專利名稱：L－薄荷醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過D，L-基衍生物的對映選擇性酶催解離制備L-薄荷醇的方法。
諸如采用物理方法能夠?qū)崿F(xiàn)所述分離。這些方法包括，例如，旋光性胺與外消旋鄰苯二甲酸氫甲酯或琥珀酸氫甲酯的鹽的分級結(jié)晶。另外，D-或L-薄荷醇能夠自外消旋薄荷醇混合物分離出來，方法是采用諸如氧基乙酸的旋光性酸酯化所述混合物，并通過結(jié)晶分離非對映化合物的混合物。D-或L-薄荷醇通過非對映酯的皂化得到。
工業(yè)應(yīng)用的自D，L-薄荷醇混合物分離光學(xué)純D-和L-薄荷醇的另一種方法(DE-A 2 109 456)借助于羧酸基酯作中間體來進行。優(yōu)選使用苯甲酸或者六氫苯甲酸的酯，還有4-甲基苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸和4-乙氧基苯甲酸的酯。該方法是旋光對映體的選擇性結(jié)晶，所得對映體的純度如此之高，以致于能夠在不進行進一步提純操作的條件下實施進一步的處理。
此外，L-薄荷醇能夠通過使用酶或微生物從D，L-薄荷醇混合物中分離出來。
還已知脂肪酶水解含水介質(zhì)中的酯，并且具有高的專一性和選擇性。另外，在某些有機溶劑中，一些脂肪酶具有催化逆反應(yīng)的能力，從而自相應(yīng)的酸和醇合成酯。
已經(jīng)使用各種策略自外消旋D，L-薄荷醇混合物制備純L-薄荷醇。因此，例如，四面體通訊(Tetrahedron Letters)27，(1986)29公開了皺摺假絲酵母(Candida rugosa)的脂肪酶自外消旋月桂酸基酯通過在含水介質(zhì)中水解有選擇性地釋放L-薄荷醇(對映體過量(ee)70％)。在外消旋薄荷醇與月桂酸的酯化中也顯現(xiàn)該對映選擇性優(yōu)勢，以高對映體純度(對映體過量86％)形成L-月桂酸基酯。在非水介質(zhì)中，外消旋薄荷醇能夠采用脂肪酶與月桂酸對映選擇地酯化，再一次有選擇性地形成L-月桂酸基酯(對映體過量95％)。10小時之后該反應(yīng)實質(zhì)上完成。D，L-薄荷醇與甘油三月桂酸酯的酯交換反應(yīng)，或者D，L-月桂酸基酯與異丁醇的酯交換反應(yīng)以相似的高對映選擇性進行，但是反應(yīng)極其緩慢(反應(yīng)時間15天或更長)。
還已知，如果物質(zhì)在水中只有差的溶解性，那么在非水介質(zhì)中在酶催化下進行反應(yīng)。作為有機溶劑的替代品，可以應(yīng)用超臨界流體，特別是超臨界二氧化碳。因此Chemie Ingenieur Technik，69，(1986)29還公開了其用于D，L-薄荷醇外消旋體拆分，更確切地說，通過各種醋酸酯與外消旋薄荷酸的對映選擇性酯交換來進行。采用烯醇酯醋酸異丙烯酯得到最好的結(jié)果。這類酯的好處是，在反應(yīng)完成之后，通過水解形成的醇，在這種情況下是異丙烯醇，立即異構(gòu)化形成相應(yīng)的酮，所以不為任何逆反應(yīng)所利用。所研究的酶是自皺摺假絲酵母的脂肪酶AY、自Burkholderia cepacia(舊稱蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia))的脂肪酶PS、自Candida antarctica B的Novozyme435、自Rhizomucor miehei的脂酶(lipozyme)IM60和自劃界假單胞菌(Pseudomonas marginata)的酯酶EP10。
酯酶EP10能夠得自含有EP10酯酶的基因的重組體E.coli菌株。酯酶EP10在體系中顯示無疑地最高的對映選擇性。Novozyme435，在所選擇的條件下，在采用各種醋酸酯的酯交換中實質(zhì)上沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)化。
根據(jù)生物技術(shù)進展(Biotechnol.Prog.)11，(1995)270報導(dǎo)，通過采用非離子表面活性劑對脂肪酶進行目標(biāo)處理可以顯著增加自皺摺假絲酵母的脂肪酶(脂肪酶AY)對外消旋薄荷醇的對映選擇性。這些研究清楚說明，在有機介質(zhì)中L-薄荷醇與月桂酸的酯化的有效性很大程度上取決于酶。自皺摺假絲酵母的脂肪酶在這個反應(yīng)中的有效性顯著高于自Rhizopus sp.、Burkholderia cepacia、Pseudomonassp.、Mucor javanicus、Aspergillus niger以及自豬胰臟的脂肪酶。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用非離子表面活性劑處理的結(jié)果是，自皺摺假絲酵母的脂肪酶的有效性增加到約5倍。
