcatcac ccacaacacc 360gagcaccaca aactagagat c 381<210>16<211>343<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1213啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(4)..(26)<223>禾谷類框<220><221>misc_feature<222>(39)..(61)<223>禾谷類框<220><221>增強(qiáng)子<222>(119)..(156)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(87)..(94)<223>G樣框<220><221>TATA信號(hào)<222>(275)..(281)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(305)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>16ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc cactactcga catggttaga agttttgagt 60ggccgtagat ttgctctaga cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt 120tttgcaaagc tccaattgct ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggc aaactgcgct 180tttccaaccg attttgttct tctcgcgctt tcttcttagg ctaaacaaac ctcaccgtgc 240acgcagccat ggtcctgaac cttcacctcg tccctataaa agcctagcca accttcacaa 300tcttatcatc acccacaaca ccgagcacca caaactagag atc 343<210>17<211>358<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1216啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(7)..(14)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(39)..(76)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(102)..(109)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(134)..(171)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(290)..(296)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(320)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>17cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt tttgcaaagc tccaattgct 60ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggt ctagacgccg attacgtggc tttagcagac 120tgtccaaaaa tctgttttgc aaagctccaa ttgctccttg cttatccagc ttcttttgtg 180ttggcaaact gcgcttttcc aaccgatttt gttcttctcg cgctttcttc ttaggctaaa 240caaacctcac cgtgcacgca gccatggtcc tgaaccttca cctcgtccct ataaaagcct 300agccaacctt cacaatctta tcatcaccca caacaccgag caccacaaac tagagatc 358<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>18atcggaattc gtgttggcaa actgc25<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>19atcgggaatt cgcagactgt ccaaaaatc29<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>20atcggaattc cagaactagg attacgccg29<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>21tacgaattcc cagctttgag tggccgtag 29<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>22atcggaattc tagacgccga ttacgtggct ttagc35<210>23<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>23tacgaattcc tcgacatggt tagaagtttt gagtgccgcc actactcgac atggttagaa 60gttttgagtg gccgtagatt tgc 83<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>24atcggaattc gccgattacg tggctttagc 30<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>25atcggaattc gcagccatgg tcctgaacc 29<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>26tacgaattcc tcgacatgg 19<210>27<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>27attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca cgcagccatg gtcctgaacc 60ttc 63<210>28<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>28attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacacgc 60agccatggtc ctgaaccttc 80<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>29tacggatccc cggggatctc tagtttgtgg tgc 33<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>30gctctagagc aaatctacgg ccactc 26<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>31gctctagacc aacacaaaag aagctgg 27<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>32catgccatgg ccaacacaaa agaagctgg 29<210>33<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>33tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatca cggtgaggtt tgtttagcct 60aag 63<210>34<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脫氧核苷酸<400>34tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatct tgatatcaca tcaatcacgg 60tgaggtttgt ttagcctaag 80<210>35<211>236<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1133啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(78)..