專利名稱：檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中的靶多核苷酸的方法，例如，通過監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)，優(yōu)選以定量方式監(jiān)測，還涉及用于所述方法的試劑盒。所述方法還適用于檢測序列特征，如多態(tài)性或等位變異，因此可用于診斷方法。
已知的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)監(jiān)測技術(shù)包括鏈特異性和一般性DNA嵌入技術(shù)，所述技術(shù)可用在少數(shù)幾種第二代PCR熱循環(huán)裝置上。
一般性熒光PCR方法使用DNA嵌入染料，所述染料在與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)具有增強(qiáng)了的熒光。在擴(kuò)增期間，由于DNA的總濃度提高而導(dǎo)致的熒光的增強(qiáng)，可用于衡量反應(yīng)的進(jìn)展，并用于確定起始靶分子拷貝數(shù)。另外，通過監(jiān)測熒光隨著溫度的受控制的改變而發(fā)生的變化，可以制備DNA解鏈曲線，例如，在PCR熱循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行。
所述一般性熒光PCR方法能監(jiān)測核酸總濃度的提高，而沒有任何時(shí)間補(bǔ)償?？梢栽诿恳淮畏磻?yīng)的相同的時(shí)間點(diǎn)上采集一個(gè)熒光讀數(shù)。終點(diǎn)解鏈曲線分析可用于從擴(kuò)增子中辨別偽跡，并且用于辨別擴(kuò)增子。可以在不能通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到的濃度下看到產(chǎn)物的峰。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，DNA解鏈曲線分析一般來說是優(yōu)化PCR熱循環(huán)的有效工具。通過確定擴(kuò)增子的解鏈溫度，可以在隨后的PCR循環(huán)中將變性溫度降低到所確定的解鏈溫度。優(yōu)化來自第一代反應(yīng)產(chǎn)物而不是基因組DNA的擴(kuò)增，減少了在隨后循環(huán)中出現(xiàn)的偽跡的形成。引物寡核苷酸及其互補(bǔ)體的解鏈溫度可用于確定它們的退火溫度，減少對經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化的需要。
不過，所述一般性嵌入方法只是準(zhǔn)鏈特異性的，因此，不太適用于需要鏈特異性檢測的場合。
熒光PCR鏈特異性方法使用其他核酸反應(yīng)成分監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。所述方法可以使用熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)作為檢測的基礎(chǔ)。通過熒光分子標(biāo)記一種或多種核酸探針，所述探針之一能夠起著能量供體的作用，而另一個(gè)是能量受體分子。有時(shí)候，上述分子分別被稱為報(bào)導(dǎo)分子和淬滅分子。所述供體分子用特殊波長的光線激發(fā)，在這種波長下，它通常會表現(xiàn)出熒光發(fā)射波長。所述受體分子是在所述發(fā)射波長下激發(fā)的，以便它能夠通過多種距離依賴性能量轉(zhuǎn)移機(jī)制接收所述供體分子的發(fā)射能量?？梢园l(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移的一種具體例子是熒光共振能量轉(zhuǎn)移或“FRET”。一般，當(dāng)受體分子靠近供體分子(例如，在相同或相鄰分子上)時(shí)，受體分子接收供體分子的發(fā)射能量。FET或FRET檢測的基礎(chǔ)，是監(jiān)測在供體反射波長下的變化。當(dāng)所述受體同樣是熒光分子時(shí)，還可以監(jiān)測受體發(fā)射波長。
存在兩種常用類型的FET或FRET探針，利用核酸探針的水解分離供體和受體的類型，以及利用雜交改變供體和受體分子的空間關(guān)系的類型。
水解探針是作為TaqManTM探針出售的。它包括DNA寡核苷酸，它是用供體和受體分子標(biāo)記過的。將所述探針設(shè)計(jì)成與PCR產(chǎn)物的一條鏈上的特定區(qū)域結(jié)合。在PCR產(chǎn)物與該鏈退火之后，Taq酶通過5’→3’聚合酶活性延伸所述DNA。Taq酶還具有5’→3’外切核酸酶活性。TaqManTM探針的3’末端是通過磷酸化進(jìn)行保護(hù)的，以防止它們啟動Taq延伸。如果TaqManTM探針與所述產(chǎn)物鏈雜交的話，延伸的Taq分子也能夠水解所述探針，從受體釋放所述供體，作為檢測的基礎(chǔ)。這種例子中的信號是累積性的，游離供體和受體分子的濃度隨著擴(kuò)增反應(yīng)的每一次循環(huán)而提高。
信號的產(chǎn)生取決于探針?biāo)夥磻?yīng)的出現(xiàn)這一事實(shí)，意味著存在與該方法相關(guān)的時(shí)間補(bǔ)償。另外，探針的存在可能打斷PCR過程的順利進(jìn)行。
另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，水解可能是非特異性的，特別是在需要大量的擴(kuò)增循環(huán)，例如超過50次循環(huán)的場合更是如此。在這種情況下，探針的非特異性水解會導(dǎo)致過分加強(qiáng)的信號。
這意味著所述技術(shù)與快速PCR方法不是非常兼容，隨著快速熱空氣熱循環(huán)儀，如由Idaho Technologies Inc.所提供的RapidCyclerTM和LightCyclerTM的開發(fā)，這一問題變得更為突出。例如，其他快速PCR裝置用于共同未決的英國專利號2334904中。與常規(guī)熱循環(huán)相比，快速循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)業(yè)已在其他文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)過。例如，所述技術(shù)特別適用于用于生物學(xué)競爭的檢測系統(tǒng)，其中，如果要避免生命損失或嚴(yán)重?fù)p傷的話，獲得結(jié)果的速度是重要的。
另外，水解探針不能提供有關(guān)解鏈滯后現(xiàn)象的大量信息，因?yàn)樾盘柈a(chǎn)生是通過，并且在很大程度上取決于探針的水解，而不是擴(kuò)增子或探針的解鏈溫度。
雜交探針是以多種形式提供的。分子信號是具有互補(bǔ)的5’和3’序列的寡核苷酸，以便它們形成發(fā)卡環(huán)。在形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)時(shí)，末端熒光標(biāo)記是非常接近的，以便發(fā)生FRET。在分子信號與互補(bǔ)序列雜交之后，分離熒光標(biāo)記，以便不發(fā)生FRET，并且它構(gòu)成了檢測的基礎(chǔ)。
還可以使用成對的標(biāo)記寡核苷酸。它們在PCR產(chǎn)物鏈上的非常接近的部位雜交，將供體和受體分子聚在一起，以便可以發(fā)生FRET。增強(qiáng)的FRET是檢測的基礎(chǔ)。這種類型的變化形式包括使用具有單一相鄰探針的標(biāo)記過的擴(kuò)增引物。
兩種探針或包括兩種標(biāo)記分子的分子信號類型的探針的使用，提高了相關(guān)方法的成本。另外，正如所公知的，該方法需要存在合理長度的已知序列，以便足夠長的兩個(gè)探針在非常接近的部位彼此特異性結(jié)合。這可能是某些診斷用途的問題，其中，一種生物體中的可用于設(shè)計(jì)有效探針的保守序列的長度可能相對短，如HIV病毒。
另外，成對的探針的使用涉及更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。例如，由探針解鏈所提供的信號受兩種探針解鏈的影響。小的錯(cuò)配的研究或需要探針之一以跨剪接區(qū)結(jié)合的場合(例如，檢測樣品中與DNA相比的RNA，其中，位于內(nèi)含子任一側(cè)的序列可以用作檢測位點(diǎn))，如果另一個(gè)探針首先解鏈的話，可能產(chǎn)生不正確的結(jié)果。