Tetrahedron Letters39，(1998)4333公開了采用微波輻射，在豬胰臟脂肪酶的情況下，不引起外消旋薄荷醇與棕櫚酸的酯化反應(yīng)的反應(yīng)速度或?qū)τ尺x擇性的變化。
脂肪酶也能接受羧酸酐作為酰基給體。羧酸酐，正如在烯醇酯的情況下已經(jīng)敘述的，其優(yōu)點是?；D(zhuǎn)移是準(zhǔn)不可逆的。根據(jù)酶和微生物技術(shù)(Enzyme and Microbial Technology)18，(1996)536，自皺摺假絲酵母的脂肪酶AY-30能夠在外消旋薄荷醇與乙酸酐、丙酸酐和丁酸酐的反應(yīng)中實現(xiàn)一定的對映選擇性。這種酶的最好結(jié)果得于在正己烷溶劑中與丁酸酐反應(yīng)48小時之后(對映體過量所形成的L-丁酸基酯的86％)。
反應(yīng)的對映選擇性一般取決于所用的脂肪酶和所用的酸酐兩者。因此，微生物生物工藝學(xué)(Microbiol.Biotechnol)43，(1995)639公開自皺摺假絲酵母的脂肪酶OF360和丙酸酐賦予所形成的L-丙酸基酯很高的光學(xué)純度(對映體過量95％)。
自D，L-薄荷醇混合物制L-薄荷醇的另一個可能的方法是對映選擇地酶催解離外消旋酯混合物。因此，Dechema Biotechnol.Conf.(1989)141公開采用自皺摺假絲酵母的脂肪酶使D，L-醋酸基酯進行水解反應(yīng)，所釋放出的L-薄荷醇說明酶的對映選擇性相當(dāng)?shù)汀?br> 已發(fā)現(xiàn)制備D-或L-薄荷醇和其衍生物的方法，其特征在于采用脂肪酶對映選擇地酶催解離D，L-基衍生物。
用于本發(fā)明方法的D，L-基衍生物是，例如下式化合物 其中R代表氫、未支化或支化的C1-C20-烷基、C3-C8-環(huán)烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳基烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷基氨基，其中上述烴基能夠任選由羥基、甲?；⒀趸?、C1-C6-烷氧基、羧基、巰基、磺基、氨基、C1-C6-烷基氨基或硝基或鹵素，優(yōu)選氯單取代或多取代。
優(yōu)選的D，L-基衍生物是D，L-薄荷醇與脂族或芳族羧酸的酯。例如，可以述及以下酯D，L-醋酸基酯、D，L-苯甲酸基酯、D，L-異戊酸基酯。
特別是優(yōu)選D，L-苯甲酸基酯。
用于本發(fā)明方法的D，L-基衍生物本身是已知的。
通常，對于本發(fā)明方法而言，使用自皺摺假絲酵母的脂肪酶。
已知脂肪酶也能通過重組體DNA技術(shù)(EP A 238 023)來生產(chǎn)。其中脂肪酶編碼基因通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從所選擇的菌株轉(zhuǎn)移到接受生物體。這種接受生物體產(chǎn)生脂肪酶。
在最優(yōu)選的實施方案中，使用固定在載體材料上的重組脂肪酶。適宜的載體材料是，例如，塑料如聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氨酯、聚丙烯酸酯、膠乳、尼龍或聚四氟乙烯，多糖如瓊脂糖或葡聚糖，離子交換樹脂(陽離子和陰離子兩者)，硅氧烷聚合物如聚硅氧烷，或硅酸鹽如玻璃。酶的固定方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉(K.Mosbach，“Immobilized Enzymes”，Methods in Enzymology44，Academic Press，New York，1976)，并且包含交聯(lián)、吸附或共價鍵合到載體材料上。
自皺摺假絲酵母的脂肪酶也已市售，例如脂肪酶AY(銷售商Amano，Nagoya，日本)。
令人驚奇的是，在本發(fā)明優(yōu)選形式中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，采用自皺摺假絲酵母的重組脂肪酶(WO99/14338)的D，L-苯甲酸基酯的水解以很高的對映選擇性(E＞100)和(-)-薄荷醇的對映體過量＞99.9％來進行。該結(jié)果由氣相色譜分析、NMR光譜和旋光測定法來證實。
兩種皺摺假絲酵母脂肪酶(市售和重組體)的不同水解行為能夠以下述事實來解釋，市售制劑不僅能含有所需要的酶，而且含有大量的性能稍有不同的同工酶。SDS-PAGE研究發(fā)現(xiàn)，所使用的重組脂肪酶僅顯示一種蛋白譜帶(見WO99/14338)，而脂肪酶AY則顯示許多蛋白譜帶。
