專(zhuān)利名稱(chēng)：L－氨基酸生產(chǎn)菌以及用于生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)領(lǐng)域技術(shù)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法以及在該方法中使用的微生物。
背景技術(shù)：
在工業(yè)上采用短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、青霉屬(Penicillium)、念珠菌屬(Candida)等微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，例如L-賴(lài)氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸。為了提高生產(chǎn)率，使用分離自大自然的菌株或其人工突變體用作這樣的工業(yè)微生物。已經(jīng)公開(kāi)了各種通過(guò)利用重組DNA技術(shù)增強(qiáng)L-谷氨酸生物合成酶的活性的技術(shù)，以提高L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。
通過(guò)培育微生物例如上述微生物以及改進(jìn)生產(chǎn)方法已經(jīng)顯著提高了L-氨基酸的生產(chǎn)能力。但是，為了進(jìn)一步達(dá)到未來(lái)更高的要求，仍然需要開(kāi)發(fā)以更低成本更有效生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
關(guān)于通過(guò)發(fā)酵中醇(可以低成本大量獲得的發(fā)酵原料)生產(chǎn)氨基酸的方法，常規(guī)已知方法采用以下微生物無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)或假單胞菌屬(Pseudomonas)(日本專(zhuān)利公布(Kokoku)號(hào)45-25273/1970)、精朊桿菌屬(Protaminobacter)(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)49-125590/1974)、精朊桿菌屬或甲烷單毛桿菌屬(Methanomonas)(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)50-25790/1975)、微環(huán)菌屬(Microcyclus)(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)52-18886/1977)、甲基菌屬(Methylobacillus)(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)4-91793/1992)、芽胞桿菌屬(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)3-505284/1991)等。
然而，迄今為止已知沒(méi)有利用嗜甲基菌屬細(xì)菌(Methylophilusbacteria)生產(chǎn)L-氨基酸的方法。盡管已知EP 0 035 831 A、EP 0 037 273A和EP 0 066 994 A描述的方法為利用重組DNA轉(zhuǎn)化嗜甲基菌屬細(xì)菌的方法，但是利用重組DNA技術(shù)改進(jìn)嗜甲基菌屬細(xì)菌的氨基酸生產(chǎn)能力仍然不為人們所了解。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供新型L-氨基酸生產(chǎn)菌和利用所述L-氨基酸生產(chǎn)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
本發(fā)明人致力于實(shí)現(xiàn)上述目的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜甲基菌屬(Methylophilus)細(xì)菌適用于生產(chǎn)L-氨基酸。而且，盡管通常認(rèn)為獲得嗜甲基菌屬細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體是困難的(FEMS Microbiology Rev.39，235-258(1986)和Antonie van Leeuwenhoek 53，47-53(1987))，但是本發(fā)明人成功獲得了所述細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體。因此完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供以下細(xì)菌(1)一種具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌。
(2)按照(1)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸或L-蘇氨酸。
(3)按照(1)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，它可耐受L-氨基酸類(lèi)似物或L-氨基酸輔源營(yíng)養(yǎng)(auxotrophy)。
(4)按照(1)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中L-氨基酸生物合成酶活性提高。
(5)按照(1)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和天冬氨酸激酶活性提高，而且所述細(xì)菌具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
(6)按照(1)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性提高，而且所述細(xì)菌具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
(7)按照(1)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中天冬氨酸激酶活性提高，而且所述細(xì)菌具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
(8)按照(5)-(7)任一項(xiàng)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中選自天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸鹽還原酶和二氨基庚二酸鹽脫羧酶的一種、兩種或三種酶的一種或多種活性提高。
(9)按照(5)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中所述二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和所述天冬氨酸激酶活性提高，因?yàn)榫幋a不影響L-賴(lài)氨酸的反饋抑制的二氫吡啶二羧酸鹽合酶的DNA和編碼不影響L-賴(lài)氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶的DNA通過(guò)導(dǎo)入轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(10)按照(1)的細(xì)菌，其中天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的活性提高，而且所述細(xì)菌具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力。
(11)按照(1)-(10)任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述嗜甲基菌屬細(xì)菌是甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌。
(12)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，它包括用培養(yǎng)基培養(yǎng)以上(1)-(11)任一項(xiàng)定義的嗜甲基菌屬細(xì)菌，在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累L-氨基酸以及從所述培養(yǎng)物收集L-氨基酸。
(13)按照(12)的方法，其中所述培養(yǎng)基包含用作主要碳源的甲醇。
(14)一種生產(chǎn)L-氨基酸含量增高的嗜甲基菌屬細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞的方法，包括用培養(yǎng)基培養(yǎng)以上(1)-(11)任一項(xiàng)定義的嗜甲基菌屬細(xì)菌，以在所述細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生并累積L-氨基酸。
(15)按照(14)的生產(chǎn)嗜甲基菌屬細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞的方法，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸或L-蘇氨酸。
(16)一種編碼以下(A)或(B)定義的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白，或
(B)具有包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白，而且具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。
(17)按照(16)的DNA，它為以下(a)或(b)定義的DNA(a)具有包含SEQ ID NO5第510-1736號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(b)可與具有SEQ ID NO5第510-1736號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針在嚴(yán)格條件下雜交，而且編碼具有天冬氨酸激酶活性的蛋白的DNA。
(18)編碼以下(C)或(D)定義的蛋白的DNA(C)具有SEQ ID NO8氨基酸序列的蛋白，或(D)具有包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO8氨基酸序列，而且具有天冬氨酸半醛脫氫酶活性的蛋白。
(19)按照(18)的DNA，它為以下(c)或(d)定義的DNA(c)具有包含SEQ ID NO7第98-1207號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(d)可與具有SEQ ID NO7第98-1207號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針在嚴(yán)格條件下雜交，而且編碼具有天冬氨酸半醛脫氫酶活性的蛋白的DNA。
(20)編碼以下(E)或(F)定義的蛋白的DNA(E)具有SEQ ID NO10氨基酸序列的蛋白，或(F)具有包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO10氨基酸序列，而且具有二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性的蛋白。
(21)按照(20)的DNA，它為以下(e)或(f)定義的DNA(e)具有包含SEQ ID NO9第1268-2155號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或
(f)可與具有SEQ ID NO9第1268-2155號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針在嚴(yán)格條件下雜交，而且編碼具有二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性的蛋白的DNA。
(22)編碼以下(G)或(H)定義的蛋白的DNA(G)具有SEQ ID NO12氨基酸序列的蛋白，或(H)具有包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO12氨基酸序列，而且具有二氫吡啶二羧酸鹽還原酶活性的蛋白。
(23)按照(22)的DNA，它為以下(g)或(h)定義的DNA(g)具有包含SEQ ID NO11第2080-2883號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(h)可與具有SEQ ID NO11第2080-2883號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針在嚴(yán)格條件下雜交，而且編碼具有二氫吡啶二羧酸鹽還原酶活性的蛋白的DNA。
(24)編碼以下(I)或(J)定義的蛋白的DNA(I)具有SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白，或(J)具有包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO14氨基酸序列，而且具有二氨基庚二酸鹽脫羧酶活性的蛋白。
(25)按照(24)的DNA，它為以下(i)或(j)定義的DNA(i)具有包含SEQ ID NO13第751-1995號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(j)可與具有SEQ ID NO13第751-1995號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針在嚴(yán)格條件下雜交，而且編碼具有二氨基庚二酸鹽脫羧酶活性的蛋白的DNA。
在此說(shuō)明書(shū)中，“L-氨基酸生產(chǎn)能力”是指在培養(yǎng)基中積累顯著量L-氨基酸或當(dāng)用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明微生物時(shí)微生物細(xì)胞中氨基酸含量提高的能力。
附圖簡(jiǎn)述


圖1圖示具有突變的dapA的質(zhì)粒RSF24P的產(chǎn)生過(guò)程?！癲apA*24”是指編碼突變DDPS的突變dapA，其中118-組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代。
圖2圖示具有突變的dapA和突變的lysC的質(zhì)粒RSFD80的產(chǎn)生過(guò)程?！發(fā)ysC*80”是指編碼其中352-蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代的突變AKIII的突變lysC。
圖3圖示含有ask基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體菌株的天冬氨酸激酶活性。
圖4圖示含有asd基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體菌株的天冬氨酸半醛脫氫酶活性。
圖5圖示含有dapA基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體菌株的二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性。
