專利名稱：實現(xiàn)高細胞密度發(fā)酵的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)懸浮動物或植物細胞系的連續(xù)方法，目的在于有效的生產(chǎn)生物制品。本發(fā)明也涉及一些裝置和儀器，通過它們可實現(xiàn)按照本發(fā)明來培養(yǎng)懸浮動物或植物細胞系的方法。
細胞培養(yǎng)對生物活性物質(zhì)和藥物活性產(chǎn)品的生產(chǎn)都非常重要。特別那些被頻繁使用又自由地懸浮在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的細胞的培養(yǎng)是困難和復(fù)雜的，因為它們與微生物和粘附的細胞不同，它們對機械應(yīng)力和基質(zhì)的不足供給都很敏感。出于這個原因，依照本發(fā)明所使用的裝置儀器和技術(shù)方法對于有效的生產(chǎn)方法是至關(guān)重要的。
在大多數(shù)培養(yǎng)懸浮動物或植物細胞系的技術(shù)方法中采用的是分批法。該方法存在缺點，即細胞計數(shù)和營養(yǎng)培養(yǎng)基和代謝物的濃度在數(shù)天或數(shù)周的批循環(huán)中不斷變化，并且死細胞在發(fā)酵的后期聚積，形成的產(chǎn)物會發(fā)生酶降解或自發(fā)降解。因此連續(xù)的發(fā)酵過程是值得推薦的，特別對于不穩(wěn)定活性化合物的生產(chǎn)。
如果高細胞密度在發(fā)酵罐中能被實現(xiàn)并且相應(yīng)可以獲得高生產(chǎn)率，連續(xù)的方法是經(jīng)濟并有競爭力的。這需要(1)在發(fā)酵罐中有充足的氧供給來滿足處于高細胞密度的細胞的高需氧量；(2)允許細胞有效保留的在反應(yīng)器系統(tǒng)中細胞保留系統(tǒng)。
(3)更可靠的長期操作，即穩(wěn)定的操作條件(細胞，基質(zhì)，代謝物和產(chǎn)物濃度)和整個反應(yīng)器系統(tǒng)的長期無菌狀態(tài)，和(4)一個穩(wěn)固，簡單和容易處理的方法。
該方法必須也要考慮細胞對于機械應(yīng)力和基質(zhì)供給不足的高敏感性以及產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。
在先的技術(shù)中描述了很多培養(yǎng)細胞系的儀器、裝置和方法。以下裝置和儀器的變體是已知的1、發(fā)酵罐細胞培養(yǎng)發(fā)酵罐經(jīng)常選用的氧供給手段是通過多孔或擴散膜的無氣泡氧供給方式，因為液體表面氣泡的形成、上升和爆破使細胞經(jīng)受高應(yīng)力度。為此目的所推薦的攪拌器為相對較小的、高速的和軸向轉(zhuǎn)運的攪拌器，其被安裝在隔膜擋板中央(例如，F(xiàn)enge，F(xiàn)raune，Maier，1992.BioTec，452-54)。這樣的反應(yīng)器的設(shè)計是不利的，既因為高速、軸向轉(zhuǎn)運的攪拌器會引起很高的應(yīng)力度，也因為在容器壁和攪拌器之間的膜上的相對低速和相應(yīng)低的氧傳輸率。
這樣一種反應(yīng)器設(shè)計更合適，其中，通過安裝的與整個隔膜高度相當(dāng)并離它有一輕微距離的大攪拌器，加強了反應(yīng)器中氧的運輸。盡管由于在此種反應(yīng)器的設(shè)計中使用的擋板，使得只能使用相對小的隔膜擋板和相應(yīng)小的傳質(zhì)表面。
由于按比例擴大該方法時，膜的表面面積與反應(yīng)器體積的比與反應(yīng)器的直徑成反比，因此上述的氧供給方法只適用于小反應(yīng)器或低細胞密度。
而且，采取大氣泡充氣的方法進行氧供給，用攪拌的方法使氣泡分散，這都限制了細胞密度和細胞培養(yǎng)的存活率，因為涉及到巨大的機械應(yīng)力強度。
2、細胞保留對于連續(xù)的發(fā)酵過程，在過去許多不同的細胞保留系統(tǒng)被建議采用，為了允許靈活處理，其被適當(dāng)安裝在發(fā)酵罐的外部。
當(dāng)使用外部裝置時，特別是在對細胞的氧供給不足和發(fā)酵罐外CO2去除不充分時，為了最小化發(fā)生的細胞損傷，特別需要操作體積小并且細胞在其中停留時間相對較短的細胞保留系統(tǒng)。
除了膜濾器和帶有固定和移動薄膜的交叉流動過濾裝置外，也用到了專用離心機和沉降裝置。
然而在通過膜濾器發(fā)生細胞保留的地方，觀察到了積垢效應(yīng)，由此致使不可能進行穩(wěn)固的低維修要求的長期操作。通過在膜上的高流速可獲得積垢的減少。但由于在膜裝置的泵、管道和通道中的高流速產(chǎn)生了增加的應(yīng)力，所以對高流速的需要是細胞低剪切處理所不允許的。