共同未決的國際申請?zhí)朩O99/28500披露了一種用于檢測特定靶核酸序列存在的方法，該方法包括a)將一種對所述序列特異的探針添加到所述樣品中，所述探針具有能夠給DNA雙鏈體結(jié)合試劑提供熒光或吸收來自它的熒光能量的部分，b)使所述混合物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，c)讓所述探針與所述靶序列雜交，并且檢測來自所述樣品的熒光。然后可以通過檢測所述樣品熒光的改變監(jiān)測所述反應(yīng)，因?yàn)樵谒龇磻?yīng)過程中熒光會發(fā)生改變，因?yàn)楫a(chǎn)生了更多的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物能夠與所述探針雜交，并且產(chǎn)生DNA雙鏈體結(jié)合試劑和探針上的熒光部分之間FET或FRET相互作用。
共同未決的國際專利申請?zhí)朠CT GB99/00504披露了一種用于檢測特定核酸序列存在的類似分析方法，該方法適用于對樣品中的靶序列的數(shù)量進(jìn)行定量。在該分析中，擴(kuò)增反應(yīng)是使用一套核苷酸實(shí)現(xiàn)的，其中的至少一種核苷酸是熒光標(biāo)記的。因此，在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入了熒光標(biāo)記。所述反應(yīng)是在存在一種探針的條件下進(jìn)行的，所述探針能與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并且，它包括能夠吸收來自所述熒光標(biāo)記過的核苷酸的熒光或向所述核苷酸提供熒光能量的反應(yīng)性分子。然后通過檢測所述樣品的熒光監(jiān)測該反應(yīng)，因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中，隨著更多產(chǎn)物的形成，熒光會發(fā)生改變，所述產(chǎn)物能與所述探針雜交，并且在它們之間產(chǎn)生FET或FRET相互作用。
國際專利申請?zhí)朩O01/11078披露了用于檢測樣品中靶核酸序列存在的另一種相關(guān)的方法。在本方法中，在第一階段，使所述靶序列成為單鏈形式，以便試劑的引物區(qū)能與它雜交。因此，它能啟動所述鏈的延伸，以便制備互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈包括標(biāo)記過的核苷酸，并且還具有它的5’末端上游的標(biāo)記過的探針區(qū)，它與產(chǎn)物的下游區(qū)互補(bǔ)。所述延伸階段一旦結(jié)束，在解鏈階段，所述產(chǎn)物與它的模板鏈分離，以便成為單鏈形式。在這種形式下，標(biāo)記過的探針區(qū)能夠纏繞在產(chǎn)物鏈的互補(bǔ)區(qū)上，并且與它雜交，以便所述標(biāo)記能夠通過FET或FRET向另一標(biāo)記提供熒光能量(供體)，因此改變了來自所述樣品的熒光。在所述反應(yīng)過程中監(jiān)測這種信號的改變，以便監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。
包括使用Scorpion探針系統(tǒng)的分析方法披露于以下文獻(xiàn)中GB2338301，和Nucleic Acids Research，2000，vol.28，no.19，3752-3761。所述Scorpion探針系統(tǒng)包括一個(gè)通過連接部分連接在探針部分上的引物部分。所述探針系統(tǒng)包括供體和受體部分。在該分析方法中，在第一階段，使靶序列成為單鏈形式，以便所述引物部分能夠與所述靶序列雜交。因此，可由此啟動所述鏈的延伸，以便產(chǎn)生一個(gè)互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈具有它的5’末端上游的探針部分，該部分與產(chǎn)物的下游區(qū)互補(bǔ)。所述延伸階段一旦結(jié)束，在解鏈階段，所述產(chǎn)物與它的模板鏈分離，并因此成為單鏈形式。在這種形式下，所述標(biāo)記過的探針區(qū)能夠纏繞在所述產(chǎn)物鏈的互補(bǔ)區(qū)上并且與它雜交。所述探針部分與所述產(chǎn)物的互補(bǔ)區(qū)的雜交，改變了供體和受體部分之間的空間關(guān)系，并因此改變了來自所述樣品的熒光信號。
本申請人業(yè)已發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)改進(jìn)的測定方法。
本發(fā)明提供了一種用于檢測靶核酸序列在樣品中的存在的方法，該方法包括在存在以下成分的條件下對所述樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增(a)DNA雙鏈體結(jié)合試劑，(b)核酸聚合酶，和(c)含有擴(kuò)增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學(xué)連接基團(tuán)與具有標(biāo)記的探針連接，所述標(biāo)記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交，并且，其中，所述標(biāo)記能夠吸收來自所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑的熒光能量或?yàn)樗鯠NA雙鏈體結(jié)合試劑提供熒光能量；以及監(jiān)測所述樣品的熒光。
與WO01/11078中的現(xiàn)有測定方法相比，本發(fā)明更便宜和簡單，而且效果出奇的好。在本發(fā)明中，以非結(jié)合狀態(tài)將DNA雙鏈體結(jié)合試劑添加到反應(yīng)混合物中，沒有必要結(jié)合在WO01/11078中的核苷酸上，或結(jié)合在GB2338301中的探針系統(tǒng)上。
在本發(fā)明的測定方法中，在第一階段，使靶序列成為單鏈形式，以便所述試劑的引物部分能夠與它雜交。這樣能夠啟動所述鏈的延伸，以便產(chǎn)生一條互補(bǔ)鏈。所述引物鏈也將具有在它的5’末端的上游的標(biāo)記過的探針區(qū)，該探針區(qū)與所述產(chǎn)物的下游區(qū)互補(bǔ)。DNA雙鏈體結(jié)合材料(優(yōu)選嵌入染料)將會夾帶在由此形成的雙鏈中。一旦延伸階段結(jié)束，所述產(chǎn)物就在解鏈階段與它的模板鏈分離，并因此形成單鏈形式。在這種形式下，標(biāo)記過的探針區(qū)能夠纏繞在產(chǎn)物鏈的互補(bǔ)區(qū)，并且與它雜交，因此將DNA雙鏈體結(jié)合試劑夾雜在產(chǎn)物鏈的探針區(qū)和互補(bǔ)區(qū)之間。由于DNA雙鏈體結(jié)合試劑和探針標(biāo)記相互靠近，所述熒光部分能夠通過FET或FRET向受體部分提供熒光能量(供體)，因此改變來自所述樣品的熒光信號?？梢栽诜磻?yīng)過程中監(jiān)測到這種信號變化，以便監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。
在擴(kuò)增的第二和隨后階段，所述產(chǎn)物鏈本身起著用于延伸的模板鏈的作用。不過，探針和引物之間的化學(xué)鍵能在與所述探針互補(bǔ)的序列產(chǎn)生之前終止延伸反應(yīng)。因此，所述探針區(qū)保持單鏈形式。
本發(fā)明的方法優(yōu)選包括(a)向被懷疑含有靶核酸序列的樣品中添加DNA雙鏈體結(jié)合試劑，核酸聚合酶和試劑；(b)使所述樣品處于引物與靶核酸序列雜交，并且形成包括所述探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的條件；
(c)使所述樣品處于標(biāo)記過的探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交的條件；和(d)在步驟(b)和(c)中的至少一個(gè)中監(jiān)測所述樣品的熒光。
如果需要，在擴(kuò)增反應(yīng)期間還可以存在沒有與標(biāo)記過的探針區(qū)結(jié)合的相應(yīng)的擴(kuò)增引物。該引物會導(dǎo)致常規(guī)未標(biāo)記過的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，該產(chǎn)物可用于介導(dǎo)信號進(jìn)入所使用的檢測器裝置的動態(tài)范圍。它還可以改善有可能因?yàn)閺?fù)合的探針/引物結(jié)構(gòu)的存在而受到不利影響的反應(yīng)效率。