圖6圖示含有dapB基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體菌株的二氫吡啶二羧酸鹽還原酶活性。
圖7圖示含有l(wèi)ysA基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體菌株的二氨基庚二酸鹽脫羧酶活性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式<1>本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物是屬于嗜甲基菌屬而且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌。本發(fā)明的嗜甲基菌屬細(xì)菌包括例如食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)AS1菌株(NCIMB10515)等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)可得自National Collections of Industrialand Marine Bacteria(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station 135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)。
按照本發(fā)明生產(chǎn)的L-氨基酸包括L-賴(lài)氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸等?？缮a(chǎn)一種或多種這樣的氨基酸。
賦予嗜甲基菌屬細(xì)菌野生型菌株L-氨基酸生產(chǎn)能力則可獲得具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌。為了獲得L-氨基酸生產(chǎn)能力，可使用常規(guī)用于培育棒狀桿菌(coryneform)、埃希氏菌屬細(xì)菌等的方法，例如獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株、L-氨基酸類(lèi)似物抗性菌株或代謝控制突變菌株的方法，以及可使用用于產(chǎn)生L-氨基酸生物合成酶活性增強(qiáng)的重組菌株的方法(參閱“氨基酸發(fā)酵”，the Japan ScientificSocieties Press[Gakkai Shuppan Center]，第一版，1986年5月30日公布，第77-100頁(yè))。培育氨基酸生產(chǎn)菌時(shí)，可賦予1種或同時(shí)賦予2種或更多種特性，例如輔源營(yíng)養(yǎng)、L-氨基酸類(lèi)似物抗性和代謝控制突變。一種或同時(shí)2種或更多種L-氨基酸生物合成酶活性增強(qiáng)。而且，可在增強(qiáng)L-氨基酸生物合成酶活性的同時(shí)具有所述特性，例如輔源營(yíng)養(yǎng)、L-氨基酸類(lèi)似物抗性和代謝控制突變。
例如，L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌可培育為L(zhǎng)-高絲氨酸或L-蘇氨酸和L-蛋氨酸輔源營(yíng)養(yǎng)的突變體(日本專(zhuān)利公布(Kokoku)號(hào)48-28078/1973和56-6499/1981)、肌醇或醋酸輔源營(yíng)養(yǎng)的突變體(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)55-9784/1980和56-8692/1981)或氧代賴(lài)氨酸、異羥肟酸賴(lài)氨酸、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、γ-甲基賴(lài)氨酸、α-氯己內(nèi)酰胺、DL-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺、α-氨基-月桂酰內(nèi)酰胺、天冬氨酸類(lèi)似物、磺胺類(lèi)藥物、醌型或N-月桂酰亮氨酸抗性突變體。
此外，L-谷氨酸生產(chǎn)菌可培育為油酸等輔源營(yíng)養(yǎng)突變體。L-蘇氨酸生產(chǎn)菌可培育為α-氨基-β-羥基纈氨酸抗性突變體。L-高絲氨酸生產(chǎn)菌可培育為L(zhǎng)-蘇氨酸輔源營(yíng)養(yǎng)突變體或L-苯丙氨酸類(lèi)似物抗性突變體。L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌可培育為L(zhǎng)-酪氨酸輔源營(yíng)養(yǎng)突變體。L-異亮氨酸生產(chǎn)菌可培育為L(zhǎng)-亮氨酸輔源營(yíng)養(yǎng)突變體。L-脯氨酸生產(chǎn)菌可培育為L(zhǎng)-異亮氨酸輔源營(yíng)養(yǎng)突變體。
而且，如下文實(shí)施例所述，可以獲得為酪蛋白氨基酸輔源營(yíng)養(yǎng)菌株的生產(chǎn)一種或多種支鏈氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸)的菌株。
為了獲得嗜甲基菌屬細(xì)菌突變體，本發(fā)明者首次采用鏈霉素抗性菌株出現(xiàn)頻率作為指標(biāo)詳細(xì)檢測(cè)了最佳突變條件。結(jié)果當(dāng)突變后存活率約0.5％時(shí)獲得最大出現(xiàn)頻率的鏈霉素抗性菌株，成功在此條件下獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。他們還相對(duì)于以前對(duì)大腸桿菌等進(jìn)行篩選而言，大規(guī)模篩選突變體，成功獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，曾經(jīng)認(rèn)為這是困難的。
如上所述，因?yàn)橐阎诤线m條件下通過(guò)誘變嗜甲基菌屬細(xì)菌可獲得突變體，所以根據(jù)突變方法，適當(dāng)設(shè)定誘變后存活率約0.5％的條件可容易地獲得所需要的突變體。
用嗜甲基菌屬細(xì)菌獲得突變體的誘變方法包括UV輻射和用用于常規(guī)誘變處理的誘變劑處理，例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸。通過(guò)選擇嗜甲基菌屬細(xì)菌的天然突變體也可以獲得具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌。
如下可獲得L-氨基酸類(lèi)似物抗性突變體例如，使誘變的嗜甲基菌屬細(xì)菌接種到含不同濃度L-氨基酸類(lèi)似物的瓊脂培養(yǎng)基中，選擇形成菌落的菌株。
如下可獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體使嗜甲基菌屬細(xì)菌在含目標(biāo)營(yíng)養(yǎng)素(例如L-氨基酸)的瓊脂培養(yǎng)基中形成菌落，將所述菌落復(fù)制到不合所述營(yíng)養(yǎng)素的瓊脂培養(yǎng)基中，選擇不能在不含所述營(yíng)養(yǎng)素的瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株。
以下例舉通過(guò)增強(qiáng)L-氨基酸生物合成酶活性賦予或增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法。[L-賴(lài)氨酸]例如通過(guò)增強(qiáng)二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性可獲得L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
可如下增強(qiáng)嗜甲基菌屬細(xì)菌的二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性使編碼二氫吡啶二羧酸鹽合酶的基因片段和/或編碼天冬氨酸激酶的基因片段與一種在嗜甲基菌屬細(xì)菌中具有功能的載體、優(yōu)選多拷貝型載體連接，獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入嗜甲基菌屬細(xì)菌宿主，以轉(zhuǎn)化所述宿主。由于編碼二氫吡啶二羧酸鹽合酶的基因和/或編碼天冬氨酸激酶的基因在轉(zhuǎn)化體菌株細(xì)胞中的拷貝數(shù)增加，所以其活性增強(qiáng)。此后也分別以縮寫(xiě)DDPS、AK和AKIII表示二氫吡啶二羧酸鹽合酶、天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III。
關(guān)于提供編碼DDPS的基因和編碼AK的基因的微生物，可使用任何微生物，前提是它們含有在嗜甲基菌屬細(xì)菌微生物中能夠表達(dá)DDPS活性和AK活性的基因。這樣的微生物可以是野生型菌株或其突變菌株。具體來(lái)說(shuō)，這樣的微生物實(shí)例包括大腸桿菌K-12菌株、食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)等。由于從埃希氏菌屬細(xì)菌獲得的DDPS編碼基因(dapA，Richaud，F(xiàn).等，J.Bacteriol.，297，(1986))和AKIII編碼基因(lysC，Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))的核苷酸序列均已經(jīng)知道，所以可用根據(jù)這些基因的核苷酸序列合成的引物和用諸如大腸桿菌K-12等的微生物的染色體DNA作為模板通過(guò)PCR獲得這些基因。作為具體實(shí)例，以下說(shuō)明衍生自大腸桿菌的dapA和lysC。但是，用于本發(fā)明的基因不限于它們。
最好是用于本發(fā)明的DDPS和AK不受L-賴(lài)氨酸的反饋抑制影響。已知得自大腸桿菌的野生型DDPS受L-賴(lài)氨酸的反饋抑制，而得自大腸桿菌的野生型AKIII受L-賴(lài)氨酸的抑制和反饋抑制。因此，導(dǎo)入嗜甲基菌屬細(xì)菌的dapA和lysC最好編碼具有對(duì)L-賴(lài)氨酸的反饋抑制不敏感的突變的DDPS和AKIII。此后，具有對(duì)L-賴(lài)氨酸反饋抑制不敏感的突變的DDPS也稱(chēng)為“突變DDPS”，而編碼突變DDPS的DNA也稱(chēng)為“突變dapA”。具有對(duì)L-賴(lài)氨酸的反饋抑制不敏感的突變的得自大腸桿菌的AKIII也稱(chēng)為“突變AKIII”，而編碼突變AKIII的DNA也稱(chēng)為“突變lysC”。
按照本發(fā)明，DDPS和AK不一定需要是突變DDPS和AK。已知例如原產(chǎn)于棒狀桿菌屬細(xì)菌的DDPS不受L-賴(lài)氨酸的反饋抑制影響。
產(chǎn)生自大腸桿菌的野生型dapA的核苷酸序列的范例為SEQ IDNO1。所述核苷酸序列編碼的野生型DDPS的氨基酸序列的范例為SEQ ID NO2。得自大腸桿菌的野生型lysC的核苷酸序列的范例為SEQ ID NO3。所述核苷酸序列編碼的野生型ATIII的氨基酸序列的范例為SEQ ID NO4。
編碼不受L-賴(lài)氨酸反饋抑制的突變DDPS的DNA包括編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的DDPS的DNA，其中所述氨基酸序列中的118-組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代。編碼不受L-賴(lài)氨酸反饋抑制的突變AKIII的DNA包括編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的AKIII的DNA，其中所述氨基酸序列中的352-蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代。
用于基因克隆的質(zhì)粒可以是任何質(zhì)粒，前提是它可在諸如埃希氏菌屬細(xì)菌等的微生物中復(fù)制，具體包括pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等。
在嗜甲基菌屬細(xì)菌中有功能的載體例如為可在嗜甲基菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。具體來(lái)說(shuō)，可以是已提及的廣譜宿主載體RSF1010及其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167，(1986))、pMFY42(Gene，44，53，(1990))、pRP301、pTB70(Nature，287，396，(1980))等。
為了使dapA和lysC連接到在嗜甲基菌屬細(xì)菌中有功能的載體而制備重組DNA，用對(duì)應(yīng)于含dapA和lysC的DNA片段末端的限制酶消化載體。常常采用諸如T4 DNA連接酶的連接酶進(jìn)行連接。dapA和lysC可以各自加入相應(yīng)的載體中或者加入一個(gè)載體中。
關(guān)于含編碼突變DDPS的突變dapA和編碼突變AKIII的突變lysC的質(zhì)粒，已知廣譜宿主質(zhì)粒RSFD80(WO95/16042)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株稱(chēng)為AJ12396，并于1993年10月28日保藏于日本國(guó)際貿(mào)易部工業(yè)科技局的國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏號(hào)為FERM P-13936，于1994年11月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定將其轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERM BP-4859?？捎靡阎椒ㄓ葾J12396菌株獲得RSFD80。
RSFD80包含的突變dapA具有SEQ ID NO1的野生型dapA核苷酸序列，其中第597號(hào)核苷C被T取代。由其編碼的突變DDPS具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中118-組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代。RSFD80包含的突變lysC具有SEQ ID NO3的野生型lysC核苷酸序列，其中第1638號(hào)核苷C被T取代。由其編碼的突變AKIII具有SEQ ID NO4的氨基酸序列，其中352-蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代。
為了將如上所述制備的重組DNA導(dǎo)入嗜甲基菌屬細(xì)菌，可使用任何方法，只要所使用的方法可獲得足夠的轉(zhuǎn)化率。例如可使用電穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。