為了用離心分離的方法移去細胞，開發(fā)了專用的離心機，但它們的缺點是使細胞經(jīng)受增加的機械應(yīng)力，因為用來移去的加速度是重力加速度的二百倍以上。另外，如果沒有維修保養(yǎng)，離心機不會安全運轉(zhuǎn)超過幾周或幾個月，并且也會導(dǎo)致操作成本增加。
還有一種將細胞從細胞培養(yǎng)上清液中移去的手段就是用重力沉降裝置。在細胞培養(yǎng)中主要應(yīng)用的重力沉降裝置是沉積槽和傾斜通道系統(tǒng)。與簡單的沉降容器相比，傾斜通道系統(tǒng)具有容積顯著更小的優(yōu)點。
迄今為止所描述過的系統(tǒng)(J.Stevens，u.a.PreprintEsact-Meeting 1993Würzburg；K.J.Thompson，J.S.WilsonPreprint Esact-Meeting 1993Würzburg；J.A.Searles，u.a.Biotechnol.Prog.1994，10，188-206；WO 94/26384)是具有很小的沉降面積的逆流系統(tǒng)(Ath＝zb1L cosα＜0.2m2；z板數(shù)；b1寬；L通道長度；α與水平線之間的傾角)，因此不能用于生產(chǎn)規(guī)模。
逆流傾斜通道系統(tǒng)中的是按比例放大是個難題，因為在發(fā)酵罐體積V增大時，沉降分離器所要求的濃縮物和清液相的收集室的體積，VSF，會超比例地增大(灌注速率恒定時，VSFαV1.5)，在灌注速率q/V增加時甚至還要增大更多(恒定的發(fā)酵罐體積時，VSFα(q/V)2.15)。由于不利的幾何形狀(流入和流出部分及通道長度)并造成大的操作體積，大多數(shù)建議用于細胞培養(yǎng)的傾斜通道系統(tǒng)的幾何形狀確實阻止它們用于大規(guī)模設(shè)備。在建議的變體中，引入其中的濃縮物和清液相的收集室以及流入和流出的通道被不利地設(shè)計。采用的傾斜通道系統(tǒng)的通道長度相對比較短，范圍在100到300mm之間。最常被建議的長度只有100mm。然而對于已知使用這些系統(tǒng)的用戶，所建議的變體的特征沒有證實是負面的，因為僅是對小規(guī)模(發(fā)酵罐體積1-25L)系統(tǒng)進行了試驗。
對于高細胞濃度發(fā)酵，用高于1.5×107活細胞每毫升反應(yīng)器體積的細胞濃度，如果采用常規(guī)的沉降器設(shè)計，對于容積為100到200L的發(fā)酵罐，則必須要有體積為70到550L或50到500L的沉降分離器(即使用可相對快速沉降的BHK細胞)。在這樣的裝置中并經(jīng)歷較長的周期也不能獲得所期望的1.5×107活細胞每毫升反應(yīng)器體積的細胞密度，因為由于在沉降分離器中停留時間長并且相應(yīng)供氧量不充分而不能維持優(yōu)選的μ≈0.4/d的生長率。
盡管Bayer AG的公報(1992，Chemie-Technik，21(3)，118)中包含了關(guān)于0.2到2.5米的長傾斜通道系統(tǒng)的參考內(nèi)容，但此論文所描述的液體分布系統(tǒng)和濃縮物收集室不能滿足關(guān)于操作體積小的要求。由于這樣的事實，即在所公開的裝置中，培養(yǎng)基是被注射到杯狀裝置中(為了減小在接收室(32)中的湍流)，接收室(32)本身的體積必須相對較大。事實上，不可能構(gòu)造這樣一個帶有杯狀裝置又具有完全圓錐或金字塔幾何形狀的接收室。為了將這個杯狀裝置放進接收室中，除了圓錐形或金字塔形的截面，接收室必須具有圓柱形截面，因此接收室的體積增加了。在上述例子中，沉降分離器的工作體積是Vs＝50到100L，這遠高于本發(fā)明中分離器的體積。
2.1冷卻為了降低沉降分離器中代謝的活性和細胞的沉降物，建議對沉降分離器中的細胞培養(yǎng)液進行冷卻。由于在沉降分離器的內(nèi)部有溫度梯度(以及對應(yīng)的密度梯度)形成，這個基本上正確的建議確實仍導(dǎo)致了對流。這反過來對細胞分離的有效性有負面影響。這一點對使用分離器表面積和分離器體積的比例相對較低的分離器時是至關(guān)重要的，因為在這樣的裝置中，每單位分離器體積僅能獲得相對較小容積的生產(chǎn)量。
2.2振動為了減少細胞在沉降分離器中的停留時間，建議對傾斜通道系統(tǒng)采用不規(guī)律振動(Bayer AG，1992，Chemie-Technik，21(3)118；Searles，等1994.Biotechnology Progress，10188-206).