(132)<223>As2/As2/As1框<220><221>misc_feature<222>(198)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>35gtgttggcaa actgcgcttt tccaaccgat tttgttcttc tcgcgctttc ttcttaggct 60aaacaaacct caccgtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc cactgacgta 120agggatgacg cacacgcagc catggtcctg aaccttcacc tcgtccctat aaaagcctag 180ccaaccttca caatcttatc atcacccaca acaccgagca ccacaaacta gagatc 236<210>36<211>299<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1134<220><221>增強(qiáng)子<222>(20)..(57)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(141)..(195)<223>As2/As2/As1框<220><221>misc_feature<222>(261)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>36gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc tccttgctta tccagcttct 60tttgtgttgg caaactgcgc ttttccaacc gattttgttc ttctcgcgct ttcttcttag 120gctaaacaaa cctcaccgtg attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac 180gtaagggatg acgcacacgc agccatggtc ctgaaccttc acctcgtccc tataaaagcc 240tagccaacct tcacaatctt atcatcaccc acaacaccga gcaccacaaa ctagagatc 299<210>37<211>453<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1217啟動(dòng)子<220><221>misc_feature<222>(8)..(15)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(40)..(77)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(102)..(109)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(134)..(171)<223>增強(qiáng)子框<220><221>misc_feature<222>(197)..(204)<223>G樣框<220><221>增強(qiáng)子<222>(229)..(266)<223>增強(qiáng)子框<220><221>TATA信號(hào)<222>(385)..(391)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(415)<223>轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)<400>37acgccgatta cgtggcttta gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc 60tccttgctta tccagcttct tttgtgttgg tctagacgcg attacgtggc tttagcagac 120tgtccaaaaa tctgttttgc aaagctccaa ttgctccttg cttatccagc ttcttttgtg 180ttggtctaga cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt tttgcaaagc 240tccaattgct ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggc aaactgcgct tttccaaccg 300attttgttct tctcgcgctt tcttcttagg ctaaacaaac ctcaccgtgc acgcagccat 360ggtcctgaac cttcacctcg tccctataaa agcctagcca accttcacaa tcttatcatc 420acccacaaca ccgagcacca caaactagag atc 45權(quán)利要求
1.嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其包含至少一段衍生自高分子量小麥麥谷蛋白的編碼基因的核酸序列。
2.按照權(quán)利要求1的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，其包含至少一段衍生自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的小麥Dx5或Bx7基因的核酸序列。
3.按照權(quán)利要求1的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，其包含至少一段衍生自高分子量小麥麥谷蛋白的編碼基因、序列鑒定號(hào)為SEQ.ID01的核酸序列。
4.按照權(quán)利要求1的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，衍生自高分子量小麥麥谷蛋白的編碼基因的所述核酸序列由選自以下序列鑒定號(hào)的一種序列組成SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19和SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
5.嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，它包含一段衍生自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的基因的核酸序列，并且它在3’位置包含一個(gè)“TATA”框和一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)。
6.按照權(quán)利要求5的嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在所述“TATA”框和所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)上游的5’位置中功能性連接的至少一個(gè)“增強(qiáng)子”框。
7.按照權(quán)利要求6的嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在所述“增強(qiáng)子”框上游的5’位置中功能性連接的至少一個(gè)“G樣”框。
8.按照權(quán)利要求6和7中任一項(xiàng)的嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在所述“增強(qiáng)子”框上游的5’位置中功能性連接的至少一個(gè)“P樣”框。
9.按照權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在至少所述“增強(qiáng)子”框上游的5’位置中功能性連接的至少一個(gè)“GATA”框。
10.按照權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的嵌合表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在所述“增強(qiáng)子”框上游的5’位置中功能性連接的至少一個(gè)禾谷類框。
11.按照權(quán)利要求6的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，它包含在所述“增強(qiáng)子”框上游的5’位置中功能性連接的兩個(gè)連續(xù)的“禾谷類”框。
12.按照權(quán)利要求5的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的5’位置中功能性連接的至少一個(gè)“as1”框或至少一個(gè)“as2”框或一個(gè)“as1/as2”框組合或“as2/as1”框組合或這些的重復(fù)排列。