在嗜甲基菌屬細(xì)菌染色體DNA上存在多拷貝dapA和/或lysC也可以增強(qiáng)DDPS活性和/或AK活性。為了在嗜甲基菌屬細(xì)菌的染色體DNA中導(dǎo)入多拷貝dapA和/或lysC，可采用在嗜甲基菌屬細(xì)菌染色體DNA上存在的多拷貝序列作為靶進(jìn)行同源重組。作為染色體DNA上存在的多拷貝序列，也可以使用重復(fù)DNA、存在于轉(zhuǎn)座因子末端的反向重復(fù)序列等。另一方面，按照日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)2-109985/1990所公開(kāi)的方法，通過(guò)將多拷貝的dapA和/或lysC置于轉(zhuǎn)移它們的轉(zhuǎn)座子上，可將其導(dǎo)入染色體DNA中。在所述兩種方法中，因?yàn)檗D(zhuǎn)化菌株中的dapA和/或lysC的拷貝數(shù)增加，所以應(yīng)該提高DDPS活性和AK活性。
除了上述的增加基因的方法之外，用更強(qiáng)的表達(dá)控制序列代替原有的諸如dapA和/或lysC啟動(dòng)子的控制序列，也可以提高DDPS活性和/或AK活性(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)1-215280/1989)。已知的這樣的強(qiáng)啟動(dòng)子有例如lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ嗜菌體的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、amyE啟動(dòng)子、spac啟動(dòng)子等。取代這些啟動(dòng)子可增強(qiáng)表達(dá)dapA和/或lysC，因此可提高DDPS活性和AK活性?？赏瑫r(shí)增強(qiáng)表達(dá)控制序列和增加dapA和/或lysC的拷貝數(shù)。
為了通過(guò)連接基因片段和載體制備重組DNA，用對(duì)應(yīng)于所述基因片段末端的限制酶消化載體。通常用諸如T4 DNA連接酶的連接酶進(jìn)行連接。關(guān)于DNA的消化方法和連接等、制備染色體DNA、PCR、制備質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)化、設(shè)計(jì)用作引物的寡核苷酸等，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的常規(guī)方法。這樣的方法介紹于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。
除了增強(qiáng)DDPS活性和/或AK活性之外，也可以增強(qiáng)參與L-賴(lài)氨酸生物合成的另一種酶活性。這樣的酶包括二氨基庚二酸途徑酶，例如二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶(關(guān)于所有前述酶參見(jiàn)WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)60-87788/1985)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(日本專(zhuān)利公布(Kokoku)號(hào)6-102028/1994)、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶、天冬氨酸半醛脫氫酶等，或者氨基己二酸途徑酶，例如高烏頭酸水合酶等。最好是天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫羧酶中至少一種酶的活性提高。
下文介紹從食甲基嗜甲基菌獲得的天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫羧酶。
此外，可降低本發(fā)明微生物催化從L-賴(lài)氨酸生物合成途徑分支產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶活性，或者可使這樣的酶缺陷。催化從L-賴(lài)氨酸生物合成途徑分支產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶包括高絲氨酸脫氫酶(參見(jiàn)WO95/23864)。
前述增強(qiáng)參與L-賴(lài)氨酸生物合成的酶的活性的技術(shù)可同樣用于下文的其它氨基酸。[L-谷氨酸]可賦予嗜甲基菌屬細(xì)菌L-谷氨酸生產(chǎn)能力，其方法例如導(dǎo)入編碼以下任何一種酶的DNA谷氨酸脫氫酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)61-268185/1986)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)62-166890/1987和63-214189/1988)、烏頭酸水合酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)62-294086/1987)、檸檬酸合酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)62-201585/1987和63-119688/1988)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)60-87788/1985和62-55089/1987)、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、二磷酸果糖醛縮酶、磷酸果糖激酶(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)63-102692/1988)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(WO99/07853)等。
此外，可降低本發(fā)明微生物催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支產(chǎn)生L-谷氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶活性，或者可使這樣的酶缺陷。催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支產(chǎn)生L-谷氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶包括α-酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、醋酸激酶、醋羥酸合酶、醋乳酸合酶、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。[L-蘇氨酸]例如通過(guò)增強(qiáng)天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的活性可賦予或增強(qiáng)L-蘇氨酸生產(chǎn)能力。例如用包含蘇氨酸操縱子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嗜甲基菌屬細(xì)菌，可增強(qiáng)這些酶的活性門(mén)本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)55-131397/1980、59-31691/1984和56-15696/1981以及日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kohyo)號(hào)3-501682/1991)。
如下也可以賦予或增強(qiáng)L-蘇氨酸生產(chǎn)能力，其方法是增強(qiáng)或?qū)刖哂幸韵禄虻奶K氨酸操縱子編碼對(duì)L-蘇氨酸的反饋抑制不敏感的天冬氨酸激酶的基因(日本專(zhuān)利公布(Kokoku)號(hào)1-29559/1989)、編碼高絲氨酸脫氫酶的基因(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)60-012995/1985)或編碼高絲氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的基因(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)61-195695/1986)。
此外，導(dǎo)入編碼突變磷酸烯醇丙酮酸羧酶的DNA也可以提高L-蘇氨酸生產(chǎn)能力，所述突變磷酸烯醇丙酮酸羧酶具有使其對(duì)天冬氨酸的反饋抑制不敏感的突變。[L-纈氨酸]例如通過(guò)在嗜甲基菌屬細(xì)菌中導(dǎo)入其控制機(jī)制基本脫敏的L-纈氨酸生物合成基因，可賦予L-纈氨酸生產(chǎn)能力。還可以導(dǎo)入基本上對(duì)嗜甲基菌屬微生物攜帶的L-纈氨酸生物合成基因的控制機(jī)制不敏感的突變。
L-纈氨酸生物合成基因的實(shí)例包括例如大腸桿菌的ilvGMEDA操縱子。ilvA基因編碼的蘇氨酸脫氨酶催化使L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮基丁酸的脫氨反應(yīng)，它是L-異亮氨酸生物合成的限速步驟。因此，為了有效進(jìn)行L-纈氨酸合成反應(yīng)，最好是使用不表達(dá)蘇氨酸脫氨酶活性的操縱子。不表達(dá)這樣的蘇氨酸脫氨酶活性的ilvGMEDA操縱子的實(shí)例包括其中消除蘇氨酸脫氨酶活性的突變導(dǎo)入ilvA、或ilvA被破壞的ilvGMEDA操縱子，以及其中缺失ilvA的ilvGMED操縱子。
因?yàn)閕lvGMEDA操縱子受L-纈氨酸和/或L-異亮氨酸和/或L-亮氨酸操縱子表達(dá)控制的影響(減弱作用)，所以最好去除或突變所述減弱作用需要的區(qū)段，使其對(duì)L-纈氨酸表達(dá)的抑制作用不敏感。
通過(guò)對(duì)野生型ilvGMEDA操縱子進(jìn)行突變處理或利用基因重組技術(shù)的方法對(duì)其進(jìn)行改良，可獲得不表達(dá)蘇氨酸脫氨酸活性而且如上所述使其對(duì)減弱作用不敏感的ilvGMEDA操縱子(參見(jiàn)WO96/06926)。[L-亮氨酸]例如，除了生產(chǎn)L-纈氨酸需要的上述特性之外，在嗜甲基菌屬細(xì)菌微生物中導(dǎo)入基本上不受控制機(jī)制影響的L-亮氨酸生物合成基因，可賦予或增強(qiáng)L-亮氨酸生產(chǎn)能力。也可以導(dǎo)入基本消除L-亮氨酸生物合成基因在嗜甲基菌屬細(xì)菌微生物中的控制機(jī)制的突變。這樣的基因?qū)嵗?，例如提供基本消除L-亮氨酸抑制作用的酶的leuA基因。[L-異亮氨酸]例如通過(guò)導(dǎo)入thrABC操縱子和ilvGMEDA操縱子可賦予L-異亮氨酸生產(chǎn)能力，其中thrABC操縱子含有編碼基本對(duì)L-蘇氨酸抑制作用不敏感、得自大腸桿菌的天冬氨酸激酶I/高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因，而ilvGMEDA操縱子含有編碼基本對(duì)L-異亮氨酸抑制作用不敏感的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因而且去除了其減弱作用需要的區(qū)段(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)8-47397/1996)。[其它氨基酸]通過(guò)增強(qiáng)嗜甲基菌屬細(xì)菌的磷酸烯醇丙酮酸鹽生產(chǎn)能力可增強(qiáng)L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的生物合成(WO97/08333)。
通過(guò)增強(qiáng)或?qū)朊撁舴种嶙兾幻?預(yù)苯酸脫水酶(CM-PDT)基因(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)5-236947/1993和62-130693/1987)和脫敏3-脫氧-D-阿拉伯糖庚酮糖酸(arabinoheptulonate)-7-磷酸合酶(DS)基因(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)5-236947/1993和61-124375/1986)，可改善L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的生產(chǎn)能力。
通過(guò)增強(qiáng)或?qū)牒幋a脫敏鄰氨基苯甲酸合酶的基因色氨酸操縱子，可改善L-色氨酸生產(chǎn)能力(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)57-71397/1982、62-244382/1987和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,371,614)。
在本說(shuō)明書(shū)中，表述“增強(qiáng)酶活性”通常是指所述酶的細(xì)胞內(nèi)活性高于野生型菌株，而且當(dāng)利用基因重組技術(shù)等修飾而獲得的所述酶活性增強(qiáng)的菌株時(shí)，所述酶的細(xì)胞內(nèi)活性高于修飾前的所述菌株。表述“降低酶活性”通常是指所述酶的細(xì)胞內(nèi)活性低于野生型菌株，而且當(dāng)利用基因重組技術(shù)等修飾而獲得的所述酶活性降低的菌株時(shí)，所述酶的細(xì)胞內(nèi)活性低于修飾前的所述菌株。
如下可生產(chǎn)L-氨基酸在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有如上所述獲得的L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌，以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并累積L-氨基酸，以及從所述培養(yǎng)物收集所述L-氨基酸。
通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌，以在所述細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生并累積L-氨基酸，從而可產(chǎn)生與嗜甲基菌屬細(xì)菌野生型菌株相比，L-氨基酸含量提高的嗜甲基菌屬細(xì)菌細(xì)胞。
采用常規(guī)用于培養(yǎng)具有甲醇同化特性的微生物的方法培養(yǎng)用于本發(fā)明的微生物。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是可以是天然或合成培養(yǎng)基，只要它含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子和其它需要的微量有機(jī)成分。
采用甲醇作為主要碳源，可以低成本制備L-氨基酸。當(dāng)甲醇用作主要碳源時(shí)，常常在培養(yǎng)基中加入0.001-30％量的甲醇。在培養(yǎng)基中加入硫酸銨等用作氮源。除了這些成分之外，通常還要加入少量微量成分，例如磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳。
常常在pH 5-9和20-45℃溫度下，例如通過(guò)振搖或攪拌通氣獲得的有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，而且通常在24-120小時(shí)內(nèi)完成培養(yǎng)。
常規(guī)可聯(lián)合使用諸如離子交換樹(shù)脂、沉淀等的已知方法從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸。