3.接種發(fā)酵罐為了有效操作發(fā)酵過程，在發(fā)酵罐中需要有特定的起始細胞濃度，因為起始細胞濃度不夠充分會導(dǎo)致由于缺乏異源外激素而推遲細胞的生長。(動物細胞的起始細胞濃度應(yīng)近似為106個/ml)因此，根據(jù)生產(chǎn)發(fā)酵罐的大小，幾個預(yù)發(fā)酵罐是必要的。對于細胞培養(yǎng)，通常使用可以獲得5×106到8×106個/ml的細胞濃度的間斷操作發(fā)酵罐，這是由于它們有簡單的操作模式。這意味著，例如接種200L的生產(chǎn)發(fā)酵罐，從細胞保存開始，一個常規(guī)的種子鏈擴張要用許多T型燒瓶，至少還需要60個滾瓶。
4.低剪切泵和管道此過程的操作需要泵和管道來連接儲罐、發(fā)酵罐、外部沉降分離器和收集容器。在已知的文獻當(dāng)中沒有給出關(guān)于泵和管道的選擇及設(shè)計的詳細內(nèi)容。然而這方面對于無菌條件下的在高細胞濃度和活性的長期培養(yǎng)是極為重要的。在該裝置中必須重視從整體上泵的正確安裝。如專利WO94/26384中所描述的，在導(dǎo)入到發(fā)酵罐的濃縮物再循環(huán)流中安裝泵是不利的，因為其結(jié)果是濃縮的細胞懸浮液(也就是大量的細胞)被暴露在泵中很高的機械應(yīng)力下。
基于上面的考慮，這個技術(shù)問題引發(fā)了開發(fā)用于發(fā)酵剪切敏感性細胞的裝置、儀器和有效的方法，據(jù)此生物產(chǎn)品才能經(jīng)濟又高質(zhì)量的生產(chǎn)。
按照本發(fā)明，此難題通過一個發(fā)酵裝置得以解決，該裝置包括容納營養(yǎng)培養(yǎng)基的至少一個儲罐、泵及管道、生產(chǎn)發(fā)酵罐、至少兩個通流熱交換器和細胞保留沉降分離器(任選裝配振蕩器(5))。一種高灌注率的連續(xù)發(fā)酵方法也有利于解決相關(guān)的技術(shù)問題。
發(fā)明概述本過程裝置由許多儀器和至少一個容納營養(yǎng)培養(yǎng)基的儲罐(1)、泵及管道(7，8)、至少間歇的連續(xù)灌注的生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、至少兩個通流熱交換器(3)和細胞保留沉降分離器(4)(任選裝配振蕩器)組成，裝置的零部件采用這種方式設(shè)計，即其中培養(yǎng)的細胞經(jīng)受低機械應(yīng)力度的長期培養(yǎng)需要超過一個月以上的過程時間。在本發(fā)明裝置的幫助下，可以獲得在細胞密度高于1.5×107個活細胞/每毫升反應(yīng)器體積和高于80％，優(yōu)選90％的存活率時具有超過3-5個月的長期穩(wěn)定培養(yǎng)。本文中存活率被定義為細胞總數(shù)在含有活細胞的培養(yǎng)物里的相對百分率。
然而依照有機體和所用的發(fā)酵步驟的類型，細胞密度、存活率和培養(yǎng)時間可以較低/短。
在本發(fā)明的操作方法中，也可能采用特殊設(shè)計的和分批和/或連續(xù)操作的接種發(fā)酵罐，其最大灌注體積小于生產(chǎn)發(fā)酵罐體積的6％，不過在細胞計數(shù)上允許50到150倍的增加。
在本發(fā)明的幫助下獲得了該方法的高生產(chǎn)率，盡管使用的是敏感性細胞并且產(chǎn)物容易降解。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一個發(fā)酵裝置，其不同于以前的工藝，裝置的多方面存在有利的變體。雖然這些有利的變體也可單獨地顯示它們的有利方面，但一個優(yōu)選的變體應(yīng)該是本發(fā)明裝置的幾個或所有的有利特征的相互作用。因而，例如增加主發(fā)酵罐的氧傳輸能力就是特別有效的，因為在沉降分離器中更有效的細胞再循環(huán)使得在培養(yǎng)物中建立了更高的細胞密度。通過本發(fā)明裝置的其他組件的相互作用，可以獲得類似的協(xié)同效應(yīng)來提高發(fā)酵過程的總體生產(chǎn)率。