13.按照權(quán)利要求12的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，所述“as1”框、“as2”框、“as1/as2”框或“as2/as1”框或其重復(fù)排列功能性地連接于所述增強(qiáng)子框下游的3’位置中。
14.按照前述權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，它也包含在所述“增強(qiáng)子”框上游功能性連接的一個(gè)“富GC”框。
15.按照前述權(quán)利要求6-14中任一項(xiàng)的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，它包含在所述“增強(qiáng)子”框上游的5’位置中功能性連接的兩個(gè)“禾谷類”框，而所述“增強(qiáng)子”框本身功能性地連接于一個(gè)“as2/as1”框上游的5’位置中。
16.按照前述權(quán)利要求5-15中任一項(xiàng)的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，它包含至少一個(gè)以反向功能性連接和/或在所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游3’位置中功能性連接的選自以下組的元件“增強(qiáng)子”框、“G樣”框、“P樣”框、“GATA”框、“禾谷類”框、任選重復(fù)的“as1”框、“as2”框和/或“as1/as2”或“as2/as1”框組合以及“富GC”框。
17.按照前述權(quán)利要求6-16中任一項(xiàng)的嵌合啟動(dòng)子，其特征在于，它包含至少一種選自以下的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
18.表達(dá)盒，其包含至少一段衍生自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的基因的核酸序列，并且所述序列以功能性方式連接于待表達(dá)的、編碼所要產(chǎn)生的多肽的核酸序列，而所述多肽編碼序列本身連接于一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止核酸序列。
19.按照權(quán)利要求18的表達(dá)盒，其特征在于，它包含至少一段衍生自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的基因、序列鑒定號(hào)為SEQ.ID01的核酸序列。
20.按照權(quán)利要求18的表達(dá)盒，其特征在于，衍生自編碼高分子量小麥麥谷蛋白的基因的所述核酸序列由選自以下序列鑒定號(hào)的至少一種序列組成SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
21.分離的啟動(dòng)子核酸序列，其特征在于，它對(duì)應(yīng)于衍生自序列鑒定號(hào)為SEQ.ID01的序列。
22.分離的啟動(dòng)子核酸序列，其特征在于，它對(duì)應(yīng)于選自以下序列鑒定號(hào)的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
23.包含一個(gè)啟動(dòng)子或一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的載體，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列能夠啟動(dòng)編碼所要產(chǎn)生的多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，所述載體的特征在于，所述啟動(dòng)子或所述啟動(dòng)子核酸序列對(duì)應(yīng)于按照權(quán)利要求1-17或21或22中任一項(xiàng)的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列。
24.按照權(quán)利要求23的載體，其特征在于，所述載體選自鑒定號(hào)為pMRT1207、pMRT1177、pMRT1178、pMRT1179、pMRT1180和pMRT1181的雙元載體。
25.在其基因組中穩(wěn)定整合了分別按照權(quán)利要求1-17或21或22中任一項(xiàng)的至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。
26.按照權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物選自雙子葉植物物種，例如馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油料種子、甜菜或向日葵；或單子葉植物物種，例如小麥、大麥、燕麥、水稻或玉米。
27.按照權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體。
28.按照權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體，其特征在于，它是種子。
29.含有分別按照權(quán)利要求1-17或21或22中任一項(xiàng)的一個(gè)啟動(dòng)子或一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的細(xì)胞。
30.按照權(quán)利要求29的細(xì)胞，其特征在于，它是植物細(xì)胞。
31.在細(xì)胞中表達(dá)編碼待產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟-用包含按照權(quán)利要求1-17或21或22中任一項(xiàng)的至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；-在允許編碼所述多肽的核酸序列或基因表達(dá)的條件下制備所述細(xì)胞的培養(yǎng)物。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
33.按照權(quán)利要求31和32中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是選自微生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的細(xì)胞。
34.按照權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
35.獲得按照權(quán)利要求25和26中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物或按照權(quán)利要求27的繁殖體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟-用包含按照權(quán)利要求1-17或21或22中任一項(xiàng)的至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)啟動(dòng)子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；-選擇整合了所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子核酸序列的植物細(xì)胞；-或者在培養(yǎng)物中，或者通過再生嵌合的或轉(zhuǎn)基因的整株植株，繁殖所述經(jīng)轉(zhuǎn)化并經(jīng)選擇的植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成的和嵌合的啟動(dòng)子,所述啟動(dòng)子包含至少一種衍生自高分子量小麥麥谷蛋白(HMWG)的編碼基因的啟動(dòng)子的核酸序列。本發(fā)明也涉及含有所述啟動(dòng)子的表達(dá)盒、載體和轉(zhuǎn)基因植物,還涉及產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物和種子的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1339067SQ00803238
公開日2002年3月6日 申請(qǐng)日期2000年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
發(fā)明者V·格魯伯, F·諾雷, M·泰森 申請(qǐng)人:默里斯坦治療公司