此外，可用分離微生物細(xì)胞的常規(guī)方法使嗜甲基菌屬細(xì)菌細(xì)胞與培養(yǎng)基分離。<2>本發(fā)明的基因本發(fā)明的DNA為編碼以下一種得自食甲基嗜甲基菌的酶的基因天冬氨酸激酶(此后也簡(jiǎn)寫(xiě)為“AK”)、天冬氨酸半醛脫氫酶(此后也簡(jiǎn)寫(xiě)為“ASD”)、二氫吡啶二羧酸合酶(此后也簡(jiǎn)寫(xiě)為“DDPS”)、二氫吡啶二羧酸還原酶(此后也簡(jiǎn)寫(xiě)為“DDPR”)和二氨基庚二酸脫羧酶(此后也簡(jiǎn)寫(xiě)為“DPDC”)。
本發(fā)明的DNA可如下獲得例如用食甲基嗜甲基菌基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC缺陷型微生物突變菌株，以及選擇恢復(fù)輔源營(yíng)養(yǎng)的克隆。
例如可如下制備食甲基嗜甲基菌基因文庫(kù)。首先，利用Saito等的方法(Saito，H.和Miura，K.，Biochem.Biophys.Acta 72，619-629，(1963))等從食甲基嗜甲基菌野生菌株如食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)制備總?cè)旧wDNA，用合適的限制酶例如Sau3AI或AluI部分消化，獲得各種片段的混合物。通過(guò)調(diào)節(jié)消化反應(yīng)時(shí)間等可控制消化程度，可使用各種各樣的限制酶。
然后，使消化的染色體DNA片段與可在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA連接，獲得重組DNA。具體來(lái)說(shuō)，用產(chǎn)生與用于消化染色體DNA的限制酶產(chǎn)生的末端核苷酸序列相同的限制酶作用于載體DNA，使其完全消化并切割所述載體。然后混合染色體DNA片段混合物和消化并切割的載體DNA，使連接酶、優(yōu)選T4 DNA連接酶作用于所述混合物，獲得重組DNA。
如下可獲得基因文庫(kù)溶液利用所獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，例如大腸桿菌JM109菌株等，以及用轉(zhuǎn)化體的液體培養(yǎng)物制備重組DNA?？蓱?yīng)用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 68，326(1979))、用氯化鈣處理接受細(xì)胞以便提高DNA滲透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))等進(jìn)行所述轉(zhuǎn)化。在下文提及的實(shí)施例中使用電穿孔。
上述載體的實(shí)例有所述及的pUC19、pUC18、pUC118、pUC119、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pSTV28、pSTV29等。也可以使用嗜菌體載體。因?yàn)槔鏿UC118和pUC119含有氨芐青霉素抗性基因，而pSTV28和pSTV29含有氯霉素抗性基因，因此使用含有氨芐青霉素或氯霉素的培養(yǎng)基，則只有帶有載體或重組DNA的轉(zhuǎn)化體才能夠生長(zhǎng)。
關(guān)于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以及從細(xì)菌細(xì)胞收集重組DNA的方法，可提及堿性SDS法等。
用如上所述獲得的食甲基嗜甲基菌基因文庫(kù)溶液轉(zhuǎn)化AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC缺陷型突變微生物菌株，以及選擇恢復(fù)輔源營(yíng)養(yǎng)的克隆。
AK缺陷型突變微生物菌株的實(shí)例包括編碼AK的三種基因(thrA、metLM、lysC)缺陷的大腸桿菌GT3。ASD缺陷型突變微生物菌株的實(shí)例包括大腸桿菌Hfr3000 U482(CGSC 5081菌株)。DDPS缺陷型突變微生物菌株的實(shí)例包括大腸桿菌AT997(CGSC 4547菌株)。DDPR缺陷型突變微生物菌株的實(shí)例包括大腸桿菌AT999(CGSC 4549菌株)。DPDC缺陷型突變微生物菌株的實(shí)例包括大腸桿菌AT2453(CGSC 4505菌株)。這些突變菌株可得自大腸桿菌遺傳保藏中心(the Yale University，Department of Biology，Osborn Meorial Labs.，P.O.Box 6666，New Haven 06511-7444，Connecticut，U.S.)。
盡管所有上述突變菌株不能在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是含有編碼AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的基因的轉(zhuǎn)化體菌株可在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)檫@些基因在轉(zhuǎn)化體中發(fā)揮作用。所以，通過(guò)選擇能夠在所述基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體菌株，并從所述菌株收集重組DNA，就可獲得含編碼各種酶的基因的DNA片段。大腸桿菌AT999(CGSC 4549菌株)即使在完全培養(yǎng)基例如L培養(yǎng)基中，當(dāng)其中不加入二氨基庚二酸時(shí)，其生長(zhǎng)速率極其緩慢。但是，可觀測(cè)到其含有編碼得自食甲基嗜甲基菌的DDPR的基因的轉(zhuǎn)化體菌株因?yàn)樗龌蚱鹱饔枚ＩL(zhǎng)。因此，通過(guò)選擇在L培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體菌株也可以獲得含編碼DDPR基因的轉(zhuǎn)化體菌株。
從所獲得的重組DNA提取插入DNA片段并測(cè)定其核苷酸序列，可確定每種酶的氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。
編碼本發(fā)明AK的基因(此后也稱(chēng)為“ask”)編碼具有序列表所示SEQ ID NO6的氨基酸序列的AK。關(guān)于ask基因的具體實(shí)例，可提及具有SEQ ID NO5核苷酸組成的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的ask基因可以具有這樣的序列各氨基酸的對(duì)應(yīng)密碼子可被等同密碼子取代，只要它編碼與SEQ ID NO6氨基酸序列相同的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明ASD的基因(此后也稱(chēng)為“asd”)編碼具有序列表所示SEQ ID NO8氨基酸序列的ASD。關(guān)于asd基因的具體實(shí)例，可提及含有SEQ ID NO7的第98-1207號(hào)核苷酸組成的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的asd基因可以具有這樣的序列各氨基酸的對(duì)應(yīng)密碼子可被等同密碼子取代，只要它編碼與SEQ ID NO8氨基酸序列相同的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明DDPS的基因(此后也稱(chēng)為“dapA”)編碼具有序列表所示SEQ ID NO10氨基酸序列的DDPS。關(guān)于dapA基因的具體實(shí)例，可提及具有SEQ ID NO9的第1268-2155號(hào)核苷酸組成的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的dapA基因可以具有這樣的序列各氨基酸的對(duì)應(yīng)密碼子可被等同密碼子取代，只要它編碼與SEQ ID NO10氨基酸序列相同的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明DDPR的基因(此后也稱(chēng)為“dapB”)編碼具有序列表所示SEQ ID NO12氨基酸序列的DDPR。關(guān)于dapB基因的具體實(shí)例，可提及具有SEQ ID NO11的第2080-2883號(hào)核苷酸組成的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的dapB基因可以具有這樣的序列各氨基酸的對(duì)應(yīng)密碼子可被等同密碼子取代，只要它編碼與SEQ ID NO12氨基酸序列相同的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明DPDC的基因(此后也稱(chēng)為“l(fā)ysA”)編碼具有序列表所示SEQ ID NO14氨基酸序列的DPDC。關(guān)于lysA基因的具體實(shí)例，可提及具有SEQ ID NO13的第751-1995號(hào)核苷酸組成的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的lysA基因可以具有這樣的序列各氨基酸的對(duì)應(yīng)密碼子可被等同密碼子取代，只要它編碼與SEQ ID NO14氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的各酶基因可具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO6、8、10、12或14各氨基酸序列的氨基酸序列，其中包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，而且編碼具有AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性的蛋白。本文使用的表述“一個(gè)或數(shù)個(gè)”優(yōu)選為1-10個(gè)、更優(yōu)選1-5個(gè)、更優(yōu)選1-2個(gè)。
編碼與AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC基本相同的蛋白的DNA，例如上述DNA，它們可如下獲得例如通過(guò)定點(diǎn)誘變修飾各核苷酸序列，使得所述氨基酸序列在特定位點(diǎn)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位。利用常規(guī)誘變處理也可以獲得上述修飾DNA。誘變處理的實(shí)例包括用羥胺等體外處理編碼AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的DNA，利用UV輻射或用于常規(guī)誘變處理的誘變劑(如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸)處理含編碼AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的基因的諸如埃希氏菌屬細(xì)菌的微生物。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位包括天然突變(突變或變異)，例如根據(jù)含AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC等的微生物種間差異或菌株間差異觀測(cè)到的突變。
如下可獲得編碼與AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC基本相同的蛋白的DNA使具有如上所述突變的DNA在合適的細(xì)胞中表達(dá)，以及檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性。采用以下方法也可以獲得編碼與AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC基本相同的蛋白的DNA從編碼AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的突變DNA或含其中一種DNA的細(xì)胞中分離可與探針在嚴(yán)格條件下雜交而且編碼具有AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性的蛋白的DNA，其中所述探針含有一種選自以下的核苷酸序列包含SEQ ID NO5第510-1736號(hào)核苷酸的核苷酸序列、包含SEO IDNO7第98-1207號(hào)核苷酸的核苷酸序列、包含SEQ ID NO9第1268-2155號(hào)核苷酸的核苷酸序列、包含SEQ ID NO11第2080-2883號(hào)核苷酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO13第751-1995號(hào)核苷酸的核苷酸序列、或這些核苷酸序列的一部分。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，具有核苷酸序列或其部分是指具有所述核苷酸序列或其部分或其互補(bǔ)核苷酸。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指允許形成所謂的特異性雜交體而不允許形成非特異性雜交體的條件。該條件可隨所述探針的核苷酸序列和長(zhǎng)度而不同。但是，它可以為例如允許高度同源DNA例如具有40％或更高同源性的DNA雜交，而不允許以上定義同源性以下的DNA雜交的條件，或者為在常規(guī)DNA雜交洗滌條件60℃溫度以及相當(dāng)于1×SSC和0.1％SDS、優(yōu)選0.1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下允許雜交的條件。
各基因的部分序列也可以用作探針。可以采用根據(jù)各基因的核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物以及含各基因的DNA片段作為模板經(jīng)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))制得這樣的探針。當(dāng)具有約300bp長(zhǎng)度的DNA片段用作探針時(shí)，雜交的洗滌條件可以為例如50℃，2×SSC和0.1％SDS。
可在如上所述的條件下雜交的基因還包括在其序列中存在中止密碼子的基因以及編碼因?yàn)榛钚灾行耐蛔兌辉倬哂谢钚缘拿傅幕?。但是這樣的基因容易通過(guò)將其與市售活性表達(dá)載體連接以及檢測(cè)AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性而去除。
因?yàn)楸景l(fā)明揭示了得自食甲基嗜甲基菌的編碼AK、ASD、DDPS、DDPR和DPDC的基因的核苷酸序列，所以可通過(guò)采用根據(jù)所述序列制備的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，從食甲基嗜甲基菌基因文庫(kù)獲得編碼AK、ASD、DDPS、DDPR和DPDC的DNA序列。此外，編碼這些酶的DNA序列也可以采用根據(jù)上述核苷酸序列制備的寡核苷酸引物通過(guò)PCR從食甲基嗜甲基菌染色體DNA擴(kuò)增獲得。
可適當(dāng)利用上述基因增強(qiáng)嗜甲基菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的能力。實(shí)施例參照下文的以下實(shí)施例進(jìn)一步具體解釋本發(fā)明。