習(xí)慣上，本發(fā)明方法所用的溶劑能夠是水、含水緩沖液和有機溶劑。優(yōu)選使用的有機溶劑是己烷、環(huán)己烷、庚烷、環(huán)庚烷、甲苯、二氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺、二噁烷、四氫呋喃或乙醇。優(yōu)選應(yīng)用的含水緩沖液是磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。
對于本發(fā)明方法，一般應(yīng)用1-10000單位(U)脂肪酶，優(yōu)選10-1000單位(U)脂肪酶，以0.01mmol基衍生物為基準(zhǔn)計。
按照本發(fā)明方法的解離一般在0-90℃下，優(yōu)選在20-60℃的溫度下實施。
按照本發(fā)明方法的解離一般在pH1-12下，優(yōu)選在約pH7下實施。
本發(fā)明方法能夠按下述實施，例如第一步在發(fā)醇桶中以與WO99/14338(參見實施例1)相似的方式生成酶；在第二步中，提純所得脂肪酶(參見實施例1)；在第三步中使基衍生物進行酶催解離(參見實施例3)。
如此制備的純薄荷醇對映體符合高分析和感官要求。
在下述處理之后，活度為40,000U/g凍干濃縮物?？偸章蕿?1g干物質(zhì)。
在復(fù)合介質(zhì)中培養(yǎng)的CRL(皺摺假絲酵母脂肪酶)的提純盡管通過Pichia pastoris向介質(zhì)中分泌活性形式的成熟皺摺假絲酵母脂肪酶，所制備的SDS凝膠分析發(fā)現(xiàn)，在上層清液中仍存在污染性蛋白質(zhì)。所以，為提純重組脂肪酶制定了提純方案。
在交叉流過濾(Sartorius，Gttingen，Sartocon Cassette0.2μm)之后，滲析50ml發(fā)酵上層清液(Spectra/Por滲析管)，以便除去干擾下一提純步驟的鹽。然后通過采用30kD膜(Pall，OmegaMinisette，MW30,000)的超濾進一步濃縮脂肪酶溶液。以DEAE-Sepharose填充FPLC柱，該柱用25mM三羥甲基氨基甲烷(tris)-HCl緩沖液(pH7.5)平衡，并施用脂肪酶溶液。在使用平衡緩沖液的洗滌步驟之后，采用NaCl梯度來洗脫脂肪酶。采用pNPP快速檢測(參見下述)測試各級分的脂肪酶活度。將黃色的級分合并、超濾、冷凍干燥(Finn Aqua Lyovac GT2)，并借助pH計測定解脂活度。提純方案總結(jié)于表1。表1自復(fù)合介質(zhì)中的Pichia pastoris的培養(yǎng)上層清液中提純CRL的表。

*活度借助pH計相對于三丁酸甘油酯進行測定酶的檢定采用pH計(Metrohm)在pH7.2常規(guī)地檢測活度。
將66mM甘油三丁酸酯采用20mg/ml阿拉伯樹膠穩(wěn)定劑乳化，并采用Ultraturrax(T25，Janke&Kunkel)在最大速度下均化7min。
加入20ml檢定溶液，并加入10-100μl酶溶液。然后采用pH計檢測活度。將一個單位定義為每分鐘釋放1μmol脂肪酸的酶的量。pNPP快速試驗為了能夠快速檢驗大量樣品，使用快速試驗。溶液A由溶解在異丙醇中的棕櫚酸對硝基苯酯(pNPP，10mm)組成。溶液B由三羥甲基氨基甲烷緩沖液(100mM，pH7.5)、膽酸鹽(0.8％(w/v))和阿拉伯樹膠(1％(w/v))組成。反應(yīng)混合物由9份溶液B和1份溶液A組成，并且必須總是新鮮配制。將待試驗溶液(50μl)吸移到微量滴定板上，并加入反應(yīng)混合物(200μl)。通過底物解離形成的黃色以目測評估或者光譜法定量。
為了確定適宜的溶劑，將等摩爾量D，L-苯甲酸基酯和D，L-薄荷醇溶解在異辛烷中，以便得到信號面積比的基準(zhǔn)(苯甲酸基酯/薄荷醇)。氣相色譜測定得到信號面積比〔苯甲酸基酯/薄荷醇〕為1.7。
然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，殘余物在10ml磷酸鈉緩沖液(pH7.2，100mM)中溶解，加入阿拉伯樹膠(0.2％(m/v))，將混合物均化10min，并在每種情況下向塑料反應(yīng)器中加入1ml等分部分。在40℃下培育1小時之后，將混合物以一層不同的溶劑(每種500μl)蓋上，并振動萃取1小時。表2示出按照GC測定得到的信號面積比〔苯甲酸基酯/薄荷醇〕。表2萃取用溶液

如此發(fā)現(xiàn)，醋酸乙酯是萃取苯甲酸基酯和薄荷醇的最適宜溶劑。
