專利名稱：利用自體裂解融合蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)及新的還原多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種需要裂解前體產(chǎn)物的多肽表達(dá)系統(tǒng)，和用于該系統(tǒng)的蛋白酶。本發(fā)明還涉及一種能夠還原二氯靛酚和氧化態(tài)谷胱甘肽的新的多肽，編碼這種新的多肽的DNA，含有該DNA的載體，用該載體轉(zhuǎn)化的宿主，和含有該多肽的藥物組合物。另外，本發(fā)明還涉及抗這種多肽的單克隆抗體，和用該抗體分離和純化所說多肽的方法。
馬鈴薯Y病毒是一組其中每種都有一種大約10,000堿基的單股RNA基因組，并且能夠感染植物如茄科植物的病毒。馬鈴薯Y病毒基因組的特征是具有一特別長(zhǎng)的開放閱讀框架，或ORF[Dougherty，W.G.and Hiebert，E.(1980)，Virology 101466-474.；Allison，R.et al.(1986)，Virology 1549-20]。為了表達(dá)在ORF中編碼的單個(gè)蛋白質(zhì)，用兩種類型的蛋白酶消化翻譯的多聚蛋白質(zhì)，這兩種類型的蛋白酶也是在ORF內(nèi)編碼的[Dougherty，W.G.and Carrington，J.C.(1988)，Ann.Rev.Phytopath.2623-143]。
煙草蝕刻病毒(TEV)是馬鈴薯Y病毒家族的一個(gè)成員，而且這種病毒能在被感染細(xì)胞中產(chǎn)生可被錐蟲藍(lán)染色的核內(nèi)包涵體。核內(nèi)包涵體明顯是由兩種蛋白組成的。其中一種已被證明是一種病毒蛋白酶，并被命名為核內(nèi)包涵體a，或NIa[J.Virol.，612540-2548(1987)]。
核包涵體是馬鈴薯Y病毒的一種蛋白酶，它能識(shí)別和切割包括Gln-Gly，Gln-Ser和Gln-Ala之一的肽序列，據(jù)信該序列是六聚體，并且出現(xiàn)在多聚蛋白質(zhì)內(nèi)相關(guān)NIa的C末端。裂解位點(diǎn)是在構(gòu)成上述二聚體的兩個(gè)殘基之間。
TEV和煙草葉脈斑紋病毒(TVMV)—馬鈴薯Y病毒家族的又一成員—的完整基因組序列已被測(cè)出，且同源性檢索表明這些病毒的NIa可以定位在它們的相關(guān)基因組中[Virology，1549-20(1986)；Nuclear Acid Res.，145417-5430(1986)]。
三葉草黃葉脈病毒，或簡(jiǎn)稱CYVV，也是一種馬鈴薯Y病毒。到目前為止，只測(cè)出了CYVV基因組3′端的基因和它所編碼的衣殼蛋白質(zhì)的序列[Uyeda，I.et al.(1991)，Intervirol.32234-245]。以往未曾推斷出基因組NIa區(qū)的結(jié)構(gòu)，也未分離出相應(yīng)的NIa。
利用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，可以容易地做到由表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生外源性蛋白質(zhì)。但是，還有許多多肽尚不能在外源系統(tǒng)中很容易地被表達(dá)。問題可能是多肽不能夠被大量地表達(dá)，而且這種情況通常也不能只在基因上游置入一個(gè)調(diào)節(jié)基因而得以糾正?；蛘呖赡苁菦]有發(fā)生為獲得成熟型蛋白質(zhì)所需的轉(zhuǎn)錄后加工過程，或錯(cuò)誤地發(fā)生了這一過程。
例如，許多真核多肽是以N末端蛋氨酸開始翻譯的，然后再去掉該氨基酸而得到成熟型多肽。這一過程不能在原核細(xì)胞中發(fā)生，因此必須尋找獲得表達(dá)的其他手段。這種技術(shù)之一包括，將所需的外源蛋白質(zhì)與麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合，例如，純化表達(dá)的融合蛋白，然后用蛋白酶，如Xa因子，腸激酶，或凝血酶進(jìn)行切割。這種笨拙方法的主要缺點(diǎn)是它需要兩個(gè)純化步驟，導(dǎo)致大量的終產(chǎn)物丟失。
美國(guó)專利NO.5,162,601公開了利用TEV蛋白酶生產(chǎn)在所要表達(dá)的每種蛋白之間具有接頭序列，如人tPA的多蛋白質(zhì)。盡管如此，該專利只是公開了將編碼這種多聚蛋白質(zhì)的多基因克隆到宿主中，而沒有公開蛋白水解裂解終產(chǎn)物的表達(dá)或純化。
用于代謝能量所需的氧在細(xì)胞環(huán)境中一般是以氧化劑形式提供的。
其中氧能被利用的活化形式一般是自由基、如超氧化物(O2-)過氧化物(H2O2)、或羥基(OH-)，所有這些都在利用后被還原形成水(H2O)。氧化本身是具有高度氧化作用的，但是，本文所用的術(shù)語(yǔ)“活化氧”是指比氣體氧有更大氧化能力的氧和含氧分子。最強(qiáng)形式的活化氧是自由基，它是一種具有一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)電子的分子或原子。
自由基一般是不穩(wěn)定的，并且，如果不適當(dāng)控制，其可使脂類、蛋白質(zhì)和核酸變性。因此說，盡管活化氧是生命所必需的，但它又是一種潛在的健康不利因素，必須嚴(yán)加控制。即使是非常微小的量，活化氧也會(huì)因?yàn)槠涓叨确磻?yīng)活性而引起疾病。結(jié)果是，如果不裝備抵御活化氧的機(jī)制，生命機(jī)體就不能存活。
在細(xì)胞環(huán)境中，必須使活化氧產(chǎn)生的部位、數(shù)量和時(shí)間與細(xì)胞中和相關(guān)危險(xiǎn)的能力達(dá)到平衡。這種能力一般是由利用其自身的抗氧化劑或抗氧化酶的防御機(jī)制提供的。在本發(fā)明說明書中，“抗氧化劑”是指天然產(chǎn)生的能夠防止或抑制脂質(zhì)自動(dòng)氧化的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱。術(shù)語(yǔ)“抗氧化酶”一般用于指能夠催化消除活化氧的反應(yīng)的酶，術(shù)語(yǔ)“抗氧化作用”也由此得到解釋。
在一些異常情況下會(huì)產(chǎn)生過量的活化氧，如當(dāng)人體處于緊張狀態(tài)，服用藥物，吸煙，手術(shù)后，器官移值，或在大腦或心肌栓塞過程中出現(xiàn)局部缺血時(shí)。如此大量的活化氧超過了機(jī)體控制系統(tǒng)消除它們的能力，致使過量的活化氧進(jìn)一步對(duì)身體造成損害，進(jìn)而嚴(yán)重地?fù)p傷正常細(xì)胞。因此說，所謂的氧化應(yīng)激是許多疾病的致病因素。
以動(dòng)脈硬化為例，被活化氧氧化的低密度脂蛋白的出現(xiàn)被認(rèn)為是這種疾病的病因之一[Steinberg，D.(1983)，Arteriosclerosis 3，283-301]。氧化應(yīng)激也被認(rèn)為與糖尿病的發(fā)生、代謝異常和血管并發(fā)癥相關(guān)之機(jī)制的誘因與影響密切相關(guān)[Kondo，M.ed.，“Approaches from Modern Medicine(4)Free Radicals”，Medical View Pub.，PP.138-146]。
活化氧也與其他的病理狀態(tài)和狀況有關(guān)，例如局部缺血性疾病(再灌注性疾病、缺血性心臟病、腦缺血、缺血性腸炎等)，水腫、血管通透性增加、炎癥、胃粘膜疾病、急性胰腺炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、肝病、帕拉夸特氏病、肺氣腫、化學(xué)性癌癥、癌轉(zhuǎn)移、成人呼吸窘迫綜合癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、白內(nèi)障、早熟性視網(wǎng)膜病、自身免疫性疾病、葉啉血癥、溶血性疾病、地中海貧血、帕金森氏癥、阿爾茨海墨氏病、癲癇、紫外線照射性疾病、放射性疾病、凍傷、和燒傷。
在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都存在有僅以消除生理狀態(tài)下產(chǎn)生的活化氧為目的的幾種防御機(jī)制。
在細(xì)胞內(nèi)，已知如下所述的一些抗氧化劑和抗氧化酶可以處理和消除活化氧。例如，存在于過氧化物體中的過氧化氫酶，這種酶可以還原和清除地氧化氫。谷胱甘肽過氧化物酶出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，并且這種酶在還原態(tài)谷胱甘肽存在下可以還原和解毒過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物。轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和乳鐵傳送蛋白，例如可以通過穩(wěn)定鐵離子而抑制活化氧的產(chǎn)生；同樣，血漿銅藍(lán)蛋白也起到類似的與銅離子相關(guān)的作用。另外，存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的超氧化物歧化酶能催化超氧化物還原以形成過氧化氫，然后過氧化氫則被過氧化氫酶消除。再者，維生素E和C能還原谷胱甘肽，而且其他的低分子量化合物也能夠還原和清除活化氧。
另一方面，象細(xì)胞外超氧化物歧化酶、細(xì)胞外谷胱甘肽過氧化物酶和還原態(tài)谷胱甘肽這類物質(zhì)存在于細(xì)胞外的環(huán)境中，它們與上述的細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)物質(zhì)具有類似的作用。盡管如此，但是與細(xì)胞內(nèi)的情況相比，細(xì)胞外抗氧化劑和抗氧化酶的種類較少，并且只有少數(shù)能夠表現(xiàn)出細(xì)胞外抗氧化作用。
谷胱甘肽對(duì)于保持細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的還原狀態(tài)具有重要的作用，它可由下式表示。谷胱甘肽最初是由de-Rey-Pailhade于1888年在酵母中發(fā)現(xiàn)的，Hopkins于1921年將其作為化合物分離出來之后，命名為谷胱甘肽。
谷胱甘肽由三個(gè)氨基酸組成谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。兩個(gè)谷胱甘肽分子的巰基可以在活化氧的存在下被氧化形成二硫鍵。
谷胱甘肽主要產(chǎn)生于肝臟，通過血漿在體內(nèi)循環(huán)。在正常機(jī)體中，谷胱甘肽幾乎全部以還原形式存在。當(dāng)氧化形式的谷胱甘肽含量增加時(shí)，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)存在下可通過谷胱甘肽還原酶的作用再產(chǎn)生還原形式的谷胱甘肽。因此，還原態(tài)谷胱甘肽可以保護(hù)細(xì)胞膜免于遭受因還原活化氧和自由基所導(dǎo)致的氧化疾病和影響。由于具有這種抗氧化特性，還原態(tài)谷胱甘肽還可以抵抗放射性的影響，并且可用作白內(nèi)障的治療藥物。最近還報(bào)道艾滋病病人體內(nèi)還原態(tài)谷胱甘肽的全身水平下降，這似乎表明了還原態(tài)谷胱甘肽在體內(nèi)的作是極為重要的。盡管如此，在異常狀況下，活化氧的量太大以致于使幾乎所有的谷胱甘肽處于被氧化狀態(tài)，從而使活化氧不可能盡快地被清除。
人硫氧還蛋白是又一個(gè)代表性的物質(zhì)，它可以在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外通過其還原活性發(fā)揮多種生理學(xué)作用。人硫氧還蛋白(也被稱為成人T細(xì)胞白血病衍生因子，ADF)作為一種能夠在成人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞介素2受體(IL-2R)的因子被克隆。它是一種在其活化位點(diǎn)帶有兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基依賴性還原酶，并能夠還原活化氧和自由基。
除了能誘導(dǎo)IL-2受體之外，人硫氧還蛋白還可以促進(jìn)被Epstein-Barr病毒(EBV)感染的B細(xì)胞株3B6中的細(xì)胞生長(zhǎng)；抵抗衍生于單細(xì)胞源細(xì)胞系U937的腫瘤壞死因子；抵抗由中性白細(xì)胞引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。而且，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，人硫氧還蛋白通過其還原活性作用于轉(zhuǎn)錄因子NFKB，JUN和FOS，從而促進(jìn)DNA結(jié)合活性，使之發(fā)揮作用以增加轉(zhuǎn)錄活性。人硫氧還蛋白目前正被開發(fā)成一種放射性疾病的預(yù)防劑，以及用作再灌注性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥的治療藥物，由于它能通過其還原能力防止細(xì)胞損傷，所有上述這些疾病也因此得以預(yù)防。
如上所述，通過清除活化氧和自由基來保持細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境處于還原狀態(tài)在生理學(xué)上是極為重要的。盡管目前尚不清楚，但相信有許多抗氧化劑和抗氧化酶存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，在消除活化氧和自由基中發(fā)揮作用。因此，發(fā)現(xiàn)一種能夠再生，例如，還原態(tài)谷胱甘肽的還原物質(zhì)是非常有用的。這類物質(zhì)對(duì)于異常的身體狀況，如上述那些疾病可能有所幫助。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的蛋白酶，編碼此蛋白酶的核苷酸序列，含有編碼這種蛋白酶之DNA序列的載體，和用所說載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼有意義蛋白質(zhì)且還編碼所說蛋白質(zhì)上游之新蛋白酶的DNA，位于所說兩序列之間并進(jìn)一步編碼可由所說蛋白酶切割之肽的序列。所有的所說序列是在相同的開發(fā)放閱讀框架中。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由所說DNA編碼的蛋白質(zhì)，以及含有所說DNA的載體，和含有所說載體的表達(dá)系統(tǒng)，所說載體能夠在一合適的宿主細(xì)胞，例如包含自動(dòng)復(fù)制所必需之核苷酸序列的宿主細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制。
從另一個(gè)角度說，本發(fā)明的首要目的是提供編碼具有體內(nèi)還原活性的新多肽的核苷酸序列。再一個(gè)目的是提供編碼能夠還原二氯靛酚和氧化態(tài)谷胱甘肽之多肽的DNA。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述DNA的重組載體，所說載體能夠在合適的宿主細(xì)胞中，例如帶有一個(gè)能進(jìn)行自動(dòng)復(fù)制之基本序列的宿主細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制。
另外，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種作為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的上述肽，并提供抗這種肽的單克隆抗體。
我們現(xiàn)已鑒定并克隆了新的CYVV蛋白酶(NIa)，并且令人驚奇地發(fā)現(xiàn)能夠用CYVV NIa作為融合蛋白質(zhì)的一部分，在大腸桿菌(E.coli)這樣的宿主中表達(dá)，并允許大量產(chǎn)生能通過自身裂解得到所需要外源性蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。這種CYVV NIa基因能穩(wěn)定地保留并在大腸桿菌中表達(dá)，所表達(dá)的NIa具有特異性蛋白酶的活性，即使該蛋白質(zhì)形成融合蛋白質(zhì)的一部分時(shí)也具有此種活性。
我們還發(fā)現(xiàn)了編碼新多肽的DNA，所說的多肽能夠還原二氯靛酚{也稱為二氯靛酚，2，6-二氯靛酚，或2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1-酮}和氧化態(tài)谷胱甘肽，可利用合適的基因工程技術(shù)大量地獲得所說的多肽。這種多肽特別適用于治療由氧化應(yīng)激引起的或與之相關(guān)的疾病，或由活化氧引起的任何疾病，如動(dòng)脈硬化，糖尿病和缺血性疾病(包括再灌注疾病、缺血性心臟病、腦供血不足和缺血性腸炎)。
因此，在本發(fā)明第一個(gè)具體體現(xiàn)的第一方面中，提供了一種多核苷酸序列，其中所說的序列沿5′至3′的方向在同一開放閱讀框架中包括a)編碼三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白，或者是它的與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白具有相似的蛋白水解特異性之突變體或變異體的序列；b)編碼可被所說三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白或其所說突變體或變異體識(shí)別和裂解之肽的序列；和c)至少一個(gè)編碼多肽的序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白，或其與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白具有相似蛋白水解特異性之突變體或變異體的編碼序列。
本發(fā)明還提供含有如上限定之序列的載體，尤其是表達(dá)載體。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供用上文限定的載體轉(zhuǎn)化的宿主，以及包括所說宿主和所說表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，以及由該表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的多肽。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體體現(xiàn)中，第一個(gè)方面提供了多核苷酸序列，它能編碼一種多肽，該多肽是有序列ID No.12中的1至526個(gè)氨基酸的氨基酸序列，或者編碼所說多肽的突變體或變異體，條件是由該多核苷酸序列編碼的多肽能夠還原二氯靛酚和氧化態(tài)谷胱甘肽。
還提供了一種含有如上所限定之序列的載體，特別是表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供了由如上限定之載體轉(zhuǎn)化的宿主，以及包括所說宿主和所說表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，并且還提供了由這種表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明還提供了上述多肽的醫(yī)療用途，以及這種多肽在治療和預(yù)防由氧化應(yīng)激引起或與之相關(guān)的疾病或由活化氧引起的任何疾病中的應(yīng)用，以及含有這種多肽的藥物組合物。
還提供了抗這種多肽的抗體，尤其是單克隆抗體，和它的等同物；本發(fā)明另外還提供了產(chǎn)生這種抗體的方法以及用這種抗體純化多肽的方法。
本發(fā)明將借助附圖得以進(jìn)一步地舉例說明，其中

圖1是從CYVV-cDNA中分離的NIa區(qū)之cDNA的限制性酶切圖譜；圖2是含有NIa5′區(qū)域之質(zhì)粒pKNI5′的構(gòu)建圖；圖3是含有部分IL-11基因和NIa 5′區(qū)域之質(zhì)粒PKNI5IL的構(gòu)建圖；圖4顯示用于制備5′IL DNA片段CIN3 DNA片段的引物，其中NIa基因的3′端和IL-11基因的5′端是融合的；圖5顯示通過PCR使CIN3 DNA片段與IL5′DNA片段融合；圖6顯示質(zhì)粒pKSUN9的構(gòu)建圖；圖7是pUCKM31-7的限制性酶切圖譜；圖8是pUCKM31-7和pcD-31之3′端核苷酸序列的比較圖；圖9是pSRα31-7的構(gòu)建圖；圖10是將一組氨酸六聚體編碼序列導(dǎo)入到pUCKM31-7中的圖解說明；圖11是pMAL31-7的構(gòu)建圖；圖12是對(duì)二氯靛酚還原活性的分析示圖；圖13是對(duì)氧化態(tài)谷胱甘肽還原活性的確定。
首先通過本發(fā)明的第一實(shí)施方案舉例說明本發(fā)明，但是下述討論也適合于本發(fā)明的第二實(shí)施方案，除非該討論明顯地不適于第二實(shí)施方案。
本發(fā)明的多核苷酸序列一般較好為DNA形式的，鑒于這一的原因，本文所引用的序列一般是指DNA。盡管如此，只要合適這些指稱也包括RNA。由于RNA的應(yīng)用在實(shí)際當(dāng)中受到限制，所以RNA不是優(yōu)選的。例如，mRNA可以在非洲蟾蜍卵母細(xì)胞或麥胚溶解產(chǎn)物系統(tǒng)中表達(dá)，但是從經(jīng)濟(jì)角度講兩者在實(shí)際生產(chǎn)中均不適于大量生產(chǎn)融合蛋白。
術(shù)語(yǔ)“肽”在本文中是指包含通過肽鍵連接之2個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何分子。因此，該術(shù)語(yǔ)包括寡肽、多肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“融合蛋白質(zhì)”是指通過將兩個(gè)或多個(gè)其他肽序列結(jié)合而獲得的任何單一多肽。
理想的是本發(fā)明的序列較好是雙股形式的，并且本發(fā)明也包括與本發(fā)明序列相應(yīng)的反義序列。本發(fā)明的雙股序列可以具有一個(gè)或兩個(gè)“粘性”末端，這種情況下反意和有意義鏈不一定準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。
當(dāng)本發(fā)明的序列在適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)中被表達(dá)時(shí)，由上述a)中鑒定的序列編碼的蛋白質(zhì)傾向裂解由上述b)的序列編碼的肽，以釋放出由上述c)的序列編碼的多肽。
在上述a)和b)的序列被翻譯之后的任何時(shí)間均可以發(fā)生融合蛋白的裂解。因此，由上述c)編碼的多肽不必要在裂解之前全部被翻譯。盡管如此，實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)至少某些融合蛋白質(zhì)(如果不是大多數(shù))，在裂解之前已全部被翻譯。
如果上述的c)序列編碼的不只是一種多肽，而且不是希望，例如，獲得一種未被切割的融合的復(fù)數(shù)多肽，那么就不必要在每個(gè)被編碼的多肽之間再進(jìn)一步編碼裂解序列。
如果上述c)的序列編碼超過一種多肽，則該序列在轉(zhuǎn)錄環(huán)境中便易于衰減。在衰減過程中，在整個(gè)mRNA被閱讀之前本發(fā)明mRNA序列的轉(zhuǎn)錄即停止，以致于靠近該序列3′端編碼的多肽產(chǎn)生數(shù)量將少于靠近5′端編碼的多肽。除非編碼了幾種多肽和/或該多肽非常長(zhǎng)，衰減一般不是問題。
除非是希望制備一起使用的多種肽或這些肽是融合的，一般優(yōu)選上述的c)序列只編碼一種多肽。否則，必須在裂解之后分離單個(gè)的多肽，而這是一種笨拙的方法，并且浪費(fèi)純化過程中的終產(chǎn)物。
然而，當(dāng)上述c)中的序列編碼一個(gè)以上的多肽，并且在每個(gè)編碼的多肽之間有一個(gè)裂解序列時(shí)，該裂解序列不一定要被CYVV-NIa所識(shí)別。必須要求的是在a)的序列和b)的序列5′端之間的裂解序列要能夠被由a)序列編碼的蛋白酶所識(shí)別。如果希望或能夠允許融合蛋白自身消化來制備多個(gè)多肽，那么任何進(jìn)一步的裂解序列便可被由a)序列所編碼的蛋白酶識(shí)別。盡管如此，對(duì)這些進(jìn)一步的序列應(yīng)當(dāng)進(jìn)行選擇以使它們能被其他工具所切割，從而使融合蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄之后被它的NIa部分所切割，以產(chǎn)生NIa和多聚蛋白質(zhì)。然后可以去掉NIa，并通過例如因子Xa或胰蛋白酶切割該多聚蛋白質(zhì)。
由上述b)序列所編碼的裂解肽(這里也稱為“裂解序列”和“裂解肽”)可以是一種全部或部分包含于由a)和c)序列所編碼的任一序列(分別是“NIa”或“蛋白酶”，和“多肽”)之中的序列。因此，裂解肽的N末端也可以是包括于蛋白酶C末端序列之中，而裂解肽的C末端部分可以包括于多肽的N末端部分中。在這種情況下，裂解肽或稱切割肽沒有獨(dú)立存在，而且蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)是由蛋白酶的C末端和多肽的N末端組成的。
裂解肽也可以是只被包含于部分蛋白酶或多肽之中。在這種情況下，裂解肽的N末端一般是包含于蛋白酶的C末端部分中，而多肽的N末端部分可以直接連接到裂解序列上或在多肽和接頭之間有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上。
如果裂解序列和蛋白酶和/或在裂解序列和多肽之間有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，那么這些殘基的數(shù)量和性質(zhì)不應(yīng)當(dāng)妨礙蛋白酶的功能。在多肽N末端存在有過量的氨基酸殘基一般是不利的，這些殘基必須去除以獲得成熟形式的多肽。如果可能并且在沒有禁忌的情況下，一般優(yōu)選對(duì)裂解肽進(jìn)行加工處理以致于融合蛋白質(zhì)裂解時(shí)獲得成熟形式的所希望的蛋白質(zhì)。但是也完全有可能獲得在N末端上帶有Gly，Ser或Ala的蛋白質(zhì)，并且如果需要的話，可通過合適的氨基肽酶的作用將其去掉。
在某些情況下，希望在多肽的N末端和裂解序列之間編碼一個(gè)脯氨酸。這樣可以允許例如通過氨基肽酶P(3，4，11，9)的作用切割殘基達(dá)到脯氨酸殘基處，但不超過它。然后，再通過脯氨酸亞氨基肽酶的作用去掉脯氨酸殘基以產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)。這便形成了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案。
a)序列編碼一種能夠切割由本發(fā)明序列編碼之融合蛋白質(zhì)的蛋白酶。在本發(fā)明中，這種蛋白酶是三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白酶，或與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白酶具有類似蛋白水解特異性的突變體或變異體。
三葉草黃色葉脈病毒NIa蛋白酶是由序列表內(nèi)序列ID No.1序列中的第10至1311位核苷酸編碼的，而NIa的一級(jí)序列是由序列表中序列ID No.2序列的第4到437位氨基酸所給出的。這些序列以及其突變體和變異體都是新的，構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
核包涵體a具有能夠特異性水解底物肽中Gln-Ala，Gln-Gly或Gln-Ser之間肽鍵的蛋白水解活性。另外，我們還發(fā)現(xiàn)NIa能夠切割Gln-Val。因此，與馬鈴薯Y病毒家族的其他蛋白酶相反，我們已發(fā)現(xiàn)CYVV NIa(本文所指的NIa除另有說明者外，應(yīng)當(dāng)理解為CYVV NIa)能夠切割序列Asn Cys Ser Phe GlnX，其中X是任何氨基酸殘基，但是尤其指Gly.Ala.Val Ser，并且特別指Gly，Ala或Ser。
另外還希望含有序列Asn Cys Ser Phe GlnX的肽能夠被NIa所切割，尤其是在這個(gè)序列立體結(jié)構(gòu)上曝露于NIa的作用之處。因此，本發(fā)明還提供了一種用于制備多肽的系統(tǒng)，其中含有序列Asn CysSer Phe Gln X的多肽的前體形式被NIa裂解。這個(gè)系統(tǒng)也可以含有其他的加工步驟，只要合適，可以是在NIa裂解之前、之后或同時(shí)發(fā)生這些加工。
盡管我們一般優(yōu)先使用編碼天然產(chǎn)生之NIa的序列(根據(jù)序列ID2)，但是本發(fā)明同樣也包括使用NIa的突變體或變異體。
如上所述，蛋白酶應(yīng)當(dāng)具有與天然NIa相同或相似的特異性。在這方面，蛋白酶一般應(yīng)當(dāng)與序列ID No.2中的氨基酸殘基4至437分享重要的序列同源性，而在沒有改變識(shí)別序列或使活性降低到應(yīng)用水平以下的情況下可能發(fā)生實(shí)質(zhì)性變異，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
一般來說，任何給定的蛋白質(zhì)的活性均取決于分子的某些保守區(qū)域，而其他區(qū)域與它們的特定序列幾乎沒有重要關(guān)聯(lián)，并且它可能幾乎完全是多余的。因此，如上所述，本發(fā)明包括了仍然能表現(xiàn)出與天然產(chǎn)生的NIa有類似特異性的該序列的任何突變體和變異體。這種突變體和變異體包括，例如缺失、加入、插入、倒位重復(fù)和類型替代(例如，用一個(gè)親水殘基替代另一個(gè)，但是原則上是不強(qiáng)的親水殘基替代強(qiáng)的疏水殘基)。小的變化一般不影響活性，除非它們是發(fā)生在分子的基本部位，而且這種改變可以是基因操作的付產(chǎn)物，例如，如果需要，發(fā)生在產(chǎn)生額外限制性位點(diǎn)時(shí)。
一般來說，除了對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的情況之外，通常沒有任何特殊的理由要改變NIa的結(jié)構(gòu)。的確，絕大部分氨基酸或編碼序列的突變或變異是在原始野生型病毒上分離新的變異的結(jié)果。然而，只要蛋白酶具有必要的特異性和足夠的蛋白水解活性，本發(fā)明并不排除精細(xì)設(shè)計(jì)的，甚至是偶然的修飾。
本文所用術(shù)語(yǔ)“不利影響”是指能夠影響蛋白酶的特異性或活性使之顯著低于上述天然NIa之效果的任何作用，影響的程度是其活性降低到有用水平以下。