除非另有說(shuō)明，否則所用試劑均得自Wako Pure Chemicals或Nakarai Tesque。各實(shí)施例所用培養(yǎng)基成分如下。所有培養(yǎng)基用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH。(L培養(yǎng)基)細(xì)菌用胰蛋白胨(DIFCO) 10g/L酵母提取物(DIFCO) 5g/L氯化鈉5g/L[于120℃蒸汽滅菌20分鐘](L瓊脂培養(yǎng)基)L培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(DIFCO) 15g/L[于120℃蒸汽滅菌20分鐘](SOC培養(yǎng)基)細(xì)菌用胰蛋白胨(DIFCO) 20g/L酵母提取物(DIFCO) 5g/L10mM氯化鈉2.5mM氯化鉀10mM硫酸鎂10mM氯化鎂20mM葡萄糖[除了鎂溶液和葡萄糖之外其他各組分蒸汽滅菌(120℃，20分鐘)，然后加入通過(guò)0.22μm濾膜除菌的2M鎂貯藏液(1M硫酸鎂、1M氯化鎂)和2M葡萄糖溶液，再使所述混合物通過(guò)0.22μm濾膜除菌](121M1培養(yǎng)基)K2HPO41.2g/LKH2PO40.62g/LNaCl 0.1g/L(NH4)2SO40.5g/LMgSO4·7H2O0.2g/LCaCl2·6H2O0.05g/LFeCl3·6H2O1.0mg/LH3BO310μg/LCuSO4·5H2O5μg/LMnSO4·5H2O10μg/LZnSO4·7H2O70μg/LNaMoO4·2H2O 10μg/LCoCl2·6H2O5μg/L1％(v/v)甲醇，pH 7.0[除了甲醇之外，其他所有成分均于121℃蒸汽滅菌15分鐘。在所述成分充分冷卻后，加入甲醇。](121生產(chǎn)培養(yǎng)基成分)甲醇 2％磷酸氫二鉀 0.12％磷酸鉀 0.062％氯化鈣六水合物 0.005％硫酸鎂七水合物 0.02％氯化鈉 0.01％氯化鐵六水合物 1.0mg/L硫酸銨 0.3％硫酸銅五水合物 5μg/L硫酸錳五水合物 10μg/L鉬酸鈉二水合物 10μg/L硼酸 10μg/L硫酸鋅七水合物 70μg/L氯化鈷六水合物 5μg/L碳酸鈣(Kanto Kagaku) 3％(pH7.0)(121M1瓊脂培養(yǎng)基)121M1培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(DIFCO)15g/L[除了甲醇之外，其他所有成分均于121℃蒸汽滅菌15分鐘。在所述成分充分冷卻后，加入甲醇。](M9基本培養(yǎng)基)Na2HPO4·12H2O 16g/LKH2PO43g/LNaCl0.5g/LNH4Cl 1g/LMgSO4·7H2O 246.48mg/L葡萄糖 2g/LpH7.0[分別滅菌(120℃，20分鐘)并加入硫酸鎂和葡萄糖。根據(jù)需要加入適量氨基酸和維生素。](M9基本瓊脂培養(yǎng)基)M9基本培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(DIFCO)15g/L實(shí)施例1制備L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌(1)(1)在嗜甲基菌屬細(xì)菌中導(dǎo)入突變lysC和突變dapA采用包含突變lysC和突變dapA的已知質(zhì)粒RSFD80(參見(jiàn)WO95/16042)將所述基因?qū)胧燃谆鷮偌?xì)菌。RSFD80是得自廣泛宿主譜的載體質(zhì)粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，16，161-167，(1986))的質(zhì)粒pVIC40(國(guó)際公布WO90/04636，日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kohyo)號(hào)3-501682/1991)，質(zhì)粒pAYC32是RSF1010的衍生物，其中從大腸桿菌獲得的突變dapA和突變lysC以該順序位于pVIC40四環(huán)素抗性基因的啟動(dòng)子(tetP)下游，使所述基因的轉(zhuǎn)錄方向相對(duì)于tetP是常規(guī)方向。突變dapA編碼118-組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代的突變DDPS。突變lysC編碼352-蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代的突變AKIII。
如下構(gòu)建RSFD80。如
圖1所示，使質(zhì)粒pdapAS24上的突變dapA在四環(huán)素抗性基因啟動(dòng)子的下游部位連接到pVIC40，獲得RSF24P。然后如圖2所示，用RSF24P和含有突變lysC的pLLC*80制備具有突變dapA和突變lysC的質(zhì)粒RSFD80。也就是說(shuō)，盡管pVIC40含有一個(gè)蘇氨酸操縱子，但是在RSFD80中該蘇氨酸操縱子被含突變dapA的DNA片段和含突變lysC的DNA片段取代。
用KSFD80質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株稱(chēng)為AJ12396，而且于1993年10月28日保存于日本國(guó)際貿(mào)易部工業(yè)科技局的國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofInternational Trade and Industry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏號(hào)為FERM P-13936，根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定于1994年11月1日轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERMBP-4859。
在30ml含有20mg/L鏈霉素的LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)大腸桿菌AJ1239菌株12小時(shí)，用Wizard+Midipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega銷(xiāo)售)從所獲得的細(xì)胞中純化RSFD80質(zhì)粒。
通過(guò)電穿孔將如上所述制備的RSFD80質(zhì)粒導(dǎo)入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。關(guān)于對(duì)照，使用于制備RSFD80質(zhì)粒的pVIC40質(zhì)粒中的編碼蘇氨酸操縱子的DNA區(qū)缺失，從而制備只含有所述載體區(qū)的pRS質(zhì)粒(參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kohyo)號(hào)3-501682/1991)，以用于RSFD80的相同方法將pRS質(zhì)粒導(dǎo)入AS1菌株。(2)含有得自大腸桿菌的突變lysC和突變dapA的嗜甲基菌屬細(xì)菌的AKIII活性用含有RSFD80質(zhì)粒的食甲基嗜甲基菌AS1菌株(下文也稱(chēng)為“AS1/RSFD80”)和含有pRS質(zhì)粒的食甲基嗜甲基菌AS1菌株(下文也稱(chēng)為“AS1/pRS”)制備無(wú)細(xì)胞提取物，并檢測(cè)AK活性。如下制備無(wú)細(xì)胞提取物(粗酶溶液)。將AS1/RSFD80菌株和AS1/pRS菌株分別接種到含有20mg/L鏈霉素的上述成分的121生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)34小時(shí)，然后去除碳酸鈣以及收獲細(xì)胞。
在0℃條件下用0.2％KCl洗滌如上所述獲得的細(xì)菌細(xì)胞，將其懸浮在含10mM硫酸鎂、0.8M硫酸銨和0.03Mβ-巰基乙醇的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中，超聲破壞(0℃，200W，10分鐘)細(xì)菌細(xì)胞。超聲細(xì)胞懸浮液于0℃下以33,000rpm離心30分鐘，分離上清液。向上清液中加入硫酸銨至80％飽和，混合物于0℃放置1小時(shí)，離心。沉淀物用含10mM硫酸鎂、0.8M硫酸銨和0.03Mβ-巰基乙醇的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7)溶解。
按照Stadtman方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236，2033(1961)，測(cè)量AK活性。也就是說(shuō)，使具有下列成分的反應(yīng)溶液于30℃溫育45分鐘，加入氯化鐵溶液(2.8N鹽酸0.4ml、12％TCA0.4ml、5％氯化鐵六水合物/0.1N鹽酸0.7ml)顯色。離心反應(yīng)溶液，檢測(cè)上清液在540nm的吸光度?；钚砸?分鐘產(chǎn)生的異羥肟酸量表示(1U＝1μM/min)。摩爾消光系數(shù)設(shè)定為600。不含天冬氨酸鉀的反應(yīng)溶液用作空白管。檢測(cè)酶活性時(shí)，在所述酶反應(yīng)溶液中加入不同濃度L-賴(lài)氨酸，檢測(cè)L-賴(lài)氨酸的抑制程度。結(jié)果見(jiàn)表1。(反應(yīng)溶液組成)反應(yīng)混合物*10.3ml羥胺溶液*20.2ml0.1M天冬氨酸鉀(pH7.0) 0.2ml酶溶液 0.1ml水(平衡用) 總計(jì)1ml*11M Tris-HCl(pH8.1)9ml，0.3M硫酸鎂0.5ml和0.2M ATP(pH7.0)5ml*2臨用前用氫氧化鉀中和的8M羥胺溶液表1

*1nM/分鐘/mg蛋白*2存在5mM L-賴(lài)氨酸的活性保留率如表1所示，導(dǎo)入RSFD80質(zhì)粒使AK活性增加約1.7倍。此外，還證實(shí)RSFD80質(zhì)粒編碼的大腸桿菌產(chǎn)生的AK對(duì)L-賴(lài)氨酸的抑制作用完全脫敏。而且，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的L-賴(lài)氨酸不能抑制AS1菌株本身具有的AK活性。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在反應(yīng)溶液存在L-賴(lài)氨酸和L-蘇氨酸各2 mM時(shí)，AS1菌株的AK被100％抑制(協(xié)同抑制)。(3)用由大腸桿菌獲得的含有突變lysC和dapA的嗜甲基菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸然后將AS1/RSFD80菌株和AS1/pRS菌株接種到含20mg/L鏈霉素的121生產(chǎn)培養(yǎng)基，于37℃振搖培養(yǎng)34小時(shí)。完成培養(yǎng)后，離心去除細(xì)菌細(xì)胞和碳酸鈣，用氨基酸分析儀(JASCO Corporation[NihonBunko]，高效液相層析)檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中的L-賴(lài)氨酸濃度。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2

實(shí)施例2制備L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌(2)(1)在廣宿主譜的載體中導(dǎo)入tac啟動(dòng)子區(qū)為了生產(chǎn)大量參與食甲基嗜甲基菌L-賴(lài)氨酸(Lys)生物合成的酶，使用tac啟動(dòng)子用于基因表達(dá)所述目的酶。tac啟動(dòng)子常常用于大腸桿菌。
采用pKK233-3的DNA(Pharmacia)作為模板，具有SEQ ID NO15和16的核苷酸序列的DNA片段作為引物以及耐熱DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得tac啟動(dòng)子區(qū)。進(jìn)行PCR，1個(gè)PCR循環(huán)為94℃20秒，60℃30秒和72℃60秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。然后收集所擴(kuò)增的DNA片段，并用EcoRI和PstI限制酶處理。另一方面，用相同限制酶消化廣宿主譜的載體pRS(參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kohyo)號(hào)3-501682/1991)，將含tac啟動(dòng)子區(qū)的上述DNA片段導(dǎo)入限制酶消化末端構(gòu)建pRS-tac。(2)制備dapA基因(二氫吡啶二羧酸鹽合酶基因)表達(dá)質(zhì)粒pRS-dapA24和LysC基因(天冬氨酸激酶基因)表達(dá)質(zhì)粒pRS-lysC80將編碼部分脫敏Lys對(duì)其酶活性的反饋抑制的二氫吡啶二羧酸鹽合酶的突變基因(dapA*24)導(dǎo)入質(zhì)粒pRS-tac，其中pRS-tac用上述(1)所述方法制得。
首先，采用RSFD80的DNA(參見(jiàn)實(shí)施例1)作為模板，具有SEQID NO17和18的核苷酸序列的DNA片段作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得dapA*24基因區(qū)。進(jìn)行PCR，1個(gè)PCR循環(huán)為94℃20秒，60℃30秒和72℃90秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。然后用Sse8387I和XbaI限制酶處理所述片段，制備具有相應(yīng)切割末端的dapA*24基因片段。另一方面，用上述相同方法以Sse8387I處理以及以XbaI部分消化pRS-tac。用T4連接酶使上述dapA*24基因片段與此消化質(zhì)粒連接，獲得pRS-dapA24。
同樣，采用RSFD80的DNA作為模板，具有SEQ ID NO19和20的核苷酸序列的DNA片段作為引物，通過(guò)PCR獲得編碼部分脫敏LyS對(duì)其酶活性的反饋抑制的天冬氨酸激酶的基因(lysC*80)。進(jìn)行PCR，1個(gè)PCR循環(huán)為94℃20秒，60℃30秒和72℃90秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。然后用Sse8387I和SapI限制酶處理所獲得的DNA片段。另一方面，用Sse8387I和SapI限制酶處理載體pRS-tac。用T4連接酶使上述lysC*80基因片段與此消化質(zhì)粒連接，獲得pRS-lysC80。(3)在食甲基嗜甲基菌中導(dǎo)入pRS-dapA24或pRS-lysC80并評(píng)價(jià)培養(yǎng)物分別通過(guò)電穿孔將如上所述獲得pRS-dapA24和pRS-lysC80導(dǎo)入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)，獲得AS1/pRS-dapA24和AS1/pRS-lysC80。將各菌株接種到含20mg/L鏈霉素的121生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)48小時(shí)。關(guān)于對(duì)照菌株，也以相同方法培養(yǎng)帶有pRS的AS1菌株。完成培養(yǎng)后，離心去除細(xì)菌細(xì)胞和碳酸鈣，用氨基酸分析儀(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相層析)檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中的L-賴(lài)氨酸濃度。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3