當(dāng)能夠從供體標(biāo)記中吸收熒光的受體標(biāo)記發(fā)揮這種作用時(shí)，來自所述供體的熒光減弱。可以檢測這種減弱，并且它表明了所述探針區(qū)的結(jié)合。
最優(yōu)選所述能吸收熒光的標(biāo)記(受體)本身是熒光分子，它能在特征性波長下發(fā)射熒光。所述探針包括羅丹明染料或Cy5。在這種場合下，來自受體分子的熒光(它的波長與供體標(biāo)記的波長不同)的增強(qiáng)，也表明了探針的結(jié)合。另外，所述受體不能發(fā)出熒光(暗受體)。這樣的受體包括DABCYL，甲基紅，QSY-7二芳基羅丹明染料和6-(二甲基氨基)-2-[4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1，3-丁間二烯基-1-乙基喹啉鎓高氯酸鹽(CAS號181885-68-7)。
所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑優(yōu)選包括一種供體標(biāo)記，并且所述受體標(biāo)記提供在所述探針上。在這種情況下，并且如果受體發(fā)出熒光的話，所述標(biāo)記過的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在就可以通過監(jiān)測由探針上的受體分子發(fā)出的熒光而進(jìn)行檢測，所述探針主要結(jié)合在相同產(chǎn)物鏈的下游區(qū)。在這種情況下，可以分辨來自擴(kuò)增產(chǎn)物的信號和熒光標(biāo)記的本底信號，以及來自任何非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的信號。另外，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑可以包括一種受體標(biāo)記，而所述探針包括所述供體標(biāo)記。
在本發(fā)明的系統(tǒng)中，可以區(qū)別總體嵌入劑信號(如在擴(kuò)增DNA時(shí))和序列特異性信號的增強(qiáng)，所述信號特異性信號僅在兩種熒光部分緊密靠近時(shí)(即當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交時(shí))產(chǎn)生。所述序列特異性信號只能通過標(biāo)記過的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生這一事實(shí)表明，該系統(tǒng)在檢測含有大量本底DNA的反應(yīng)混合物中的特異性靶序列方面是高度特異的。這是因?yàn)榉翘禺愋詳U(kuò)增產(chǎn)物不能與探針區(qū)雜交，并因此不能產(chǎn)生所述檢測信號。除了所述序列特異性信號之外，一般的嵌入劑信號的測定可以是有利的。一般的嵌入劑信號與反應(yīng)混合物中的擴(kuò)增程度成正比，因此可用于表明擴(kuò)增的效力或阻斷。
可以用廉價(jià)試劑進(jìn)行這種性質(zhì)的測定。單一的標(biāo)記探針比包括受體和供體分子的探針更經(jīng)濟(jì)。
擴(kuò)增優(yōu)選是用已知擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，鏈置換測定(SDA)或NASBA，不過優(yōu)選PCR。
監(jiān)測供體和受體部分的熒光，并且計(jì)算它們的發(fā)射之間的關(guān)系。
所述標(biāo)記在探針上的位置是不重要的，不過它通常位于探針的末端區(qū)。在所述試劑中可以使用一種以上標(biāo)記，不過優(yōu)選一種標(biāo)記，因?yàn)楦?jīng)濟(jì)一些。
為了進(jìn)行FET，如FRET，所述供體部分的熒光發(fā)射的波長必須短于受體部分的波長。
因此，在下面的表1中列舉了合適的組合
*由Molecular Probes，UK提供。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，很多其他類似的組合是可能的。
被用作供體和/或受體的分子，優(yōu)選能產(chǎn)生尖銳的發(fā)射峰，并且在發(fā)射的波長上少有或沒有重疊。在這種條件下，可能不需要從通過擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的信號中分辨“鏈特異性峰”。只是簡單地測定鏈特異性信號(即由受體部分提供的信號)，就能夠提供有關(guān)通過所述靶反應(yīng)導(dǎo)致的FET或FRET的程度的信息。
不過，來自供體和受體部分的熒光信號存在光譜的重疊，在所述結(jié)果中證明了這一點(diǎn)，例如，通過憑經(jīng)驗(yàn)確定所述光譜之間的關(guān)系，并且利用這種關(guān)系對來自兩種信號的信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
將所述標(biāo)記過的探針與引物分開的化學(xué)鍵優(yōu)選是任何能連接核苷酸序列的分子，不過所述核苷酸序列不能被DNA聚合酶識別。可以獲得多種能滿足這種要求的化學(xué)接頭。
例如，在WO 95/08642中披露了可用于形成接頭的化合物和反應(yīng)的類型的例子。具體地講，所述化學(xué)接頭包括將兩個(gè)多核苷酸序列、引物和探針連接在一起的一組原子。所述接頭可以通過任何常規(guī)方法連接相應(yīng)的多核苷酸序列。
一般來說，所述接頭來自具有第一和第二官能團(tuán)的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，通過這種方式，它可以分別結(jié)合于探針和引物序列，或結(jié)合于各個(gè)核苷酸，然后再從核苷酸產(chǎn)生所述探針和引物序列。所述接頭通常被設(shè)計(jì)成不能結(jié)合核苷酸。
例如，接頭的合成詳細(xì)披露于以下文獻(xiàn)中S.Agrawal等，NucleicAcids Research，1986，14，6227和WO88/02004(AppliedBiosystems)；J.L.Ruth和D.E.Bergstrom，J.Org.Chem.，1978，43，2870；D.E.Bergstrom和M.K.Ogawa，J.Amer.Chem.Soc.，1978，10，8106；和C.F.Bigge，P.Kalaritis，J.R.Deck和M.P.Mertes，J.Amer.Chem.Soc.，1980，102，2033；和歐洲專利申請?zhí)?63,879。有關(guān)具有連接探針和引物的化學(xué)連接基團(tuán)的試劑的結(jié)構(gòu)和合成的更詳細(xì)的說明，讀者還可以參見國際專利申請?zhí)朩O01/11078。
具體地講，所述接頭包括多種形式的乙二醇，例如六乙二醇(HEG)。所述接頭可以具有以下結(jié)構(gòu)-(CHOH-CHOH)n-，其中，n是大于1的整數(shù)，例如1-10，并且優(yōu)選6。
所述包括連接探針和引物的接頭基團(tuán)的試劑可以從OswelResearch Products Ltd，UK獲得。
本發(fā)明方法的用途是多種多樣的。正如在下文將要更詳細(xì)地討論的，所述方法可用于產(chǎn)生有關(guān)所述樣品中的靶核酸序列的定量和定性結(jié)果。更具體地講，本發(fā)明不僅提供了定量擴(kuò)增，而且，作為補(bǔ)充或替代，它還可用于獲得特征性數(shù)據(jù)，如雙鏈脫穩(wěn)定化溫度或解鏈溫度。
在本發(fā)明的方法中，所述標(biāo)記過的探針與擴(kuò)增引物整合，并且在擴(kuò)增反應(yīng)過程中一直存在。所述方法使得檢測能夠以均一的方式進(jìn)行，就是說，擴(kuò)增和監(jiān)測可以在一個(gè)容器中進(jìn)行，所有試劑都是最初添加的。不需要隨后的添加試劑的步驟。還可將本發(fā)明的方法用于某些非均一系統(tǒng)中。應(yīng)當(dāng)指出的是，沒有必要在存在固體支持物的情況下實(shí)施所述方法(盡管這也是選擇方案之一，正如下面將要進(jìn)一步討論的)。
由于在整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中都存在探針，所述熒光信號使得可以監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。這可以提供對存在于樣品中的靶序列進(jìn)行定量的手段。