許多取代、加入等都可能發(fā)生，唯一的限制是其活性不能受到不利的影響。一般來說，只有在NIa的三維結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的影響時(shí)才可能對(duì)活性有不利作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“突變體”是指對(duì)活性不產(chǎn)生不利影響的序列中氨基酸的缺失、加入、插入、倒位和取代。本發(fā)明還包括“變異體”，該術(shù)語(yǔ)用于指與序列ID 2密切相關(guān)的天然產(chǎn)生的CYVVNIa，但是在大的種群內(nèi)它以預(yù)期方式由之發(fā)生變化。這一定義內(nèi)包含了等位基因變異和來源于其他培育品種的表現(xiàn)出類似活性與相關(guān)序列的那些多肽。
應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明第二方案的NIa和蛋白質(zhì)都不必分別與序列ID 2和12中所描述的序列完全一致。唯一的要求是盡管多肽只是完整天然序列的一部分或該部分的突變體或變異體，但它們都必須有所需的活性。
真核生物的基因，如干擾素基因，一般被認(rèn)為表現(xiàn)有多態(tài)性[參見Nishi，T.et al.(1985)，J.Biochem.97，153-159]。這種多態(tài)性導(dǎo)致出現(xiàn)了在多肽中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的情況，以及除了核甘酸序列取代之外沒有氨基酸序列變化的其他情形。
因此，只要對(duì)蛋白酶活性沒有不利影響，多核苷酸編碼序列可以以任何所需方式被修飾。點(diǎn)突變和其他的變化可以有效地加入或缺失限制性位點(diǎn)，例如，以有助于基因操作/表達(dá)，或增強(qiáng)或方便地修飾NIa分子。
術(shù)語(yǔ)“突變體”和“變異體”還用于指多核苷酸序列，并且這種特指應(yīng)當(dāng)以合適的方式，mutatis mutandis加以解釋。應(yīng)當(dāng)清楚的是，雖然肽序列的突變體或變異體總是在編碼核苷酸序列中反映出來，但反過來則不一定是真實(shí)的。因此，有可能核苷酸序列發(fā)生很大變化(參見下文關(guān)于基因編碼簡(jiǎn)并性的討論)，而不以任何方式影響肽序列。這種核苷酸序列的突變和變異是在本發(fā)明之內(nèi)的。
例如，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了用一個(gè)絲氨酸密碼子取代白介素2(IL-2)基因中的半胱氨酸密碼子所獲得的蛋白質(zhì)仍然能夠表達(dá)IL-2的活性[Wang，A.et al.(1984)，Science 2241431-1433]。因此，只要某序列編碼具有合適NIa活性的天然或合成蛋白質(zhì)，那么它就包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員可以容易地由序列ID 2經(jīng)反向工程制得本發(fā)明編碼NIa的基因。
應(yīng)當(dāng)指出的是，由于基因密碼的簡(jiǎn)并性，任何給定的反向工程操作的序列都不一定與來自相同肽的任何反向工程操作的互補(bǔ)序列完好或充分雜交。這是本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員預(yù)計(jì)之中的共同因素。并且任何給定序列的簡(jiǎn)并性經(jīng)常是很寬的，以致于很難合成一個(gè)甚至很短的互補(bǔ)寡核苷酸序列作為天然產(chǎn)生之寡核苷酸序列的探針。
密碼子的簡(jiǎn)并性是這樣的，例如，對(duì)于大多數(shù)經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸會(huì)有4個(gè)或更多個(gè)可能的密碼子。因此，對(duì)于任何特定肽的可能的編碼序列的數(shù)量可隨著殘基的數(shù)量呈指數(shù)增加。鑒于此，本發(fā)明NIa的可能的編碼序列數(shù)會(huì)有6位或超過6位數(shù)。盡管如此，還是要根據(jù)相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)來平衡G+C的含量。而且還應(yīng)考慮到一些其他因素如用于相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)的密碼子頻率。
如上所述，雜交可能不是表示序列同源性可靠指征，然而，與序列ID 1表現(xiàn)有50％以上，較好70％，最好80％的同源性一般是優(yōu)選的。在每種情況下，都應(yīng)是編碼所定義的蛋白酶。
本發(fā)明還包括了前導(dǎo)序列編碼的蛋白酶上游的可能應(yīng)用。這樣可使得融合蛋白質(zhì)進(jìn)入宿主外環(huán)境，并在培養(yǎng)上清中收集之。然后使收集到的外在化融合蛋白質(zhì)自身消化，并收集多肽。作為這種信號(hào)序列，可以使用任何合適的序列，尤其是已為特定表達(dá)系統(tǒng)特殊制備的序列。
本發(fā)明還包括了含有本發(fā)明序列的載體。
用于本發(fā)明的載體的一般性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明來說并不十分重要。一般來說，合適的載體和表達(dá)我體以及其構(gòu)建對(duì)于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且可以準(zhǔn)確地根據(jù)操作者要使用該序列達(dá)到的目的，如克隆或表達(dá)，來選擇適當(dāng)載體。
合適的表達(dá)載體可以是基于噬菌體或質(zhì)粒的載體，盡管可以對(duì)它們進(jìn)行工程化改造以使適應(yīng)于其它宿主，但二者一般都是宿主特異性的。其它合適的載體包括粘性質(zhì)粒(Cosmids)和反轉(zhuǎn)錄病毒以及任何其他的載體，它們對(duì)于特定系統(tǒng)可以有，也可以沒有特異性。合適的控制序列，如識(shí)別序列、啟動(dòng)子、操縱基因、誘導(dǎo)基因、終止子和調(diào)節(jié)表達(dá)中基本的或有用的其它序列，對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們可以是與CYVV或所用載體相關(guān)的那些序列，或者是其它合適來源的序列?？梢砸匀魏魏线m的方式對(duì)載體進(jìn)行修飾或基因工程化改造。
序列ID 2代表了編碼完整NIa的足夠序列?？梢约尤胨枰慕K止子，啟動(dòng)子和其他的這類控制序列，例如，以有利于與合適載體的連接，或表達(dá)，或二者兼有之。
可以容易地將編碼本發(fā)明NIa的DNA片段，與編碼裂解序列的任何片段及編碼多肽的片段一起插入到任何合適的載體中。理想的是，接受載體含有利于插入的合適的限制性位點(diǎn)，但是也可以利用例如鈍端連接，但是這可以導(dǎo)致在開放閱讀框架上及插入方向上的不確定性。在這種情況下，當(dāng)然要對(duì)轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行檢測(cè)，以選擇具有插到正確方向和正確ORF中之必要片段的載體。為了確保該片段位于正確的ORF中，理想的是創(chuàng)制一個(gè)序列a)b)和c)的構(gòu)建體，然后將其直接插入到載體中，從而減少了獲得所需表達(dá)載體的不確定性。本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員根據(jù)所需的表達(dá)系統(tǒng)可以選擇到合適的載體。
經(jīng)用例如所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)，用氨芐青霉素抗性或其他合適的工具選擇轉(zhuǎn)化體，加入色氨酸或其他合適的啟動(dòng)子誘導(dǎo)物(如吲哚基丙烯酸)，可以表達(dá)所需要的融合蛋白質(zhì)?？山?jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)來分析表達(dá)程度[Laemmli et al.，Nature，(1970)，227，PP，680-685]。
還需指出的是，如果使用另一種載體時(shí)，則使用任何合適的選擇標(biāo)記物，或其他的選擇方法，和/或使用任何所需的或方便的合適啟動(dòng)子都是同樣可被接受的。
培養(yǎng)之后，如果要從宿主細(xì)胞中收集融合蛋白質(zhì)，則要適當(dāng)?shù)厥占D(zhuǎn)化體細(xì)胞、破碎細(xì)胞(如用超聲波)并沉淀細(xì)胞碎片。破碎也可以是利用酶消化技術(shù)，如使用纖維素酶，或者使用某種試劑如玻璃珠振蕩，但一般優(yōu)選超聲處理破碎方法(因該方法不需要其他的試劑)。對(duì)所得到的上清分析其多肽活性，并通過SDS-PAGE確定裂解產(chǎn)物。
常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法適合于獲得表達(dá)產(chǎn)物。
通過從三葉草黃色葉脈病毒中分離RNA基因組來制備本發(fā)明的DNA[Uyeda，I.et al.(1975)Ann.Phytopath.Soc.Japan4192-203]。合適的CYVV來源是ATCC NO.PV123。在任何情況下，三葉草黃色葉脈病毒可以限定為能夠引起蠶豆壞死的病毒。
從被感染植物中純化的CYVV顆粒中獲得基因組RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并用已知方法制備雙股cDNA。
為了確定病毒是否為CYVV相同毒侏的突變體或變異體，序列同源性是一種好的標(biāo)志。許多類型的馬鈴薯Y病毒是已知的，它們?cè)谥虏⌒苑矫娓鞑幌嗤?。一種已知病毒是否構(gòu)成該家族的分離的成員，是基于病毒衣殼蛋白的血清學(xué)關(guān)聯(lián)及氨基酸序列的同源性。因此，具有分享90％同源性之一級(jí)氨基酸序列的病毒被認(rèn)為是相同毒株，而具有分享低于70％同源性之一級(jí)氨基酸序列的病毒則被認(rèn)為是不同的家族成員[Shukla，D.D.and Ward，C.W.(1989)，Arch.Virol.106171-200]。根據(jù)本發(fā)明中所用CYVV之衣殼蛋白質(zhì)的各種特性[Uyeda，I.et al.(1991)，Intervirol.32234-245]，此CYVV被鑒別為馬鈴薯Y病毒家族的一個(gè)獨(dú)立成員。因此，任何具有90％或更多的衣殼蛋白質(zhì)一級(jí)氨基酸序列同源性的病毒，或任何用抗CYVV抗血清(如ATCC NO.PVAS-123三葉草黃色葉脈病毒抗血清)經(jīng)ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性的病毒，均被限定為是三葉草黃色葉脈病毒的毒株。
CYVV能夠在其上面生長(zhǎng)的各種植物品種包括普通云扁豆，蠶豆和Pisum Sativum，但是優(yōu)選蠶豆，尤其是蠶豆培育品種Wase-Soramame。
純化病毒顆粒的優(yōu)選方法包括在適合的緩沖液中將被感染之植物的葉子制成勻漿并擠壓，然后用有機(jī)溶劑如氯仿提取，反復(fù)差速離心，然后再進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。
確定如此獲得的病毒顆粒是否為CYVV的一種方法是在電子顯微鏡下檢查該病毒顆粒。另一種方法是將病毒顆粒與蠶豆一起培育以觀察是否有癥狀出現(xiàn)。
從病毒顆粒中提取基因組RNA的合適方法包括硫氰酸鈲/苯酚法，硫氰酸鈲/三氟銫法和苯酚/SDS方法。但是，我們優(yōu)選使用堿性蔗糖密度梯度離心法[Dougherty，W.G.and Hiebert，E.(1980)Virology 101466-474]。
然后可在一無細(xì)胞翻譯體系中檢驗(yàn)按上述方法獲得的RNA，以確定它的確能編碼蛋白酶。經(jīng)監(jiān)測(cè)溶解產(chǎn)物中收獲之產(chǎn)物的分子量的改變，即可確定當(dāng)RNA不只編碼總翻譯產(chǎn)物中的蛋白酶時(shí)，產(chǎn)物的自溶(自身消化)現(xiàn)象。例如可借助抗衣殼蛋白質(zhì)抗體來進(jìn)行這一監(jiān)測(cè)。
如果需要，可以利用抗衣殼蛋白質(zhì)抗體，例如，將被翻譯的基因組RNA注射到爪蟾卵母細(xì)胞中[Gurdon，J.B.(1972)，Nature 233177-182]，或利用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞或麥胚溶解產(chǎn)物系統(tǒng)[Schleif，R.F.and Wensink，P.C.(1981)，“Pract ical Methods in Molecular Biology”Spring-Verlag，N.Y.]以在不同時(shí)間監(jiān)測(cè)翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生。
可利用如此獲得的基因組RNA作為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單股DNA，再通過下述的標(biāo)準(zhǔn)方法由單股cDNA合成雙股cDNA(ds-cDNA)。合適的方法包括S1核酸酶法[Efstratidiatis，A.et al.(1976).Cell 7279-288；Okayama，H.and Berg，P.(1982)，Mol.Cell.Biol.2161-170和其他文獻(xiàn)]、Land法[Land，H.et al.(1981)Nucleic Acids Res.9，2251-2266]和O.Joon Yoo法[Yoo.O.J.et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1049-1053]。在各種選擇中，我們優(yōu)選Gubler-Hoffman法[Gubler，U.and Hoffman，B.J.(1983)，Gene 25263-269]。
可將如此獲得的ds-cDNA結(jié)合到克隆載體，如質(zhì)粒或λ噬菌體中，然后將所得到的重組載轉(zhuǎn)化到微生物如大腸桿菌，尤其是E.coli DH5α菌株中。按本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，利用其對(duì)抗菌素，如四環(huán)素或氨芐青霉素的抗性來選擇轉(zhuǎn)化株。
可以利用Hanahan方法[Hanahan，D.(1983)，J.Mol.Biol.166557-580]實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，其中將重組DNA載體導(dǎo)入到已經(jīng)用氯化鈣、氯化鎂或氯化銣處理而處于感受態(tài)的細(xì)胞中。
選擇具有NIa DNA之轉(zhuǎn)化株的合適方法如下所述。
(1)用探針篩選如果希望從野生型CYVV開始，那么分離合適RNA的一種方法是利用cDNA探針，條件是NIa的氨基酸序列已經(jīng)被闡明(所使用的序列部分可以來自NIa的任何區(qū)域)。為此，合成與相關(guān)氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸。一般來說，所選擇的氨基酸序應(yīng)包括盡可能少的簡(jiǎn)并性，否則必須利用幾種可能的密碼子生產(chǎn)幾種探針。在這種情況下，考慮到密碼子利用頻率因素可能會(huì)有所幫助?；蛘?，可考慮多個(gè)核苷酸序列，并可以用次黃嘌呤核苷替代變化的核苷酸。用放射性同位素如32P，35S或生物素標(biāo)記探針。用放射標(biāo)記的探針將變性的質(zhì)粒DNA固定到硝化纖維素濾膜上以檢測(cè)轉(zhuǎn)化體毒株，可通過放射自顯影檢測(cè)出陽(yáng)性克隆。
(2)使用PCR探針在此方法中，合成來源于與部分已知氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的有意義鏈和反義鏈的寡核苷酸，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)[Saiki，R.K.et al.(1988)，Science 239，487-491]?？梢詫⑺鼈兟?lián)合使用用于擴(kuò)增編碼NIa的DNA片段。通過反轉(zhuǎn)錄已知編碼NIa的病毒基因組RNA獲得的cDNA是合適的模板DNA。用32P，35S或生物素標(biāo)記如此制備的DNA片段，用該探針進(jìn)行菌落雜交或噬斑雜交以選擇有用克隆。
(3)根據(jù)在動(dòng)物細(xì)胞中的外源性產(chǎn)生進(jìn)行篩選該方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體毒株以擴(kuò)增基因，然后將該基團(tuán)轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞中(一般使用處于復(fù)制感受態(tài)和含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒，或使用可被整合到適當(dāng)染色體中的質(zhì)粒)，以表達(dá)由該基因編碼的蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^測(cè)定相關(guān)活性來選擇轉(zhuǎn)化株。
(4)使用抗NIa抗體進(jìn)行選擇從用CYVV感染的植物中制備抗核包涵體(NIa和NIb)的抗體，或在合適的系統(tǒng)中制備抗由該表達(dá)載體產(chǎn)生之蛋白質(zhì)的抗體。這種抗體，或其抗抗體能夠檢測(cè)出所需的NIa或有意義的轉(zhuǎn)化株。
(5)選擇性雜交翻譯系統(tǒng)如上所述，使轉(zhuǎn)化體cDNA與來源于表達(dá)NIa之細(xì)胞的mRNA雜交，解離結(jié)合到cDNA上的mRNA并回收之。在翻譯系統(tǒng)中將收集的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，例如，將其注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，或注射到兔網(wǎng)織細(xì)胞溶解產(chǎn)物或麥胚溶解產(chǎn)物這樣的無細(xì)胞體系中。通過檢查NIa活性或利用抗NIa抗體檢測(cè)NIa，來選擇有意義的轉(zhuǎn)化株。
可用已知方法[參見Maniatis，T.et al.(1982)，“Molecular Cloning A Laboratory Manual”Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.]從有意義的轉(zhuǎn)化株中獲得編碼CYVV NIa的DNA。例如，從細(xì)胞中分離出與載體DNA相對(duì)應(yīng)的一部分，并從所說的質(zhì)粒DNA上切下編碼所說蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域。
可以利用，例如，Maxam-Gilbert化學(xué)修飾方法[Maxam，A.M.and Gilbert，W.(1980)，“Methods in Enzymology”65499-276]，或借助例如使用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法[Messing，J.and Vieira，J.(1982)，Gene 19269-276]來完成對(duì)所獲得之DNA的序列測(cè)定。
近年來，熒光技術(shù)傾向于替代較為危險(xiǎn)的放射性同位素測(cè)定DNA序列。另外，當(dāng)前一般可通過機(jī)機(jī)器人在計(jì)算機(jī)控制下完成雙脫氧核苷酸鏈終止法。用于電泳后閱讀堿基序列的系統(tǒng)越來越豐富，這方面的例子包括“CATALYST 800”測(cè)序機(jī)器人和373A DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems)。這些系統(tǒng)使得DNA堿基序列測(cè)定方法即快捷又安全。
一般所選擇的本發(fā)明的載體能夠在原核或真核“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞”中表達(dá)。另外，通過將一合適的啟動(dòng)子和用于表型表達(dá)的序列導(dǎo)入到載體中，可以使該基因在相配的宿主細(xì)胞中得以表達(dá)。
合適的原核宿主包括大腸桿菌和枯草桿菌。為了進(jìn)行相關(guān)基因的表型表達(dá)，載體可以適當(dāng)?shù)睾衼碓从谂c宿主相容的種的復(fù)制子。在大腸桿菌中，質(zhì)粒可以含有復(fù)制原點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，如Lac或UV5。能夠?qū)⒒诒硇吞卣?表現(xiàn)型)的選擇性賦予被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體是優(yōu)選的。
經(jīng)常使用大腸桿菌作為宿主，并且優(yōu)選衍生于大腸桿菌菌株K12的JM 109菌株。目前用于大腸桿菌的載體一般選自pBR322或pUC質(zhì)粒系列，但是也可以按照需要使用其他的菌株和載體。適合于大腸桿菌的啟動(dòng)子包括乳糖啟動(dòng)子(Lac)、色氨酸啟動(dòng)子(trp)、色氨酸—乳糖啟動(dòng)子(tac)，脂蛋白(lpp)啟動(dòng)子、lambda(λ)PL啟動(dòng)子(來自λ噬菌體)和多肽鏈延長(zhǎng)因子Tu(tnf B)啟動(dòng)子，但是本發(fā)明并不限于這些啟動(dòng)子。
枯草桿菌的合適菌株包括207-25菌株。合適的載體包括pTUB228[Obmura，K.et al.(1984)，J.Biochem.9587-93]和其他載體。合適的啟動(dòng)子是枯草桿菌α淀粉酶基因的調(diào)節(jié)序列。這是一個(gè)能夠?qū)⑿盘?hào)肽序列(來源于α淀粉酶)用于細(xì)胞外分泌的適當(dāng)例子。
如果希望在真核細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白質(zhì)，則可以使用脊椎動(dòng)物、昆蟲、酵母、植物等的細(xì)胞。優(yōu)選性脊椎動(dòng)物細(xì)胞是COS細(xì)胞，尤其是COS-1細(xì)胞[例如參見Gluzman，Y.(1981)，Cell 23175-182]，或二氫葉酸還原酶缺陷性中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞系(CHO)[Urlaub，G.and Chasin，L.A.(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220]，但本發(fā)明并不局限于這些宿主細(xì)胞。如上所述，COS細(xì)胞適合于用作脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞，而且這些細(xì)胞可以作為實(shí)施例。含有SV40復(fù)制子的表達(dá)載體能夠在COS細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制，并且這些載體還具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列及一個(gè)或多個(gè)切接位點(diǎn)?？梢越柚鷰追N方法，如DEAE-葡聚糖法[Luthman，H.and Magnusson，G.(1983)，Nucleic AcidsRes，11，1295-1308]、磷酸鈣-DNA共沉淀法[Graham，F(xiàn).L.and van der Eb.A.J.(1973)，Virology 52，456-457]和電穿孔法[Neumann，E.et al.(1982)，EMBO J.1，841-845]，用含有所需DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化COS細(xì)胞。
如果用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則應(yīng)當(dāng)使用能夠表達(dá)可提供G418抗性之neo基因的載體。攜帶這種標(biāo)記物的合適載體包括pRSVneo[Sambrook，J.et al.(1989)；“MoleculorCloning-A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory，NY]和pSV2-neo[Southern，P.J.and Berg，P.(1982)，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341]。然后可根據(jù)它們對(duì)G418的抗性來選擇轉(zhuǎn)化體。
可用常規(guī)方法培養(yǎng)選擇的轉(zhuǎn)化體，并且在本發(fā)明的第二個(gè)方案的情況下，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都產(chǎn)生多肽?？梢愿鶕?jù)所使用的宿主細(xì)胞，從常用培養(yǎng)基中選擇合適的培養(yǎng)基。例如，對(duì)于COS細(xì)胞來說，必須向培養(yǎng)基中加入含有血液成份，如胎牛血清的培養(yǎng)基，如RPMI-1640培養(yǎng)基或Dulbecco氏修改的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)。
如果研究者選用昆蟲細(xì)胞，那么可以使用來源于Spodopterafrugiperda的細(xì)胞[Smith，G.E.et al.(1983)，Mol.Cell.Biol.32156-2165]。
合適的酵母包括貝克氏酵母(Saccharomyces Cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)。
合適的植物細(xì)胞包括來源于煙草(Nicotiana tabacum)和Oryza sativa的植物細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)指出的是，上面列舉的宿主是本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)宿主，本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員能夠在這些和其他宿主中適當(dāng)?shù)剡x擇所需要者。
適用于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體包括在待表達(dá)之基因上游有一啟動(dòng)子的那些載體，而且所說載體中還帶有RNA切接位點(diǎn)與聚腺苷酸化位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄終止序列，如果需要還帶有復(fù)制原點(diǎn)。這種表達(dá)載體的合適例子是pSV2dhfr，它帶有SV40早期啟動(dòng)子[Subramani，S.et al.(1981)，Mol.Cell.Bio.，1854-864]。
適用于昆蟲細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)包括Spodoptera frugiperda的培養(yǎng)細(xì)胞。合適的表達(dá)載體在所要表達(dá)基因的上游帶有桿狀病毒多角體啟動(dòng)子，并且還帶有聚腺苷酸化位點(diǎn)和同源重組所需要的部分AcMNPV(Acutographa Californica核多角體病病毒)基因組。其中一個(gè)例子是p BacPAK8[Matuura，Y.et al.(1987)，J.Gen.Virol.681233-1250]。
對(duì)于真核表達(dá)，一般使用酵母，如貝克氏酵母(S.cerevisiae))。適用于酵母的表達(dá)載體包括醇脫氫酶啟動(dòng)子[Bennetzen，J.L.andHall，B.D.(1982)，J.Biol.chem.2573018-3025]、酸性磷酸酶啟動(dòng)子[Miyahara，A.et al.(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，1-5]，或羧基肽酶Y啟動(dòng)子[Ichikawa，K.et al.(1993)，Biosci.Biotech.Biochem.571686-1690]。在這種情況下，也可以使用來源于羧基肽酶Y的信號(hào)肽序列，以使表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外空間。
適用于植物的表達(dá)載體，例如包括pBI121，它具有一個(gè)35S啟動(dòng)子[衍生于花椰菜花葉病毒的早期啟動(dòng)子)、來源于Agrobacteriumtumefaciens的藍(lán)曙紅(nopaline)合成基因的多聚腺苷酸化序列及Agrobacterium tumefaciens基因轉(zhuǎn)移序列[Jefferson，R.A.et al.(1987)，EMBO J.63901-3907]?？捎肁grobacteriumtumefaciens感染和電穿孔等方法將這些載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中。
質(zhì)粒pKK 388-1(由Clonetech.Co.生產(chǎn))具有trc啟動(dòng)子并適用于大腸桿菌。該表達(dá)載體能夠在衍生于大腸桿菌菌株K12的菌株，如JM109菌株中自動(dòng)復(fù)制?？赏ㄟ^如上所述的已知方法很容易地將此載體導(dǎo)入到大腸桿菌中。將如此獲得的菌株接種到培養(yǎng)基上，如已知的LB培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)一段時(shí)間。
然后經(jīng)加入，例如異丙基-β-吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，以激活trc啟動(dòng)子。進(jìn)一步培養(yǎng)之后，破碎細(xì)胞(如超聲波破碎)并從細(xì)胞中提取所表達(dá)的蛋白質(zhì)。如果希望產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在N末端帶有脯氨酸(Pro)，則一般適于使用大腸桿菌作為宿主。