實(shí)施例3制備L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌(3)將食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)接種到121M1培養(yǎng)基中，并于37℃培養(yǎng)15小時(shí)。以NTG用常規(guī)方法(NTG濃度100mg/L，37℃，5分鐘)處理獲得的細(xì)菌細(xì)胞，將其涂布在含7g/L S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(AEC)和3g/LL-蘇氨酸的121M1瓊脂培養(yǎng)基上。于37℃培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞2-8天，挑出形成的菌落，以獲得AEC抗性菌株。
將上述AEC抗性菌株接種到121生產(chǎn)培養(yǎng)基，于37℃在有氧條件下培養(yǎng)38小時(shí)。完成培養(yǎng)后，離心從培養(yǎng)基中去除細(xì)菌細(xì)胞和碳酸鈣，用氨基酸分析儀(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相層析)檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中的L-賴(lài)氨酸濃度。選擇相對(duì)于原菌株L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力提高的菌株，并將其命名為食甲基嗜甲基菌AR-166菌株。原菌株和AR-166菌株的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)量見(jiàn)表4。
表4

食甲基嗜甲基菌AR-166菌株個(gè)人命名為AJ13608，于1999年6月10日將其保存于日本國(guó)際貿(mào)易部工業(yè)科技局的國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(Naional Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏號(hào)為FERM P-17416，根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定于2000年3月31日轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERM BP-7112。實(shí)施例4制備L-蘇氨酸生產(chǎn)菌(1)在嗜甲基菌屬細(xì)菌中導(dǎo)入蘇氨酸操縱子質(zhì)粒通過(guò)電穿孔將含從大腸桿菌獲得的蘇氨酸操縱子的質(zhì)粒pVIC40(國(guó)際公布WO90/04636，日本專(zhuān)利中請(qǐng)公開(kāi)(Kohyo)號(hào)3-501682/1991)導(dǎo)入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)(CanadianJournal of Microbiology，43，197(1997))以獲得AS1/pVIC40菌株。關(guān)于對(duì)照，使pVIC40質(zhì)粒缺失編碼蘇氨酸操縱子的DNA區(qū)，從而獲得只含有所述載體區(qū)的pRS(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(Kohyo)號(hào)3-501682/1991)，以用于pVIC40的相同方法將其導(dǎo)入AS1菌株，獲得AS1/pRS菌株。(2)用含有從大腸桿菌獲得的蘇氨酸操縱子嗜甲基菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸分別將AS1/pVIC40和AS1/pRS菌株接種到含20mg/L鏈霉素、1g/L L-纈氨酸和1g/L L-亮氨酸的121生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)50小時(shí)。完成培養(yǎng)后，離心去除細(xì)菌細(xì)胞和碳酸鈣，用氨基酸分析儀(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相層析)檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中的L-蘇氨酸濃度。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5

實(shí)施例5制備支鏈氨基酸生產(chǎn)菌將食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)接種到121M1培養(yǎng)基中，并于37℃培養(yǎng)15小時(shí)。以NTG用常規(guī)方法(NTG濃度100mg/L，37℃，5分鐘)處理獲得的細(xì)菌細(xì)胞，將其涂布在含0.5％酪蛋白氨基酸(DIFCO)的121M1瓊脂培養(yǎng)基上。于37℃培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞2-8天，使其形成菌落。挑出所形成的菌落接種到121M1瓊脂培養(yǎng)基和含0.5％酪蛋白氨基酸的121M1瓊脂培養(yǎng)基上。與前一種培養(yǎng)基相比，選擇在后一種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得更好的菌株作為酪蛋白氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。用此方法從NTG-處理的500個(gè)菌株中獲得9個(gè)滲漏(leaky)酪蛋白氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。從這些酪蛋白氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得一個(gè)相對(duì)于其原菌株在培養(yǎng)基中累積更多L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸的菌株。該菌株命名為食甲基嗜甲基菌C138菌株。
食甲基嗜甲基菌C-138菌株個(gè)人命名為AJ13609，于1999年6月10日將其保存于日本國(guó)際貿(mào)易部工業(yè)科技局的國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏號(hào)為FERM P-17417，根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定于2000年3月31日轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERM BP-7113。
將原菌株(AS1菌株)和C138菌株接種到121生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于37℃在有氧條件下培養(yǎng)34小時(shí)。完成培養(yǎng)后，離心去除培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞和碳酸鈣，用氨基酸分析儀(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相層析)檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中的L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸濃度。結(jié)果見(jiàn)表6。
表6

實(shí)施例6制備食甲基嗜甲基菌AS1菌株的染色體DNA文庫(kù)(1)制備食甲基嗜甲基菌AS1菌株的染色體DNA用鉑環(huán)將食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)接種到試管中的5ml 121M1培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。以1％量將所獲得的培養(yǎng)細(xì)菌液接種到500ml體積的Sakaguchi培養(yǎng)瓶中的50ml 121M1培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。然后離心收獲細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮于50ml TEN溶液(含50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA和20mM氯化鈉(pH8.0)的溶液)。離心收獲細(xì)胞，再次將其懸浮于5ml含5mg/ml溶菌酶和10μg/ml RNA酶的TEN溶液。使懸浮液于37℃放置30分鐘，然后加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉至終濃度分別為10μg/ml和0.5％(wt/vol)。
將所述懸浮液于70℃放置2小時(shí)，然后加入并混合等量飽和酚溶液(用10mM Tris-HCl(pH8.0)飽和的酚溶液)。離心懸浮液，收集上清液。加入并混合等量酚/氯仿溶液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)，離心混合物。收集上清液，加入等量氯仿溶液(氯仿∶異戊醇＝24∶1)，重復(fù)相同提取步驟。在上清液中加入1/10體積3 M醋酸鈉(pH4.8)和2.5倍體積乙醇沉淀染色體DNA。離心收集沉淀物，用70％乙醇洗滌，減壓干燥，以及用適量TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA(pH8.0))溶解。(2)制備基因文庫(kù)使50μl上述(1)獲得的部分染色體DNA(1μg/μl)、20μl H緩沖液(500 mM Tris-HCl、100mM氯化鎂、10mM二硫蘇糖醇、1000mM氯化鈉(pH7.5))以及8單位限制酶Sau3AI(Takara Shuzo)在總體積200μl中于37℃反應(yīng)10分鐘，然后加入并混合200μl酚/氯仿溶液，以中止反應(yīng)。離心反應(yīng)混合物，收集上層溶液，在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離。用ConcertTM快速凝膠提取系統(tǒng)(DNA收集試劑盒，GIBCO BRLCo.)收集相對(duì)于2-5kb堿基對(duì)(此后簡(jiǎn)寫(xiě)為“kbp”)的DNA。用這種方法獲得50μl分級(jí)大小(fractionated size)DNA溶液。
另一方面，使2.5μg質(zhì)粒pUC118(Takara Shuzo)、2μlK緩沖液(200mM Tris-HCl、100mM氯化鎂、10mM二硫蘇糖醇、1000mM氯化鉀(pH8.5))和10單位限制酶BamHI(Takara Shuzo)在總體積20μl中于37℃反應(yīng)2小時(shí)，然后加入并混合20單位牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo)，使所述混合物再反應(yīng)30分鐘。使反應(yīng)混合物與等量酚/氯仿溶液混合，離心混合物。收集上清液，加入等量氯仿溶液重復(fù)相似的提取步驟。在上清液中加入1/10體積3 M醋酸鈉(pH4.8)和2.5倍體積乙醇沉淀DNA。離心收集DNA，用70％乙醇洗滌，減壓干燥，以及用適量TE溶液溶解DNA。
用2型連接試劑盒(Takara Shuzo)連接如上所述制備的染色體DNA的Sau3AI消化產(chǎn)物和pUC118的BamHI消化產(chǎn)物。在反應(yīng)混合物中加入1/10體積3M醋酸鈉(pH4.8)和2.5倍體積乙醇沉淀DNA。離心收集DNA，用70％乙醇洗滌，減壓干燥，以及用適量TE溶液(連接酶溶液A)溶解DNA。
用上述步驟的相同方法，連接(連接酶溶液B)用限制酶AluI(Takara Shuzo)部分消化染色體DNA獲得的片段和質(zhì)粒pSTV29(Takara Shuzo)的SmaI消化產(chǎn)物。
用鉑環(huán)將大腸桿菌JM109接種到試管中的5ml L培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。以1％量將所獲得的培養(yǎng)細(xì)菌液接種到500ml體積的Sakaguchi培養(yǎng)瓶中的50ml L培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)直到培養(yǎng)物OD660為0.5-0.6，在冰上冷卻15分鐘。然后于4℃離心收獲細(xì)胞。使細(xì)胞懸浮于50ml冰冷的水中，離心洗滌細(xì)胞。重復(fù)該操作一次，使細(xì)胞懸浮于50ml冰冷的10％甘油溶液，離心洗滌細(xì)胞。把細(xì)胞懸浮在與細(xì)胞相同體積的10％甘油溶液中，分成50μl的等份。在50μl體積的細(xì)胞中加入1μl以上制備的連接酶溶液A或連接酶溶液B。然后將混合物裝入BioRad電穿孔設(shè)備的特殊小杯(0.1cm寬，預(yù)冰冷)中。
所述設(shè)備設(shè)定為1.8kV和25μF，脈沖控制器的設(shè)定為200ohms。將所述小杯安裝到所述設(shè)備上，對(duì)其施加脈沖。施用脈沖后，立即加入1ml冰冷的SOC培養(yǎng)基，將所述混合物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌試管中，于37℃振搖培養(yǎng)1小時(shí)。將各細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液體培養(yǎng)物涂布在含抗生素(當(dāng)使用連接酶溶液A時(shí)為100μg/ml氨芐青霉素，或者當(dāng)使用連接酶溶液B時(shí)為20μg/ml氯霉素)的L瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。刮取出現(xiàn)在各瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，接種到在500ml體積的Sakaguchi培養(yǎng)瓶中的50ml含相應(yīng)抗生素的L培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)2小時(shí)。用SDS堿法從各培養(yǎng)細(xì)菌液中提取質(zhì)粒DNA，以分別形成基因文庫(kù)溶液A和基因文庫(kù)溶液B。實(shí)施例7克隆食甲基嗜甲基菌AS1菌株的賴(lài)氨酸生物合成基因(1)克隆編碼天冬氨酸激酶(AK)的基因用基因文庫(kù)溶液B通過(guò)上述相同的電穿孔方法轉(zhuǎn)化編碼AK的3種基因(thrA、metLM和lysC)缺陷的大腸桿菌GT3。在轉(zhuǎn)化溶液中加入含20μg/ml二氨基庚二酸的SOC培養(yǎng)基，于37℃振搖培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)菌液涂布在含20μg/ml二氨基庚二酸和20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基上，以獲得形成的菌落。將其作為母板復(fù)制到含20μg/ml氯霉素的M9瓊脂培養(yǎng)基上，復(fù)制物于37℃培養(yǎng)2-3天。所述宿主不能在不含二氨基庚二酸的M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)樗痪哂蠥K活性。相反，預(yù)期含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼AK的基因的轉(zhuǎn)化體菌株因?yàn)樗龌虻淖饔枚軌蛟贛9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