如果使用熒光受體部分的話，在擴(kuò)增反應(yīng)的每一次循環(huán)期間，含有靶序列和探針區(qū)的擴(kuò)增子鏈能產(chǎn)生受體信號。隨著樣品中所述擴(kuò)增子數(shù)量的增加，受體的信號也會增強(qiáng)。通過將增強(qiáng)速度隨循環(huán)進(jìn)行作圖，可以確定所述增強(qiáng)的起始點(diǎn)。
所述標(biāo)記過的探針可以包括核酸分子，如DNA或RNA，它能夠與單鏈形式的靶核酸序列雜交。在這種情況下，將使用的條件使得靶核酸序列成為單鏈形式。另外，所述探針可以包括諸如肽核酸或其他核酸類似物的分子，它還能結(jié)合雙鏈形式的靶序列。
具體地講，所使用的擴(kuò)增反應(yīng)包括讓所述樣品處于使樣品中所存在的所有靶核酸序列成為單鏈形式的條件，如PCR或LCR的步驟。如果滿足合適的雜交條件，在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，所述探針區(qū)就能夠與含有它的擴(kuò)增子鏈的下游區(qū)雜交。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)所述探針，以便在擴(kuò)增反應(yīng)的每一次循環(huán)期間滿足所述條件。因此，在擴(kuò)增反應(yīng)的每一次循環(huán)的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，所述探針能與靶序列雜交，并且由于FET或FRET而產(chǎn)生信號。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，所述探針區(qū)將會分離或者從所述下游區(qū)解鏈，因此，由所述受體標(biāo)記發(fā)生的信號，將會根據(jù)它是含有供體還是受體分子而減弱或增強(qiáng)。例如，當(dāng)它是受體時(shí)，在擴(kuò)增的每一次循環(huán)中，都產(chǎn)生了來自受體標(biāo)記的熒光峰。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，所述峰的強(qiáng)度會增強(qiáng)，因?yàn)橛懈嗟陌ㄌ结樀臄U(kuò)增子鏈可以利用。
通過在每一次循環(huán)期間監(jiān)測來自樣品的受體標(biāo)記的熒光，可以用多種方式監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。例如，通過計(jì)算解鏈峰下面的面積，并且將該數(shù)據(jù)對循環(huán)次數(shù)作圖，可以分析由解鏈峰提供的數(shù)據(jù)。
熒光優(yōu)選是用已知熒光計(jì)監(jiān)測的。來自它的信號，例如，光學(xué)放大器電壓形式的信號，被傳送給數(shù)據(jù)處理器板，并且轉(zhuǎn)化成與每一個(gè)樣品試管相關(guān)的光譜?？梢酝瑫r(shí)評估多個(gè)試管，例如96個(gè)試管。在反應(yīng)過程中，能夠以頻繁的間隔，例如每10毫秒1次地收集數(shù)據(jù)。
例如，以這種方式產(chǎn)生的光譜可以使用預(yù)先選擇的諸如染料的熒光部分的″fits″進(jìn)行分辨，以便形成代表每一種發(fā)出信號的部分的峰(即DNA雙鏈體結(jié)合試劑和/或探針標(biāo)記)?？梢源_定所述峰下面的面積，該面積表示每一種信號的強(qiáng)度值，并且，如果必要的話，作為彼此的商數(shù)形式表示。信號強(qiáng)度和/或比例的差別，使得FET或FRET的變化可以通過反應(yīng)或不同的反應(yīng)條件，如溫度而記錄。上文所述的變化與探針和靶序列之間的結(jié)合現(xiàn)象相關(guān)。不同的峰下面的面積的積分，可以計(jì)算出FET或FRET作用的強(qiáng)度值。
以上數(shù)據(jù)提供了一種對存在于樣品中的靶核酸的量進(jìn)行定量的方法。
引物/標(biāo)記過的探針試劑在溶液中可以是游離的或者固定在固體支持物上，例如固定在用于分離產(chǎn)品的磁珠的珠表面上，或者固定在檢測器裝置的表面上，如表面等離子共振檢測器的波導(dǎo)管，和例如，DNA陣列。其選擇取決于要檢驗(yàn)的特定陣列的性質(zhì)和所采用的特定檢測方法。
可以對探針進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便它能被用于擴(kuò)增反應(yīng)中的DNA聚合酶水解，以便釋放受體分子。由此提供了一種累計(jì)性信號，存在于該系統(tǒng)中的游離探針標(biāo)記的量隨著每一次循環(huán)而加強(qiáng)。不過，在本測定方法中，所述探針沒有必要以這種方式使用，因?yàn)樗鲂盘柌蝗Q于所述探針的水解。
優(yōu)選對所述探針進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便它能從靶序列上完整地釋放下來，并且，在擴(kuò)增反應(yīng)期間，如果滿足了合適的雜交條件，它能夠再次結(jié)合。例如，這可能發(fā)生在擴(kuò)增反應(yīng)的延伸階段。不過，由于所述信號不依賴于探針?biāo)?，可以將所述探針設(shè)計(jì)成能在擴(kuò)增循環(huán)的任何階段與靶序列雜交并且從靶序列上解鏈。具體地講，優(yōu)選將所述探針設(shè)計(jì)成在低于該反應(yīng)的延伸溫度的溫度下雜交，因?yàn)檫@樣能確保對擴(kuò)增反應(yīng)的干擾最小。
這樣提供了一種完全可逆的信號，該信號直接與在所述反應(yīng)的每一階段存在的擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量相關(guān)。另外，當(dāng)反應(yīng)速度是最重要的時(shí)候是有利的，例如，在快速PCR中，因?yàn)橐獧z測的與擴(kuò)增子鏈整合在一起的探針能夠與它快速雜交。
以這種方式產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠以各種方式解讀。在它的最簡單的形式下，在擴(kuò)增反應(yīng)過程中或在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)受體分子熒光的增強(qiáng)是存在的靶序列數(shù)量增加的指標(biāo)，表明擴(kuò)增反應(yīng)業(yè)已進(jìn)行的事實(shí)，因此，所述靶序列確實(shí)存在于所述樣品中。不過，正如上文所述，還可以通過監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程進(jìn)行定量。最后，可以獲得表征數(shù)據(jù)，并且，特別是在解鏈溫度分析中，作為終點(diǎn)測定或進(jìn)程測定，以便獲得有關(guān)所述序列的信號，正如下面將要進(jìn)一步討論的。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案包括一種用于檢測核酸擴(kuò)增的方法，包括在存在以下成分的條件下對靶多核苷酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增(a)核酸聚合酶，(b)DNA雙鏈體結(jié)合試劑，和(c)含有擴(kuò)增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學(xué)連接基團(tuán)與具有第二種標(biāo)記的探針連接，所述標(biāo)記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交，并且，其中，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑或第二種標(biāo)記中的一個(gè)包括一種供體標(biāo)記，該標(biāo)記能夠給所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑或第二種標(biāo)記中的另一個(gè)提供熒光能量，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑或第二種標(biāo)記中的另一個(gè)包括一種能吸收來自所述供體分子的熒光能量的受體標(biāo)記，所述引物能夠與所述靶多核苷酸雜交；并且在擴(kuò)增過程中監(jiān)測熒光的變化。
所述受體標(biāo)記本身優(yōu)選是熒光標(biāo)記，并且能在特征性波長下發(fā)射熒光能量。所述擴(kuò)增優(yōu)選是用一對引物進(jìn)行的，所述引物是設(shè)計(jì)過的，以便只有DNA鏈上的靶核苷酸序列被擴(kuò)增，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。所述核酸聚合酶優(yōu)選是熱穩(wěn)定性聚合酶，如Taq聚合酶。