基于上述的描述，并在必要時(shí)考慮附帶的實(shí)施例，可根據(jù)多肽的物理和化學(xué)特性，用已知的方法從適當(dāng)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離和純化含有所需多肽的部分。這些適當(dāng)?shù)姆椒òㄓ玫鞍壮恋韯┨幚?、超濾、各種層析法[如分子篩層析(凝膠過濾)，吸附層析、離子交換層析、親和層析和高效液相層析(HPLC)]、透析以及上述方法的聯(lián)合使用。
為了確定所表達(dá)的NIa蛋白質(zhì)是否具有所必需的蛋白酶活性，可使純化的NIa蛋白質(zhì)與含有該蛋白酶裂解序列的底物蛋白質(zhì)，例如編碼融合之基因的表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，該融合蛋白質(zhì)包括了病毒衣殼蛋白(NIa的天然底物)和核包涵體b(NIb)[Dougherty，W.G.et al.(1988)，EMBO J.71281-1287]?？梢詫⑦@種融合蛋白質(zhì)從病毒基因組cDNA中分離出來，并插入到表達(dá)載體中。然后將所得到的表達(dá)載體導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。按已知方法，如用蛋白質(zhì)沉淀劑或?qū)游龇ㄌ幚硭@得的融合蛋白質(zhì)，即可分離并純化之。
使如此分離和純化的底物蛋白質(zhì)與所說蛋白酶在合適的緩沖溶液中，于合適溫度下反應(yīng)，并回收反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)回收的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，并用抗衣殼蛋白抗體進(jìn)行Western印跡分析，根據(jù)譜帶遷移的差別檢測(cè)蛋白酶活性。在此方法中，也可以使用含有合適裂解序列的合成寡肽。
不需純化便可測(cè)出本發(fā)明蛋白酶的蛋白水解活性。因此通過連接蛋白酶基因的序列和相同的開放閱讀框架、啟動(dòng)子如trc啟動(dòng)子的下游，以及蛋白酶裂解序列的上游即可測(cè)出其活性。如果表達(dá)產(chǎn)物中的蛋白酶有活性，就可通過Western印跡法觀察到比融合蛋白遷移率高的帶。
通過從凝膠中回收已被觀察到裂解的帶，并通過常規(guī)的方法學(xué)分析其氨基末端序列就可確定蛋白質(zhì)是否在所需肽鍵處裂解。
可以產(chǎn)生預(yù)期產(chǎn)生的該蛋白質(zhì)，例如可以作為融合蛋白質(zhì)，如與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)，一起形成的融合蛋白質(zhì)，和然后可用本發(fā)明的NIa在體外裂解接頭序列。作為一種選擇，所需的蛋白質(zhì)可以在宿主細(xì)胞中直接表達(dá)如作為與所說的蛋白酶形成的融合蛋白質(zhì)，所需的蛋白質(zhì)則可經(jīng)自身裂解而制得。
如有必要，可傳用上述方法容易地以高產(chǎn)率和高純度產(chǎn)生NIa，并可將如此得到的本發(fā)明的重組NIa用作蛋白酶。
如果必要可以化學(xué)合成本發(fā)明的DNA，然后可用常規(guī)方法學(xué)，如亞磷酸三酯法[Hunkapiller，M.et al.(1984)；Nature 310105-111]或用核苷酸的化學(xué)合成法[Grantham，R.et al.(1981)，Nucleic Acids Res.9r43-r74]制備之。如有必需，可用常規(guī)方法對(duì)這些核苷酸序列進(jìn)行部分修飾，如用位點(diǎn)特異性誘變法，使用含有編碼所需修飾的合成的寡核苷酸作為引物[Mark，D.F.et al.(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.815662-5666]。
如上面可提到的，例如可使用由[α-32P]dCTP標(biāo)記的探針，以隨機(jī)引物法[Feinberg，A.P.and Vogelstein，B，(1983)Anal.Biochem.1326-13]，或缺口翻譯方法[Maniatis，T.et al.(1982)，in″Molecular Cloning A Laboratory Mannual″Cold SpringHarbor Labora-tory.N.Y.]確認(rèn)雜交。用常規(guī)方法使DNA固定到固相上，例如吸收到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后加熱或用紫外線照射。再將固相常規(guī)浸沒在預(yù)雜交液中，其中含有6×SSC，5％Denhardt溶液和0.1％SDS，并在55℃下保溫4小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。然后向預(yù)雜交溶液中加入預(yù)先制備的探針至最終比活性為1×106cpm/ml，并將混合物在60℃下保溫過夜。然后在室溫下用6×SSC將固相反復(fù)洗5次每次5分鐘，再在57℃下洗20分鐘，并經(jīng)放射自顯影來確定DNA是否已雜交。需認(rèn)識(shí)到這只是一個(gè)特定實(shí)例，使用其他方法同樣是可能的。
可用細(xì)胞內(nèi)直接切割法或細(xì)胞外切割法來制備所需的蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)直接切割法通過一裂解序列，較好是Gln-Gly，Gln-Ser或Gln-Ala將編碼NIa的DNA與編碼所需蛋白質(zhì)的DNA相連接，所得的DNA編碼一融合蛋白，并被插入到含有啟動(dòng)子和終止子的載體中，然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中得以表達(dá)。被表達(dá)的融合蛋白質(zhì)通過蛋白酶活性自身裂解，從而得到一個(gè)，其中Gly，Ser或Ala被一肽鍵連接與有用蛋白質(zhì)之N-末端上的肽。特別優(yōu)選的表達(dá)蛋白質(zhì)是IL-11。
可以按上述方法，根據(jù)需要從所得蛋白質(zhì)，的N-末端上裂解，任何殘基，例如使用氨肽酶P來裂解N-末端的Pro殘基是合乎需要的。
一些表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)有氨肽酶P存在。然而，如果不存在氨肽酶P，就需要在原位裂解N-末端氨基酸殘基，然后可將氨肽酶P的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。氨肽酶P是已知蛋白質(zhì)，此酶基因序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得知的。
當(dāng)需要得到N-末端以Pro開始的蛋白質(zhì)時(shí)，通常延長(zhǎng)培養(yǎng)期限以使細(xì)胞的氨肽酶P起作用是有利的。
如上所述，可借助脯氨酸亞氨肽酶(3，4，11，5)的催化作用除去N-末端的Pro殘基，它可經(jīng)內(nèi)源表達(dá)或由外源表達(dá)載體表達(dá)(此酶是已知蛋白質(zhì)，而且此酶的基因序列是本技術(shù)領(lǐng)域人員容易利用的)。另外，可在從表達(dá)系統(tǒng)中回收后，例如融合蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌出來后，再裂解脯氨酸殘基。
因此可以看出，本發(fā)明允許生產(chǎn)具有任何預(yù)期N末端殘基的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的序列可產(chǎn)生含有Ala N-末端的多肽，然后可通過丙氨酸氨肽酶(3，4，11，14)的催化作用除去該丙氨酸殘基；丙氨酸氨肽酶是已知的酶，且其中基因序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易利用的。此技術(shù)還允許生產(chǎn)具有自由選擇之N末端殘基的多肽。
可用已知方法分離和純化所需蛋白質(zhì)。細(xì)胞外切割法可將適當(dāng)?shù)腄NA與載體結(jié)合，然后將此載體包括于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中來產(chǎn)生NIa?？墒褂秒x子交換柱、凝膠過濾柱或反相柱等純化由被轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的NIa。另外，NIa亦可被表達(dá)為與另一多肽，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶或麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)相融合的蛋白質(zhì)，然后可分別用谷胱甘肽柱或麥芽糖柱分離并純化之。用腸激酶或Xa因子切割純化的產(chǎn)物后，NIa即可被純化并使用。
同時(shí)，制備含有NIa識(shí)別序列(裂解序列)的蛋白質(zhì)前體。它可存在于指定的位置，或者該蛋白質(zhì)可通過適當(dāng)接頭(裂解序列)，連接如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶或麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)連接，而成為融合蛋白質(zhì)的一部分?？稍谶m當(dāng)緩沖溶液中使前體與NIa反應(yīng)，在體外裂解前體。如有必要，可按上述方法除去N末端的氨基酸殘基。
同前所述，可用已知方法分離和純化所得到的蛋白質(zhì)。
有關(guān)本發(fā)明的第二個(gè)具體體現(xiàn)，我們相信自然發(fā)生的還原肽具有序列ID12所示的序列，它由526個(gè)氨基酸組成，帶有N-末端纈氨酸殘基。
據(jù)信自然存在的編碼此肽的DNA具有序列ID11中70至1647位的核苷酸序列。
本發(fā)明的肽可以還原氧化的谷胱甘肽和二氯靛酚。這是對(duì)此肽準(zhǔn)確的描述，但在某種程度上有些累贅，以致本發(fā)明的肽在本文中也稱為KM31-7肽或蛋白質(zhì)。
KM31-7蛋白質(zhì)來源于體內(nèi)，也可是它的突變體或變異體，因而與其毒性和/或抗原性有關(guān)的問題很少。
在本發(fā)明的第二個(gè)具體體現(xiàn)中，據(jù)信具有序列ID12中序列-23至526的多肽是KM31-7蛋白質(zhì)的前體。因而本發(fā)明也包括此前體及其突變體和變異體，以及編碼它們中的任一個(gè)的多核苷酸序列。
下面有關(guān)本發(fā)明第二個(gè)具體體現(xiàn)的討論是必要的。應(yīng)理解上述與CYVV NIa有關(guān)的許多前體對(duì)于分離、克隆和表達(dá)編碼本發(fā)明肽的DNA也是適用的。差別基本上是從這樣的事實(shí)中產(chǎn)生的，即CYVV NIa是植物病毒蛋白質(zhì)，而本發(fā)明的肽是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在將描述用基因重組技術(shù)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到已表達(dá)的特定多肽的一般步驟。
用已知方法可得到編碼KM31-7肽的mRNA并將其反轉(zhuǎn)錄成ds-DNA。任何適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞、細(xì)胞系或組織都可用作起始的mRNA的來源，但我們優(yōu)選使用從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離的KM-102細(xì)胞系[Harigaya，K.and Handa.H.(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，3447-3480]。
可使用不同的方法，如硫氰酸胍熱酚法或者硫氰酸胍鹽酸胍法從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取mRNA，但一般優(yōu)選的是硫氰酸胍氯化銫法。
既然真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中存在的mRNA中的大多數(shù)都已知具有3′末端的polyA序列，因而可利用此特性通過Oligo(dT)纖維素柱吸附來影響哺乳動(dòng)物mRNA的純化。洗脫出的mRNA可進(jìn)一步通過如蔗糖密度梯度離心的方法來分級(jí)分離。
可在適當(dāng)系統(tǒng)如Xenopus laevis卵母細(xì)胞系統(tǒng)、兔網(wǎng)織細(xì)胞系統(tǒng)或麥胚系統(tǒng)(文獻(xiàn)同上)中翻譯mRNA，來進(jìn)一步證實(shí)得到的mRNA確實(shí)是編碼所需肽的。
按下述方法完成表達(dá)產(chǎn)物之還原活性的測(cè)定。i)二氯靛酚還原活性的測(cè)定此測(cè)定方法由Beinert.H.在″Methods in Enzymology″(1962)，5，546中作過描述。
50μM二氯靛酚(Sigma)制劑是用20mM磷酸鹽緩沖液和0.5MNaCl(pH7.8)配制的。將1ml此制劑放入小杯中(SARSTEDT，10×4×45mm)，再加入檢測(cè)樣品。將15μl溶于同樣緩沖液的1mM NADPH(Boeringer-Mannheim)在室溫下加入小杯以開始反應(yīng)。
經(jīng)監(jiān)測(cè)氧化態(tài)二氯靛酚在600nm處，吸收的降低或者經(jīng)監(jiān)測(cè)NADPH在340mm處吸收的降低測(cè)出還原酶活性。(ii)氧化態(tài)谷胱甘肽還原活性的測(cè)定該檢測(cè)法的方法學(xué)由Nakajima，T.等人在″New BasicExperimental Methods in Biochemistry(6)-Assay MethodsUsing Biological Activity″，3-34中作過描述。
10mM氧化態(tài)谷胱甘肽制劑(Boeringer-Mannheim)是用20mM磷酸鹽緩沖液和0.5M NaCl配制并用調(diào)pH至7.8。在小杯(10×4×4mm)中先放入試樣。再放入15μl此制劑然后將15μl用相同緩沖液配制的1mM NADPH在室溫下加入小杯中以開始反應(yīng)，可經(jīng)監(jiān)測(cè)340nm處吸收的降低來測(cè)定谷胱甘肽還原酶活性。
可用如上所述的不同的方法從mRNA制得ds-DNA。它們包括S1核酸酶方法、Land方法和O.Joon Yoo方法(文獻(xiàn)同上)，但在此例中我們優(yōu)先使用Okayama-Berg方法[Okayama H.and Berg.P.(1982).Mol.Cell.Biol.，2，161-170]。
然后可將如此得到的ds-cDNA摻入克隆載體中，并將所得的重組質(zhì)粒被導(dǎo)入上述大腸桿菌中。
可用不同方法篩選到含有編碼本發(fā)明肽之所需DNA的菌株，例如使用上述與篩選含NIa DNA轉(zhuǎn)化體有關(guān)并作了適當(dāng)?shù)男薷牡姆椒ā＠?，如果用PCR來制備探針，則合適的模板DNA可以是上述的CDNA或者是基因組DNA。
在本發(fā)明第二個(gè)具體體現(xiàn)中，可以經(jīng)初步篩選來減少所要檢測(cè)之菌株的數(shù)目。初步篩選是可能的，因?yàn)楸景l(fā)明的肽與細(xì)胞有關(guān)，以致它的mRNA細(xì)胞因子的mRNA共同享有AUUUA特征部分[Shaw，G.and Kamen，R.(1986)，Cell 46，659-667]，因此在初步篩選中可以使用與AUUUA特征部分互補(bǔ)的合成的寡核苷酸探針，然后通過測(cè)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來進(jìn)行篩選。
然后可從載體上切掉編碼該肽的DNA，并用上述與NIa DNA有關(guān)的相似方法來測(cè)定序列。另外，按上述方法將DNA片段引入適當(dāng)?shù)妮d體中，用以轉(zhuǎn)化原核或真核宿主。
KM31-7蛋白質(zhì)可以單獨(dú)使用，也可與一種或多種其他治療藥物聯(lián)合使用，用于預(yù)防和治療由氧化的壓力導(dǎo)致或與之相關(guān)的病理狀態(tài)，或者由激活的氧導(dǎo)致的任何疾病。這些狀態(tài)包括但不只限于動(dòng)脈硬化、糖尿病、局部缺血(如再灌注障礙、缺血性心臟病、離缺血和缺血性腸炎)、浮腫、血管滲透性過高、炎癥、胃粘膜病變、急性胰腺炎、Crohn′氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、肝病、Paraquat氏病、肺氣腫、化學(xué)致癌、致癌性轉(zhuǎn)移、成人呼吸困難綜合癥、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、白內(nèi)障、早熟性視網(wǎng)膜病、自身免疫疾病、卟啉病、溶血癥、地中海貧血癥，Parkinson氏癥、Alzheimer氏病、癲癇、紫外線照射病、放射病、凍傷和燒傷。
本發(fā)明第二個(gè)具體體現(xiàn)的藥用組合物含有藥學(xué)上活性量的KM31-7肽及其藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的組合物可以不同的方式給藥，如以片劑、膠囊、粒劑、粉末和糖漿劑的形式口服給藥，或者以注射液、輸注液和栓劑的形式經(jīng)腸道外途徑給藥。其它適當(dāng)?shù)慕o藥方式對(duì)本技術(shù)熟練人員來說是顯而易見的。
當(dāng)本發(fā)明的肽以注射或輸注的方式給藥時(shí)，可將此肽的無熱原制劑制成適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的水溶液以供腸道外給藥。符合pH、等滲性和穩(wěn)定性要求的多肽溶液的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定給藥的劑量和形式，所考慮的標(biāo)準(zhǔn)包括病人狀態(tài)、體重、性別、年齡、飲食、其他感染的嚴(yán)重程度、給藥時(shí)間以及其他臨床上重要的因素。通常正常成年人口服劑量為每天約0.01mg至1000mg范圍。此量在24小時(shí)之內(nèi)可以以一次劑量給藥或者分幾次亞劑量給藥。當(dāng)此肽經(jīng)腸道外途徑給藥時(shí)，可通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，每次給藥約0.01mg至約100mg。
為了完全鑒定KM31-7蛋白質(zhì)，得到此蛋白質(zhì)特異性的抗體是重要的，這種抗體對(duì)于檢測(cè)KMα31-7蛋白質(zhì)的功能、定量、純化以及組織分配都有用處。
因此，經(jīng)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種由被PMAL31-7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌所產(chǎn)生的多肽，再將抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞一起制備雜交瘤，再篩選并克隆雜交瘤即可得到產(chǎn)生抗-KM31-7抗體的雜交瘤。由所得到的雜交瘤產(chǎn)生的抗體可識(shí)別從被PSRα31-7轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞的無血清培養(yǎng)物上清液中得到的多肽。
因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了抗體，較好是單克隆抗體或其等同物，它可特異性地識(shí)別KM31-7蛋白質(zhì)，或KM31-7蛋白質(zhì)的突變體或變異體。
本發(fā)明的抗體是針對(duì)KM31-7蛋白質(zhì)或其突變體或變異體的。應(yīng)認(rèn)識(shí)到此抗體可為多克隆或單克隆，但更好是單克隆形式的。這是因?yàn)榇嬖谕ǔＥc多克隆抗體有關(guān)的非確定性。為保持結(jié)果的一致性，不論是用于治療還是用于純化KM31-7蛋白質(zhì)，都優(yōu)選使用單克隆抗體。
可由任何適當(dāng)?shù)膭?dòng)物制備本發(fā)明的抗體。然而，當(dāng)抗體是非人抗體的，就會(huì)產(chǎn)生抗原性問題。在這方面，有可能建造出與人抗體更接近相似的抗體。可用本領(lǐng)域中已知的方法，經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾可以達(dá)到這一目的。
本發(fā)明也設(shè)想了抗同種異型抗體，即那些識(shí)別位點(diǎn)可識(shí)別上述抗體之識(shí)別位點(diǎn)的抗體。這種抗體可通過給適當(dāng)?shù)膭?dòng)物使用最初的抗體來制備這類抗同種異型抗體。值得注意的是，此過程與相應(yīng)于最初的或抗同種異型抗體的各代都可趨于無窮盡地傳遞下去。然而如果每一代不能篩選出可正確識(shí)別的抗體，那么特異性實(shí)際上就會(huì)消失?？雇N異型抗體是有用的，例如用于檢測(cè)游離的抗KM31-7抗體。
本發(fā)明也設(shè)想了能夠識(shí)別KM31-7蛋白質(zhì)的本發(fā)明抗體的片段，以及攜帶有這種抗體之識(shí)別位點(diǎn)的分子。這種片段和分子在本文中被稱作本發(fā)明抗體的″等同物″。
用質(zhì)粒pMAL 31-7轉(zhuǎn)化E.coli，純化表達(dá)產(chǎn)物并用于免疫實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。將被免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞融合以制備雜交瘤，即可得到產(chǎn)生高濃度和有良好穩(wěn)定性之抗KM31-7單克隆抗體的克隆(此克隆被命名為MKM150-2并被保藏于FermentationResearch Institute of the Agency of Industrial Scienceand Technology，Japan，保藏號(hào)為FERM BP-5086)。此克隆的培養(yǎng)物在其上清液中產(chǎn)生抗-KM31-7的單克隆抗體。
將得到的抗-KM31-7單克隆抗體與通過在E.coli中引入和表達(dá)PMAL31-7得到的融合蛋白質(zhì)一起發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng)。此抗體也與從用編碼KM31-7的cDNA轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物上清中得到的KM31-7蛋白質(zhì)發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng)。
為了產(chǎn)生單克隆抗體，一般還需接著完成下列步驟，它們包括(a)純化將被用作抗原的生物高聚物；(b)經(jīng)注射抗原來免疫小鼠，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候通過取樣和檢查血液從脾臟制備抗體生成細(xì)胞；(c)制備骨髓瘤細(xì)胞；(d)將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；(e)篩選可產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞群；(f)制備單個(gè)的克隆(克隆化)；(g)培養(yǎng)可大量產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，或如條件允許飼養(yǎng)被雜交瘤感染的小鼠；并(h)將所得單克隆抗體作為一標(biāo)記的試劑來檢測(cè)其生理活性或特性。
可參考上面所列的步驟來描述抗KM31-7單克隆抗體的生產(chǎn)。值得注意的是，沒有必要再作詳細(xì)精確地描述，而且有可能使用任何適當(dāng)?shù)牟襟E。例如，可以使用脾以外的抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤，以及其他哺乳動(dòng)物的抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤。下述步驟代表了目前優(yōu)選得到抗KM31-7單克隆抗體的方法。(a)抗原純化經(jīng)在E.coli中表達(dá)pMAL31-7并純化表達(dá)產(chǎn)物所得到的融合蛋白質(zhì)是有效的抗原材料。被pMAL31-7轉(zhuǎn)化的E.coliTB-1培養(yǎng)物需經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。然后使用直鏈淀粉樹脂柱(New England Biolabs)以親合層析法純化被表達(dá)的融合蛋白質(zhì)。從被pSRα31-7轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞之無血清培養(yǎng)物上清液中純化得到的KM31-7也是有效的抗原。(b)抗體生成細(xì)胞的制備將從(a)中得到的純化的融合蛋白質(zhì)，與弗氏完全或不完全佐劑，或明礬等佐劑相混合，然后用得到的疫苗免疫實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物優(yōu)選BALB/C小鼠，因?yàn)榇蠖鄶?shù)從小鼠中得到的有用的骨髓瘤都是從BALB/C小鼠中得到的。而且，這些小鼠的特性已經(jīng)被研究的很詳細(xì)。再者，如果抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤都來自BALB/C小鼠，則所得到的雜交瘤即可在BALB/C小鼠的腹腔中生長(zhǎng)。因此使用BALB/C小鼠可提供許多便利，使得單克隆抗體可從腹水中輕易獲得而無需使用復(fù)雜的操作步驟。然而，本發(fā)明并不局限于使用BALB/C小鼠。
抗原可以任何適當(dāng)?shù)男问浇o藥，如皮下注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或肌肉內(nèi)注射，優(yōu)選皮下注射或腹膜內(nèi)注射。
免疫可經(jīng)一次或有適當(dāng)間隔期的多次給藥而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的方案是免疫后再進(jìn)行一次或多次間隔1至5周的加強(qiáng)免疫。如果定期測(cè)定免疫動(dòng)物血清中抗所說抗原的抗體效價(jià)則可改善后來步驟的結(jié)果。具有很高抗體效價(jià)的動(dòng)物被用來提供可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。較好在最后一次免疫后3至5天從動(dòng)物體內(nèi)分離得到用于繼后融合的抗體生成細(xì)胞。
檢測(cè)抗體效價(jià)的方法包括，例如可使用放射性同位素免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、熒光抗體技術(shù)和被動(dòng)血細(xì)胞凝集法等多種不同的已知技術(shù)，但因其敏感性、速度、準(zhǔn)確性和自動(dòng)化潛力而優(yōu)選RIA和ELISA。
ELISA的適當(dāng)形式如下所述。將抗原吸附于固相上，再將固相表面暴露于與抗原不相關(guān)的蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)中以封閉沒有吸收抗原的表面任何區(qū)域然后洗固相，再將它暴露于最初抗體(如小鼠血清)的系列稀釋樣品。樣品中任何抗-KM31-7的抗體都與抗原結(jié)合。洗滌后加入酶聯(lián)的抗小鼠第二抗體，以允許結(jié)合已被結(jié)合的小鼠抗體，洗滌后加入酶底物，通過檢測(cè)參數(shù)，如由底物分解引起的顏色改變來計(jì)算抗體效價(jià)。(溶液)(c)骨髓瘤細(xì)胞的制備所建立的小鼠細(xì)胞系被優(yōu)選用作骨髓瘤細(xì)胞的來源。此細(xì)胞系的合適例子包括骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63 Ag8-U1(P3-U1)，它來自源于BALB/C的8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠[Current Topics in Micro-biology and Immunology，81，1-7(1978)]、以及P3-NSI/1-Ag4，1(NS-1)[European J.Immunology，6，511-519(1976)]，SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature，276，269-270(1978)]、P3-X63-Ag8，653(653)[J.Immunology，123，1548-1550(1979)]和P3-X63-Ag8(X63)[Nature 256，495-497(1975)]。這些細(xì)胞系可以在適當(dāng)培養(yǎng)基中作次級(jí)傳代培養(yǎng)，如使用8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基，含有8-氮雜鳥嘌呤、1.5mM谷氨酰胺、5×10-5M2-巰基乙醇、10μg/ml慶大霉素和10％小牛血清)、Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基(IMDM)或Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)。在細(xì)胞融合前3至4天，通過在正常培養(yǎng)基中，也即完全GIT[5.5ml MEM非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco)、27.5ml NCTC109(Gibco)、6ml青霉素一鏈霉素溶液(Sigma)和11ml谷氨酰胺在500mlGIT培養(yǎng)基(Wako PureChemicalIndustry)中的200mM溶液(Sigma)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使細(xì)胞計(jì)數(shù)在融合當(dāng)天增加到至少2×107個(gè)。(d)細(xì)胞融合抗體生成細(xì)胞是血漿細(xì)胞和它們的前體淋巴細(xì)胞。它們可取自動(dòng)物個(gè)體的任何適宜部位，如脾臟、淋巴結(jié)、外周血液或這些部位任何適宜的聯(lián)合。然而最常用的是脾細(xì)胞。末次免疫后3至5天，從至少具有規(guī)定的抗體效價(jià)的小鼠中收獲抗體生成細(xì)胞。將所得的抗體生成細(xì)胞與上述(c)中得到的骨髓瘤細(xì)胞融合。目前最常用的方法是使用聚乙二醇融合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，這應(yīng)歸功于該化合物的相對(duì)低水平的細(xì)胞毒性以及容易處理。此方法按下述步驟進(jìn)行。