本發(fā)明也涉及在本發(fā)明的裝置中實現(xiàn)高細胞密度發(fā)酵過程的有利方法。根據(jù)本發(fā)明，該方法使有效使用發(fā)酵裝置的變體的正面效應(yīng)成為可能。
該發(fā)酵裝置的有利變體描述如下1、生產(chǎn)發(fā)酵罐由于它對于攪拌所采用的最佳設(shè)計，該生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)顯著之處在于在氣/液相界面的傳質(zhì)速率高并且剪應(yīng)力最小。
開發(fā)了三種不同的發(fā)酵罐類型可產(chǎn)生上述的效應(yīng)。
在發(fā)酵罐類型A(圖3)中，氧供給是通過擴散薄膜發(fā)生的。所用的硅管膜具有較小的壁厚，被軸向纏繞到管狀定片上并以同心的方式將攪拌器圍繞在里面(14)。將發(fā)酵罐和管狀定片設(shè)計成細長的形狀是有利的，因為這樣能獲得較大的體積比傳質(zhì)表面(A/V[m-1])。攪拌器是大面積、多槳葉槳式的攪拌器(13)，它與硅管只相距一小段距離，優(yōu)選是5到15mm，并且攪拌器槳葉延伸到超過管狀定片的整個長度。即使以低轉(zhuǎn)速攪拌，攪拌器的功率小于10或20瓦每立方米發(fā)酵罐體積，這種設(shè)計類型也會產(chǎn)生硅管的輕微振動，因此在操作過程中，額外地加強了傳質(zhì)并且同時產(chǎn)生了對薄膜的清洗凈化作用。
為了令人滿意的懸浮細胞，攪拌器根據(jù)本發(fā)明以這樣一種方式進行改良，即它們可以延伸到接近容器底部的區(qū)域。這通過攪拌器在靠近底部區(qū)域的漸縮端部(13a)而成為可能。
根據(jù)類型A，發(fā)酵罐不含任何擋板。這樣的結(jié)果是管狀定片可以很大并且比傳質(zhì)表面面積可能達到A/V＞10/D(A傳質(zhì)面積；V發(fā)酵罐體積；D容器直徑)。因此可以用d/D＞0.6的特別大的攪拌器(d攪拌器的外徑)，這樣可以產(chǎn)生格外低的剪切度。
與含擋板的系統(tǒng)相比，外圍運動仍然占優(yōu)勢并驚人的產(chǎn)生了附加的傳質(zhì)增強和額外的氣泡充氣。具有給定氣泡尺寸的氣泡進行切線運動，在發(fā)酵罐中產(chǎn)生了更大的氣體含量，因此也就產(chǎn)生了更大的相界面。
除了硅管定片，又可以在發(fā)酵罐底部組裝充氣環(huán)(17)用于額外的氣泡充氣。這就允許了氧的額外運輸和可能需要的二氧化碳去除的強化。
對于發(fā)酵罐類型A，在硅酮管中使用純氧和過量的壓力可以獲得高達2×107個活細胞每毫升的非常高的細胞密度。
在發(fā)酵罐類型B(圖4)中，氧供給僅通過細氣泡充氧來進行。
細氣泡充氣是通過具有很小尺寸(dL＜15μm)的孔或洞的特殊燒結(jié)體、過濾板、陶瓷膜或激光穿孔板(20)來進行的。由于可以使用v＜0.5m/h的低表面氣體速度，這樣就形成了很小的氣泡，它們在低速攪拌器的緩和攪拌下表現(xiàn)出僅僅輕微的聚結(jié)傾向。因此高細胞密度發(fā)酵的氧需求可通過以小于通過機械穿孔孔洞(dL＞0.2mm)的大氣泡充氣所必須的表面氣體速度的1/10來獲得，這樣細胞的增長不會受到充氣過程的負面影響。
另外，根據(jù)本發(fā)明，攪拌用的大型低速多級葉片攪拌器(18)中，攪拌器外直徑對容器內(nèi)直徑的比d/D＞0.5，優(yōu)選d/D＞0.6，因為高速的攪拌器，尤其是軸向運動的高速攪拌器被意外地發(fā)現(xiàn)會導(dǎo)致氣泡的聚結(jié)。這些大的攪拌器產(chǎn)生非聚結(jié)低剪切的細小氣泡的分布。同時，延至接近底部的攪拌器和與容器底部有一定距離的擋板產(chǎn)生懸浮液并使生物量均勻分布，由于在底部產(chǎn)生的切線運動，即使在很低的攪拌功率，P/V＜5W/m3時也會產(chǎn)生這樣的效果。
擋板(19)不是以徑向輻射的方式安裝，而是以傾斜的方式安裝的，其結(jié)果是得到高出40％的傳質(zhì)效率(攪拌器功率下每體積單位的物質(zhì)流量)和相應(yīng)對細胞的應(yīng)力額外減少。
因為這些擋板(19)沒有被安裝在容器壁上，不僅與容器底部有與一定的距離，也沒有伸出液體表面，因此頂端被液體覆蓋，所以沉降可以被充分地避免。這為原位清洗(CIP“就地清洗”)創(chuàng)造了重要的先決條件。