實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)的合適條件為本領(lǐng)域所熟知。在每一種情況下，最佳條件可以根據(jù)涉及到的特定擴(kuò)增子、所使用的引物的性質(zhì)和所使用的酶而改變。在每一種情況下，最佳條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。典型的變性溫度為95℃的數(shù)量級，典型的退火溫度為55℃的數(shù)量級，而延伸溫度為72℃的數(shù)量級。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，可以用標(biāo)記過的探針定量RNA轉(zhuǎn)錄物，例如，在表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，可將其用于藥物發(fā)現(xiàn)。具體地講，本實(shí)施方案適合在來自真核生物的組織中進(jìn)行表達(dá)研究。真核細(xì)胞中編碼蛋白的DNA可以包括內(nèi)含子，DNA序列的非編碼區(qū)，以及編碼蛋白序列的外顯子。在細(xì)胞“剪接”過程中，將非編碼內(nèi)含子序列從源于DNA序列的RNA序列上去掉。PCR引物通常靶定編碼區(qū)，并且，在將逆轉(zhuǎn)錄酶PCR用于總核酸提取物時(shí)，產(chǎn)物將來自DNA依賴型擴(kuò)增和RNA依賴型擴(kuò)增。因此，在用于表達(dá)研究時(shí)，PCR本身包括來自基因組DNA和表達(dá)的RNA的擴(kuò)增。
被設(shè)計(jì)用于跨編碼外顯子的相鄰末端區(qū)上的內(nèi)顯子結(jié)合的標(biāo)記過的探針因?yàn)樗鰞?nèi)含子而具有有限的相互作用。剪接過的RNA業(yè)已除去了所述區(qū)，因?yàn)榫幋a外顯子的相鄰的末端區(qū)構(gòu)成了一個(gè)連續(xù)序列，使得它能夠有效結(jié)合所述所述探針區(qū)。
相反，如果被設(shè)計(jì)成能結(jié)合內(nèi)含子區(qū)，所述探針區(qū)只能檢測基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。由這樣的探針發(fā)生的信號，只與DNA濃度相關(guān)，而與樣品的RNA濃度無關(guān)。還可以使用兩種試劑，每一種試劑具有不同的探針和引物，一種試劑適用于RNA的剪接區(qū)，而另一種試劑適用于DNA中的內(nèi)含子。
因此，在另一種實(shí)施方案中，所述探針區(qū)對于RNA的剪接區(qū)或DNA中的內(nèi)含子是特異的，這樣，只檢測和/或定量擴(kuò)增的RNA或擴(kuò)增的DNA中的一種。
作為替代或補(bǔ)充，本發(fā)明的方法可用于確定序列特征的雜交測定。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定靶核酸序列特征的方法，該方法包括(a)在存在DNA雙鏈體結(jié)合試劑和一種包括擴(kuò)增引物的試劑的條件下擴(kuò)增所述序列，所述引物的5’末端通過化學(xué)鍵與一種探針連接，所述探針包括相似于所述靶序列的一個(gè)區(qū)域的序列，并且它還包括一種標(biāo)記，當(dāng)所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑和所述標(biāo)記中的一個(gè)是供體標(biāo)記，而其中的另一個(gè)是受體標(biāo)記時(shí)，所述供體標(biāo)記能夠向所述受體標(biāo)記提供熒光能量；以便形成摻入了探針區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)讓擴(kuò)增產(chǎn)物處于使它的探針區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物的互補(bǔ)區(qū)雜交的條件，和(c)監(jiān)測所述樣品的熒光，并且確定特定的反應(yīng)條件，所述序列的特征，在所述條件下，由于探針區(qū)與樣品的雜交或在探針區(qū)和靶核酸序列之間形成的雙鏈體的脫穩(wěn)定化而導(dǎo)致熒光變化。
合適的反應(yīng)條件包括溫度，電化學(xué)條件，或?qū)μ囟富蚧瘜W(xué)物質(zhì)的存在的反應(yīng)。通過監(jiān)測當(dāng)所述特性改變時(shí)熒光的變化，可以獲得所述序列精確性質(zhì)的特有信息。例如，對于溫度來說，可以確定由于加熱而導(dǎo)致的樣品中的探針與所述序列分發(fā)生分離的溫度。例如，在檢測以及在遺傳診斷中需要定量多態(tài)性和/或等位變異時(shí)是極其有用的?！岸鄳B(tài)性”包括轉(zhuǎn)換，顛換，插入，缺失或倒位，這種現(xiàn)象可能發(fā)生在序列上，特別是自然出現(xiàn)的。
如果靶序列僅有一個(gè)堿基對的差別的話，解鏈的滯后將是不同的。因此，舉例來說，當(dāng)一種樣品只包括一種等位變體時(shí)，所述探針區(qū)的解鏈溫度是特別有價(jià)值的，這一溫度不同于在僅含有另一種等位變體的樣品中的溫度。含有兩種等位變體的樣品具有相當(dāng)于每一種等位變體的兩個(gè)解鏈點(diǎn)。
因此，在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測多態(tài)性和/或等位變異的方法，所述方法包括用本發(fā)明的方法擴(kuò)增被懷疑含有所述多態(tài)性或變異的序列，用所產(chǎn)生的熒光信號測定探針區(qū)從擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列上解鏈的溫度，并且將這種信號與多態(tài)性或等位變異的存在相聯(lián)系。
類似的考慮適用于相應(yīng)的電化學(xué)特征，或用于某些酶或化學(xué)物質(zhì)的存在?？梢詫?biāo)記過的探針固定在固體表面上，在該表面上可以施加電化學(xué)電位。根據(jù)序列的確切性質(zhì)，在特定電化學(xué)值下，下游靶序列能夠結(jié)合在所述探針上或者從所述探針排斥。
另外，探針雜交的動力學(xué)能夠以絕對值形式確定靶序列濃度。根據(jù)來自所述樣品的熒光變化，可以計(jì)算探針區(qū)與樣品的雜交速度。雜交速度的增加與樣品中所存在的靶序列的數(shù)量相關(guān)。隨著靶序列的濃度因?yàn)閿U(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行而提高，探針區(qū)的雜交將更快地進(jìn)行。因此，該參數(shù)還可被用作定量的基礎(chǔ)。這種數(shù)據(jù)處理方式是有用的，因?yàn)樗恢苯右蕾囉谛盘枏?qiáng)度而提供信息。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了一種用于本發(fā)明方法中的試劑盒，該試劑盒包括一種含有擴(kuò)增引物的試劑，引物的5’末端通過化學(xué)鍵與對靶核苷酸序列特異的探針連接，其中，所述探針包括第一種標(biāo)記，它可以起著供體或受體標(biāo)記的作用；以及包括第二種標(biāo)記的DNA嵌入試劑，所述第二種標(biāo)記起著供體或受體標(biāo)記的作用，其中，所述第一和第二種標(biāo)記構(gòu)成了供體-受體對。
如果必要的話，可以將所述探針固定在諸如磁珠的支持物上，或用于檢測器的支持物上，如消散性波檢測器裝置的波導(dǎo)管。所述試劑盒的其他可能在的成分，包括用于擴(kuò)增反應(yīng)的試劑，如DNA聚合酶。
非熒光受體分子的使用，還可用于披露于共同未決的國際專利申請?zhí)朠CT/GB99/09054中的測定方法中。
下面將結(jié)合附圖，以舉例形式對本發(fā)明作具體說明，其中

圖1示意性地表示在本發(fā)明方法中發(fā)生的分子相互作用。