將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞用培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)充分洗滌并混合，以使脾細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的比率大約為5至10∶1，然后經(jīng)受離心分離之。棄去上清并充分打破細(xì)胞團(tuán)，然后在攪拌下加入聚乙二醇的混合溶液(PEG，分子量1000至4000)。幾分鐘后，離心分離細(xì)胞。再棄去上清，在含有5至10ng/ml小鼠IL-6的適當(dāng)量的完全GIT中懸浮沉淀的細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板的小孔中。一旦證實(shí)各孔中有細(xì)胞生長(zhǎng)，即將培養(yǎng)基換成HAT培養(yǎng)基(含有5至10ng/ml小鼠IL-6，10-6至10-3M次黃嘌呤，10-8至10-7M氨基蝶呤和10-6至10-4M胸苷的完全GIT)。(e)雜交瘤組群的選擇將培養(yǎng)板置于35至40℃的CO2恒溫箱中溫育10至14天在這段時(shí)間里，每隔1至3天加入培養(yǎng)基量一半的新鮮HAT培養(yǎng)基。
骨髓瘤細(xì)胞來自8-氮雜鳥嘌呤抗性細(xì)胞系，骨髓瘤細(xì)胞和僅含骨髓瘤的雜交瘤在HAT培養(yǎng)基中不能存活。然而，含有抗體生成細(xì)胞部分的雜交瘤，包括抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤則可以存活。僅含有抗體生成細(xì)胞的雜交瘤將死亡，從而通過在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可選擇出由骨髓瘤細(xì)胞和抗體生成細(xì)胞組成的雜交瘤。
在那些可觀察到雜交瘤克隆生長(zhǎng)的小孔中，以HT培養(yǎng)基(其中氨基喋呤已從HAT培養(yǎng)基中除去)替代HAT培養(yǎng)基。除去一部分培養(yǎng)物上清液，并例如用ELISA檢測(cè)抗KM31-7抗體的效價(jià)。
上述方法是就8-氮雜鳥嘌呤抗性細(xì)胞而言的，但也可以使用允許選擇雜交瘤的其他細(xì)胞系。在這種情況下，通常所使用的培養(yǎng)基成分也應(yīng)改變。(f)克隆將來自(e)，已確定可產(chǎn)生抗KM31-7特異性抗體的雜交瘤轉(zhuǎn)移到不同的平板上進(jìn)行克隆?？墒褂貌煌目寺》椒ǎ缃臃N法(其中雜交瘤經(jīng)有限稀釋分析，以使每孔只含一個(gè)雜交瘤)、軟瓊脂法(其中接種的克隆被軟瓊脂培養(yǎng)基接收)、接種法(其中用顯微操作器移去單個(gè)細(xì)胞)和分揀器克隆法(其中通過細(xì)胞分揀器可分離個(gè)別細(xì)胞)。有限稀釋分析因其簡(jiǎn)單易行而成為最常用的方法。
對(duì)于那些可不斷觀察到抗體的小孔，需例如通過有限稀釋分析重復(fù)2至4次克隆。選擇不斷顯示有抗KM31-7抗體產(chǎn)生的克隆作為要選擇的雜交瘤。(g)通過雜交瘤培養(yǎng)制備單克隆抗體將從(f)選出的雜交瘤培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基中。通過使用大培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)得到大體積培養(yǎng)物。對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行凝膠過濾，再收集和純化IgG部分即可得到抗KM31-7單克隆抗體。另外，雜交瘤也可在同系小鼠的腹腔內(nèi)生長(zhǎng)(例上面提到的BALB/C小鼠)或例如Nu/Nu小鼠。進(jìn)行此步驟的簡(jiǎn)單方法是使用單克隆抗體制備試劑盒(例Pharmacia的MAbTrap GII)。(h)單克隆抗體的鑒定可按下述方法鑒定從(g)得到之單克隆抗體的同種異型和亞類?？梢允褂玫蔫b定技術(shù)的例子包括Ouchterlony方法，ELISA和RIA。盡管Ouchterlony方法簡(jiǎn)單，但缺點(diǎn)是在單克隆抗體的濃度十分低時(shí)，必須進(jìn)行濃縮。
如果使用ELISA或RIA，可將培養(yǎng)物上清液直接暴露于已吸附了抗原的固相。然后用IgG亞類的各型特異性的第二抗體鑒定亞類的類型。另外，可使用同種異型分型試劑盒(例如，Amersham的小鼠單克隆抗體同種異型分型試劑盒)。通過Folin-Lowry法或通過測(cè)量280nm處的吸收值可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量[1.4(OD280)＝1mg/ml免疫球蛋白]。
在相伴的實(shí)施例中，從被稱為MKM150-2的雜交瘤得到的單克隆抗體被鑒定為IgG類同種異型，并被認(rèn)定屬于IgG1亞類。
按照本發(fā)明得到的單克隆抗體對(duì)KM31-7蛋白質(zhì)有高度特異性。而且因?yàn)橥ㄟ^培養(yǎng)上面提到的雜交瘤可始終如一地得到高質(zhì)量的單克隆抗體，所以它可被用來分離和純化KM31-7蛋白質(zhì)，并且利用抗原-抗體反應(yīng)，以免疫沉淀法用所說的單克隆抗體分離和純化所說的KM31-7蛋白質(zhì)，也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
現(xiàn)參考所附的非限制性的實(shí)施例來舉例說明本發(fā)明。所有溶液都是含水的和由去離子水制備的，所有百分?jǐn)?shù)，除非另外說明者外都是指W/V。如果方法不是特別的，則都可在″MolecularCloning-A Laboratory Manual″[第二版，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，Cold Spring HarborLaroratoryPress]中找到。溶液和其它培養(yǎng)基的制備方法在下文標(biāo)題為″培養(yǎng)基″的部分給出，而不在實(shí)施例中給出。在沒有技術(shù)的實(shí)施例中提到的方法應(yīng)在前面實(shí)施例的上下文中加以解釋。A)CYVV的來源材料將冷凍保存的三葉草黃葉脈病毒(clover yellow vein virus)[CYVV分離物No.30Uyeda，I.et al.(1975)，Am.phytopath.Soc.Japan 41192-203]感染的葉加10倍體積的接種緩沖液磨碎。
使用已長(zhǎng)出第二片成葉的Vicia faba，Cultivar Wase-Soramamefaba繁殖CYVV。在成葉上噴灑金剛砂(400目)，再用玻璃抹刀接種上面得到的液體。接種后約8至10天，被接種的葉已成了網(wǎng)眼狀的花葉病狀態(tài)，除去這片葉子以用作CYVV的來源。B)病毒的純化用含有3倍體積提取緩沖液的切碎機(jī)切碎上述(A)步驟中分離的葉。切碎后，在研缽用杵進(jìn)一步磨碎葉。用裝備有發(fā)動(dòng)機(jī)的不銹鋼攪動(dòng)刀電機(jī)在室溫下將所得制品緩慢攪拌1小時(shí)。然后通過雙層紗布擠出液體制劑。
隨后的所有步驟都在4℃下進(jìn)行。
將粗提液與一半體積的氯仿混合，在Waring混合器中被混勻，隨后將制劑在6000×g下離心15分鐘。離心后收集水層，在這部分中加入聚乙二醇(PEG#6,000)至終濃度為4％V/V。
將得到的混合物在冰上攪拌1小時(shí)，再將其在冰上放置1小時(shí)。將由此得到的液體以6,000×g離心15分鐘，作為含有病毒的部分回收沉淀物。將此沉淀物懸浮于含有0.5M尿素的50ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，再與等體積的四氯化碳相混合，將所得制品劇烈攪拌5分鐘，然后將制劑以3,000×g離心10分鐘。再用Hitachi RP-30轉(zhuǎn)子在4℃以30,000rpm將水相超速離心90分鐘。所得片狀沉淀物作為含有病毒的那部分被回收。
將片狀沉淀物懸浮于含有1％Triton X100(PH 7.4)的10mM磷酸鹽緩沖液中，再將此懸液在4℃以8,000×g離心1分鐘。使所得上清在10至40％蔗糖密度梯度柱管中被分層(40％10ml，30％10ml，20％10ml，10％10ml；已在4℃下的放置過夜；此柱已預(yù)先用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4))制備得到。一旦上清液在管內(nèi)分層，即用HitachiPRS 25轉(zhuǎn)子在4℃下以23,000rpm將其超速離心120分鐘。
離心后，可使用裝配有OD260nm檢測(cè)器的分級(jí)分離器(ModelUA-2由ISCO CO.制造)來分級(jí)分離庶糖密度梯度柱管。具有約20至30％蔗糖密度，在OD260nm處有吸收的部分即為含有病毒的部分。
用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)兩倍稀釋所回收的病毒部分，使用Hitachi RP-65轉(zhuǎn)子在4℃以下40,000rpm將其離心90分鐘。將所得沉淀物重新懸浮于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中以產(chǎn)生純化的病毒溶液。c)病毒RNA的分離CYVV的基因組RNA含有約10,000個(gè)堿基，并且其3′末端是聚腺苷酸化的。無論是使用常規(guī)的酚/十二烷基磺酸鈉法或是硫氰酸鈲法，因其長(zhǎng)度和聚腺苷酸化的兩方面問題，都使得在無損失情況下提取到全長(zhǎng)度RNA變得很困難。相應(yīng)地，通過堿性蔗糖密度梯度離心法則可制得病毒基因組RNA。
將500μl病毒溶液(根據(jù)1mg/ml病毒的OD260nmO 2.5算得含有2mg病毒)加入到500μl降解溶液中并將混合液在室溫下放置20分鐘。然后使混合物在已用1×SSC制備的0％至33.4％蔗糖密度梯度柱管(33.4％1.4ml，30.4％7.6ml，27％7.0ml，23％6.3ml，18.7％5ml，12％3.2ml，0％2.7ml；均在4℃下放置過夜)上分層。所用的緩沖液仍為1×SSC，用Hitachi RPS-27轉(zhuǎn)子將已分層的管在15℃，24,000rpm下超速離心9小時(shí)。然后刺穿管的底部以分級(jí)分離蔗糖密度梯度。檢測(cè)每個(gè)部分在260nm處的吸收值即可鑒定出病毒的基因組RNA部分。病毒基因組RNA蔗糖濃度約為20至30％時(shí)發(fā)生沉積。所得基因組RNA的產(chǎn)量約為25μg。D)病毒cDNA的合成使用上述C)中制備的基因組RNA作為模板來合成cDNA。cDNA的合成是使用CDNA合成系統(tǒng)(cDNA Synthesis System Plus)(由Amersham制造)進(jìn)行的。所得CDNA在Sephadex G50柱(注冊(cè)商標(biāo)，由Pharmacia制造)上純化，用dCTP和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(由Bethesda Research Laboratories制造)將polyc鏈加到純化的cDNA的5′末端上。用限制性酶pstI消化質(zhì)粒，再在兩端都加上3′poly G鏈即可制得質(zhì)粒pBR322(由Bethesda ResearchLaboratories制造)的制劑。在此制劑中加入cDNA，在65℃下將混合物溫育5分鐘，然后在57℃下溫育2小時(shí)。逐漸冷卻所得混合物以使cDNA的poly C鏈與質(zhì)粒的poly G鏈退火。E)轉(zhuǎn)化按氯化鈣法將上述D)中制備的新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli菌株HB101中。E.coli菌株HB101的種子培養(yǎng)物是在液體LB培養(yǎng)基中振蕩過夜而制得的。用0.5ml此種子培養(yǎng)物接種50ml新鮮液體LB培養(yǎng)基，將接種物在37℃下振蕩培養(yǎng)直至OD550mm為0.5。在4℃下以5,000×g離心5分鐘以回收細(xì)菌細(xì)胞，將所得片狀沉淀物輕輕懸浮在25mlTris-鈣緩沖液中，并在冰上放置5分鐘。將所得懸浮液以4,000×g再離心4分鐘，并將片狀沉淀物懸浮于5ml Tris-鈣緩沖液中，在冰上放置2小時(shí)即得到感受態(tài)細(xì)胞。
將上述D)中得到的100μl新質(zhì)粒加到200μl如上制得的感受態(tài)細(xì)胞中，將混合物在冰上放置30分鐘。然后在42℃下溫育2分鐘，再加入1ml液體LB培養(yǎng)基，并在37℃下將所得混合物振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將所得混合物涂布在含有12.5μg/ml鹽酸四環(huán)素和1.5％W/W瓊脂的固體LB培養(yǎng)基上。在37℃下過夜培養(yǎng)細(xì)胞以得到CDNA克隆文庫(kù)。F)質(zhì)粒pNS51的制備與選擇用堿-SDS法分析cDNA重組質(zhì)粒文庫(kù)。此方法詳述如下。
將得自上述E)的固體LB培養(yǎng)物中抗四環(huán)素但對(duì)青霉素敏感的細(xì)菌菌落接種于2ml液體LB培養(yǎng)基中，將所得懸液在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。以10,000×g離心以回收細(xì)胞并將其懸浮于70μl另外含有16μl溶菌酶溶液(10mg/ml)的裂解緩沖液中。攪拌5秒以形成懸浮液后于室溫下放置5分鐘。然后在懸浮液中加入160μl堿-SDS溶液，將試管倒數(shù)幾次以第一次混合所得混合物，并再在冰上放置5分鐘。在混合物中加入120μl的5M醋酸鉀，再在冰上放置5分鐘，然后在4℃下以10,000×g將混合物離心5分鐘。
離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，再在試管中加入250μl異丙醇并將所得混合物在冰上放置30分鐘。然后，以10,000×g再將混合物離心5分鐘，將所得狀沉淀物溶于100μl TE緩沖液[10mMTris，1mM EDTA(pH8.0)]中，再在所得混合物中加入等量苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)并劇烈混均之，在4℃下以10,000×g將混合物離心5分鐘(下文中此步驟指的是苯酚提取)。
將離心得到的100μl水層與10μl 3M醋酸鈉(pH5.2)和250μl乙醇相混合，將所得混合物在于冰上放置10分鐘，然后以10,000×g離心5分鐘以得到核酸部分(下文中，將使用同樣相對(duì)量上清液、乙醇和醋酸鈉溶液的步驟稱為乙醇沉淀)。
將所得片狀沉淀物懸浮于50μl RNase A(10μg/ml，溶于TE緩沖液)溶液中，再在37℃下保溫1小時(shí)。然后向保溫的懸浮液中加入30μl聚乙二醇溶液(2.5M氯化鈉，20％聚乙二醇#8,000)，并將混合物在冰上放置1小時(shí)。然后在4℃下以10,000×g將混合物離心5分鐘以得到作為片狀沉淀物的DNA部分，乙醇沉淀兩次以上以得到純化的質(zhì)粒DNA。
將純化的質(zhì)粒DNA用限制性酶PstI裂解，再用TBE溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，使凝膠經(jīng)受Southern印跡雜交[Southern，E.M.(1975)，J.Mol.Biol.89503-517]。更具體地說，凝膠先在變性溶液中振蕩40分鐘，再轉(zhuǎn)移到中和緩沖溶液振蕩2小時(shí)。
振蕩后，將凝膠轉(zhuǎn)移到含有20×SSC的聚氨酯海綿上以將DNA轉(zhuǎn)移到一片Hybond-N膜(注冊(cè)商標(biāo)；由Amersham制造)上。DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上后，將膜在1×SSC中振蕩10分鐘，再在80℃下干燥1小時(shí)以固定DNA。然后將膜置于預(yù)雜交溶液[5ml甲酰胺，1ml 50×Denhardt氏溶液，2.5ml 20×SSC，100μl酵母tRNA(50mg/ml)，100μl 10％SDS和1.3ml重蒸餾水]中并在50℃下溫育3小時(shí)。
用已被Mg2+裂解的病毒基因組RNA作為探針。更具體地說，在上述c)中得到的含有1μg病毒RNA的16μl溶液中加入4μl 5x變性緩沖液。將混合物在37℃下溫育3小時(shí)，經(jīng)乙醇沉淀，再在70℃下加熱5分鐘然后置冰上驟冷，得到含有100ng RNA(根據(jù)1mg/ml RNA的OD260為20來計(jì)算)的5μl變性的RNA溶液。
向變性的RNA溶液中加入4μl 5x標(biāo)記緩沖液、1μl 3.3mM[γ-32P]ATP(0.37MBq)以及10μl重蒸餾水然后將20u T4多核苷酸激酶[由Takara Shuzo制造]加入混合物中，并在37℃下溫育30分鐘。重復(fù)五次乙醇沉淀步驟以除去未摻入的[γ-32P]ATP。
將所得經(jīng)標(biāo)記的探針加入雜交溶液[5ml甲酰胺2ml 50％硫酸葡聚糖、200μl 50×Denhardt氏溶液、2.5ml 20×SCC、50μl酵母tRNA(50mg/ml)、100μl 10％SDS 1.3ml重蒸水]中以達(dá)終濃度為5×105cpm/ml，并將上面得到的Hybond-N膜移入此溶液中，經(jīng)在50℃下保溫過夜進(jìn)行雜交、然后于60℃下用含有0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)的2×SSC振蕩洗滌。此步驟重復(fù)三次，再在室溫下用含有0.1％SDS的0.1×SSC將Hybond-N膜振蕩洗滌1小時(shí)，然后干燥。
放射自顯影結(jié)果顯明，被稱為pNs51的質(zhì)粒具有一插入片段，它含有已與病毒基因組RNA雜交的約6,500個(gè)堿基對(duì)(bp)。G)pNS51插入片段的序列測(cè)定為了繪制在pNS51中克隆之cDNA的限制性圖譜，用下列每種限制性酶消化質(zhì)粒BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、PstI、SalI、SphI、SacI、SmaI、XhoI、XbaI及它們的配對(duì)。所得的圖譜如圖1所示。
隨后，將用限制性酶SalI和PstI消化得到的每一個(gè)片段插入到M13mp19 RFDNA中。為此，用限制性酶PstI和SalI消化pNS51，并在使用1×TBE的5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離裂解產(chǎn)物。電泳后，用1μg/ml溴化乙錠使凝膠染色以在紫外燈下分辨出帶。用剃刀切割含有每一DNA帶的凝膠條，再用裝有Centricon-30(由Amicon制造)的電洗脫儀(由Amicon制造)進(jìn)行洗脫。
使用DNA連接試劑盒(由Takara Shuz0制造)將每一片段插入到預(yù)先僅用SalI或用PstI和SalI兩者消化，再用堿性磷酸酶處理的M13mp19中。
使用氯化銣法將所得重組M13mp19RF-DNA(其中已使用T4DNA連接酶將片段插入)引入E.coli菌株JM109中。將已在M9基本瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌株JM109的單菌落接種于液體SOB培養(yǎng)基中并振蕩培養(yǎng)過夜。將0.6ml過夜培養(yǎng)物接種于50ml新鮮的SOB液體培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩培養(yǎng)直至OD600nm達(dá)到0.5。4℃下5,000×g離心10分鐘以回收細(xì)胞；將片狀沉淀物輕輕懸浮在25ml TFB1緩沖液中并在冰上放置20分鐘。
將懸浮液以3,000xg再離心5分鐘，將片狀沉淀物懸浮于2mlTFB2緩沖液中，然后在上放置20分鐘以提供感受態(tài)細(xì)胞。
連接后，使用1至10μl如上所得的重組M13mp19 RF-DNA與100μl感受態(tài)細(xì)胞相混合，并在冰上放置1小時(shí)。然后將此混合物在42℃下保溫1.5分鐘，然后向混合物中加入500μl SOC液體培養(yǎng)基，在37℃下振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。
在所得振蕩培養(yǎng)物中加入含有0.8％瓊脂、30μl 100mMIPTG、10μl 10％的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-半乳糖苷(X-gal)和100μl指示劑細(xì)菌(菌株JM109在37℃下，2×YT培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)物)的2×YT培養(yǎng)基，將混合物散布于含有1.2％瓊脂的2×YT固體培養(yǎng)基上?；旌衔锕袒?，在37℃下過夜培養(yǎng)。隨后重組噬菌體表現(xiàn)為白色的噬菌斑。
將所得各白色噬菌斑以1/100的量接種于含有指示劑細(xì)菌的2×YT液體培養(yǎng)基中。在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。以10,000×g離心1分鐘后，將上清液冷凍或在4℃下貯藏以作為噬菌體溶液，細(xì)胞片狀沉淀物按制備質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)方法處理，以回收RF雙鏈DNA(下文中簡(jiǎn)稱為RF-DNA)，它是噬菌體的復(fù)制中間體。經(jīng)用限制性酶消化證實(shí)插入片段的存在。
由此，得到51SS/M13mp19(例如，含有SalI/SalI片段的M13mp19，該片段本身又是含有來自CYVV基因組5′區(qū)域之PstI-SalI片段的51PS5′/M13mp19基因組的一部分)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，通過堿-SDS和氯化銫密度梯度離心從這些噬菌體克隆中純化RF-DNA′S。
將5μg所得純化的DNA先用BamHI裂解以得到5′粘性末端，再進(jìn)一步用KpnI裂解以得到3′粘性末端，下一步則根據(jù)伴隨有除去一個(gè)堿基的系統(tǒng)(由Promega制造)的方案，加入核酸外切酶以從每一個(gè)cDNA線性化質(zhì)粒的5′粘性末端分步缺失堿基。用核酸外切酶的持續(xù)處理10分鐘，在1至10分鐘的不同時(shí)間取出樣品。因?yàn)檩d體有3′粘性末端，它不會(huì)受核酸外切酶的攻擊。用S1核酸酶處理得自1至10分鐘期間的不同樣品以將其切成平頭，再用T4DNA連接酶將其連接成環(huán)狀形式。
用上述氯化銣法將所得環(huán)狀重組M13 mp19 RF-DNA引入E.coli菌株JM109中。相應(yīng)地，具有不同長(zhǎng)度cDNA插入的重組噬菌斑作為白色噬菌斑被得到。
用常規(guī)方法從以上得到的重組噬菌體亞克隆中提取RF-DNA，以篩選具有不同長(zhǎng)度插入段的克隆。經(jīng)接種于含有E.coli指示劑菌株的液體2×YT培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜，以分別培養(yǎng)篩選出的克隆。然后在4℃下以10,000×g將1.5ml每種培養(yǎng)物離心5分鐘取1ml上清液被轉(zhuǎn)移并新鮮試管中，并在試管中混合下加入250μl20％聚乙二醇水溶液(20％聚乙二醇#8000，2.5M氯化鈉)，然后在冰上放置30分鐘。將混合物在4℃下10,000×g離心5分鐘，并將所得片狀沉淀物懸浮于100μlTE緩沖液中。按前述方法進(jìn)行苯酚提取和乙醇沉淀，從每份制劑中回收單鏈DNA(下文簡(jiǎn)稱為SSDNA)噬菌體基因組。
使用ssDNA作模板，以雙脫氧鏈終止法測(cè)定進(jìn)行上面所得每一個(gè)亞克隆的核苷酸序列。具體地說，使用7-脫氮雜-測(cè)序酶2.0變體dCTP試劑盒(由USB制造)，用[α-32P]dCTP(220TBq/mmol，由Amersham制造)標(biāo)記噬菌體ssDNA。將所得反應(yīng)產(chǎn)物在含有8M脲素、使用1×TBE為緩沖液的5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，干燥凝膠，并經(jīng)放射自顯影確定核苷酸序列。
通過分析pNS51的5′-PstI-SalI片段和M-SalI-SalI片段的核苷酸序列，我們可確定總共3,839個(gè)堿基。
作為尋找以上所得序列中開放閱讀框架(下文簡(jiǎn)稱為ORF)的結(jié)果，在病毒基因組的正意義鏈上測(cè)知了多肽的單個(gè)ORF。然后確定在ORF中編碼的多肽序列，使用GeneBank將此多肽序列與已知序列相比較的同源性研究表明它與TEV-HAT同源。
已知如TEV、梅痘病毒(plum pox virus)或脊髓灰質(zhì)炎病毒(動(dòng)物病毒)的病毒的成熟需通過蛋白酶的作用，蛋白酶通常裂解含有Gln-Ala、Gln-Ser或者Gln-Gly鍵的肽鍵[Willink J.和VanKammen，A.(1988)，Arch.Virol.981-26]。對(duì)CYVV-No.30的外殼蛋白裂解位點(diǎn)的分析結(jié)果是我們可以在推斷出的多肽序列中發(fā)現(xiàn)三個(gè)裂解序列[Uyeda，I.et al.(1991)Intervirology 32234-245]。從這些裂解位點(diǎn)的一個(gè)開始，自氨基酸序列位置4的Gly至位置437的Gln這段多肽被鑒定為來自CYVV的核包合體a。H)CYVV-NIa/IL-II融合蛋白質(zhì)的制備通過編碼Gln-Ala的連接序列將上述G)中鑒定為編碼CYVV NIa的DNA，在它的3′末端在碼內(nèi)串聯(lián)連接到編碼人白細(xì)胞介素II(IL-II)的DNA上。
需檢查下列情況首先，上述G)中鑒定的DNA是否能編碼其有蛋白質(zhì)水解活性的NIa；第二，此蛋白酶是否能切割所需的氨基酸序列；第三，當(dāng)NIa是與所需異源蛋白質(zhì)一起構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)的一部分時(shí)，NIa的蛋白酶活性是否仍以類似于在被病毒感染的細(xì)胞中存在的方式存在；以及第四，裂解該融合蛋白所得的任何異源蛋白質(zhì)是否能維持其完整性、結(jié)構(gòu)和功能。
由于NIa本身是從病毒前體多肽上切割而產(chǎn)生的，所以NIa順反子沒有起始密碼子。因此，有必要在NIa基因的5′末端加上起始密碼子ATG。NIa基因的3′端也必需在相同的ORF中與IL-II基因的5′端相連接。為了解決這些問題，可利用在NIa基因中間存在的XhoI酶的位點(diǎn)，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來修飾NIa。
為了在NIa的5′末端(NIa 5′)加上起始密碼子ATG和適于克隆的限制性酶NcoI的識(shí)別位點(diǎn)，需制備PCR引物。所制備的序列是5′GTCCATGGGGAAAAGTAAGAGAACA 3′(稱為NSATG；序列ID3)和5′ACTCTGAGACCGTGCTCGAG 3′(稱為NSx1；序列ID NO.4)。
將0.8μl dNTP溶液(dATP、dTTP、dCTP和dGTP各25mM)。10×Taq緩沖液(由Promega制造)和各1μg所得引物加到1μg質(zhì)粒pNS51DNA中，混合物用重蒸餾水補(bǔ)足到100μl。加入5單位在10×Taq緩沖液中制得的DNA聚合酶以進(jìn)行PCR。PCR程序?yàn)槊看窝h(huán)92℃，1分鐘；37℃，1分鐘；72℃，2分鐘，重復(fù)20次，接著是92℃，1分鐘；37℃，1分鐘；72℃，30分鐘的單一循環(huán)。
將所得經(jīng)擴(kuò)增的DNA用苯酚提取并用乙醇沉淀，再在5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，通過溴化乙錠染色檢出含有DNA的一條帶，從凝膠上切下此帶并用裝有Centricon-30(由Amicon制造)的電洗脫儀(由Amicon制造)進(jìn)行電洗脫。洗脫后，用Centricon(Amicon)在4℃下以7,500×g離心45分鐘，以濃縮和回收洗脫的DNA部分。經(jīng)用苯酚提取和用乙醇沉淀進(jìn)一步純化所得DNA濃縮物。
將1μg其中SacI識(shí)別位點(diǎn)已被xhoI識(shí)別位點(diǎn)取代的質(zhì)粒pkk388-1(由Clonetech制造)分別用限制性酶NcoI和XhoI切割并用小牛腸堿性磷酸酶(下文簡(jiǎn)稱為CIAP；由Takara Shuzo制造)處理使之脫磷酸化。用連接試劑盒(由Takara Shuzo制造)將所得DNA與100ng已被NcoI和XhoI裂解并按上述方法脫磷酸化的pkk388-1連接，并將如此得到的重組DNA克隆到E.Coli TM109中，從而得到質(zhì)粒pKNI 5′，它以正常方向插入pkk388-1之trc啟動(dòng)子的下游(圖2)。
質(zhì)粒pCD 20-2[Kawashima，1.et al.(1991)，F(xiàn)EBS L.283199-202]含有編碼IL-11前體(pre-IL-11)并具有分泌信號(hào)序列的cDNA。用限制性酶BanHI和ApaI切割該質(zhì)粒，切下既含有IL-11前體(pre-IL-11)又含有SV40啟動(dòng)子的區(qū)域。將此片段連接在pBluescript II SK+的BamHI和ApaI位點(diǎn)之間，再用限制性酶XhoI和kpnI切割，即可產(chǎn)生編碼缺少成熟IL-11(Mat-IL-11)N末端之蛋白質(zhì)的基因。
用T4連接酶將所得Mat-IL-11片段(缺少其N末端)整合到已預(yù)先用限制性酶xhoI和kpnI裂解并已用CIAP處理過的pKNI5中。我們將所得構(gòu)建體定名為pKNI 5IL(圖3)。為了通過Ala在NIa的C末端將此特定序列與Mat-IL-11相連接，同時(shí)保持相同的閱讀框架，需合成四種PCR引物5′AGGAAAAGAGTTCCTCGAGC 3′(稱為NSx2；序列ID NO.5)，5′AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC 3′(稱為NSJ 001P；序列ID NO.6)，5′GCCAGGTGGTGGCCCAGGTGCTTGGAATGAACAATT 3′(稱為NSJ002N；序列ID NO.1)，5′TTGTCAGCACACCTGGGAGCTGTAGAGCTC 3′(稱為ILSAC；序列IDNO.8)。