在發(fā)酵罐類型C(圖5)中，氧供給是通過細泡氧充氣進行的(如同類型B)。與類型B不同的是使用不帶擋板的反應(yīng)器，其中有偏心安裝的多級葉片攪拌器(21)。
攪拌器(21)的這種偏心安裝加強了軸向混合但卻沒有完全抑制周圍的流動組分，就像使用擋板一樣，特別是壁擋板。如上面提到的，周圍仍然占優(yōu)勢的運動驚人地加強了在氣/液相界面的傳質(zhì)。具有給定氣泡尺寸的氣泡進行切線運動產(chǎn)生了更高的氣體含量，相應(yīng)的產(chǎn)生了更大的相界面。
根據(jù)本發(fā)明，攪拌器的這種偏心安裝有效的阻止了細胞沉降并為發(fā)酵罐的就地清洗創(chuàng)造了理想的先決條件。
根據(jù)本發(fā)明，采用發(fā)酵罐類型B和C，當(dāng)使用純氧時，可以獲得高達5×107個活細胞/毫升的細胞密度，存活率大于90％。
2、接種發(fā)酵罐為了簡化發(fā)酵過程，生產(chǎn)發(fā)酵罐的種子量是在單級預(yù)培養(yǎng)中產(chǎn)生的。這是用培養(yǎng)基管直接接種而不帶有任何額外的培養(yǎng)步驟。為了在接種發(fā)酵罐(9)中獲得50到150倍細胞量的增加，需要特別的發(fā)酵罐幾何形狀和特別的預(yù)培養(yǎng)類型。有一點也是特別必要的，即培養(yǎng)物要在小的操作體積中被接種，該體積尺寸通過加入營養(yǎng)培養(yǎng)基而在預(yù)培養(yǎng)階段增加。
特別的發(fā)酵罐幾何形狀是必要的，因為對于動物細胞的有效培養(yǎng)要求大于105個細胞每毫升(優(yōu)選大于5×105到106個細胞每毫升)的細胞濃度。如果細胞濃度較低，對于所需要獲得的高生長率來說，代謝物和快速生長所需要的異源外激素的濃度過低。
依照本發(fā)明，發(fā)酵罐(圖6)有一個向下漸縮的截面。一個特別的變體中，上部分(27a)和下部分(27b)都是圓柱形狀，下面的部分直徑較小。因此下部分大約只占總體積的1/6。特殊形狀的過渡裝置連接容器的上下兩部分。
根據(jù)本發(fā)明的其它反應(yīng)器都有向下漸縮的圓錐形狀。
將由幾個帶大面積葉片的攪拌器(23，23a)組成的多級攪拌系統(tǒng)和靠近攪拌器的浸沒的擋板用來攪拌。充氣過程是通過安裝在接近容器底部的微型分布器進行的。根據(jù)本發(fā)明，攪拌系統(tǒng)是以這種方式設(shè)計的即引入反應(yīng)器的每一個截面的動力對于細氣泡的均勻分布和細胞的運動都是足夠的。出于這個目的，依照不同的反應(yīng)器截面，所用的槳葉攪拌器具有不同的直徑和槳葉高度，并且彼此之間的距離不同。
作為使用擋板的反應(yīng)器系統(tǒng)的一個備選方案，可使用不帶擋板并裝有偏心攪拌器的反應(yīng)器系統(tǒng)(23)。
在預(yù)發(fā)酵罐(9)中的培養(yǎng)物可以以分批、補料分批和連續(xù)灌注的方法被連續(xù)操作，帶或不帶細胞保留。連續(xù)的預(yù)培養(yǎng)操作是特別有好處的，因為可以獲得比分批發(fā)酵過程中高3-4倍的細胞密度，并且用于生產(chǎn)發(fā)酵罐的接種物料可以被供給更長的時間，這樣任何隨后的生產(chǎn)過程的快速啟動才能發(fā)生。
在預(yù)培養(yǎng)方法的連續(xù)操作過程中，一種類似的技術(shù)過程被用于生產(chǎn)培養(yǎng)物的過程。此過程的結(jié)構(gòu)又包括很多儀器和至少一個裝營養(yǎng)培養(yǎng)基的儲存罐、泵和管道、連續(xù)灌注的接種發(fā)酵罐(9)、通流熱交換器和帶或不帶振動器的細胞保留系統(tǒng)，此過程的所有組件被設(shè)計為可以獲得高于107個活細胞每毫升反應(yīng)器體積的細胞密度和高于90％的存活率的低剪切培養(yǎng)。
3、沉降分離器為此過程開發(fā)的外部沉降分離器(4)的特征在于以最小的體積來達到某一有效的分離器表面積，其結(jié)果是發(fā)酵罐外面的細胞沉降時間和相應(yīng)的氧供給不足可以被降到最小。