圖2表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖3表示用比較性現(xiàn)有技術(shù)的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖4表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖5表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的腦膜炎基因的腦膜炎系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖6表示用比較性現(xiàn)有技術(shù)方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的腦膜炎基因的腦膜炎系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖7表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的腦膜炎基因的腦膜炎系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖8表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度衣原體基因的衣原體系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖9表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的衣原體基因的衣原體系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖10表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的修飾基因的遺傳修飾過的大豆系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。和圖11表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的修飾基因的GM大豆系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。
圖1示意性地表示在本發(fā)明方法中發(fā)生的分子相互作用。在所示出的擴(kuò)增反應(yīng)中，制備了DNA分子(1)，以便通過讓它與成對的擴(kuò)增引物(2)，(3)接觸進(jìn)行擴(kuò)增。通過化學(xué)鍵(8)將引物之一(2)與包括受體標(biāo)記(7)的探針(6)連接。在反應(yīng)混合物中提供熒光供體成分(10)。
使DNA分子(1)成為單鏈形式(圖1B)，以便在擴(kuò)增反應(yīng)中，引物(2，3)分別作為正向和反向引物結(jié)合，正如眾所周知的。
在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)過程中，積累了擴(kuò)增子產(chǎn)物(9)(圖1C)。
在隨后的擴(kuò)增階段，當(dāng)該產(chǎn)物解鏈時(shí)，探針區(qū)(6)包括一個(gè)結(jié)合擴(kuò)增子鏈中的互補(bǔ)區(qū)的受體標(biāo)記(7)。嵌入劑部分(10)被夾雜在探針和所述產(chǎn)物之間。熒光嵌入劑部分(10)和受體標(biāo)記(7)之間的FRET相互作用，在所述受體的特有波長下產(chǎn)生了一種信號。
然后可以用常規(guī)熒光檢測裝置監(jiān)測來自受體分子(7)的信號。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，對于本發(fā)明來說，使用第二種引物(3)不是必要的。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，所述探針上的標(biāo)記可以是供體標(biāo)記，而所述嵌入劑部分可以是受體標(biāo)記。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)制備了含有具有工作濃度的以下試劑的PCR反應(yīng)混合物。
其組成是50mM Trizma pH8.8，25℃，3mM氯化鎂，8％w/Vol.甘油，250ng/μl非乙?；Ｑ灏椎鞍?，200μM dNTP′s PCR核苷酸，0.01單位/μl尿嘧啶-n-糖基化酶，0.04單位/μl Taq(外切5′-3′缺陷型)DNA聚合酶和0.0 3μM抗TaqStart抗-Taq抗體。
在添加到所述混合物中之前，將Taq DNA聚合酶和TaqStart抗-Taq抗體一起溫育10分鐘。
作為熒光供體標(biāo)記，將SYBRGold添加到反應(yīng)混合物中，最終濃度為參考溶液的1∶20,000-1∶200,000的稀釋度。
使用Taq DNA聚合酶以便確保所述試劑在反應(yīng)過程中不會被水解。發(fā)現(xiàn)這種聚合酶的使用不是必須的，因?yàn)樵诒景l(fā)明的方法中使用了非常短的保持時(shí)間。
靶模板研究了若干種靶模板和相關(guān)的基因。下面列舉了這些靶模板的基因。
靶模板基因人胎盤DNA ABI人β-肌動蛋白擴(kuò)增子大豆 Le1凝集素遺傳修飾過的大豆 CP4 EPSPS腦膜炎萘瑟氏菌PorA沙眼衣原體Ct質(zhì)粒為每一種靶基因制備了包括探針和引物的常規(guī)新型寡核苷酸試劑。每一種試劑具有以下一般性結(jié)構(gòu)FL-PROBE-HEG-PRIMER，其中，F(xiàn)L是熒光部分，PROBE是探針序列，HEG是HEG(六乙二醇)，而PRIMER是引物序列，它能與合適的靶序列雜交。所述試劑可以從OswelResearch Products Ltd.，UK獲得。用于本發(fā)明方法中具有相同的一般性結(jié)構(gòu)的試劑可以按照WO01/11078中披露的方法制備。
下面列舉了相應(yīng)于每一種基因的試劑的結(jié)構(gòu)基因試劑結(jié)構(gòu)肌動蛋白$atgccctcccccatgccatcctgcgt*cagcggaaccgctcattgccaatgg (Seq No.1)凝集素 $tgccttctttctcgcaccaattgaca*cctgcatgtgtttgtggctt (seq.No.2)CP4 $ccttcatgttcggcggtctcgc*atgcgcgtttcaccgct (Seq.No.3)PorA$tcagcqgcagcgtccaattcg*acttgctgttttgggccg (Seq.No.4)PorA$ccaaacgcacttccgccatog*tcagccaagogccagac (Seq.No.5)Ct $tatgcttacacatttatcgactqggtgattacagc*ttttcgtctctttttcgcagc (Seq.No.6)$-5′Cy5標(biāo)記*-HEG連接基團(tuán)根據(jù)需要，改變要檢測的基因序列的濃度。所述試劑的最終濃度為0.2μM。
通過使用類似的TaqmanTM測定方法和WO99/28500的方法重復(fù)所述實(shí)驗(yàn)，比較本發(fā)明方法和現(xiàn)有方法的性能。
熱循環(huán)實(shí)時(shí)PCR容器和消耗品是從Roche公司獲得的。用常規(guī)技術(shù)對該儀器進(jìn)行校正。發(fā)現(xiàn)用特定產(chǎn)品和SYBRGold運(yùn)行顏色校正程序是非常有利的。還發(fā)現(xiàn)用Cy5運(yùn)行顏色校正程序是有利的。
熱循環(huán)方案如下對于本發(fā)明的方法和WO99/28500的方法來說50℃，保持1分鐘，以便進(jìn)行抑制95℃，保持1分鐘，以便開始變性50輪(95℃，5秒；60℃，5秒；74℃5秒，5秒延伸，收集熒光)對于TaqmanTM來說50℃，保持1分鐘，以便進(jìn)行抑制95℃，保持1分鐘，以便開始變性50輪(95℃，5秒；60℃，20-120秒；在步驟結(jié)束時(shí)收集熒光)以上結(jié)果表明，本發(fā)明的方法明顯快于使用現(xiàn)有TaqmanTM分析的方法。
所述熱循環(huán)PCR儀使用3個(gè)檢測器，它們是F1，F(xiàn)2和F3。F1在520nm波長下工作，優(yōu)化而檢測SYBRGold和熒光素的發(fā)射。F2在640nm波長下工作，優(yōu)化而檢測LC640產(chǎn)生的信號。F3在705nm波長下工作，優(yōu)化而與LC705一起使用。
F1(520nm/熒光素)光學(xué)檢測器，被用于檢測由SYBRGold嵌入染料所產(chǎn)生的非鏈特異性擴(kuò)增信號。F3(705nm/LC705染料)光學(xué)檢測器被用于使用由探針的Cy5部分產(chǎn)生的信號檢測特異產(chǎn)物的擴(kuò)增。所述探針系統(tǒng)使用Cy5，而不是LC705，因?yàn)檫@樣在寡核苷酸合成期間能產(chǎn)生更好的結(jié)合染料。