所進(jìn)行的第一個(gè)PCR反應(yīng)使用了NSx2和NDJ002N引物對(duì)，用PNS51 DNA作模板以擴(kuò)增編碼NIa之C末端的插入?yún)^(qū)域(被稱為CNI3區(qū)域)。另一個(gè)PCR反應(yīng)則是使用NSJ001P和ILSAC引物對(duì)，用pNS 51DNA作模板以擴(kuò)增編碼IL-11肽之N末端的插入?yún)^(qū)域(被稱為5′IL區(qū)域)。PCR程序是將92℃，1分鐘；37℃，1分鐘和72℃，2分鐘的循環(huán)重復(fù)20次，然后是92℃，1分鐘； 37℃，1分鐘和72℃，30分鐘的單一循環(huán)。從每個(gè)PCR步驟中得到的產(chǎn)物用苯酚抽提再用乙醇沉淀，然后經(jīng)受5％聚丙烯酰胺凝膠電泳。切割下含有經(jīng)擴(kuò)增之DNA帶的凝膠帶，并使用上述電洗脫法從凝膠條中電洗脫回收DNA。結(jié)果如圖4中所示。
所得兩個(gè)經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段是引物NSJ001P和NDJ002N的區(qū)域，即CIN 3 DNA片段的3′末端部分和5′IL DNA片段的5′末端部分，它們?cè)诤塑账嵝蛄猩嫌胁糠滞葱浴Ｒ虼?，如果使用引物NS×2和ILSAC再進(jìn)行PCR，同源的部分就會(huì)雜交以致于可以得到含有兩基因部分的融合的DNA，同源部分是作為連接部分來起作用的(圖5)。相應(yīng)地，將所得CIN3 DNA片段和5′IL DNA片段混合，僅使用NSX2和ILSAC作為引物再進(jìn)行PCR。此PCR程序包括10次循環(huán)92℃，1分鐘；37℃，1分鐘和72℃，2分鐘；然后是20次循環(huán)92℃，1分鐘；45℃，1分鐘和72℃，2分鐘，最后是一個(gè)單循環(huán)92℃，1分鐘；55℃，1分鐘和72℃30分鐘。經(jīng)苯酚處理和乙醇沉淀后，進(jìn)行5％聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳以獲得CNI3IL DNA片段，其中融合了CNI 3和5′IL。方法示于圖5中。
用限制性酶XhoI裂解CNI3 IL DNA片段，并使用T4DNA連接酶將所得片段插入已預(yù)先被限制性酶XhoI裂解，并經(jīng)CIAP脫磷酸化的pKNI 5′中。將所得質(zhì)?？寺〉紼.Coli菌株JM 109中。為了選擇出其中CNI 3IL片段已在正確方向插入的克隆，從所得克隆中提取質(zhì)粒并用引物NSX2和ILSAC進(jìn)行PCR。使用此系統(tǒng)，只有從其中以正確方向插入了該片段的克隆中才可檢測(cè)到DNA帶。從而得到質(zhì)粒pKSUN 9，其中通過裂解序列Gln-Ala將NIa和Mat-IL-11連接在同一閱讀框架中(圖6)。I)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)Ala-IL-11將攜帶有質(zhì)粒pKSUN 9的E.Coli(下文簡(jiǎn)稱為菌株KSUN9)在5ml含有42μg/ml青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。將2.5ml所得KSUN 9培養(yǎng)物加到250ml新鮮LB培養(yǎng)基中(含有相同量的青霉素)，并在37℃下振蕩培養(yǎng)直至OD600nm達(dá)到1.0。一旦OD600nm已達(dá)到1.0，即加入IPTG直至終濃度為0.1mM，同時(shí)將混合物在28℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。
確切按照相同步驟生產(chǎn)第二份培養(yǎng)物，不同的是最終培養(yǎng)是在28℃下進(jìn)行36小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間(所加IPTG的濃度為1mM)，以獲得成熟的IL-11(它有N末端Pro)。J)western印跡法進(jìn)行western印跡分析是為了確定pKSUN9在E.Coli中是否有功能以及所構(gòu)建的重組基因是否被表達(dá)。
經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的12和36小時(shí)培養(yǎng)物均進(jìn)一步按下述步驟處理。在4℃下，3,000×g離心5分鐘，從2ml培養(yǎng)物中回收細(xì)胞，將片狀沉淀物懸浮于100μl 20mM硼酸鈉緩沖液(用0.1N NaOH將pH調(diào)至9.0)中。將所得懸浮液用超聲波發(fā)生器處理(手提式超聲波發(fā)生器UR-20P，由Tomy Seiko Co制造)，其中置于8處處理2分鐘以使細(xì)胞破碎，并在4℃下，10,000×g離心10分鐘。回收含有可溶蛋白質(zhì)部分的上清液。按照Laemmli方法[Laemmli，U.K.(1970)，Nature 227680-685]取5μl上清液在12％ SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。
電泳后，將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇)中振蕩5分鐘，并吸印在一片PVDF膜(跨過印跡轉(zhuǎn)移介質(zhì)，由Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室制造)上。此吸印步驟是使用Trans-Blot-SD Semi-DryTransfer Cell(由Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室制造)，在15V下處理1小時(shí)完成的。將被吸印的PVDF膜用PBS-Tw培養(yǎng)基洗10分鐘，洗過的PVDF膜被轉(zhuǎn)移到含有5％脫脂牛奶(由Snow Brand Milk Products制造)的PBS--Tw中，在37℃下封閉1小時(shí)。
封閉后，將PVDF膜在PBS-Tw中進(jìn)一步洗滌，10分鐘一次，5分鐘兩次，然后將其轉(zhuǎn)移到在PBS-Tw中被稀釋10,000倍的抗IL-11兔血清中，在37℃下保溫20分鐘。再用PBS-Tw洗PVDF膜，一次洗10分鐘，再兩次各洗5分鐘。
將PVDF膜再轉(zhuǎn)移到用辣根過氧化物酶(由Amersham制造)標(biāo)記的，并用PBs-Tw稀釋了5,000倍的抗兔IgG羊抗體中，在37℃下保溫20分鐘。然后再用PBS-Tw洗PVDF膜，一次洗10分鐘，再四次各5分鐘。
進(jìn)一步洗滌后，將PVDF膜用提示的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)劑(由Amersham制造)處理，將PVDF膜與x-射線膠片接觸30秒至5分鐘，顯示出與抗IL-11抗體反應(yīng)的帶。
作為上述western吸印試驗(yàn)的結(jié)果，從12小時(shí)和36小時(shí)培養(yǎng)物中都發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)于分子量約50KDa和約23KDa的信號(hào)帶。23KDa的帶顯示出基本上與作為對(duì)照的成熟IL-11有相同的遷移率。因此，23KDa信號(hào)帶似乎就是Gln-Ala連接序列處被NIa的蛋白質(zhì)水解活性從NIa/IL-11融合蛋白質(zhì)中裂解下來的IL-11。可以推斷較重的帶(50KDa)即為未裂解的融合蛋白質(zhì)。
下文中，從12小時(shí)培養(yǎng)物中得到的23KDa蛋白質(zhì)被稱為23KDa-ON，從36小時(shí)培養(yǎng)物中得到的23KDa蛋白質(zhì)被稱為23KDa-36hr。K)23KDa-ON和23KDa-36hr蛋白質(zhì)的純化23KDa-ON和23KDa-36hr蛋白質(zhì)需經(jīng)純化以測(cè)定它們N末端的氨基酸序列。按照上文I)中所述的相同步驟得到各250ml 12小時(shí)和36小時(shí)培養(yǎng)物。然后培養(yǎng)物再進(jìn)一步按下述方法處理。將培養(yǎng)物在4℃下5,000×g離心15分鐘，將片狀沉淀物懸浮于10ml 20mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0)中，再用French擠壓器或超聲波發(fā)生器破細(xì)胞。在4℃下15,000×g離心30分鐘后，回收作為上清液的可溶性蛋白質(zhì)部分。
使用Pharmaria制造的FPLC，利用下述條件對(duì)所得可溶性蛋白質(zhì)部分進(jìn)行弱離子交換柱層析柱CM Toyopearl Pack 650M(2.2×20cm，由Toso制造)洗脫緩沖液A＝10mM硼酸-氫氧化鈉(pH9.0)，13mM氯化鉀B＝10mM硼酸-氫氧化鈉(pH9.0)，13mM氯化鉀，400mM氯化鈉流速2.5ml/分鐘餾分體積5ml/管所用的濃度梯度是在120分鐘期間從洗脫液A至洗脫液B的線性梯度。
隨后對(duì)被洗脫下的每一部分進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附分析(EL1SA)，以找出含IL-11的部分。
ELISA按下述步驟進(jìn)行。96孔免疫板(Maxisoap；由Nunc制造)的每一孔都裝有含1μg/ml抗IL-11小鼠單克隆抗體的100μl 50mM碳酸鈉緩沖液，將此板置37℃下保溫1小時(shí)，然后用PBS-T介質(zhì)(含有0.1％吐溫20的PBS)將各孔洗四次。
將按上述方法制得的FPLC部分分別用PBS-T稀釋100倍，并以100μl/孔的等分樣品裝進(jìn)孔中。將板置37℃保溫1小時(shí)，再用PBS-T洗滌各孔，然后在各孔內(nèi)裝入100μl用PBS-T稀釋直至終濃度為1μg/ml的抗IL-11兔IgG。
將此板置37℃下繼續(xù)保溫1小時(shí)，并用PBS-T洗滌，然后在各孔中裝入100μl已被PBS-T稀釋3,000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(由Gibco Bethesda Research Laboratories制造)。將此板再置37℃下保溫1小時(shí)，然后用PBS-T洗。再在各孔中裝入100μl堿性磷酸酶底物溶液。將此板置室溫下繼續(xù)保溫30分鐘至1小時(shí)，然后檢測(cè)各孔的顏色變化(405nm的吸光度)以鑒定感興趣的部分。
合并從FPLC步驟中得到的、用上述ELLSA方法鑒定為含有可與兔抗IL-11抗體反應(yīng)之物質(zhì)的部分(第19-25管)，用Centprep-10(由Amicon制造)濃縮100倍，然后按Laemmli方法(文獻(xiàn)同上)在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將凝膠電吸印到一片PVDF膜上，所用方法與上述Western印跡方法中所用的相似，只是使用Problot膜(由Applied Biosystems制造)作為PVDF膜。
吸印后，用重蒸餾水徹底洗膜，用考馬氏亮藍(lán)R-250染色，用50％甲醇脫色，然后切下含有在Western印跡中可與抗IL-11抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)帶。
用蛋白質(zhì)測(cè)序儀(由Applied Biosystems制造)分析此蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列，來自可與抗-LL-11抗體反應(yīng)的23KDa-ON帶的N末端序列被測(cè)定為Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-(序列ID NO.9)此序列符合成熟IL-11蛋白質(zhì)氨基酸序列的氨基酸序列-1至+6，根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，可推斷從12小時(shí)培養(yǎng)物得到的，并與抗-LL-11抗體反應(yīng)的23KDa蛋白質(zhì)是Ala-IL-11。相應(yīng)地，可明顯看出此蛋白質(zhì)是通過NIa的蛋白質(zhì)水解活性在特異裂解序列的Gln-Ala位點(diǎn)上裂解NIa/IL-11融合蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的。
可與抗-IL-11抗體反應(yīng)的23KDa-36hr帶的N末端序列被測(cè)定為Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro(序列ID NO.10)此序列符合成熟IL-11的氨基酸序列+1至+7。因此，可得出下列結(jié)論。
經(jīng)用IPTG誘導(dǎo)后，NIa/IL-11融合蛋白質(zhì)可在E.Coli.中得以表達(dá)。
經(jīng)誘導(dǎo)后培養(yǎng)12小時(shí)，所表達(dá)的NIa/IL-11融合蛋白質(zhì)由NIa的蛋白酶活性在其特異裂解序列的Gln-Ala肽鍵處被裂解。
用NIa裂解肽鍵后，成熟的但在其N末端有一額外Ala的IL-11可在E.Coli中得以表達(dá)。
Ala-IL-11的表達(dá)被確立后，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，Ala-IL-11成熟為IL-11，其中存在于Ala-IL-11之N末端上的Ala殘基被刪除了。
根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，可以推斷出培養(yǎng)36小時(shí)后得到的23KDa蛋白質(zhì)是N末端為Pro的成熟型的IL-11。
因此，可以確定IL-11可與NIa一起表達(dá)為融合蛋白質(zhì)，而NIa的活性可以裂解含有Gln-Ala的特異性接頭序列以產(chǎn)生Ala-IL-11。連續(xù)培養(yǎng)可以產(chǎn)生成熟的IL-11，其中通過E.Coli中存在的因子刪除了丙氨酸殘基而暴露出脯氨酸N末端。
為了確保所表達(dá)的IL-11和Ala-IL-11具有生物學(xué)活性，以脂肪生成抑制因子(AGIF)活性被作為檢測(cè)指標(biāo)。IL-11具有脂肪生成抑制活性這一事實(shí)先前已被證明[Kawashima，I.et al(1991)，F(xiàn)EBS L.283199-202]。L)檢測(cè)對(duì)從3T3-L1細(xì)胞變成脂肪細(xì)胞之形態(tài)學(xué)變化的抑制作用本發(fā)明所用的檢測(cè)AGIF活性的方法如下。使用從ATCC購(gòu)買的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系3T3-L1[Green，H.and Kehinde，O.(1974)，Cell 1113-116]。在所有情況下，此細(xì)胞都被置于10％ CO2-90％空氣混合的潮濕氣體中，在37℃下培養(yǎng)并用培養(yǎng)基A進(jìn)行次級(jí)培養(yǎng)。按照下述由Rubin等人描述的方法[Rubin，C.S.et al.(1978)，J.Biol.Chem.2537570-7578]進(jìn)行脂肪生成分化的誘導(dǎo)。
將3T3-L1細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基A中至密度為1.0×104細(xì)胞/ml，并接種于48孔的多組盤(由Coaster制造，0.5ml/孔)中，然后培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)。用新鮮培養(yǎng)基A替換原培養(yǎng)基，再培養(yǎng)2天后，用脂肪生成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基B替換原培養(yǎng)基，同時(shí)一起加入0.5ml樣品。每隔兩天用新鮮培養(yǎng)基B和新鮮樣品替換原培養(yǎng)基。
用脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基即培養(yǎng)基C而不是培養(yǎng)基B取代孔中已耗盡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基。在第一次加入試樣后4天至7天間對(duì)于不同的孔在不同的時(shí)間開始上述替換。
在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)2天后，用5％甲醛固定細(xì)胞，分別用油紅O和蘇木精著染在細(xì)胞和細(xì)胞核中積累的任何脂肪顆粒。進(jìn)行顯微攝影并計(jì)數(shù)積累有被染色之脂肪顆粒的細(xì)胞數(shù)目。按公式計(jì)算脂肪生成率(AR)AR(％)＝100×積累脂肪顆粒的細(xì)胞數(shù)目/總的細(xì)胞數(shù)目根據(jù)Yoshio Mitomo和Shojiro Takayama在由IshiyakuShuppan出版的″Lectures on Clinical Testing″Vol.12，″Pathology″(1982)中描述的方法進(jìn)行細(xì)胞固定和用油紅O及蘇木精染色。M)脂蛋白脂酶抑制活性的測(cè)定方法按照Beutler等人所描述的方法[Beutler，B.A.et al.，(1985)，J.Immonol.1353972-3977]進(jìn)行此項(xiàng)測(cè)定。按上文L)中所述方法，制備脂肪生成分化的3T3-L1細(xì)胞，不同的是當(dāng)誘導(dǎo)化分成脂肪細(xì)胞時(shí)不加入試樣。另外亦可將試樣和新鮮的培養(yǎng)基C一起加入，并將細(xì)胞培養(yǎng)18小時(shí)。
然后，棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS(-)(磷酸鹽緩沖鹽水，由NissuiSeiyaku配制)洗滌兩次，再往每孔內(nèi)加入300μl培養(yǎng)基D繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。從每份培養(yǎng)物上清液中取出100ml的等份樣品用于檢測(cè)脂蛋白脂酶(LPL)活性，每份樣品測(cè)三次得到一平均數(shù)。
LPL活性按Nilsson-Ehle和Schotz[Nilsson-Ehle，P.andSchotz，M.C.(1976)，J.Lipid Res.17536-541]所述的方法測(cè)定。將上面所得的每份上清液等份樣品與等體積的LPL底物溶液混合，37℃反應(yīng)120分鐘。加入1.05ml 0.1M碳酸鉀緩沖液(用0.1M硼酸鉀調(diào)至pH 10.5)和3.25ml的甲醇∶氯仿∶庚烷[141∶125∶100(V/V)]混合液，劇烈攪拌使反應(yīng)停止。然后將混合物在室溫下3,000xg離心15分鐘。用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定水-甲醇相中的3H含量。
1單位LPL活性定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol脂肪酸所需的活性。在底物溶液中的13mM的甘油三[9，10(n)-3H]油酸酯通過稀釋甘油三[9，10(n)-3H]油酸酯，(37.0 GBq/mol)制得，后者是由Amersham用三油酸甘油酯(Sigma生產(chǎn))制造，然后用硅膠柱層析法純化的。
下列實(shí)施例涉及體現(xiàn)本發(fā)明的谷胱甘肽還原蛋白質(zhì)。
實(shí)施例1從KM-102細(xì)胞中抽提poly(A)＝RNA將KM-102細(xì)胞置于36個(gè)直徑為15cm塑料培養(yǎng)皿中添加含10％小牛血清的Iscove氏改良的基本培養(yǎng)基(Boeringer-Mannheim)中進(jìn)行培養(yǎng)。
當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到匯合時(shí)，加入佛波醇十四烷基乙酸酯(PMA)和鈣離子載體A23187(Sigma)，使其終濃度分別為10ng/ml和0.2μM，并在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。在3、6和14小時(shí)后，分別收集12個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞分別溶于硫氰酸胍溶液中，并收集液相。
poly(A)+RNA的分離基本上按″Molecular Cloning-A Laboratory Manual″[Maniatis，T，et al.(1982).196-198]中所述方法進(jìn)行。現(xiàn)對(duì)這一方法詳細(xì)描述如下。
對(duì)每份回收的液相樣品分別作如下處理。液體用一裝有21G注射針頭的10ml注射器反復(fù)吸入和推出。在與RPS 40-T離心機(jī)(Hitachi koki)轉(zhuǎn)子采樣桶大小相稱的Polyaromar離心管中預(yù)先加入3ml 5.7M CsCl-0.1M EDTA(pH7.5)溶液，然后將細(xì)胞樣品加到溶液上直到將管裝滿。
20℃下以30,000rpm離心18小時(shí)后，將所得沉淀餅懸浮于400μl蒸餾水中，再用乙醇沉淀。將所得沉淀團(tuán)塊溶解于400μl蒸餾水中。邊攪拌邊加入等體積的氧仿/1-丁醇混合物(4∶1，V/V)，并離心分離收集水層。再次用乙醇沉淀，將所得沉淀物溶于600μl蒸餾水中以得到總RNA。分別匯集用pMA/A23187刺激3、6和14小時(shí)后的樣品，得到大約4.5mg的總RNA。
合并用這種方法得到的三種類型總RNA各600μg，并經(jīng)Oligo(dT)纖維素柱層析純化poly(A)+RNA。
將總RNA溶于吸附緩沖液中，65℃加熱5分鐘。將所得溶液加到裝有吸附緩沖液的Oligo(dT)纖維素柱(Pharmacia，7型)上，并用洗脫液洗脫以回收100μg poly(A)+RNA。
實(shí)施例2制備cDNA文庫(kù)用Okayama-Berg方法制備cDNA文庫(kù)。
使5μg Poly(A)+RNA和24單位逆轉(zhuǎn)錄酶(Seikagaku Corp.)在20μl逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溶液中42℃反應(yīng)1小時(shí)。
加入2μl 0.25M EDTA和1μl 10％SDS以終止反應(yīng)，然后用20μl苯酚/氯仿混合液(1∶1，V/V)使溶液去蛋白。離心除去蛋白質(zhì)部分后，向上清液中加入20μl 4M乙酸銨和80μl乙醇，然后于-70℃下冷卻15分鐘。離心分離收集沉淀物，用75％乙醇洗，并減壓干燥。
將干燥的沉淀物溶于15μl末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)溶液中，37℃加溫3分鐘。然后向反應(yīng)溶液中加入18單位的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(Pharmacia)，反應(yīng)5分鐘。加入1μl 0.25M EDTA和0.5μl 10％SDS終止反應(yīng)，溶液用苯酚-氯仿(如上所述)脫蛋白。離心去除蛋白部分，收集上清液與15μl 4M乙酸銨和60μl乙醇徹底混合，將混合物于-70℃下冷卻15分鐘，并離心收集沉淀物。
將所得沉淀團(tuán)塊溶解于10μl限制性酶緩沖液中，加入2.5單位的限制性酶Hind III，37℃消化1小時(shí)。
反應(yīng)溶液再用苯酚-氯仿去蛋白，隨后用乙醇沉淀并將上清液于-70℃下冷卻15分鐘。離心收集所得沉淀物并溶解于10μl TE緩沖液[10mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA]中。用1μl所得的溶液制成10μl的反應(yīng)溶液，其中含10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、100mM NaCl和10ng Oligo(dG)-尾部接頭DNA[3′-Ologo(dG)-接尾的PL-1 Hind III接頭，Pharmacia]，于65℃加熱5分鐘，然后于42℃加溫30分鐘。反應(yīng)混合物用冰水冷卻。然后向其中加入10μl 10×連接酶緩沖液、 78μl蒸餾水和8單位T4 DNA連接酶。反應(yīng)溶液于12℃下保存過夜。
第二天，將反應(yīng)混合物與10μl含1M KCl、1單位核糖核酸酶H、33單位DNA聚合酶I、4單位T4DNA連接酶、0.5μl dNTP溶液(20mMdATP，20mM dCTP，20mM dGTP和20mM dTTP)及0.1μl 50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)的溶液混合，所得混合物先在12℃溫育1小時(shí)，然后在25℃加溫1小時(shí)。之后，反應(yīng)溶液用蒸餾水稀釋5倍，再用Hanahan方法[hanahan D.(1983)J.Mol.Biol.166，557-580]直接以其轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α，由此制備KM-102細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。
實(shí)施例3制備寡核苷酸探針根據(jù)細(xì)胞素mRNA之3′非翻譯區(qū)的AUUUA序列，用化學(xué)方法合成命名為ATT-3的15個(gè)堿基的寡核苷酸5′-TAAATAAATAAATAA-3′(序列ID NO.13)。合成使用380B型自動(dòng)DNA合成儀)Perkin-Elmer Japan AppliedBiosystems)，按其所附手冊(cè)提供的說明進(jìn)行操作。所用的方法是Caruthers等人[Matteucci，M.D.and Caruthers，M.H.(1981)J.A.Chem.Soc.103，3185-3191]所描述的磷酰胺方法。當(dāng)合成15-mer后，將所得的寡核苷酸從支持物上分離下來并去掉保護(hù)基團(tuán)。所得的寡核苷酸溶液凍干形成粉末，然后溶于蒸餾水，貯存于-20℃下備用。
實(shí)施例4篩選cDNA文庫(kù)按照Grunstein和Hogness[Grunstein，M.and Hogness，D.S.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72，3961-3965]所述的方法，將由上面實(shí)施例2制備的cDNA文庫(kù)產(chǎn)生的6,500個(gè)集落固定到硝酸纖維濾膜上。將實(shí)施例3中制備的ATT-3探針按標(biāo)準(zhǔn)程序(見″MolecularCloning-A Laboratory Manual″)用32P作5′標(biāo)記，并用標(biāo)記的探針進(jìn)行集落雜交。
預(yù)雜交在下述溶液中37℃進(jìn)行3小時(shí)6xSSC、1x Denhardt溶液、0.25％SDS、0.05％焦磷酸鈉和100μg/ml變性魚精DNA。然后，在下述溶液中，31℃下雜交過夜6×SSC、1×Denhardt溶液、17μg/ml酵母tRNA和0.05％含32P-標(biāo)記之探針ATTT-3的焦磷酸鈉溶液。
第二天用含0.05％焦磷酸鈉的6×SSC溶液室溫將硝酸纖維系濾膜洗2小時(shí)。隨后的放射自顯影發(fā)現(xiàn)33個(gè)陽(yáng)性克隆。
按下述標(biāo)準(zhǔn)程序從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒DNA。隨機(jī)挑選幾個(gè)克隆用雙脫氧鏈終止法測(cè)定其部分cDNA核苷酸序列。然后，通過個(gè)人計(jì)算機(jī)比較這些部分序列與記錄在EMBL或GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸序列的同源性，發(fā)現(xiàn)由ATT-3檢測(cè)到的克隆之部分序列中的某些與Alu重復(fù)序列的一些部分有同源性[Schmid，C.W.and Jelinek，W.R.(1982).Science 216，1065-1070]。
按標(biāo)準(zhǔn)方法從人基因組DNA制備含有Alu重復(fù)序列的DNA片段并用32P標(biāo)記之。用該標(biāo)記的DNA作為使用如上鑒定的33個(gè)克隆進(jìn)行的集落雜交中的探針，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)12個(gè)克隆具有Alu重復(fù)序列。確定剩下的21個(gè)克隆的cDNA插入序列的長(zhǎng)度，證實(shí)該長(zhǎng)度變化范圍為50至3,600個(gè)堿基。
對(duì)剩下的21個(gè)克隆的cDNA插入序列進(jìn)行限制性酶切圖譜分析，并按上述方法測(cè)定部分核苷酸序列。然后，按上文所述方法通過個(gè)人計(jì)算機(jī)檢測(cè)這些部分序列與登記在EMBL或GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列的同源性，并選擇出那些具有新序列的克隆。
實(shí)施例5第31號(hào)克隆的Northern雜交其中的一個(gè)克隆，第31號(hào)克隆(命名為pcD-31)具有一個(gè)大約560bp的cDNA插入序列。從pcD-31的cDNA插入片段得到一個(gè)PstI-AatI片段(292bp)并用32P標(biāo)記，將其用作Northern印跡程序中的探針，這一程序使用從KM-102細(xì)胞制備的poly(A)+并與實(shí)施例1的程序相似。這一雜交用于測(cè)定與pcD-31插入序列相對(duì)應(yīng)的天然形成之mRNA的長(zhǎng)度。
Northern雜交的程序如下從KM-102細(xì)胞中制備5.5μg poly(A)+RNA并在1M乙二醛、50％二甲亞砜(DMS0)和0.01M磷酸氫二鈉(pH7.0)的混合液中50℃溫育1小時(shí)。向保溫的混合物中加入4μl的電泳顏料，然后在1×TAE中用1％瓊脂糖凝膠電泳。