約3000個(gè)轉(zhuǎn)化體中有2個(gè)轉(zhuǎn)化體在M9培養(yǎng)基上形成菌落。從在M9培養(yǎng)基上形成的菌落中提取質(zhì)粒，并進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)在所述質(zhì)粒上存在插入片段。這2種質(zhì)粒分別命名為pMMASK-1和pMMASK-2。采用這2種質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌GT3。所獲得的轉(zhuǎn)化體能夠在M9基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。進(jìn)而使含各所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在含20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心培養(yǎng)細(xì)菌液收集細(xì)胞。通過(guò)超聲細(xì)胞制備無(wú)細(xì)胞的提取物，按照Miyajima等的方法(Journal ofBiochemistry(Tokyo)，第63卷，139-148(1968))檢測(cè)AK活性(圖3pMMASK-1、pMMASK-2)。此外，同樣在含20μg/ml二氨基庚二酸和20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有載體pSTV29的GT3菌株，以及檢測(cè)AK活性(圖3載體)。結(jié)果，與僅帶有所述載體的轉(zhuǎn)化體比較，在2個(gè)含插入片段的克隆中觀測(cè)到AK活性提高。因此，證實(shí)能夠克隆在pSTV29上的基因?yàn)榈米允臣谆燃谆木幋aAK的基因。該基因稱(chēng)為ask。
通過(guò)雙脫氧法測(cè)定ask基因的DNA核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)pMMASK-1和pMMASK-2含有共同的片段。含得自食甲基嗜甲基菌的ask基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO5。所述核苷酸序列可編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO5和6。(2)克隆編碼天冬氨酸半醛脫氫酶(ASD)的基因采用如上所述的相同方法，使用基因文庫(kù)溶液B通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化asd基因缺陷的大腸桿菌Hfr3000 U482(CGSC 5081菌株)。在轉(zhuǎn)化溶液中加入含20μg/ml二氨基庚二酸的SOC培養(yǎng)基，使混合物于37℃振搖培養(yǎng)。離心收獲細(xì)胞。通過(guò)將其懸浮在L培養(yǎng)基中以及離心懸浮液，從而洗滌細(xì)胞。再重復(fù)相同洗滌操作一次，將細(xì)胞懸浮在L培養(yǎng)基中。然后將懸浮液涂布在含20μg/ml氯霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。宿主在不含二氨基庚二酸的L培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)極其緩慢，因?yàn)樗狈sd基因。相反，因?yàn)樗龌虻淖饔?，所以預(yù)期即使在L培養(yǎng)基中，含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼ASD的基因的轉(zhuǎn)化體菌株也可觀測(cè)到正常生長(zhǎng)。進(jìn)而預(yù)期所述宿主大腸桿菌不能在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼ASD的基因的轉(zhuǎn)化體菌株能夠在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)樗龌虻淖饔?。所以，挑取在L培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體菌落，劃痕并培養(yǎng)于M9培養(yǎng)基上。結(jié)果觀察到了生長(zhǎng)。因此證實(shí)編碼ASD的基因在這些轉(zhuǎn)化體菌株中具有預(yù)期的功能。
從在M9培養(yǎng)基上形成的3個(gè)轉(zhuǎn)化體菌落提取質(zhì)粒，而且證實(shí)所述質(zhì)粒中存在插入片段。3種質(zhì)粒分別命名為pMMASD-1、pMMASD-2和pMMASD-3。當(dāng)再用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Hfr3000U482時(shí)，各轉(zhuǎn)化體可在M9基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。進(jìn)而在含20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基上培養(yǎng)各轉(zhuǎn)化體過(guò)夜，離心培養(yǎng)的細(xì)菌液收集細(xì)胞。超聲處理細(xì)胞制備粗酶溶液，按照Boy等人的方法(Journal ofBacteriology，Vol.112(1)，84-92(1972))檢測(cè)ASD活性(圖4pMMASD-1、pMMASD-2和pMMASD-3)。此外，同樣在含20μg/ml二氨基二庚酸和20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)帶有所述載體的宿主，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)一樣檢測(cè)ASD活性(圖4載體)。結(jié)果在僅帶有所述載體的轉(zhuǎn)化體不能檢測(cè)到酶活性，而在具有插入片段的3個(gè)克隆中均能夠檢測(cè)到ASD活性。因此證實(shí)所獲得的基因?yàn)榈米允臣谆燃谆木幋aASD的基因(稱(chēng)為asd)。
用雙脫氧法測(cè)定asd基因的DNA核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)全部3種所獲得的克隆含有同樣的片段。含有得自食甲基嗜甲基菌的asd基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO7。所述核苷酸序列可編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO7和8。(3)克隆編碼二氫吡啶二羧酸鹽合酶(DDPS)的基因采用基因文庫(kù)溶液A通過(guò)相同電穿孔步驟轉(zhuǎn)化dapA基因缺陷型大腸桿菌AT997(CGSC 4547菌株)。在轉(zhuǎn)化溶液中加入含20μg/ml二氨基二庚酸的SOC培養(yǎng)基，使混合物于37℃振搖培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)的細(xì)菌液涂布在含20μg/ml二氨基庚二酸和100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基上，以獲得形成的菌落。將其作為母板復(fù)制到含100μg/ml氨芐青霉素的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上，復(fù)制物于37℃培養(yǎng)2-3天。所述宿主不能在不含二氨基庚二酸的M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)樗莇apA基因缺陷型。相反，預(yù)期含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼DDPS的基因的轉(zhuǎn)化體菌株因?yàn)樗龌虻淖饔枚軌蛟贛9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
從在M9培養(yǎng)基上形成的2株菌落提取質(zhì)粒，并進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)在所述質(zhì)粒上存在插入片段。這2種質(zhì)粒分別命名為pMMDAPA-1和pMMDAPA-2。采用這2種質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌AT997時(shí)，各轉(zhuǎn)化體均能夠在M9基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。進(jìn)而使含相應(yīng)質(zhì)粒的各轉(zhuǎn)化體在含100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心培養(yǎng)細(xì)菌液收集細(xì)胞。通過(guò)超聲處理細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，按照Yugari等人的方法(Journal of Biological Chemistry，第240卷，第4710頁(yè)(1965))檢測(cè)DDPS活性(圖5pMMDAPA-1、pMMDAPA-2)。此外，同樣在含20μg/ml二氨基庚二酸和100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有所述載體的宿主細(xì)菌，以及檢測(cè)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的DDPS活性(圖5載體)。結(jié)果，在僅帶有所述載體的轉(zhuǎn)化體中沒(méi)能檢測(cè)到所述酶活性，而在帶有具有所述插入片段的質(zhì)粒的各轉(zhuǎn)化體中均可測(cè)到DDPS活性。因此，證實(shí)所獲得的基因?yàn)榈米允臣谆燃谆木幋aDDPS的基因(稱(chēng)為dapA)。
通過(guò)雙脫氧法測(cè)定dapA基因的DNA核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)所述插入片段的兩種質(zhì)粒含有共同的片段。含得自食甲基嗜甲基菌的dapA基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO9。所述核苷酸序列可編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO9和10。(4)克隆編碼二氫吡啶二羧酸鹽還原酶(DDPR)的基因采用基因文庫(kù)溶液A通過(guò)如上所述的相同電穿孔步驟轉(zhuǎn)化dapB基因缺陷型大腸桿菌AT999 (CGSC 4549菌株)。在轉(zhuǎn)化溶液中加入含20μg/ml二氨基二庚酸的SOC培養(yǎng)基，使混合物于37℃振搖培養(yǎng)。然后離心收獲細(xì)胞。通過(guò)將其懸浮在L培養(yǎng)基中以及離心懸浮液，從而洗滌細(xì)胞。再重復(fù)相同洗滌操作一次，將細(xì)胞懸浮在L培養(yǎng)基中。再后，將細(xì)菌懸浮液涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。宿主在不含二氨基庚二酸的L培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)極其緩慢，因?yàn)樗狈apB基因。相反，因?yàn)樗龌虻淖饔?，所以預(yù)期即使在L培養(yǎng)基中，在含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼DDPR基因的轉(zhuǎn)化體菌株也可觀測(cè)到正常生長(zhǎng)。進(jìn)而所述宿主大腸桿菌不能在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是因?yàn)樗龌虻淖饔?，預(yù)期含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼DDPR的基因的轉(zhuǎn)化體菌株能夠在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
所以，將在L培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體菌落劃痕并培養(yǎng)于M9瓊脂培養(yǎng)基上。之后在M9培養(yǎng)基上仍然觀測(cè)到生長(zhǎng)。因此證實(shí)編碼DDPR的基因在轉(zhuǎn)化體菌株中具有作用。從在M9培養(yǎng)基上形成的菌落提取質(zhì)粒，結(jié)果證實(shí)在所述質(zhì)粒上存在插入片段。采用質(zhì)粒(pMMDAPB)再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌AT999時(shí)，轉(zhuǎn)化體可在M9基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。進(jìn)而使含所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在L培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心培養(yǎng)細(xì)菌液收集細(xì)胞。通過(guò)超聲處理細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，按照Tamir等人的方法(Journal of Biological Chemistry，第249卷，第3034頁(yè)(1974))檢測(cè)DDPR活性(圖6pMMDAPB)。此外，同樣在含20μg/ml二氨基庚二酸和100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有所述載體的宿主細(xì)菌，以及檢測(cè)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的DDPR活性(圖6載體)。結(jié)果，在僅帶有所述載體的轉(zhuǎn)化體中沒(méi)能檢測(cè)到DDPR活性，而在帶有pMMDAPB的轉(zhuǎn)化體上可測(cè)到DDPR活性。因此，證實(shí)所獲得的基因?yàn)榈米允臣谆燃谆木幋aDDPR的基因(稱(chēng)為dapB)。