實(shí)施例1-β-激動蛋白基因的檢測和定量圖2表示通過F3檢測器測定的熒光，它是用本發(fā)明的方法作為各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)形式測定的。每一組數(shù)據(jù)表示特定循環(huán)次數(shù)的低水平的本底反應(yīng)，它取決于所述樣品內(nèi)的DNA濃度。在每一組數(shù)據(jù)內(nèi)，所觀察到的熒光在某些循環(huán)次數(shù)下顯著增強(qiáng)，這取決于樣品中人DNA的濃度。熒光是通過結(jié)合于引物下游的擴(kuò)增產(chǎn)物的所述試劑的探針部分產(chǎn)生的。這一結(jié)合過程使Cy5部分靠近了SYBRGold。SYBRGold發(fā)出熒光，所發(fā)射的光線被Cy5部分吸收。然后，Cy5本身發(fā)射光線，由F3檢測器檢測所發(fā)出的光線。隨著循環(huán)次數(shù)的進(jìn)一步增加，熒光達(dá)到最大值，然后緩慢減弱。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由于所述探針部分被擴(kuò)增產(chǎn)物所取代(通常稱之為“鉤子效應(yīng)”，這種現(xiàn)象還出現(xiàn)在雙雜交探針報(bào)導(dǎo)化學(xué)中)而導(dǎo)致的。
對圖2A的數(shù)據(jù)組進(jìn)行分析，產(chǎn)生了圖2B所示的定量曲線。所述曲線的相關(guān)系數(shù)接近1.0，這表明本發(fā)明的方法在核酸序列的定量和鑒定方面是很出色的。
圖3表示用WO99/28500的測定方法獲得的β-肌動蛋白基因的比較數(shù)據(jù)。圖3A表示以循環(huán)次數(shù)的函數(shù)形式測定的熒光。對于β-肌動蛋白系統(tǒng)來說，是作為DNA濃度的函數(shù)形式測定的。通過現(xiàn)有系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)的噪音，比通過本發(fā)明方法獲得的數(shù)據(jù)的噪音更高。另外，使用本發(fā)明的方法，反應(yīng)梯度更陡，并且使用本發(fā)明的方法，循環(huán)閾值同樣略低一些。通過比較圖2B和3B證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。
圖4表示用現(xiàn)有方法通過TaqmanTM測定獲得的比較數(shù)據(jù)。與本發(fā)明的曲線相比，其反應(yīng)曲線相對矮一些。此外，與本發(fā)明的方法相比，TaqmanTM方法非常慢。
實(shí)施例2-porA基因的鑒定和定量圖5表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的作為各種濃度的人DNA的腦膜炎系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)的熒光。所示出的數(shù)據(jù)使用了具有Seq.No.5的結(jié)構(gòu)的試劑。每一組數(shù)據(jù)表示特定循環(huán)次數(shù)的低水平的本底反應(yīng)，取決于樣品內(nèi)DNA的濃度。在每一組數(shù)據(jù)中，觀察到的熒光在特定循環(huán)次數(shù)下急劇增強(qiáng)，這取決于樣品中人DNA的濃度。
圖6表示用WO99/28500的測定方法獲得的porA基因的比較數(shù)據(jù)。
圖7表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法獲得的比較數(shù)據(jù)。同樣，與本發(fā)明的曲線相比，所述反應(yīng)曲線較矮。另外，與本發(fā)明的方法相比，TaqmanTM方法非常緩慢。與本發(fā)明的方法相比，TaqmanTM反應(yīng)曲線的噪音較大，并且由所述數(shù)據(jù)產(chǎn)生的定量曲線產(chǎn)生了更低的相關(guān)系數(shù)。
實(shí)施例3-Ct質(zhì)粒DNA的鑒定和定量圖8表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的作為各種濃度的人DNA的衣原體系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)的熒光。每一組數(shù)據(jù)表示特定循環(huán)次數(shù)的低水平本底反應(yīng)，取決于樣品內(nèi)DNA的濃度。在每一組數(shù)據(jù)中，觀察到的熒光在特定循環(huán)次數(shù)下急劇增強(qiáng)，這取決于樣品中人DNA的濃度。
圖9表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法獲得的數(shù)據(jù)。同樣，與本發(fā)明的方法相比，TaqmanTM方法非常緩慢。
實(shí)施例4-CP4 EPSPS基因的鑒定和定量圖10表示用本發(fā)明的方法通過F3檢測器測定的作為各種濃度修飾基因的遺傳修飾過的大豆系統(tǒng)的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)的熒光。該圖還示出了由lect系統(tǒng)產(chǎn)生的熒光。它是各種濃度的所述修飾基因的循環(huán)次數(shù)的函數(shù)。在每一組數(shù)據(jù)中，所觀察到的熒光在特定循環(huán)次數(shù)下急劇增強(qiáng)，這取決于樣品中相關(guān)基因的濃度。所述lect系統(tǒng)可有效用作對照，正如所預(yù)料的，熒光和循環(huán)次數(shù)的反應(yīng)曲線實(shí)際上不取決于所述修飾基因的濃度。對于修飾基因系統(tǒng)來說，可以看出的是，修飾基因濃度的提高導(dǎo)致了熒光急劇增強(qiáng)所需要的循環(huán)次數(shù)的減少。
圖11表示用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法獲得的比較數(shù)據(jù)。同樣，與本發(fā)明的曲線相比，所述反應(yīng)曲線較矮。另外，與本發(fā)明的方法相比，TaqmanTM方法非常緩慢。
應(yīng)當(dāng)指出的是，實(shí)際上在所有場合下，用現(xiàn)有技術(shù)的TaqmanTM方法獲得的數(shù)據(jù)的噪音都比用本發(fā)明方法獲得的數(shù)據(jù)的噪音高。另外，反應(yīng)曲線也比本發(fā)明的反應(yīng)矮，并且用本發(fā)明方法獲得的數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的定量曲線與TaqmanTM方法獲得的曲線相比，具有更高的相關(guān)系數(shù)。
本發(fā)明還提供了一種有可能非?？焖俚姆椒ā１疚乃峁┑谋景l(fā)明方法的數(shù)據(jù)，是使用設(shè)備在最快的可能工作模式下獲得的。人們認(rèn)為，較短的探針長度有助于產(chǎn)生快速反應(yīng)。因此，預(yù)計(jì)本發(fā)明方法的速度受實(shí)施該方法的儀器的現(xiàn)有參數(shù)的制約。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測靶核酸序列在樣品中的存在的方法，該方法包括在存在以下成分的條件下對所述樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增(a)DNA雙鏈體結(jié)合試劑，(b)核酸聚合酶，和(c)含有擴(kuò)增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學(xué)連接基團(tuán)與具有標(biāo)記的探針連接，所述標(biāo)記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交，并且，其中，所述標(biāo)記能夠吸收來自所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑的熒光能量或?yàn)樗鯠NA雙鏈體結(jié)合試劑提供熒光能量；以及監(jiān)測所述樣品的熒光。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述方法包括(a)向被懷疑含有靶核酸序列的樣品中添加DNA雙鏈體結(jié)合試劑，核酸聚合酶和試劑；(b)使所述樣品處于引物與靶核酸序列雜交，并且形成包括所述探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的條件；(c)使所述樣品處于標(biāo)記過的探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交的條件；和(d)在步驟(b)和(c)中的至少一個(gè)中監(jiān)測所述樣品的熒光。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括所述探針。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑是嵌入染料。