電泳后，使用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法(見″molecular Cloning-aLaboratory Manual″)以20×SSC將瓊脂糖凝膠上的RNA過夜轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜(Bio Rad，Zeta-Probe)上。轉(zhuǎn)移后，用2×SSC輕輕洗濾膜，空氣干燥，再在80℃下繼續(xù)干燥2小時(shí)以固定mRNA。
使用Multiprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)，用32P標(biāo)記pcD-31的PstI-AatI片段。
預(yù)雜交在含有5×SSCP，2.5×Denhardt溶液，50％甲酰胺，10mM磷酸氫二鈉(pH7.0)，0.5％SDS和100μg/ml變性魚精DNA的溶液中，于37℃下在濾膜上進(jìn)行3小時(shí)。
在含32P-標(biāo)記的探針、5×SSCP、1×Denhardt溶液、50％甲酰胺、10mM磷酸氫二鈉(pH7.0)、0.1％SDS和100μg/ml變性魚精DNA的溶液中，于42℃下在濾膜上雜交過夜。第2天，濾膜先用含50％甲酰胺、5×SSC和0.1％SDS的溶液37℃洗濾膜1小時(shí)，然后再在含有40％甲酰胺、5×SSC和0.1％SDS的溶液中，于相同溫度下洗2小時(shí)。最后，在2×SSC溶液中室溫下洗15分鐘。繼后的放射自顯影表明，克隆pcD-31的cDNA插入片段并不是全長(zhǎng)度，而且相應(yīng)mRNA全長(zhǎng)為3.9kb(根據(jù)分子量標(biāo)記物的校準(zhǔn)曲線測(cè)知)。
實(shí)施例6制備用于篩選克隆pcD-31cDNA的新文庫(kù)使用cDNA合成系統(tǒng)正型和cDNA克隆系統(tǒng)(λgt10，連接物方法，由Amersham提供)制備新cDNA文庫(kù)。
從KM-102細(xì)胞提取5μg poly(A)+RNA(按與實(shí)施例1相似的程序)，加入100單位逆轉(zhuǎn)錄酶，并在50μl逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溶液中于42℃下反應(yīng)40分鐘。然后向反應(yīng)溶液中加入20μCi[α-32P]dCTP，93.5μl第二鏈緩沖液，4單位核糖核酸酶H和115單DNA聚合酶I(均隨試劑盒提供)，先于12℃溫育1小時(shí)，然后于22℃溫育1小時(shí)，最后于70℃加熱10分鐘。加熱處理后，加10單位T4 DNA聚合酶(隨試劑盒提供)到反應(yīng)溶液中，于37℃反應(yīng)10分鐘。
然后，反應(yīng)混合物用苯酚-氯仿去蛋白質(zhì)。將反應(yīng)液離心收集上清液，并與250μl 4M乙酸銨和1ml乙醇充分混合?；旌衔锢鋮s到-20℃過夜并離心收集沉淀物。將所得沉淀物溶于30μl無菌水中。取出10μl所得的溶液，加到由2μl連接酶/激酶緩沖液、250pmoleEcoRI連接物和5單位T4 DNA連接酶(均隨試劑盒提供)組成的混合物中，于15℃培養(yǎng)過夜。然后將全部反應(yīng)溶液加到隨試劑盒提供的篩析層析柱上層析除去EcoRI連接物。反應(yīng)液收集成120μl的等份樣品，每等份與200μl 0.25×TE緩沖液混合。將第10到第17等份合并，并用丁醇濃縮到總體積為120μl。
然后將全部濃縮制品與55μl無菌水、20μl連接酶/激酶緩沖液和40單位T4多核苷酸激酶(均隨試劑盒提供)混合，并將所得混合液于37℃溫育30分鐘。然后將反應(yīng)混合物以苯酚-氯仿提取法脫蛋白三次，再用乙醇沉淀，-20℃冷凍過夜。離心收集所得沉淀物并溶解于10μl無菌水中，作為備用cDNA樣品。
每2μl cDNA樣品中加入1μg λgt10的EcoRI臂、1μl連接酶/激酶緩沖液和2.5單位T4 DNA連接酶(均隨試劑盒提供)，然后于15℃培養(yǎng)過夜。以同樣方法制備含4μl cDNA樣品的樣品。每份樣品進(jìn)一步按下述方法處理。首先將所得的全部反應(yīng)溶液加到10μl抽提物A(隨試劑盒提供)中，然后將所得混合物加到15μl提取物B(隨試劑盒提供)中，并將所得混合液于20℃溫育20分鐘，以便發(fā)生體外包裝反應(yīng)。
然后，向反應(yīng)溶液中加入470μl SM緩沖液并貯存于4℃下。用貯存的溶液感染經(jīng)10mM MgsO4處理過的E.Coli菌株NM 514，以產(chǎn)生KM-102 cDNA的λgt10文庫(kù)。
實(shí)施例7cDNA文庫(kù)的篩選將從實(shí)施例6中制備的合并的cDNA文庫(kù)中產(chǎn)生的2×105個(gè)噬菌斑，按下述方法固定在尼龍濾膜(Hyband N，Amersham)上。
將實(shí)施例6中制備的感染的E.Coli培養(yǎng)在10個(gè)含固態(tài)LB培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中，以使每個(gè)培養(yǎng)皿形成1到2×104個(gè)噬菌斑。通過輕壓培養(yǎng)皿上的尼龍濾膜將噬菌斑轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上。然后用18G注射器針頭穿刺濾膜并在凝膠上標(biāo)記3個(gè)位置用于參考。將濾膜于4℃下放置5到10分鐘后，揭去濾膜并浸入堿性溶液(0.1N NaOH，1.5MNaCl)中20秒鐘。然后將濾膜轉(zhuǎn)移到中性溶液
中20秒至1分鐘，再在室溫下空氣干燥2小時(shí)。最后，將濾膜置于80℃下干燥2小時(shí)。
實(shí)施例8探針的制備和雜交使用Multiprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)標(biāo)記pcD-31(實(shí)施例4)的PstI-AatI片段和EcoT 221-AatI片段(223bp)，制得來自pcD-31的32P-標(biāo)記的探針。使用上述探針與實(shí)施例7所得的濾膜進(jìn)行噬菌斑雜交。
將濾膜放在50％甲酰胺、5×SSCP、2.5× Denhardt溶液、0.01M磷酸氫二鈉(pH7.0)、0.5％SDS和100μg/ml變性魚精DNA的混合溶液中37℃溫育2小時(shí)以進(jìn)行預(yù)雜交。
然后將濾膜放在含上面制備的32P標(biāo)記之探針和50％甲酰胺、5×SSCP、1×Denhardt溶液、0.01M磷酸氫二鈉(pH7.0)、0.1％SDS和100μg/ml變性魚精DNA的反應(yīng)溶液中37℃溫育過夜，以完成雜交步驟。
第二天，先用含50％甲酰胺、5×SSC和0.1％SDS的溶液室溫洗濾膜3小時(shí)，然后再用2×SSC室溫洗5分鐘。放射自顯影顯示出初篩得到80個(gè)陽(yáng)性克隆。
用每次被鑒定為陽(yáng)性的克隆，再重復(fù)實(shí)施例7和8的程序三次(四次篩選)，最終得到共17個(gè)陽(yáng)性克隆。從17個(gè)克隆中分別分離其cDNA，用EcoRI切下插入片段。通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定每個(gè)cDNA插入片段的長(zhǎng)度，并分離出具有3.9kbp之cDNA插片段、相當(dāng)于原始mRNA的全長(zhǎng)的31-7號(hào)克隆。
實(shí)施例9第31-7號(hào)克隆的限制性圖譜用EcoRI消化第31-7號(hào)克隆以分離并純化含cDNA插入段的3.9kb片段。再用T4 DNA連接酶將此片段插入PUC 18中。用這一新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α。根據(jù)抗氨芐青霉素抗性束選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用EcoRI消化DNA并對(duì)裂解的DNA作瓊脂糖凝膠電泳分析以鑒定有3.9kbpcNDA插入段的pUCKM31-7克隆。
分別用限制性酶Hind III、SacI、XbaI、SmaI、Bg 1II、EcoT22I和AatI裂解或用其中兩個(gè)酶同時(shí)裂解pUCKM 31-7。對(duì)所得的片段作瓊脂糖凝膠電泳分離，用λHind III/X 174 Hae III標(biāo)記物作指示劑測(cè)出各片段的長(zhǎng)度。所得的限制性圖譜如圖7所示。
實(shí)施例10第31-7號(hào)克隆的序列測(cè)定使用M13噬菌體通過雙脫氧鏈終止法測(cè)定pUCKM 31-7 cDNA插入段的全部核苷酸序列。另外，用373A DNA序列儀(Perkin-ElmerJapan Applied Biosystems)分析該一部分序列。所得的核苷酸序列為列于序列表中的ID No.11。
PUCKM 31-7 cDNA插入段為3815個(gè)堿基長(zhǎng)，清楚地具有一個(gè)由549個(gè)氨基酸組成，起始氨基酸為蛋氨酸的閱讀框架。顯然沒有poly(A)尾部。比較pcD-31插入段3′端的堿基順序與克隆pUCK31-7的順序表明，pUCKM 31-7插入段僅丟失了poly(A)尾部(圖8)，而無其它缺失。
為了比較堿基和氨基酸順序，分別檢查了EMBL和GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)及NBRF和SW1SS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)。發(fā)現(xiàn)最相近的匹配是該肽序列與人谷胱甘肽還原酶有35.3％的同源性。由此推論pUCKM31-7 cDNA插入段的ORF清楚地編碼一個(gè)新的多肽。該新的多肽即為所附序列表中的序列ID No.12。
實(shí)施例11新多肽的表達(dá)和純化高表達(dá)載體的構(gòu)建及在COS-1細(xì)胞中的表達(dá)按標(biāo)準(zhǔn)程序用Hind III消化pUCKM 31-7并分離和純化含cDNA插入片段的3003bp片段。用DNA修平端試劑盒(Takara Shuzo)使所得片段的末端變?yōu)槠蕉恕?br> 同時(shí)，高表達(dá)載體pCDL-SRα296[Takabe.Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8，466-472]用PstI和KpnI消化并用DMA修平端試劑盒使其末端變?yōu)槠筋^。用T4 DNA連接酶將修成平頭的插入序列連接到修成平頭的質(zhì)粒中。用氯化鈣法以所得的DNA轉(zhuǎn)化E.coli。挑選所得的AmpR轉(zhuǎn)化細(xì)菌，分析保留在細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒DNA。
經(jīng)用Hind III和Bgl II消化質(zhì)粒，然后瓊脂糖凝膠電泳定位800bp片段，選擇出一個(gè)cDNA轉(zhuǎn)錄方向與SRα啟動(dòng)子方向一致的菌株，并將選出的質(zhì)粒命名為pSRα31-7(圖9)。SRα啟動(dòng)子含有SV 40早期啟動(dòng)子和HTLV-1長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的R-U5序列，并具有比單獨(dú)的SV 40早期啟動(dòng)子強(qiáng)10到100倍的啟動(dòng)活性。
然后，用所得的質(zhì)粒pSRα31-7轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。用GTE-1基因?qū)胙b置(Shimadzu)經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。
COS-1細(xì)胞在七個(gè)150cm3培養(yǎng)瓶的底部生長(zhǎng)到半?yún)R合。每個(gè)瓶里有25ml DMEM(含10％小牛血清)培養(yǎng)基。收集培養(yǎng)基并各用3mlTrypsin-EDTA溶液(10x溶液可從Sigma得到)處理，室溫放置直至細(xì)胞分離。加入1ml滅活的小牛血清和9ml新鮮trypsin-EDTA溶液，離心收集細(xì)胞。然后將收集的細(xì)胞用PBS(-)緩沖液洗滌二次并以6×107細(xì)胞/ml的密度重新懸浮于BBS(-)緩沖液中。
同時(shí)，用氯化銫法制備質(zhì)粒DNA并在PBS(-)緩沖液中配成200μg/ml。
將上面提到的PBS(-)細(xì)胞和質(zhì)粒樣品各20μl混合，將所得的混合物放入含有以2mm間隔分開之電極的小室中。對(duì)混合物以1秒鐘間隔施加2個(gè)600V的脈沖，每個(gè)持續(xù)時(shí)間為30微秒。
電極小室于4℃冷卻5分鐘，然后，將里面的細(xì)胞DNA混合物與含10％小牛血清的10ml DMEM混合。將該混合物轉(zhuǎn)移到Petri培養(yǎng)皿中，在5％CO2氣體中37℃培養(yǎng)過夜。第二天，棄去培養(yǎng)物上清液，細(xì)胞用無血清DMEM洗滌并重懸于10ml DMEM中，37℃培養(yǎng)3天。然后，收獲細(xì)胞上清液。
同樣收集陰性對(duì)照培養(yǎng)物的上清液。陰性對(duì)照使用不含cDNA插入段的pCDL-SRα296質(zhì)粒，但用與試驗(yàn)培養(yǎng)物同樣的方式制備。
1ml陰性對(duì)照和試驗(yàn)培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液分別按以下程序處理。上清液先用三氯乙酸(TCA)處理以沉淀蛋白質(zhì)，離心收集沉淀物。將所得沉淀物用冰凍丙酮洗滌后空氣干燥。然后溶于含2-巰基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)樣品緩沖液中。SDS-PAGE于還原條件下在12.5％凝膠上進(jìn)行。
對(duì)電泳帶的銀染色使用銀染色試劑″Daiichi″(DaiichiChemical Detection)進(jìn)行。試驗(yàn)樣品培養(yǎng)物上清液的幾個(gè)特定帶(分子量約60,000)被著染。
由于pSRα31-7中序列編碼的多肽分子量約為60,000，而且從氨基酸序列推斷其翻譯后修飾增加糖側(cè)鏈?zhǔn)遣豢赡艿模虼诉@幾個(gè)特定的帶是與pSRα31-7 cDNA編碼的多肽相對(duì)應(yīng)的。
實(shí)施例12用于COS-1細(xì)胞的高表達(dá)質(zhì)粒的制備下一步證實(shí)實(shí)施例11中鑒定的幾個(gè)特定的60KDa帶與pSRα31-7的插入序列編碼的多肽是一樣的。還可望確定該多肽N末端氨基酸順序。為此，制備了一個(gè)克隆，其中由PSRα31-7插入序列編碼的多肽之C末端有額外的6個(gè)His殘基，緊接在終止密碼子之前。組氨酸殘基對(duì)Ni2+有高親合力，目的是為了表達(dá)具有組氨酸6聚體(6×His)的多肽，它可用裝有Ni2+的親合樹脂柱純化。
首先，使用自動(dòng)DNA合成儀394(Perkin-Elmer JapanAppliedBiosystems)合成66個(gè)堿基的寡核苷酸5′-CTAGCGCTOTGGGGCAAGCATCCTCCAGGCTGGCTGCCACCACCACCACCACCACTGATCTAGACT-3′(序列ID No.14)及其互補(bǔ)的66堿基鏈并純化之。混合寡核苷酸樣品，于70℃下溫育3分鐘，然后再于37℃溫育30分鐘以使之退火。接著，用T4多核苷酸激酶使末端磷酸化。
用T4DNA接酶將所得的雙鏈(ds)片段連接到預(yù)先經(jīng)Eco47 III消化過的pUCKM31-7中。構(gòu)建體如圖10所示。用該DNA以氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α，選擇并篩選所得的轉(zhuǎn)化菌株，得到pUCKM 31-7His。通過分析該pUCKM31-7 His的相關(guān)堿基順序的一部分，證實(shí)在pUCKM 31-His中插入了該片段的這個(gè)部分沒有異常。
然后將pUCKM31-7 His的插入段亞克隆到pCDL-SRα296中，制備COS-1細(xì)胞的高表達(dá)質(zhì)粒。
用Xbal和Hind III消化pUCKM 31-7 His，純化所得片段，在有2mMdATP，2mM dCTP，2mM dGTP，2mM dTTP，50mM TRIS-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM二硫蘇糖醇和50μg/ml BSA存在的條件下，用1單位klenow片段將片段修成平頭。
同時(shí)，高表達(dá)載體pcDL-SRα296用PstI和KpnI消化并用DNA修平端試劑盒修成平頭，然后用T4DNA連接酶連接平頭片段和平頭質(zhì)粒。用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α。然后選擇和篩選轉(zhuǎn)化體。選出cDNA轉(zhuǎn)錄方向與SRα啟動(dòng)子方向一致的菌株，這一菌株的質(zhì)粒命名為pSRα31-7 His。用所得質(zhì)粒pSRα31-7His轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，并用如實(shí)施例11所述者相似的方法得到無血清上清液。
實(shí)施例13純化及N末端氨基酸順序分析使實(shí)施例12中制得的600ml上清液在17倍體積的透析緩沖液中4℃透析15小時(shí)。用另外17倍體積的透析緩沖液替代上述緩沖液4℃繼續(xù)透析4小時(shí)。
透析過的制劑在下述條件下用FPLC(快速蛋白質(zhì)多核苷酸液相層析儀-Pharmacia)做親和層析。
柱20ml ProBondTM樹脂(InVitrogen)裝入XK16/20(2.0×20cm，Pharmacia)柱中洗脫緩沖液A)含200mM味唑、0.5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)
B)含300mM味唑、0.5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)流速1ml/分鐘洗脫溶液分配5ml/管洗胱條件用洗脫緩沖液A)回收4管后，用洗脫緩沖液B)回收16管，各管按1至20次序編號(hào)。
從所得的各部分樣品中各取300μl分別用TCA進(jìn)行沉淀處理，所得的沉淀按前述方法用12.5％凝膠在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE。用銀染色法鑒定帶，并在圍繞編號(hào)為10的部分(管)檢測(cè)到三條帶。這三條帶的存在表明pSRα31-7His插入段編碼一條具有不同N末端順序的3種不同長(zhǎng)度的多肽。
剩余的第7至14管樣品用TCA沉淀法濃縮，對(duì)沉淀物用10％凝膠在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE。使用凝膠膜轉(zhuǎn)移裝置(Marisol，KS-8441)將蛋白帶從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ProBlotTM，Applied Biosystems)上。轉(zhuǎn)移以9V在轉(zhuǎn)移緩沖液
中4℃進(jìn)行2.5小時(shí)。
然后，膜用0.2％萘酚藍(lán)黑(Sigma)染色。從膜上切下與前面鑒定者相對(duì)應(yīng)的三條帶，用氣相蛋白質(zhì)測(cè)序儀(Shimadzu，PPSQ-10)測(cè)定每條帶從N末端到第6個(gè)氨基酸的序列。帶有第二大表觀分子量(分子量約60,000)的帶N端順序是Val-Val-Phe-Val-Lys-Gln(序列ID No.12的第1至6位氨基酸)。
這6個(gè)氨基酸相當(dāng)于克隆31-7之ORF的前6個(gè)氨基酸，也相當(dāng)于由pSRα31-7His和PSRα31-7 cDNA插入段編碼之前體多肽N末端從第24位氨基酸(Val)開始的6個(gè)氨基酸的序列。因此，以這種前體多肽N末端切去1至23號(hào)氨基酸將導(dǎo)致分泌以Val殘基起始的成熟形式的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例14還原活性的測(cè)定i)表達(dá)載體的構(gòu)建前面實(shí)施例中純化的多肽當(dāng)它從COS-1細(xì)胞中表達(dá)時(shí)只能以極小的產(chǎn)量得到。故不可能將此多肽用于其他用途，如活性試驗(yàn)。因此必須找到能在可代用的宿主中表達(dá)pSRα31-7 cDNA的插入段所編碼的多肽，且能得到足夠用于純化和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)之適當(dāng)數(shù)量產(chǎn)物的辦法。為達(dá)到這一目的，進(jìn)行下述處理。
用Hind III消化pUCKM31-7，分離和純化含cDNA插入段的3003bp的片段，用DNA修平端試劑盒使之變成平頭末端。該片段再進(jìn)一步用XbaI消化。
表達(dá)載體pMAL-c[Guan，C.et al.(1987)Gene 67，21-30]用XbaI和StuI消化，然后用T4連接酶將上述XbaI修飾的Hind II片段連接到這一裂解的質(zhì)粒中。所得構(gòu)建體示于圖11中。用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化E.coli TB-1并選擇和篩選AmpR轉(zhuǎn)化株。挑選cDNA轉(zhuǎn)錄方向與啟動(dòng)子方向一致的菌株，所得到的質(zhì)粒被命名為pMAL31-7。ii)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化在3ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，制備含有pMAL31-7的E.coli種子培養(yǎng)物。第二天，將1ml種子培養(yǎng)物加入100ml含50μg/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.5。在這一階段，培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.1mM，并將培養(yǎng)物于37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過夜。
第二天，經(jīng)以6500rpm于4℃下離心20分鐘，從過夜的培養(yǎng)物中回收細(xì)菌細(xì)胞。將沉淀物懸浮于10ml柱緩沖液中，用超聲破碎儀處理以破碎所得懸浮液中的細(xì)胞。于0℃下8800rpm離心30分鐘除去全部細(xì)胞及細(xì)胞碎片，回收上清液中的可溶性蛋白質(zhì)部分。取1ml該可溶性部分在直鏈淀粉樹脂柱(New England Biolabs)上進(jìn)行層析。
往10ml柱緩沖液中加入麥芽糖至終濃度為10mM，以制備用于層析的洗脫緩沖液。
陰性對(duì)照樣品也進(jìn)行層析。陰性對(duì)照樣品的制備用相似程序，不同的是，pMAL-C載體中沒有任何cDNA插入段。然后測(cè)定層析樣品中蛋白質(zhì)的還原活性。iii)測(cè)定還原活性用二氯酚-酚(DCIP)和氧化態(tài)谷胱甘肽在樣品杯(SARSTEDT，10×4×45mm)中測(cè)還原活性。
a)使用DCIP測(cè)定還原活性將各90.4μg(用蛋白試驗(yàn)試劑盒(Bio-Rad)測(cè)定的)上述ii)步驟中所得的層析樣品分別與1ml 50μM DCIP(Sigma)混合。然后向各樣品中加入15μl 1mM NADPH(Boehringer Mannheim)，并定時(shí)監(jiān)測(cè)OD600nm和OD340nm的吸光度。所得的兩個(gè)波長(zhǎng)處吸光度的降低如圖12所示，可見僅有pMAL31-7樣品含有減少DCIP的因子。b)用氧化態(tài)谷胱甘肽測(cè)定還原活性在預(yù)先裝入不同小杯中的上面ii)步驟中得到的各90.4μg層析樣品中加入15ml 10mM氧化態(tài)谷胱甘肽(Boeringer-Mannheim)。每個(gè)小杯中再加入15μl 1mM NADPH，并定時(shí)監(jiān)測(cè)OD340nm處的吸光度。結(jié)果如圖13所示，可見只有得自pMAL31-7樣品中的蛋白質(zhì)能還原氧化態(tài)谷-胱肽。還觀察到，當(dāng)無氧化態(tài)谷胱甘肽存在時(shí)則不消耗NADPH，所以可以認(rèn)為在NADPH存在下，只有pMAL31-7樣品中的蛋白質(zhì)才能還原氧化態(tài)的谷胱甘肽。
實(shí)施例15N末端氨基酸序列的純化和分析從實(shí)施例13可推斷，用pSRα31-7 His轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞表達(dá)具有三種類型的N末端的多肽。
在一個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，用從pMAL31-7轉(zhuǎn)化的E.coli中回收的融合蛋白質(zhì)免疫兔，得到抗KM31-7蛋白的多克隆抗體制品。使用該多克隆抗體做Western印跡分析，在從pSRα31-7轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中得到的無血清培養(yǎng)物上清液中也清楚地檢測(cè)到三種類型的帶。這一結(jié)果與實(shí)施例13中所得的結(jié)果相似。
因此，用pSRα31-7轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，以期收集到大體積的無血清培養(yǎng)物上清液，得以純化和分析KM31-7蛋白質(zhì)的N端序列。
用pSRα31-7轉(zhuǎn)染COS0-1細(xì)胞，在裝有30ml DMEM的150mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天。然后收集上清液，再向各培養(yǎng)皿中加入30ml新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)3天。再次收集培養(yǎng)物上清液有關(guān)轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)的其它方面同實(shí)施例11所述，但使用199培養(yǎng)基培養(yǎng)。
合并收獲到的上清液，離心后收集10升無血清培養(yǎng)上清液并將其在10mM Tris-HCl(pH9.0)中透析過夜。對(duì)透析的制品用FPLC(Pharmacia)在下述條件下進(jìn)行離子交換層析8次柱20ml DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，填入XK16/20(2.0×20cm，Pharmacia)洗脫緩沖液A).10mM Tris-HCl(pH9.0)B).10mM Tris-HCl(H9.0)-0.5M NaCl流速1ml/分鐘洗脫溶液分配3ml/管洗脫條件在60分鐘以線型濃度梯度由洗脫溶液A變成洗脫溶液B。
收集在0.1M-0.4M間各NaCl濃度下洗脫的各部分并合并之，在含0.1M Tris-HCl，5mM EDTA(pH7.6)和1mM 2-巰基乙醇的透析緩沖液中透析過夜。經(jīng)透析的制品再使用2′，5′-ADP Sepharose 4B(Pharmacia)于下述條件下進(jìn)行親合層析柱20ml 2′，5′-ADP Sepharose 4B填入xK16/20(Φ2.0×20cm，Pharmacia)洗脫緩沖液A)0.1M Tris-HCl，5mM EDTA(pH7.6)，1mM 2-巰基乙醇B)0.1M Tris-HCl，5mM EDTA(pH7.6)，1mM 2-巰基乙醇，10mMNADPH流速0.5ml/分鐘洗脫溶液分配2ml/管洗脫條件在120分鐘內(nèi)以線型濃度梯度從洗脫液A變?yōu)橄疵撘築從每個(gè)所得的部分中取100μl等份試樣用TCA沉淀，對(duì)沉淀物在還原條件下使用12.5％凝膠做SDS-PAGE。
電泳后，對(duì)凝膠作銀染色以確定蛋白帶。從第11管起得到三條帶。
第11至第14管的全部剩余液經(jīng)用TCA沉淀而濃縮，沉淀物在還原條件下用12.5％凝膠進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后將蛋白質(zhì)從凝膠上轉(zhuǎn)移到ProBlot PVDF膜(Applied Biosystems)上。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上后，將膜用0.2％萘酚藍(lán)黑染色并切下三條蛋白帶。用氣相蛋白質(zhì)序列儀進(jìn)行N端序列分析。
測(cè)知三種類型中分子量最小的帶N端為L(zhǎng)ys-Leu-Leu-Lys-Met。這5個(gè)氨基酸相當(dāng)于由pSRα31-7cDNA之插入段編碼的多肽之N端從第49號(hào)氨基酸開始的5個(gè)氨基酸。因此可推斷，在第48位氨基酸殘基處裂解該肽產(chǎn)生一個(gè)N端以Lys開始的成熟型蛋白質(zhì)。
實(shí)施例16制備抗KM31-7蛋白質(zhì)的單克隆抗體a.)抗原蛋白質(zhì)的制備在3ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃下振蕩培養(yǎng)一接種環(huán)的細(xì)胞，以制備含pMAL31-7的E.coli種子培養(yǎng)物。取1ml所得的種子培養(yǎng)物接種到100ml含50μg/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)直至OD600nm達(dá)到0.5。此階段向培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為0.1mM，然后于37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過夜。
所得的過夜培養(yǎng)物于4℃下以6500r.p.m.離心20分鐘回收細(xì)胞，將片狀沉淀物重懸于10ml柱緩沖液中。所得懸液中的細(xì)胞用超聲破碎儀破碎，0℃下8,000r.p.m離心30分鐘。所得的上清液即含有可溶性的蛋白質(zhì)部分。
將該可溶性的蛋白質(zhì)部分加在1ml直鏈淀粉樹脂柱上進(jìn)行層析。用10ml含10mM麥芽糖的柱緩沖液洗脫。將從層析中得到的融合蛋白質(zhì)貯存作為抗原備用。(b)免疫的小鼠脾細(xì)胞的制備往上面(a)步驟中純化的2ml(相當(dāng)于200μg)抗原中加入2ml弗氏完全佐劑以形成乳劑。將該乳劑抽入裝有玻璃活塞的5ml注射器筒內(nèi)，通過皮下注射免疫年齡為8周的雄性BALB/C小鼠。
進(jìn)行第二次免疫時(shí)，佐劑使用弗氏不完全佐劑，但與第一次免疫的程序相同。以大約每2周免疫一次的速度共做四次免疫。