通過(guò)雙脫氧法測(cè)定dapB基因的DNA核苷酸序列。含得自食甲基嗜甲基菌的dapB基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO11。所述核苷酸序列可編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO11和12。(5)克隆編碼二氨基庚二酸鹽脫羧酶(DPDC)的基因采用基因文庫(kù)溶液A通過(guò)如上所述的相同電穿孔步驟轉(zhuǎn)化lysA基因缺陷型大腸桿菌AT2453(CGSC 4505菌株)。在轉(zhuǎn)化溶液中加入SOC培養(yǎng)基，使混合物于37℃振搖培養(yǎng)。然后離心收獲細(xì)胞。通過(guò)將其懸浮在5ml滅菌水中以及離心懸浮液，從而洗滌細(xì)胞。再重復(fù)相同洗滌操作一次，將細(xì)胞懸浮在500μl滅菌水中。然后將細(xì)菌懸浮液涂布在含20μg/ml氯霉素的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)2-3天。所述宿主在不含賴(lài)氨酸的M9基本培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，因?yàn)樗狈ysA基因。相反，因?yàn)樗龌虻淖饔?，所以預(yù)期含有得自食甲基嗜甲基菌的編碼DPDC基因的轉(zhuǎn)化體菌株可在M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
因此從在M9培養(yǎng)基上形成的3個(gè)轉(zhuǎn)化體菌株提取質(zhì)粒，并進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)在所述質(zhì)粒上存在插入片段。這3種質(zhì)粒分別命名為pMMLYSA-1、pMMLYSA-2和pMMLYSA-3。采用各質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌AT2453時(shí)，各轉(zhuǎn)化體均可在M9基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。進(jìn)而使含相應(yīng)質(zhì)粒的各轉(zhuǎn)化體在含20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心培養(yǎng)細(xì)菌液收集細(xì)胞。通過(guò)超聲處理細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，按照Cremer等人的方法(Journal of General Microbiology，第134卷，3221-3229(1988))檢測(cè)DPDC活性(圖7pMMLYSA-1、pMMLYSA-2、pMMLYSA-3)。此外，同樣在含20μg/ml氯霉素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有所述載體的宿主細(xì)菌，以及檢測(cè)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的DPDC活性(圖7載體)。結(jié)果，在僅帶有所述載體的轉(zhuǎn)化體中沒(méi)能檢測(cè)到DPDC活性，而在具有所述插入片段的3個(gè)克隆中均可測(cè)到DPDC活性。因此，證實(shí)所獲得的基因?yàn)榈米允臣谆燃谆木幋aDPDC的基因(稱(chēng)為lysA)。
通過(guò)雙脫氧法測(cè)定lysA基因的DNA核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)全部3個(gè)插入片段含有共同的DNA片段。含得自食甲基嗜甲基菌的lysA基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO13。所述核苷酸序列可編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO13和14。
工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明提供具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌、采用所述嗜甲基菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法以及L-氨基酸含量提高的嗜甲基菌屬細(xì)菌細(xì)胞。采用本發(fā)明的方法可利用甲醇作為原料生產(chǎn)L-氨基酸。而且，本發(fā)明提供從嗜甲基菌屬細(xì)菌獲得的新型L-賴(lài)氨酸生物合成酶基因。
權(quán)利要求
1.一種具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的嗜甲基菌屬細(xì)菌(Methylophilusbacteria)。
2.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸或L-蘇氨酸。
3.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，它具有L-氨基酸類(lèi)似物抗性或L-氨基酸輔源營(yíng)養(yǎng)(auxotrophy)。
4.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中L-氨基酸生物合成酶活性增強(qiáng)。
5.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和天冬氨酸激酶活性增強(qiáng)，而且所述細(xì)菌具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
6.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性增強(qiáng)，而且所述細(xì)菌具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
7.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中天冬氨酸激酶活性增強(qiáng)，而且所述細(xì)菌具有L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
8.按照權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中選自天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸鹽還原酶和二氨基庚二酸鹽脫羧酶中的1種、2種或3種酶的活性增強(qiáng)。
9.按照權(quán)利要求5的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中通過(guò)將編碼不受L-賴(lài)氨酸反饋抑制的二氫吡啶二羧酸鹽合酶的DNA以及編碼不受L-賴(lài)氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶的DNA導(dǎo)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用而增強(qiáng)所述二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和天冬氨酸激酶活性。
10.按照權(quán)利要求1的嗜甲基菌屬細(xì)菌，其中天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的活性增強(qiáng)，而且所述細(xì)菌具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力。
11.按照權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述嗜甲基菌屬細(xì)菌是食甲基嗜甲基菌。
12.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1-11任一項(xiàng)定義的嗜甲基菌屬細(xì)菌，以便在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并累積L-氨基酸，以及從所述培養(yǎng)物中收集所述L-氨基酸。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述培養(yǎng)基含有用作主要碳源的甲醇。
14.一種產(chǎn)生L-氨基酸含量提高的嗜甲基菌屬細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞的方法，它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)定義的嗜甲基菌屬細(xì)菌，以便在所述細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生并累積L-氨基酸。
15.按照權(quán)利要求14的產(chǎn)生所述嗜甲基菌屬細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞的方法，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸或L-蘇氨酸。
16.一種編碼以下(A)或(B)定義的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白，或(B)具有包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO6的氨基酸序列而且具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。
17.按照權(quán)利要求16的DNA，它為以下(a)或(b)定義的DNA(a)具有包含SEQ ID NO5第510-1736號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(b)在嚴(yán)格條件下可與具有SEQ ID NO5第510-1736號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針雜交，而且編碼具有天冬氨酸激酶活性的蛋白的DNA。
18.一種編碼以下(C)或(D)定義的蛋白的DNA(C)具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的蛋白，或(D)具有包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO8的氨基酸序列而且具有天冬氨酸半醛脫氫酶活性的蛋白。
19.按照權(quán)利要求18的DNA，它為以下(c)或(d)定義的DNA(c)具有包含SEQ ID NO7第98-1207號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(d)在嚴(yán)格條件下可與具有SEQ ID NO7第98-1207號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針雜交，而且編碼具有天冬氨酸半醛脫氫酶活性的蛋白的DNA。
20.一種編碼以下(E)或(F)定義的蛋白的DNA(E)具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白，或(F)具有包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO10的氨基酸序列而且具有二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性的蛋白。
21.按照權(quán)利要求20的DNA，它為以下(e)或(f)定義的DNA(e)具有包含SEQ ID NO9第1268-2155號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(f)在嚴(yán)格條件下可與具有SEQ ID NO9第1268-2155號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針雜交，而且編碼具有二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性的蛋白的DNA。
22.一種編碼以下(G)或(H)定義的蛋白的DNA(G)具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的蛋白，或(H)具有包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO12的氨基酸序列而且具有二氫吡啶二羧酸鹽還原酶活性的蛋白。
23.按照權(quán)利要求22的DNA，它為以下(g)或(h)定義的DNA(g)具有包含SEQ ID NO11第2080-2883號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(h)在嚴(yán)格條件下可與具有SEQ ID NO11第2080-2883號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針雜交，而且編碼具有二氫吡啶二羧酸鹽還原酶活性的蛋白的DNA。
24.一種編碼以下(I)或(J)定義的蛋白的DNA(I)具有SEQ ID NO14的氨基酸序列的蛋白，或(J)具有包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO14的氨基酸序列而且具有二氨基庚二酸鹽脫羧酶活性的蛋白。
25.按照權(quán)利要求24的DNA，它為以下(i)或(i)定義的DNA(i)具有包含SEQ ID NO13第751-1995號(hào)核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(j)在嚴(yán)格條件下可與具有SEQ ID NO13第751-1995號(hào)核苷酸的核苷酸序列或其部分的探針雜交，而且編碼具有二氨基庚二酸鹽脫羧酶活性的蛋白的DNA。
全文摘要
在含有用作主要碳源的甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以下細(xì)菌從而生產(chǎn)L－氨基酸:屬于嗜甲基菌屬、能夠利用甲醇作為主要碳源生長(zhǎng)而且具有L－氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌(例如通過(guò)在嗜甲基菌屬細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入編碼不受L－賴(lài)氨酸反饋抑制的二氫吡啶二羧酸鹽合酶的DNA以及另一種編碼不受L－賴(lài)氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶的DNA而轉(zhuǎn)化,并因此增強(qiáng)二氫吡啶二羧酸鹽合酶活性和天冬氨酸激酶活性的嗜甲基菌屬細(xì)菌)或?qū)儆谑燃谆鷮俣倚枰业鞍装被岬募?xì)菌。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1346402SQ00806019
公開(kāi)日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者郡司義哉, 安枝壽, 杉本慎一, 辻本信晴, 島岡惠, 宮田由理, 大場(chǎng)麻奈美 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社