用在本發(fā)明發(fā)酵裝置中的沉降分離器包含帶有矩形截面和平行安裝的管材或通道。依照本發(fā)明的儀器具有的管材直徑或通道高度的優(yōu)選尺寸在10mm或更小，大致的長度在0.2到2.5m或大約0.2到1.5m，與水平線的傾斜角α＝40-65°。
在裝有平行通道并具有矩形截面的分離器中，裝置包括壓力穩(wěn)定矩形組件(29)，該組件被用螺絲固定在其下面的濃縮物回收容器(32，44)上，并通過焊接的法蘭盤固定在蓋板上。矩形組件(29)內(nèi)含有很多凹槽，這些凹槽決定了通道的高度，其兩邊彼此相對以一定的間距安裝，并根據(jù)本發(fā)明在間隔中插入板來形成每個通道的邊界。組件的截面優(yōu)選是矩形，高與寬的比例(a/b1)與組件傾斜角的正弦值相符合(

圖15)。這樣就使組件下面的濃縮物回收容器的表面面積和體積盡可能的小。
該組件是從一整塊材料中沖壓出來的或是由預(yù)制的U形型材或四塊板無縫焊接到一起而成。
各種結(jié)構(gòu)的元件被用螺絲固定在一起，如此在O環(huán)密封的幫助下能保證長期無菌環(huán)境。
根據(jù)本發(fā)明的裝置中使用的沉降分離器可以被拆卸，因此很容易清洗和保養(yǎng)。有關(guān)帶有平行通道具有矩形截面的分離器的考慮也應(yīng)用于形成通道的板(30)。如果需要外部清洗，它們可以在蓋板被擰下以后被拆下。
根據(jù)本發(fā)明，在大的沉降分離器中，總體上，該組件是被以可旋轉(zhuǎn)的方式安裝在儀器的質(zhì)量中心，這樣板就可以輕松地從水平的位置被拆下并插回組件的凹槽中。
為了減少發(fā)酵罐外細胞的滯留時間，沉降分離器面向上的表面被制造為具有高度的表面光滑度，優(yōu)選表面粗糙度Ra＜0.25um，如DIN4768所規(guī)定的，這與ISO 3274和ASME B46.1-1995.是相當(dāng)?shù)摹Ｗ鳛橐粋€可選方案，經(jīng)過疏水涂敷的表面和具有蓮花效應(yīng)的表面經(jīng)證明是合適的。
蓮花效應(yīng)被理解為某些表面的防污染效應(yīng)，由緣于被充分限定的表面結(jié)構(gòu)(粗糙度)和有關(guān)材料的特性的適當(dāng)組合，就像在某些植物，例如蓮花上所觀察到的。例如以適當(dāng)材料制作的帶有顯微細小圓丘的表面結(jié)構(gòu)被認為是具有蓮花效應(yīng)的。適用材料經(jīng)常是疏水材料。
3.1逆流沉降分離器逆流沉降分離器(圖8-12)由三部分組成帶通道的組件(31)、濃縮物回收容器(32)和蓋板(29)。
離開發(fā)酵罐(2)的懸浮液在傾斜的通道下面被引入圓錐形或金字塔形的容器(32)中，清澈相在通道(38)的上面被除去。
濃縮物的再循環(huán)出口在它的最低點與接收室中心(36)結(jié)合在一起，這樣使細胞附聚物以向下的方向從板上滑下來，被接收室收集并再循環(huán)進入發(fā)酵罐。由于在逆流沉降分離器的接收室(32)里，同時發(fā)生流入的細胞懸浮液的澄清，以及分離出來的在通道中形成的細胞附聚物的返回，并且根據(jù)本發(fā)明，此容器的體積應(yīng)該最小化，因此容器的流動特征和流入管道必須被設(shè)計成有利的方式。特別是為了大儀器的使用而按比例放大時，任何流入物流所引起的速度上的波動的增加(例如湍流的開始)都必須避免。只有這樣，才可能保證在接收室中分離出來的附聚物的主要部分不會重新懸浮和重新被引入通道中(31)。這些儀器的不利設(shè)計會導(dǎo)致細胞的存活率降低到80％以下。
基于流體動力學(xué)的最基本的考慮，對可能適用于接收容器的設(shè)計原理進行了選擇，并且通過CFD(計算的流體動力學(xué))計算和專門的實驗測試使其進一步最佳化。因此根據(jù)本發(fā)明采用了下面的設(shè)計原理·為避免接收室中潛在的環(huán)形運動，流入通道(34)采用對稱安裝；
·采用大流入截面以保證流入物流的速度低于0.1m/s；·采用帶有小頂角的流入分散器，其可降低速度同時湍流也少；·采用帶有小于4°或小于6°的半錐角的圓錐形擴散器，并在應(yīng)用扁平擴散器的地方，截面面積除以周長的縱向微分(1/P dA/ds)小于0.1(P周長[cm]；A面積[cm2]；s長度坐標[cm])。