開始第二次免疫時(shí)，免疫前直接從眼基底靜脈叢取血，用固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清中抗KM31-7抗體的效價(jià)。固相抗KM31-7 ELISA在96孔ELISA板(Costar)的各孔中加入用作抗原的150-200μl(約相當(dāng)于200ng的融合蛋白質(zhì))從pSRα31-7轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中得到的無血清培養(yǎng)物上清液。平板于4℃下過夜，使溶液包被板孔的底部表面。第二天，平板用0.1％Tween-20/磷酸鹽緩沖鹽水(0.1％Tween 20/PBS)洗3次，然后每孔加入100μl以PBS配成10μg/ml濃度的BSA溶液，室溫放置1小時(shí)。
然后，再用0.1％Tween 20/PBS將平板洗3次，并向各孔內(nèi)加入30-100μl系列稀釋之樣品形式的第一抗體(例如小鼠血清、雜交瘤培養(yǎng)物上清液或單克隆抗體)，并將平板于室溫下放置1小時(shí)。
然后，將平板再用0.1％Tween 20/pBS洗三次，每孔加入100μl的第二抗體。第二抗體由羊抗小鼠IgG過氧化物酶復(fù)合物(Amersham)的3000倍稀釋液或羊抗小鼠IgG-堿性磷酸酶復(fù)合物(BIO-RAD)的3000倍稀釋液制成。平板于室溫下放置1至2小時(shí)。
然后，平板再用0.1％Tween 20/pBS洗三次，各孔內(nèi)加入100μl過氧化物酶底物溶液(BIO-RAD，過氧化物酶底物試劑盒ABTS)或含0.001％磷酸對(duì)硝基苯酯的10％二乙醇胺溶液。將平板在室溫下放置15至30分鐘，然后可使用微板閱讀議(BIO-RAD)測(cè)415nm或405nm處吸光率以計(jì)算出抗體滴度(效價(jià))。(c)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備在正常培養(yǎng)基(完全GIT)中培養(yǎng)8-氮鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3-X63-Ag8.653(653)(ATCC no.CRL-1580)，最少得到2×107個(gè)細(xì)胞。(d)雜交瘤的制備按上文(b)中所述方法進(jìn)行免疫后得到1.4×108個(gè)被免疫小鼠的脾細(xì)胞，并用DMEM(Nissui Pharmaceutical)徹底洗細(xì)胞。洗過的細(xì)胞與上述步驟c)中制備的1.5×107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3-X63-Ag 8.653(653)混合，并將所得混合物以800r.p.m離心6分鐘。
收集由脾細(xì)胞和P3-X63-Ag.653(653)細(xì)胞的混合物組成的細(xì)胞團(tuán)并分散開所形成的沉淀餅。預(yù)先將聚乙二醇4000(聚乙二醇#4000)用DMEM配成50％溶液。將該溶液在1分鐘時(shí)間內(nèi)以2ml/分的速度邊攪拌邊滴入分散開的細(xì)胞中。然后DMEM以同樣的方式在1分鐘內(nèi)以2ml/分鐘的速度加入細(xì)胞樣品中。按上述方法再一次加入聚乙二醇和DMEM溶液。最后，在3分鐘內(nèi)逐漸加入16ml DMEM。所得的細(xì)胞制品以800r.p.m離心6分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞懸浮于35ml含5至10ng/ml小鼠IL-6的完全GIT中。(e)雜交瘤的篩選100μl上述步驟d)中制備的懸液加入96孔板的各孔中(Sumitomo Bakelite)并在7.5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，每孔中加入50μl HAT培養(yǎng)基，再培養(yǎng)4天后，每孔再加入50μl HAT培養(yǎng)基。平板再培養(yǎng)3天。此后，在可觀察到融合細(xì)胞之菌落生長(zhǎng)的孔中取部分培養(yǎng)上清液樣品，按上面步驟b)中所述的固相ELISA法測(cè)定抗KM31-7抗體的滴度。立即用HT培養(yǎng)基代替取樣的培養(yǎng)基。(f)克隆用有限稀釋分析法將從用作陽(yáng)性的試驗(yàn)孔中得到的細(xì)胞重復(fù)克隆三次。選擇那些觀察到具有恒定抗體效價(jià)的克隆用作產(chǎn)生抗KM31-7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。尤其是在這一階段，不僅按上述步驟b)所述方法進(jìn)行ELISA，而且還使用得自pCDL-pSRα296轉(zhuǎn)染之COS-1細(xì)胞的無血清培養(yǎng)物上清液制備固相，進(jìn)行對(duì)照ELISA。從而，選擇那些與前者反應(yīng)但不與對(duì)照ELISA反應(yīng)的細(xì)胞系進(jìn)行克隆。(g)單克隆抗體的純化從產(chǎn)生抗KM31-7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系中收集培養(yǎng)物上-清液，用0.22μm濾器(Millipore)過濾除菌，然后用MAb Trap G II(Pharmacia)純化抗體。(h)檢測(cè)單克隆抗體1)單克隆抗體的抗原特異性用從pSRα31-7轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞得到的無血清培養(yǎng)物上清液做免疫沉淀試驗(yàn)，以證實(shí)單克隆抗體是對(duì)KM31-7蛋白質(zhì)特異的。2)單克隆抗體的分類使用小鼠單克隆抗體分型試劑盒(Amersham)進(jìn)行本試驗(yàn)，鑒定該抗體為屬于IgG1亞類的抗體。
實(shí)施例17用抗原-抗體反應(yīng)分離和純化KM31-7蛋白質(zhì)按上面實(shí)施例16h)1)中所述方法進(jìn)行。還用抗體和從pcDL-pSRα296轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞得到的無血清上清液重復(fù)同一試驗(yàn)。
各1.7ml無血清上清液中加入1.4μg單克隆抗體，室溫反應(yīng)1小時(shí)，同時(shí)在2.2ml小離心管中以20r.p.m離心。用不加單克隆抗體的pSRα31-7轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞無血清上清液作為對(duì)照。
各管中加入30μl預(yù)先用0.1％Tween 20/PBS洗過的Protein GSepharose 4 Fast Flow(Pharmacia)以吸附抗體，并在室溫下以20r.p.m的速率繼續(xù)離心30分鐘。
每份混合物在小離心管中以10000r.p.m離心幾秒鐘后，小心棄去上清液，以免丟失沉淀物。將沉淀物分別用0.1％Tween 20/PBS洗滌并離心，再以同樣的方法洗5次。
將所得沉淀懸浮于含10μl2-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液中。每份懸液于90℃加熱2分鐘，然后使用12.5％凝膠在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，將產(chǎn)物從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-RAD)上。用實(shí)施例1(a)部分中所述的抗KM31-7多克隆抗體和確定從COS-1/pSRα31-7無血清培養(yǎng)物上清液中特異地沉淀KM31-7蛋白質(zhì)的抗KM31-7單克隆抗體進(jìn)行Western吸印分析。
實(shí)施例18Cyvv-NIa/KM31-7融合蛋白質(zhì)的制備為了用CYVV-NIa蛋白酶技術(shù)表達(dá)KM31-7蛋白，必須將NIa基因3′端連接到與KM31-7蛋白DNA相同的閱讀框架中。因此，完成下述二步驟程序i)將KM31-7 cDNA的3′側(cè)鏈(Sma I-Xba I，1006bp)引入pKSUN9中為了得到含有KM31-7cDNA 3′端的Sma I-Xba I片段(1,006bp)，用限制性內(nèi)切酶Sma I和Xba I消化7μg的pSRα31-7質(zhì)粒DNA，并使用0.8％瓊脂糖凝膠，以GENE CLEAN II(Funakoshi Japan)收集和純化所得的片段。
同時(shí)，用Sma I和Xba I同樣地消化5μg pKSUN9質(zhì)粒DNA，用牛堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，E.coliC75，Takara Shuzo，Japan)使裂解片段去磷酸化。將所得去磷酸的線性化的DNA用連接試劑盒(Takara Shuzo)與Sma I-Xba I KM-31片段連接，用所得構(gòu)建體轉(zhuǎn)化E.coli菌株JM109。選擇并篩選轉(zhuǎn)化體得到含Sma I-XbaI片段的pNIa31-7SX克隆。ii)NIa蛋白酶和KM31-7的連接為了將NIa的C端序列與在同一閱讀框架中有Val N末端殘基之KM31-7亞型的N端序列相連接，使用一Perkin-Elmer JapanApplied Biosystems392型DNA合成儀構(gòu)建4個(gè)類型的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。引物如下5′GGT CAG CAC AAA TTT CCA3′ SEQ.ID No.15(1)5′AAA CAC AAC TTG GAA TGA ACA ATT 3′SEQ.ID No.16(2)5′TCA TTC CAA GTT GTG TTT GTG AAA 3′SEQ.ID No.17(3)5′CAT AGG ATG CTC CAA CAA 3′SEQ.ID No.18(4)第一輪PCR用1μg pKSUN9質(zhì)粒DNA作模板完成。將引物(1)和(2)各100pmol和1/10體積10倍濃度的Taq聚合酶反應(yīng)緩沖溶液及最后5單位Taq聚合酶(Takara Shuzo)按此順序加入反應(yīng)溶液中。PCR反應(yīng)先在72℃下進(jìn)行3分鐘，隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃，1分鐘；55℃，2分鐘和72℃，3分鐘，以72℃處理10分鐘結(jié)束。PCR反應(yīng)后，對(duì)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物進(jìn)行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳。用溴化乙錠染色鑒定含DNA的凝膠條并切下之。向各壓碎的凝膠條中加入300μl洗脫緩沖液(0.5乙酸銨，1mM EDTA，pH8.0)37℃下保溫過夜。離心得到含有經(jīng)純化和擴(kuò)增之DNA的上清液。
用同樣的方式再進(jìn)行一次PCR，但使用1μg的pUCKM31-7質(zhì)粒DNA作模板并用引物(3)和(4)，所得DNA純化方法同上所述。
第一次PCR擴(kuò)增的片段含有編碼KM31-7蛋白質(zhì)N末端殘基的序列，從Val-Val-Phe開始，一直到NIa Xho I位點(diǎn)上游的31bp處。第二次pCR擴(kuò)增的片段含有編碼Asn-Cys-Ser-Phe-Gln，從NIa之C末端到KM31-7cDNA之Sma I位點(diǎn)下游32bp的序列。
因此，當(dāng)用從兩次PCR得到的DNA片段及引物(1)和(4)進(jìn)行PCR時(shí)，產(chǎn)生一條由9bp的NIa之3′端與15bp的編碼KM31-7所需N-端的序列組成的雜交鏈。這樣，可能產(chǎn)生一條以這一部分作為連接子的融合DNA序列。
根據(jù)這一邏輯，有充分理由地用這種方式進(jìn)行第二輪PCR，并從凝膠中收集擴(kuò)增的片段。iii)將NIa/KM31-7DNA引入pNIa31-7SX中從i)中得到的5μg pNIa31-7SX質(zhì)粒DNA用Xho I和Sma I消化后，用牛堿性磷酸酶處理所得DNA使之脫磷酸化。在ii)中制備的PCR產(chǎn)物也用Xho I和Sma I消化，將所得片段用連接試劑盒與經(jīng)消化并脫磷酸化的pNIa31-7SX連接。用所得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化E.coli菌株JM109。
然后選擇并篩選出AmpR轉(zhuǎn)化菌。篩選是通過用Xho I消化及隨后做凝膠電泳進(jìn)行的。選擇僅含有8.0Kbp帶的克隆。然后用HindIII消化所選出之克隆的質(zhì)粒并再做凝膠電泳。所選擇的質(zhì)粒有一條330bp帶，相當(dāng)于NIa之cDNA插入段的一部分。該質(zhì)粒被命名為pNI a31-7V，其含有Xho I和Sma I PCR產(chǎn)物。
測(cè)定克隆pNIa31-7V的堿基序列，且證實(shí)了編碼NIa和KM31-7的序列被連接在同一閱讀框架中，帶有位于NIa和KM31-7蛋白質(zhì)之間的必要的Gln-Val裂解序列。iV)KM31-7蛋白質(zhì)的生產(chǎn)Western印跡證實(shí)pNIa31-7V在E.coli中發(fā)揮功能，并且KM31-7蛋白質(zhì)是由構(gòu)建的重組基因表達(dá)的。
含有pNIa31-7V的E.coli種子培養(yǎng)物在3ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。取1ml種子培養(yǎng)物加入100ml含50μg/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到1.0。此時(shí)，往培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為1mM，然后將培養(yǎng)物在28℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)兩夜。
此后，將1ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)小離心管中，以15000rpm離心5分鐘。棄去上清液，片狀沉淀物與300μl無菌水和300μl含2-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液混合以分散沉積的細(xì)胞體。所得的懸液于95℃加熱2分鐘，然后取10μl這種懸液在還原條件下用8％凝膠做SDS-PAGE。
電泳后，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。這一過程通過將凝膠與膜接觸，并在轉(zhuǎn)錄緩沖液(25mM Tris-HCl，1.4％甘氨酸和20％甲醇)中于4℃保溫2.5小時(shí)，并使用凝膠膜轉(zhuǎn)錄裝置(Marisol，Japan)在19V下完成。
然后，用20mlPBS-T培養(yǎng)基洗硝酸纖維素膜，再在20ml含5％脫脂乳(Snow Brand Co.Ltd)的PBS-T中封閉1小時(shí)。然后，膜用2份20ml的PBS-T漂洗，再在含1μl在無菌水中作100倍稀釋的抗KM31-7兔MAb血清(第一抗體)的20ml PBS-T中反應(yīng)90分鐘。然后將硝酸纖維素膜漂洗一次15分鐘，再洗二次各5分鐘，每次均使用20ml PBS-T。
將洗過的膜浸入在PBS-T中3,000倍稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG羊抗體(BIO-RAD)(用作上述第二抗體)溶液中，并放置1小時(shí)。然后用20ml PBS-T洗膜并轉(zhuǎn)移到ECL檢測(cè)試劑(Amersham)溶液中，經(jīng)過放射自顯影檢測(cè)出與抗KM31-7抗體反應(yīng)的帶。
進(jìn)行Western印跡分析并檢測(cè)到一條分子量約為60,000的帶。該帶表現(xiàn)出與用作對(duì)照的用pSRα31-7轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞得到的無血清培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)到的三種KM31-7蛋白質(zhì)中分子量次大的蛋白質(zhì)具有相同的遷移率。
培養(yǎng)基xM磷酸鹽緩沖液一種Na2HPO4的xM溶液，用xM NaH2PO4溶液調(diào)到所需的pH值。接種緩沖液
0.1M Tris-HCl緩沖液，pH7.0，0.05MEDTA，1％2-巰基乙醇。提取緩沖液0.1M Tris-HCl緩沖液，0.05MEDTA，1％2-巰基乙醇，pH7.0。降解溶液200mM碳酸銨，2％SDS，2mMEDTA，400μg/ml皂土和20μg/ml蛋白酶K(pH9.0)。1×SSC0.15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉，pH7.0。液態(tài)LB培養(yǎng)基10g Bacto Tryptone(Difco)，5g Bacto酵母提取物(Difco)和5g氯化鈉，用蒸餾水定容到1升。Tris-鈣緩沖液10mM Tris，50mM氯化鈣，用鹽酸調(diào)到pH7.4。溶胞緩沖液0.17g蔗糖，250μl 1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，200μl 0.5MEDTA(pH8.0)，用重蒸水定容到20ml。堿-SDS溶液0.2M氫氧化鈉，1％SDS。TBE溶液100mM Tris，100mM硼酸，1mMEDTA。變性溶液1.5M氯化鈉，0.5M氫氧化鈉。中和緩沖液0.5M Tris，3M氯化鈉(pH7.4)。50x Denhardt′s溶液1％聚乙烯吡咯烷酮，1％牛血清白蛋白，1％Ficol l400。溶液用雙蒸水稀釋，根據(jù)需要調(diào)到合適的濃度。5x 變性緩沖液125μl 1M甘氨酸(pH9.0)，25μl 1M氯化鎂，850μl重蒸水。5x 標(biāo)記緩沖液25μl 1M Tris-HCl緩沖液(pH7.9)，5μl 1M氯化鎂，2.5μl1M二硫蘇糖醇，9.2μl重蒸水。10x M9鹽溶液0.145M磷酸氫二鈉，0.172M磷酸二氫鉀，0.187M氯化銨，0.137M氯化鈉，pH7.0。M9基本瓊脂培養(yǎng)基10ml 10x M9鹽溶液，100μl 1M硫酸鎂，1ml 20％葡萄糖，50μl 1％鹽酸硫胺素鹽，1ml 0.01M氯化鈣和13ml重蒸水，混合后過濾滅菌，在往平皿中加入50ml 3％細(xì)菌瓊脂后立即注入該混合液。液態(tài)SOB培養(yǎng)基10g細(xì)菌蛋白胨，2.5g細(xì)菌酵母提取物，100μl 5M氯化鈉和125μl 1M氯化鉀混合，加蒸餾水定容到500ml。高壓滅菌后，加入5ml 1M氯化鎂和5ml 1M硫酸鎂。TFB1 緩沖液5ml 1M 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES-以1NHcl調(diào)節(jié)至pH6.2)，6.045g氯化銣，0.735g二水合氯化鈣和4.94g四水合氯化錳混合，用冰乙酸調(diào)到pH5.8，用重蒸水定容到500ml并過濾滅菌。TFB2 緩沖液
1ml 1M2-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)，1.102g二水合氯化鈣，0.12g氯化銣和15ml甘油混合，用冰乙酸調(diào)pH6.5，用重蒸水定容到100ml，并過濾滅菌。液態(tài)SOC培養(yǎng)基5ml液體SOC介質(zhì)，90μl 20％葡萄糖。2x YT培養(yǎng)基16g細(xì)菌蛋白胨，5g細(xì)菌酵母提取物和5g氯化鈉混合，用重蒸水定容到1升。PBS-Tw 培養(yǎng)基80mM磷酸氫二鈉，20mM磷酸二氫鈉，100mM氯化鈉，0.1％ Tween-20。PBS-T培養(yǎng)基4g氯化鈉，0.1g磷酸二氫鉀，1.45g十二水合磷酸氫二鈉，0.1g氯化鉀和0.1g疊氮鈉，用重蒸水調(diào)到1升，pH7.4。堿性磷酸酶底物溶液0.01％磷酸對(duì)硝基苯酯溶于用鹽酸調(diào)到pH9.8的10％二乙醇胺水溶液中。培養(yǎng)基ADMEM(Dulbecco氏修飾的Eagle培養(yǎng)基，含4.5g/l葡萄糖)，10％滅活的小牛血清(Hyclone生產(chǎn))和10mMHEPES(pH7.2)。培養(yǎng)基BDMEM(含4.5g/l葡萄糖)，10mM HEPES(pH7.2)，3％滅活的小牛血清，5μg/ml牛胰島素(Sigma生產(chǎn))，8μg/ml d-生物素(Sigma生產(chǎn))，4μg/ml泛酸(Sigma生產(chǎn))，1.0μM地塞米松(Sigma生產(chǎn))和0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(Aldrich生產(chǎn))。培養(yǎng)基CDMEM(含4.5g/l葡萄糖)含5％滅活的小牛血清，10mM HEPES(pH7.2)和100ng/ml牛胰島素。培養(yǎng)基DDMEM(含4.5g/l葡萄糖)，5％滅活小牛血清，10mM HEPES(pH7.2)，100ng/ml牛胰島素和10U/ml肝素鈉(Novo Industry Co.生產(chǎn))。LPL底物溶液13mM甘油三[9，10(n)-3H]油酸酯(51.8KBq/μmol，Amersharm生產(chǎn))，1.3mg/ml L-α-磷酸酰膽堿二硬脂酰(Sigma Co.生產(chǎn))，20mg/ml牛血清白蛋白(Sigma Co.生產(chǎn))，135mM Tris-鹽酸[Tris-HCl(pH8.1)，Sigma Co.生產(chǎn)]，16.5％(V/V)甘油和16.5％(V/V)滅活的小牛血清。硫氰酸胍溶液4M硫氰酸胍，1％Sarkosyl，20mM乙二胺四乙酸(EDTA)，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，100mM 2-巰基乙醇和0.1％消泡劑A(Sigma)。吸附緩沖液0.5M NaCl，20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA和0.1％SDS。洗脫溶液10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA和0.05％SDS。實(shí)施例2的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溶液50ml Tris-HCl(pH8.3)，8mM MgCl2，30mM KCl，0.3mM二硫蘇糖醇，2mM dATP，2mM dGTP，2mM dTTP，10μCi[α-32P]dCTP和1.4μg引物DNA載體(3′-Oligo(dT)結(jié)尾的PCDV-1，Pharmacia)。末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)溶液140mM二甲胂酸鉀，30mM Tris-HCl(pH6.8)，1mM CoCl2，0.5mM二硫蘇糖醇，0.2μg poly A和100mM dCTP。限制性酶緩沖液50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM二硫蘇糖醇。10體積連接酶緩沖液10mM ATP，660mM Tris-HCl(pH7.5)，66mM MgCl2和100mM二硫蘇糖醇。電泳染料50％甘油，0.01M磷酸氫二鈉(pH7.0)和0.4％溴酚藍(lán)。1x TAE0.04 Tris-乙酸，0.001M EDTA。1x SSCP120mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，13mM磷酸二氫鉀，和1mM EDTA。實(shí)施例6的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溶液1x第一條鏈合成緩沖液，5％焦磷酸鈉，100單位核糖核酸酶抑制劑，1mM dATP，1mM dGTP，1mM dTTP，0.5mM dCTP和3.75μg oligo(dT)引物，均隨cDNA克隆系統(tǒng)(Amersham)提供。SM緩沖液100mM NaCl，8mM MgSO4·7H2O，50mM Tris-HCl(pH7.5)和0.01％明膠。透析緩沖液20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)和0.5M NaCl。柱緩沖液10mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl和1mM EDTA。Taq聚合酶反應(yīng)緩沖溶液Taq含500mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2，100mM dATP，100mM dCTP，100mM dGTP，100mMdTTP和2mg/ml明膠。
序列表序列ID號(hào)1序列長(zhǎng)度1320序列類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線型分子類型mRNA的cDNA反意無原始來源生物三葉草黃脈病毒特征1-1320 E CDS10-1311 E mat多肽序列描述AAG TTC CAA GGG AAA AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG TTG AAG TTC AGA 48Lys Phe Gln Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gln Lys Leu Lys Phe Arg1 5 10 15GCG GCA AGA GAC ATG AAG GAT CGT TAT GAA GTG CAT GCC GAT GAG GGG 96Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly20 25 30ACT TTA GTG GAA AAT TTT GGA ACT CGT TAT TCA AAG AAA GGC AAG ACA 144Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr35 40 45AAA GGT ACT GTT GTG GGT TTG GGT GCA AAA ACA AGA CGG TTC ACT AAC 192Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn50 55 60ATG TAT GGT TTT GAC CCC ACG GAG TAT TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT 240Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp65 70 75 80CCA ATC ACG GGT GCA ACA TTG GAT GAA ACC CCA ATT CAC AAT GTA AAT 288Pro Ile Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro Ile His Asn Val Asn85 90 95TTG GTT GCT GAG CAT TTT GGC GAC ATA AGG CTT GAT ATG GTT GAC AAG 336Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp Ile Arg Leu Asp Met Val Asp Lys100 105 110GAG TTA CTT GAC AAA CAG CAC TTA TAC CTC AAG AGA CCA ATA GAA TGT 384Glu Leu Leu Asp Lys Gln His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro Ile Glu Cys115 120 125TAC TTT GTA AAG GAT GCT GGT CAG AAG GTG ATG AGG ATT GAT CTA ACA 432Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gln Lys Val Met Arg Ile Asp Leu Thr130 135 140CCC CAC AAC CCA TTG TTG GCA AGC GAT GTT AGC ACA ACC ATA ATG GGT 480Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Agp Val Ser Thr Thr Ile Met Gly145 150 155 160TAT CCT GAG AGA GAA GGT GAA CTC CGT CAA ACT GGA AAG GCA AGG TTA 528Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Lys Ala Arg Leu165 170 175GTC GAC CCA TCA GAG TTG CCC GCG CGG AAT GAG GAT ATT GAT GCA GAG 576Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp Ile Asp Ala Glu180 185 190TTT GAG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GGT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT 624Phe Glu Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile195 200 205TCA CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAG 672Ser Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu210 215 220AAG ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT 720Lys Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His225 230 235 240CTG TTC AGA AGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT GGC 768Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly245 250 255TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG 816Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu260 265 270GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAG TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT 864Gly His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe275 280 285CCA CAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT 912Pro Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val290 295 300TTG GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA 960Leu Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser305 310 315 320GAG TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT 1008Glu Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His325 330 335TGG ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT 1056Trp Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr340 345 350AAA GAT GGA TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC 1104Lys Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly355 360 365GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT 1152Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr370 375 380CTA CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT 1200Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn385 390 395 400CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT 1248Leu Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Aep Ala Pro405 410 415GAA GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG 1296Glu Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu420 425 430AAT TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG 1320Asn Cys Ser Phe Gln Ala Ser Ala435 440序列ID號(hào)2序列長(zhǎng)度440序列類型氨基酸拓樸學(xué)線型分子類型蛋白質(zhì)反意無來源生物三葉草黃脈病毒特征4-437 E mat-肽序列描述Lys Phe Gln Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gln Lys Leu Lys Phe Arg1 5 10 15Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly20 25 30Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr35 40 45Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn50 55 60Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp65 70 75 80Pro Ile Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro Ile His Asn Val Asn85 90 95Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp Ile Arg Leu Asp Met Val Asp Lys100 105 110Glu Leu Leu Asp Lys Gln His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro Ile Glu Cys115 120 125Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gln Lys Val Met Arg Ile Asp Leu Thr130 135 140Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr Ile Met Gly145 150 155 160Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Lys Ala Arg Leu165 170 175Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp Ile Asp Ala Glu180 185 190Phe Glu Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile195 200 205Ser Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu210 215 220Lys Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His225 230 235 240Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly245 250 255Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu260 265 270Gly His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe275 280 285Pro Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val290 295 300Leu Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser305 310 315 320Glu Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His325 330 335Trp Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr340 345 350Lys Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly355 360 365Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr370 375 380Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn385 390 395 400Leu Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro405 410 415Glu Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Mer Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu420 425 430Asn Cys Ser Phe Gln Ala Ser Ala435 440序列ID號(hào)3序列長(zhǎng)度25序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸合成DNA序列描述GTCCATGGGG AAAAGTAAGA GAACA 25序列ID號(hào)4序列長(zhǎng)度20序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述ACTCTGAGAC CGTGCTCAGAG 20序列ID號(hào)5序列長(zhǎng)度20序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其他核酸，合成的DNA序列描述AGGAAAGAG TTCCTCGAGC序列ID號(hào)6序列長(zhǎng)度36序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述AATTGTTCAT TCCAAGCACC TGGGCCACCA CCTGGC 36序列ID號(hào)7序列長(zhǎng)度36序列類型核酸拓樸線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述GCCAGGTGGT GGCCCAGGTG CTTGGAATGA ACAATT 36序列ID號(hào)8序列長(zhǎng)度30序列類型核酸拓樸線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述TTGTCAGCAC ACCTGGGAGC TGTAGAGCTC 25序列ID號(hào)9序列長(zhǎng)度7序列類型氨基酸拓樸學(xué)線型分子類型蛋白質(zhì)序列描述Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly 71 5序列ID號(hào)10序列長(zhǎng)度7序列類型氨基酸拓樸學(xué)線型分子類型蛋白質(zhì)序列描述Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro 71 5序列ID號(hào)11序列長(zhǎng)度1650序列類型核酸鏈型雙鏈拓樸學(xué)線型分子類型mRNA的cDNA來源生物Homo sapiens特征表達(dá)特征的符號(hào)CDS存在位置1..1647檢測(cè)特征的方法E表達(dá)特征的符號(hào)mat-肽存在位置70..1647檢測(cè)特征的方法E表示特征的符號(hào)sig肽存在位置1..69檢測(cè)特征的方法E序列ATG TCA TGT GAG GAC GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG 48Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu-23 -20 -15 -10GCC GCG GAA ACC GAT CTG CCC GTT GTG TTT GTG AAA CAG AGA AAG ATA 96Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gln Arg Lys Ile-51 5GGC GGC CAT GGT CCA ACC TTG AAG GCT TAT CAG GAG GGC AGA CTT CAA 144Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg Leu Gln10 15 20 25AAG CTA CTA AAA ATG AAC GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC 192Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp30 35 40TAT GAC CTT ATC ATC ATT GGA GGT GGC TCA GGA GGT CTG GCA GCT GCT 240Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala45 50 55AAG GAG GCA GCC CAA TAT GGC AAG AAG GTG ATG GTC CTG GAC TTT GTC 288Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val60 65 70ACT CCC ACC CCT CTT GGA ACT AGA TGG GGT CTT GGA GGA ACA TGT GTG 336TAr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val75 80 85AAT GTG GGT TGC ATA CCT AAA AAA CTG ATG CAT CAA GCA GCT TTG TTA 384Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu90 95 100 105GGA CAA GCC CTG CAA GAC TCT CGA AAT TAT GGA TGG AAA GTC GAG GAG 432Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu110 115 120ACA GTT AAG CAT GAT TGG GAC AGA ATG ATA GAA GCT GTA CAG AAT CAC 480Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His125 130 135ATT GGC TCT TTG AAT TGG GGC TAC CGA GTA GCT CTG CGG GAG AAA AAA 528Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys140 145 150GTC GTC TAT GAG AAT GCT TAT GGG CAA TTT ATT GGT CCT CAC AGG ATT 576Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His Arg Ile155 160 165AAG GCA ACA AAT AAT AAA GGC AAA GAA AAA ATT TAT TCA GCA GAG AGA 624Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg170 175 180 185TTT CTC ATT GCC ACT GGT GAA AGA CCA CAT TAC TTG GGC ATC CCT GGT 672Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly190 195 200GAC AAA GAA TAC TGC ATC AGC AGT GAT GAT CTT TTC TCC TTG CCT TAC 720Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr205 210 215TGC CCG GGT AAG ACC CTG GTT GTT GGA GCA TCC TAT GTC GCT TTG GAG 768Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu220 225 230TGC GCT GGA TTT CTT GCT GGT ATT GGT TTA GAC GTC ACT GTT ATG GTT 816Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val235 240 245AGG TCC ATT CTT CTT AGA GGA TTT GAC CAG GAC ATG GCC AAC AAA ATT 864Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn Lys Ile250 255 260 265GGT GAA CAC ATG GAA GAA CAT GGC ATC AAG TTT ATA AGA CAG TTC GTA 912Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val270 275 280CCA ATT AAA GTT GAA CAA ATT GAA GCA GGG ACA CCA GGC CGA CTC AGA 960Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg285 290 295GTA GTA GCT CAG TCC ACC AAT AGT GAG GAA ATC ATT GAA GGA GAA TAT 1008Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Sar Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr300 305 310AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 1056Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys Ile315 320 325GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ATA AAT GAA AAG ACT GGA AAA ATA 1104Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile330 335 340 345CCT GTC ACA GAT GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile350 355 360GGC GAT ATA TTG GAG GAT AAG GTG GAG CTC ACC CCA GTT GCA ATC CAG 1200Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln365 370 375GCA GGA AGA TTG CTG GCT CAG AGG CTC TAT GCA GGT TCC ACT GTC AAG 1248Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys380 385 390TGT GAC TAT GAA AAT GTT CCA ACC ACT GTA TTT ACT CCT TTG GAA TAT 1296Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr395 400 405GGT GCT TGT GGC CTT TCT GAG GAG AAA GCT GTG GAG AAG TTT GGG GAA 1344Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu410 415 420 425GAA AAT ATT GAG GTT TAC CAT AGT TAC TTT TGG CCA TTG GAA TGG ACG 1392Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr430 435 440ATT CCG TCA AGA GAT AAC AAC AAA TGT TAT GCA AAA ATA ATC TGT AAT 1440Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn445 450 455ACT AAA GAC AAT GAA CGT GTT GTG GGC TTT CAC GTA CTG GGT CCA AAT 1488Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn460 465 470GCT GGA GAA GTT ACA CAA GGC TTT GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG 1536Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu475 480 485ACC AAA AAG CAG CTG GAC AGC ACA ATT GGA ATC CAC CCT GTC TGT GCA 1584Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val Cys Ala490 495 500 505GAG GTA TTC ACA ACA TTG TCT GTG ACC AAG CGC TCT GGG GCA AGC ATC 1632Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile510 515 520CTC CAG GCT GGC TGC TGA 1650Leu Gln Ala Gly Cys525序列ID號(hào)12序列長(zhǎng)度526序列類型氨基酸鏈型單鏈拓樸學(xué)線型分子類型肽序列Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu-23 -20 -15 -10Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gln Arg Lys Ile-5 1 5Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg Leu Gln10 15 20 25Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp30 35 40Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala45 50 55Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val60 65 70Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val75 80 85Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu90 95 100 105Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu110 115 120Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His125 130 135Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys140 145 150Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His Arg Ile155 160 165Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg170 175 180 185Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly190 195 200Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr205 210 215Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu220 225 230Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val235 240 245Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn Lys Ile250 255 260 265Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val270 275 280Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg285 290 295Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr300 305 310Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys Ile315 320 325Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile330 335 340 345Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile350 355 360Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln365 370 375Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys380 385 390Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr395 400 405Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu410 415 420 425Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr430 435 440Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn445 450 455Thr Lys Asp Aen Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn460 465 470Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu475 480 485Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val Cys Ala490 495 500 505Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile510 515 520Leu Gln Ala Gly Cys525序列ID號(hào)13序列長(zhǎng)度15序列類型核酸鏈型雙鏈拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列TAAATAAATA AATAA序列ID號(hào)14序列長(zhǎng)度66序列類型核酸鏈型雙鏈拓樸線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC TGGCTGCCAC CACCACCACC ACCACTGATC 60TAGACT66序列ID號(hào)15序列長(zhǎng)度18序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述GGTCAGCACA AATTTCCA 18序列ID號(hào)16序列長(zhǎng)度24序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述AAACACAACT TGGAATGAAC AATT24序列ID號(hào)17序列長(zhǎng)度24序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述TCATTCCAAG TTGTGTTTGT GAAA24序列ID號(hào)18序列長(zhǎng)度18序列類型核酸拓樸學(xué)線型分子類型其它核酸，合成的DNA序列描述CATAGGATGC TCCAACAA 18
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸序列，該序列編碼由序列表中序列ID No.1的第10至1311號(hào)核苷酸給出的三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白質(zhì)或其與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白質(zhì)具有相似蛋白水解特異性之突變體或變異體。
2.一種含有權(quán)利要求1的多核苷酸序列的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的載體，它是一種表達(dá)載體。
4.一種用權(quán)利要求2的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
5.一種NIa蛋白，該蛋白含有由序列ID No.2中4至437號(hào)殘基所給出的序列，或其與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白具有相似蛋白水解特異性的突變體或變異體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，該多肽具有由序列ID No.2中的4至437號(hào)殘基所給出的序列，或其與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a蛋白具有相似蛋白水解特異性的突變體或變異體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多肽，該多肽具有由序列ID No.2中的4至437號(hào)殘基所給出的序列。
全文摘要
利用自體溶解融合蛋白質(zhì)的表達(dá)系系統(tǒng)和新的還原性多肽。本發(fā)明提供了用于外源性多肽的表達(dá)系統(tǒng),其中多肽被表達(dá)成與三葉草黃色葉脈病毒核包涵體a(NIa)構(gòu)成的融合蛋白質(zhì),該NIa成份在表達(dá)之后負(fù)責(zé)自體溶解該融合蛋白質(zhì)。此系統(tǒng)可被用于表達(dá)一種新的多肽,它被命名為KM31－7蛋白質(zhì),并且能夠還原二氯靛酚和氧化態(tài)谷胱甘肽。此多肽可用于治療由氧化應(yīng)激引起的疾病。
文檔編號(hào)C12N5/12GK1385529SQ0113396
公開日2002年12月18日 申請(qǐng)日期2001年8月15日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月13日
發(fā)明者高橋亙, 芹澤伸記, 小石龍?zhí)? 川島一郎 申請(qǐng)人:三共株式會(huì)社