在每種情況下，反應(yīng)均在1ml磷酸鈉緩沖液中(pH7.2，100mM)在40℃下采用0.2％(m/v)阿拉伯樹膠作加溶劑來進行。在每種情況下，所用的酶的量為每0.01mmol D，L-苯甲酸基酯為400U提純的皺摺假絲酵母脂肪酶。采用氣相色譜測定薄荷醇的對映體過量，并以信號面積為基準(zhǔn)計算苯甲酸基酯的對映體過量。表3采用rec.CRL進行D，L-苯甲酸基酯水解。

表3說明，對于在所選擇反應(yīng)條件下D，L-苯甲酸基酯的水解而言，自皺摺假絲酵母的重組脂肪酶顯示很高的對映選擇性(E＞100)。
另外，深入研究了下述市售脂肪酶對于外消旋苯甲酸基酯的立體選擇性自皺摺假絲酵母(Amano AY)、Burkholderia cepacia(舊稱蔥頭假單胞菌；Roche Diagnostics，Penzberg；ChirazymeL-1)、Rhyzomucor miehei(Roche Diagnostics，Penzberg；ChirazymeL-9)和Rhizopus oryzae(Amano F)的市售脂肪酶。表5示出采用自Rhizomucor miehei的脂肪酶在40℃和反應(yīng)時間16小時時使D，L-苯甲酸基酯進行反應(yīng)的結(jié)果。產(chǎn)物的對映體過量僅2％，意味著對映選擇性很低。表5采用RML進行D，L-苯甲酸基酯水解

自Burkholderia cepacia和米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶在反應(yīng)時間達(dá)16小時之后仍未產(chǎn)生轉(zhuǎn)化。
表6說明采用Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.(Nagoya Japan)的市售皺摺假絲酵母脂肪酶進行的D，L-苯甲酸基酯的水解。反應(yīng)在40℃和50℃下進行。表6采用市售CRL(Amano AY)進行D，L-苯甲酸基酯水解

表6說明，雖然市售皺摺假絲酵母脂肪酶有高活性，但是也具有對苯甲酸基酯很低的對映選擇性。
反應(yīng)在40℃下進行20小時，同時進行劇烈攪拌。反應(yīng)過程之后是薄層色譜法。然后，反應(yīng)混合物用甲苯萃取(250ml，2×100ml)，合并的有機相經(jīng)Na2SO4干燥，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮。
采用柱色譜法(硅膠)提純其余的淺黃色反應(yīng)混合物。應(yīng)用比例為10∶1的石油醚/醋酸乙酯作流動相。產(chǎn)量得到了產(chǎn)量為255mg(1.6mMol，20.0％)(-)-薄荷醇和421mg(1.6mmol，20.0％)苯甲酸基酯。表征旋光角的測定薄荷醇〔α〕20D＝-51.3(c＝1.00，CH2Cl2)〔α〕20D＝-50±1苯甲酸基酯〔α〕20D＝+86.3(c＝1.00，CH2Cl2)〔α〕20D＝+84.5(c＝1.00，CH2Cl2)NMR波譜薄荷醇1H-NMR(CDCl3，500.1MHz)δ相對TMS 0.81(d；J＝6.9；3H)；0.92(2d；6H)；0.97(d，1H)；1.10(d；J＝10.2；1H)；1.40-1.47(m；2H)；1.59-1.67(m；2H)；1.96(d，1H)；2.17(m；1H)；3.42(dt；J＝10.4，4.1；1H).13C-NMR(CDCl3，125.8MHz)δ相對TMS16.10；21.03；22.23；23.15；25.83；31.66；34.56；45.06；50.15；71.54.苯甲酸基酯1H-NMR(CDCl3，500.1MHz)δ相對TMS0.80(d；J＝7.0；3H)；0.92(2d；J＝5.2，4.7；6H)；1.08-1.19(m；2H)；1.53-1.58(m；2H)；1.70-1.75(m；2H)；1.93-2.00(m；1H)；2.11-2.15(m；1H)；4.94(dt；J＝10.9，4.4；1H)；7.41-7.56(m；3H)；8.04(t；2H).13C-NMR(CDCl3，125.8MHz)δ相對TMS16.52；20.78；22.05；23.64；26.50；31.45；34.34；40.98；47.29；74.82；128.29；129.56；130.88；132.68；166.09.氣相色譜薄荷醇≥99.9％ee
為了進行比較，采用Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.(NagoyaJapan)市售的皺摺假絲酵母(Amano AY)進行D，L-醋酸基酯水解(表8)。該表清楚說明，相對D，L-醋酸基酯而言，這些市售制劑與皺摺假絲酵母重組脂肪酶相比，具有顯著低的對映選擇性。表8采用市售CRL(Amano AY)進行D，L-醋酸基酯水解