5.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑包括一種供體標(biāo)記，而所述探針包括受體標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑包括一種受體標(biāo)記，而所述探針包括供體標(biāo)記。
7.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述受體標(biāo)記是發(fā)射特征性波長的能量的熒光分子。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述受體標(biāo)記是羅丹明染料或Cy5。
9.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述受體標(biāo)記是暗受體。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述暗受體選自下列任意一種DABCYL，甲基紅，QSY-7二芳基羅丹明染料和6-(二甲基氨基)-2-[4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1，3-丁間二烯基-1-乙基喹啉鎓高氯酸鹽(CAS號181885-68-7)。
11.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
12.如權(quán)利要求1-8和11中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述受體分子是熒光分子，并且，其中，監(jiān)測供體和受體分子的熒光，并且計(jì)算這兩種發(fā)射之間的關(guān)系。
13.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，在擴(kuò)增反應(yīng)過程中監(jiān)測來自所述樣品的熒光信號，并且將結(jié)果用于對存在于所述樣品中的靶序列的數(shù)量進(jìn)行定量。
14.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，在擴(kuò)增反應(yīng)是在存在不與標(biāo)記探針結(jié)合的其他相應(yīng)的擴(kuò)增引物的條件下進(jìn)行的。
15.一種用于檢測核酸擴(kuò)增的方法，包括在存在以下成分的條件下對靶多核苷酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增(a)核酸聚合酶，(b)DNA雙鏈體結(jié)合試劑，和(c)含有擴(kuò)增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學(xué)連接基團(tuán)與具有第二種標(biāo)記的探針連接，所述標(biāo)記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交，并且，其中，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑或第二種標(biāo)記中的一個(gè)包括一種供體標(biāo)記，該標(biāo)記能夠給所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑或第二種標(biāo)記中的另一個(gè)提供熒光能量，所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑或第二種標(biāo)記中的另一個(gè)包括一種能吸收來自所述供體分子的熒光能量的受體標(biāo)記，所述引物能夠與所述靶多核苷酸雜交；并且在擴(kuò)增過程中監(jiān)測熒光的變化。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述擴(kuò)增是用一對引物進(jìn)行的，所述引物是設(shè)計(jì)過的，以便只有DNA鏈上的靶核苷酸序列被擴(kuò)增。
17.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述探針對于RNA的剪接區(qū)或DNA中的內(nèi)含子是特異的，這樣，只檢測和/或定量擴(kuò)增的RNA或擴(kuò)增的DNA中的一種。
18.一種用于確定靶核酸序列特征的方法，該方法包括(a)在存在DNA雙鏈體結(jié)合試劑和一種包括擴(kuò)增引物的試劑的條件下擴(kuò)增所述序列，所述引物的5’末端通過化學(xué)鍵與一種探針連接，所述探針包括相似于所述靶序列的一個(gè)區(qū)域的序列，并且它還包括一種標(biāo)記，當(dāng)所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑和所述標(biāo)記中的一個(gè)是供體標(biāo)記，而其中的另一個(gè)是受體標(biāo)記時(shí)，所述供體標(biāo)記能夠向所述受體標(biāo)記提供熒光能量；以便形成摻入了探針區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)讓擴(kuò)增產(chǎn)物處于使它的探針區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物的互補(bǔ)區(qū)雜交的條件，和(c)監(jiān)測所述樣品的熒光，并且確定特定的反應(yīng)條件，所述序列的特征，在所述條件下，由于探針區(qū)與樣品的雜交或在探針區(qū)和靶核酸序列之間形成的雙鏈體的脫穩(wěn)定化而導(dǎo)致熒光變化。
19.一種用于檢測多態(tài)性和/或等位變異的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)的方法擴(kuò)增被懷疑含有所述多態(tài)性或變異的序列，用所產(chǎn)生的熒光信號測定探針區(qū)從擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列上解鏈的溫度，并且將這種信號與多態(tài)性或等位變異的存在相聯(lián)系。
20.一種用于上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法中的試劑盒，該試劑盒包括一種含有擴(kuò)增引物的試劑，引物的5’末端通過化學(xué)鍵與對靶核苷酸序列特異的探針連接，其中，所述探針包括第一種標(biāo)記，它可以起著供體或受體標(biāo)記的作用；以及包括第二種標(biāo)記的DNA嵌入試劑，所述第二種標(biāo)記起著供體或受體標(biāo)記的作用，其中，所述第一和第二種標(biāo)記構(gòu)成了供體-受體對。
全文摘要
一種用于檢測樣品中的靶核酸序列存在的方法，該方法包括在存在以下成分的條件下對所述樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增(a)DNA雙鏈體結(jié)合試劑，(b)核酸聚合酶，和(c)含有擴(kuò)增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學(xué)連接基團(tuán)與具有標(biāo)記的探針連接，所述標(biāo)記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴(kuò)增產(chǎn)物上的互補(bǔ)區(qū)雜交，并且，其中，所述標(biāo)記能夠吸收來自所述DNA雙鏈體結(jié)合試劑的熒光能量或?yàn)樗鯠NA雙鏈體結(jié)合試劑提供熒光能量；以及監(jiān)測所述樣品的熒光。
文檔編號C12Q1/68GK1527885SQ02814133
公開日2004年9月8日 申請日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者M·A·李, M A 李 申請人:英國國防部