專利名稱：高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株及其用途。
背景技術(shù)：
殼聚糖(chitosan)是由氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接成的具有生物活性的高分子聚合物，化學(xué)名為聚2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。它主要是以被廢棄的蝦殼、蟹殼為原料，經(jīng)脫鈣、去除蛋白和脫乙酰基等化學(xué)過程而得到的。其分子結(jié)構(gòu)式如下圖所示。 殼聚糖具有許多獨(dú)特的生物活性。1991年的國際甲殼素大會把殼聚糖和甲殼素確定為除了糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)之外的第六大生命要素，對它們在醫(yī)療保健方面的作用給予了很高的評價。
殼聚糖的許多生物活性需要以低分子量或者殼寡聚糖的形式才能體現(xiàn)出來，同時一些特定聚合度的殼低聚糖還具有許多殼聚糖本身所不具有的特殊生物活性，如抗腫瘤、免疫激活等作用。但是由于人體內(nèi)殼聚糖酶和胃酸的含量很少，殼聚糖的作用效果受到了很大的限制。
低聚糖的制備主要有三種方法，即化學(xué)法、糖轉(zhuǎn)移法和酶降解法。目前低聚糖的主要制備方法是水解法，用氟化氫降解殼聚糖，得到較高產(chǎn)量的三糖到十糖，但是最后需要移走大量的氟化氫且進(jìn)行進(jìn)一步脫氟反應(yīng)，從而在實(shí)踐中受到限制。而且化學(xué)反應(yīng)條件非?？量?。酸水解法是用鹽酸將殼聚糖部分水解，得到低聚糖溶液，要強(qiáng)化水解條件。甲殼質(zhì)低聚糖酸溶液可用活性碳-氟鎂石柱吸附分離法進(jìn)行精制，這樣可獲得單糖到七糖的低聚糖，吸附的低聚糖可用乙醇溶解析出，并通過改變乙醇濃度分離出二～七糖的各種低聚糖(活性碳不吸附單糖)；需大量的乙醇才能將低聚糖沉淀出來，且氨基葡萄糖不能回收，殼低聚糖酸溶液則要先用濃縮法除去剩余鹽酸，再用陽離子交換色譜分離獲得不同分子量的殼聚糖。因此，化學(xué)方法降解甲殼質(zhì)和殼聚糖生產(chǎn)殼低聚糖，但由于這些方法存在產(chǎn)物得率低，環(huán)境污染嚴(yán)重以及降解程度難以控制等缺點(diǎn)，逐漸為酶降解法所取代。目前用于殼聚糖降解的酶有專一性的殼聚糖酶，也有非專一性的酶如纖維素酶、脂肪酶、溶菌酶等，市售非專一性酶的活力都不大高，而成本較高。所以，篩選新的菌株以獲得高活力殼聚糖酶是目前殼低聚糖生產(chǎn)研究的一個熱點(diǎn)問題。本發(fā)明公開了一種新的高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株和一種酶法生產(chǎn)殼低聚糖的方法。以定向育種的方法誘導(dǎo)菌種產(chǎn)生產(chǎn)殼聚糖酶活性，并利用含有殼聚糖酶的粗酶液制備不同分子量的殼低聚糖，可以提高產(chǎn)品的附加值，能產(chǎn)生很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株及其用途。
高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株的菌落為淡灰綠色，菌落形態(tài)部分埋伏氣生型，氣生菌絲為松絮狀，形狀為菌絲體，營養(yǎng)菌絲為無色；菌絲有橫隔膜，分生孢子梗具有橫隔，光滑，分生孢子梗頂端生有不對稱帚狀分枝，分生孢子為橢圓形。
它用于發(fā)酵粗酶液降解殼聚糖制備殼低聚糖。
從土壤里篩選的青霉屬菌株，再采用殼聚糖作為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)，以定向育種的方法誘導(dǎo)菌種產(chǎn)生產(chǎn)殼聚糖酶活性，并利用含有殼聚糖酶的發(fā)酵液制備不同分子量的殼低聚糖。此方法效率高，成本低，不污染環(huán)境，可以控制降解速率，獲得幾萬乃至幾個聚合度的殼低聚糖和寡聚糖產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了經(jīng)定向育種得到的青霉屬菌株，該菌株能生產(chǎn)高活力的殼聚糖酶。該菌株的育種方法是用從土壤里篩選的青霉屬菌株，再采用大分子量的殼聚糖作為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)幾代傳代、抗生素優(yōu)化和紫外線誘變之后，菌種的產(chǎn)殼聚糖酶活力得到了很大提高，發(fā)酵粗酶液的酶活力達(dá)到2.6U/mL。
本發(fā)明還提供了利用菌株發(fā)酵產(chǎn)生的含有殼聚糖酶的發(fā)酵液生產(chǎn)殼低聚糖的方法。將發(fā)酵粗酶液與大分子量殼聚糖溶液按1∶10-30的比例混合，在30℃-60℃的溫度下慢速攪拌3-10小時，根據(jù)產(chǎn)品的聚合度要求選擇不同的反應(yīng)時間，殼聚糖的平均分子量可以從50萬降解到一萬以下。Penicillium sp.的形態(tài)學(xué)

實(shí)施例11.菌種的育種采集土壤樣品，經(jīng)富集、純種分離得到多個菌株。以大分子量的殼聚糖作為唯一碳源進(jìn)行定向育種培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌種的產(chǎn)殼聚糖酶活性。經(jīng)過數(shù)代傳代、抗生素優(yōu)化和紫外線誘變之后，菌種的產(chǎn)殼聚糖酶活性得到了很大提高，以菌種降解殼聚糖的能力作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，篩選優(yōu)化獲得一株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高的菌株作為生產(chǎn)用菌株。發(fā)酵粗酶液的酶活力達(dá)到2.6U/mL。