實施例8D，L-異戊酸基酯的水解表9總結(jié)了進行D，L-異戊酸基酯水解的結(jié)果。反應(yīng)在含有0.2％(m/v)阿拉伯樹脂加溶劑的磷酸鈉緩沖液(pH7.2，100mM)中進行。為確定最佳溫度，選擇反應(yīng)溫度為40℃、50℃和60℃。在每種情況下，所使用的酶的量為每0.01mmol D，L-異戊酸基酯800U提純皺摺假絲酵母脂肪酶。采用氣相色譜測定對映體過量。表9采用rec.CRL(ITB)進行D，L-異戊酸基酯水解

表9說明，在采用皺摺假絲酵母重組脂肪酶進行的D，L-異戊酸基酯水解中，得到的產(chǎn)物對映體過量為＞99％ee。反應(yīng)的最佳溫度為50℃。在60℃下，在6小時之后，發(fā)現(xiàn)酶的活性損失，其原因在于反應(yīng)停滯，這是由于酶在高溫下變性之故。
自皺摺假絲酵母的游離脂肪酶的固定化確定適宜的載體材料為了固定化自皺摺假絲酵母的提純天然脂肪酶，試驗了各種載體材料。在Celite545(Fluka)、EP100(聚丙烯粉末200-400μm，Akzo Nobel)、Hyflo Super Cell(Fluka)、SiO2(Fluka)和Al2O3(Fluka)上的固定化以脂肪酶的疏水吸附為基礎(chǔ)，而鍵合到DEAE-Sepharose(Pharmacia Biotech)上是由于離子相互作用。取決于載體材料，應(yīng)用每克載體2000-3000單位提純的脂肪酶。
在進行固定化之后，過濾樣品，以pH計(pH7.2，30℃)測定在濾液和固定化物(immobilizate)中相對甘油三丁酸酯的活性。表10示出在各種載體材料上的固定效率。表10在濾液和固定化物中固定化之后的活性

因為采用載體材料EP100和SiO2得到活性、固定化皺摺假絲酵母脂肪酶的最高收率，所以這些固定化物應(yīng)用在D，L-苯甲酸基酯的水解中。
雖然在上文中為了說明的目的詳述了本發(fā)明，能夠理解該詳述僅僅為此目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明精神和范圍的條件下能夠?qū)Ρ景l(fā)明作出變更方案，除非受權(quán)利要求書所限制。
權(quán)利要求
1.一種制備D-或L-薄荷醇或其衍生物的方法，包括通過脂肪酶以對映選擇的方式酶催解離D，L-基衍生物的步驟。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述D，L-基衍生物具有式 式中R代表氫、未支化或支化的C1-C20-烷基、C3-C8-環(huán)烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳基烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷基氨基，其中上述烴基能夠任選由羥基、甲?；?、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巰基、磺基、氨基、C1-C6-烷基氨基或硝基或鹵素單取代或多取代。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中D，L-基衍生物是脂族或芳族D，L-基酯。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中D，L-基衍生物是D，L-苯甲酸基酯。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酶是皺摺假絲酵母。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酶是重組脂肪酶。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述脂肪酶是皺摺假絲酵母的重組脂肪酶1。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)在約pH7的含水介質(zhì)中在10-70℃的溫度下進行。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酶是固定化脂肪酶。
全文摘要
通過對映選擇酶催解離自D,L－基衍生物制備L－薄荷醇。
文檔編號C12P41/00GK1364910SQ0210180
公開日2002年8月21日 申請日期2002年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月11日
發(fā)明者I·－L·加特菲爾德, J·－M·希爾默, U·博恩謝伊爾, R·施密德特, S·沃爾洛瓦 申請人:哈爾曼及賴默股份有限公司