·運用兩個徑向的，優(yōu)選是切線方向的流入物流。
在徑向流入物流的變體(圖8)中，兩個直接相對的流入物流(35)在接收室中心只產(chǎn)生一個駐點流，流入物流的入口點被安置在與通道和濃縮物再循環(huán)出口有一定距離處。該距離優(yōu)選大于15倍的通道高度和大于濃縮物再循環(huán)出口直徑的10倍。流入發(fā)生在接收室底部以上高于接收室的一半小于總高的0.8倍的幾何高度。
其中流入物流被呈切線安排的流入物流變體的特征在于流入物流相同(圖9；圖11)或相反方向(圖10；圖12)的安排。
在使用切線流入物流和圓錐形接收室的情況下，流入優(yōu)選發(fā)生在安裝在容器外部的環(huán)形通道中(圖9中的40)。
3.2交叉流動沉降分離器在交叉流動沉降分離器中，依照本發(fā)明通道被設(shè)計為矩形通道。裝置具有包含通道、蓋板和濃縮物回收容器的組件。
在該組件中，從發(fā)酵罐出來的流入物流被安排在通道的一側(cè)，清澈相出口在相對的另一側(cè)。在流出和流入室里面可以構(gòu)建板(49)來使液體分布得到改善。板可以是平板或具有一定形狀的板。這些板優(yōu)選被設(shè)計安裝為接近并與流入和流出通道垂直。為了保證液體在所有通道上的均勻分布，流入借助于圓形或扁平的擴散器在箱體中通道的上游或下游發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，流動區(qū)利用專門的流體動力學(xué)試驗采用以下的方式設(shè)計，即在流速低于0.1m/s時得到無分離、層狀流動，并且在平行安裝的通道上發(fā)生的是均勻分布。
除了從流入通道流入培養(yǎng)基以外，直接向圓錐形或金字塔形的接收室(44)里供給一定量的發(fā)酵液可能是有利的。這一過程減少了細胞在圓錐或金字塔形接收器(44)里的滯留時間。
在傾斜的通道下面安裝了圓錐或金字塔形容器，在該容器中，濃縮物再循環(huán)出口被裝在其最低點的中心處。
交叉流動分離器具有以下有利特性
·細胞的分離和再循環(huán)不受逆流流動的防礙，而在逆流系統(tǒng)的情況下會發(fā)生。
·遞減的濃縮物的平行流動促進了細胞從板上的下滑，特別是在濃縮物返回流與清澈相流的比例qR/q大于2的情況下更是如此。
·在給定的同樣的通道截面下，濃縮物的收集容器可以比用逆流分離器的情況時更小，因為根據(jù)交叉流動分離器的設(shè)計，流入不在濃縮物收集容器中發(fā)生。
·分離通道上游的接收室和其下游的流出室可以具有這樣的外形尺寸，即當(dāng)按比例放大此過程時，隨著分離器面積的增加，它們的體積并不超比例地增加，這與逆流分離器相比代表了交叉流動分離器的關(guān)鍵的優(yōu)點。
·在這種分離器類型中，通道的長度可以比在逆流沉降分離器中的更短。較小的通道長度，無逆流的存在和促進細胞下滑的返回流減少了細胞在分離器中的滯留時間。
因此對于非常高的細胞密度，優(yōu)選使用交叉流動分離器。
4、振動為了加速細胞的再循環(huán)和防止通道結(jié)垢，可應(yīng)用靠氣動或電動操作的振動器。它們優(yōu)選安裝在濃縮物回收容器的頂部或法蘭盤上。
振動強度、振幅和頻率與操作、培養(yǎng)條件和相關(guān)的細胞保留系統(tǒng)相適合。振動強度優(yōu)選在0.1到0.3g，振幅優(yōu)選在0.1到1mm，頻率在20到50Hz。
5、旋風(fēng)分離器、超聲波分離系統(tǒng)和第二沉降裝置的使用為了初步的分離和減少沉降分離器中要被分離的細胞物質(zhì)，可推薦在沉降分離器的上游安裝旋風(fēng)分離器或超聲波分離系統(tǒng)。這樣的旋風(fēng)分離器可以分離細胞物質(zhì)高達50％，多數(shù)是在低流速下進行的，也就是對細胞只有較低的應(yīng)力度。運用超聲波分離系統(tǒng)也可獲得類似的效果，這種系統(tǒng)在市場上就可以買到(如Biosep來自Applikon，Schiedam，荷蘭產(chǎn))，它允許以技術(shù)上有利的灌注率進行部分分離。