Penicillium sp.該菌種保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2002年12月9日，保藏編號0851。
2.菌種的發(fā)酵取斜面保藏菌種一支，活化5小時之后，加入無菌水10ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液接入50ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為100rpm、30℃下培養(yǎng)40小時左右。將培養(yǎng)得到的菌懸液分為5份，分別接入50ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時至指數(shù)生長階段時，接入2L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)基與發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成如下初始pH值為5

發(fā)酵罐培養(yǎng)30小時后，在冰箱中4℃下保存發(fā)酵液二小時，然后在4000rpm離心后取上清液作為粗酶液，待用。
3.殼低聚糖的制備1)殼聚糖溶液配制將42萬分子量的殼聚糖樣品100g置于50L 2％的醋酸溶液中，用強(qiáng)力攪拌器攪拌，直至殼聚糖完全溶解為止。
2)殼低聚糖溶液制備配制將上述過程中獲得的粗酶液與大分子量殼聚糖溶液以1∶20的比例混合，在50℃的溫度下慢速攪拌5小時，用旋轉(zhuǎn)黏度計測定，黏度為2cp。
3)提取和純化將殼低聚糖溶液經(jīng)離子交換柱分離純化，去除陰、陽離子，真空濃縮到固含量達(dá)到10％時，待用。
4)采用蒸發(fā)量為5L/hr的噴霧干燥機(jī)，通過噴霧干燥，得到淡黃色粉末狀水溶性殼低聚糖產(chǎn)品。通過凝膠液相色譜測定，粘均分子量為2000，2-10個聚合度的殼寡聚糖的含量占33.6％。
實(shí)施例21.菌種的選育與實(shí)施例1相同。
2.取斜面保藏菌種3支，活化5小時之后，加入無菌水各10ml，洗下孢子。直接接入2L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。初始pH值為4.5，在通氣量0.05-0.1m3/hr的情況下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵74小時，當(dāng)菌種生長到達(dá)指數(shù)生長階段時停止發(fā)酵。
1.殼低聚糖的制備1)殼聚糖溶液配制將42萬分子量的殼聚糖樣品100g置于50L 2％的醋酸溶液中，用強(qiáng)力攪拌器攪拌，直至殼聚糖完全溶解為止。
2)殼低聚糖溶液制備配制將上述過程中獲得的粗酶液與大分子量殼聚糖溶液以1∶30的比例混合，在35℃的溫度下慢速攪拌2小時。
3)提取和純化將殼低聚糖溶液經(jīng)離子交換柱分離純化，去除陰、陽離子，真空濃縮到固含量達(dá)到6％時，待用。
4)采用蒸發(fā)量為5L/hr的噴霧干燥機(jī)，通過噴霧干燥，得到淡黃色粉末狀水溶性殼低聚糖產(chǎn)品。通過凝膠液相色譜測定，粘均分子量為9800。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株，其特征在于菌落為淡灰綠色，菌落形態(tài)部分埋伏氣生型，氣生菌絲為松絮狀菌絲體，營養(yǎng)菌絲為無色；菌絲有橫隔膜，分生孢子梗具有橫隔，光滑，，分生孢子梗頂端生有不對稱帚狀分枝，分生孢子為橢圓形。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株，其特征在于所說菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下殼聚糖5-40g/L、蛋白胨5-15g/L、尿素5-12g/L、KH2PO44-10g/L、(NH4)2SO46-12g/L。
3.一種高產(chǎn)殼聚糖酶真菌菌株的用途，其特征是用于發(fā)酵粗酶液降解殼聚糖制備殼低聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種高產(chǎn)殼聚糖酶真菌菌株的用途，其特征在于所說殼低聚糖的制備方法為1)將發(fā)酵粗酶液與大分子量殼聚糖溶液按1∶10-30的比例混合，在30℃-60℃的溫度下慢速攪拌3-10小時，殼聚糖的平均分子量降解到2-10個聚合度的殼寡糖。2)將殼低聚糖溶液經(jīng)離子交換色譜分離純化，去除陰、陽離子，真空濃縮到固含量達(dá)到2-25％時，通過噴霧干燥，得到淡黃色粉末狀水溶性殼低聚糖產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株及其用途。高產(chǎn)殼聚糖酶的真菌菌株的菌落為淡灰綠色，菌落形態(tài)部分埋伏氣生型，氣生菌絲為松絮狀，形狀為菌絲體，營養(yǎng)菌絲為無色；菌絲有橫隔膜，分生孢子梗具有橫隔，光滑，分生孢子梗頂端生有不對稱帚狀分枝，分生孢子為橢圓形。它用于發(fā)酵粗酶液降解殼聚糖制備殼低聚糖。從土壤里篩選的青霉屬菌株，再采用殼聚糖作為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)，以定向育種的方法誘導(dǎo)菌種產(chǎn)生產(chǎn)殼聚糖酶活性，并利用含有殼聚糖酶的發(fā)酵液制備不同分子量的殼低聚糖。此方法效率高，成本低，不污染環(huán)境，可以控制降解速率，獲得幾萬乃至幾個聚合度的殼低聚糖和寡聚糖產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/14GK1450162SQ02159880
公開日2003年10月22日 申請日期2002年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者鄭連英, 朱江峰 申請人:浙江大學(xué)