由于較低的細胞濃度，在沉降分離器里，在隨后的細胞分離過程中可以獲得改進的細胞再循環(huán)和較高的灌注率。因此這樣才可能在較高的細胞濃度下操作發(fā)酵罐并提高過程的生產(chǎn)率。
大的細胞附聚物的分離具有類似的正面效應(yīng)，此分離通過安裝在沉降分離器的上游，優(yōu)選下游，的較小的沉降裝置實現(xiàn)。因為大的附聚物包圍了大量百分比的由基質(zhì)供應(yīng)不足(有限的擴散)造成的死細胞，使這些死細胞比活細胞以更大的程度被去除，總的細胞計數(shù)被降低同時存活率被提高。
6、泵、管道和熱交換器發(fā)酵過程的連續(xù)操作需要三臺泵。第一臺泵是用來將基質(zhì)引入發(fā)酵罐，第二臺泵是用來將細胞的懸浮液從發(fā)酵罐運輸?shù)匠两捣蛛x器中，第三臺泵則完成從分離器到收集容器的運輸。對于運輸細胞懸浮液的這兩臺泵必須用低剪切泵，特別是第二臺泵，這是為了不降低細胞活力。依照本發(fā)明，使用低速正位移泵來以低脈動度運輸懸浮液。帶有大泵管的真空膠管泵和非密封正位移泵導(dǎo)致的顆粒應(yīng)力小于0.01N/m2或小于0.004N/m2，被證明對無菌長時間操作是適合的。
允許在低滯留時間有效加熱的螺旋熱交換器被用于冷卻細胞懸浮液，使其溫度在進入分離器之前低于發(fā)酵罐溫度，并用于加熱細胞懸浮液，使其溫度在再循環(huán)回發(fā)酵罐時達到發(fā)酵罐的溫度。
裝置的管道和連接件被設(shè)計為以下的方式，即只有細胞在管道中流動的沉積極限以上的低流速，管中的彎管被減到最少并且截面逐漸加寬。彎頭件優(yōu)選采用的是曲徑與管直徑的比例大于2。截面的加寬包括帶有半錐角達到6°的擴散器，優(yōu)選達到4°。截面減小和相應(yīng)的流速增大必須加以限制，以便使得流速增加導(dǎo)致的慣性力保持很小。
本發(fā)明還涉及一套實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，其包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、沉降分離器(4)和收集容器(6)，其中沉降分離器具有的分離器面積基于分離器體積之比Ath/Vs＞30m2/m3或更優(yōu)選Ath/Vs＞70m2/m3。甚至更優(yōu)選的分離器表面積基于分離器體積之比為Ath/Vs＝50到100m2/m3。更優(yōu)選沉降分離器是逆流沉降分離器。在優(yōu)選的實施方式中，分離器具有的絕對表面積為Ath＝0.5m2到10m2并且仍然具有上述的高Ath/Vs比值。
本發(fā)明也涉及一套實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，其包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、沉降分離器(4)和收集容器(6)，其中沉降分離器具有圓錐形(32)或金字塔形接收室(43)并且向沉降分離器的接收室的流入是借助于至少兩個導(dǎo)管進行的，這些導(dǎo)管成徑向地(35)并在同一方向(39、42)或相反的方向(41、43)成切線安裝，它們被以矩形方式分布在截面上。
本發(fā)明也涉及到上面提到的裝置，其中向沉降分離器的流入是借助于導(dǎo)管進行的，這些導(dǎo)管在同一方向成切線安裝并處于安裝在接收室外面的環(huán)形通道(40)里。
另外，本發(fā)明還涉及到高細胞密度發(fā)酵用的裝置，其中向沉降分離器的流入是借助于圓形擴散器(35)或扁平擴散器(39)進行的，圓形擴散器具有最大為6°、更優(yōu)選為4°的半錐角；扁平擴散器的周長相關(guān)截面面積的縱向微分為0.1或更小，速度最大為0.1m/s。
另外，本發(fā)明還涉及一套實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，其包括至少一個沉降裝置，其中來自發(fā)酵罐(45、48)的流入入口和清澈相(46)的出口被安裝在沉降通道的各一邊，濃縮物收集室(44)由對稱安裝在沉降通道底部的金字塔形或圓錐形容器組成，其中在通道中與滑下來的生物量相垂直地產(chǎn)生交叉流動。
另外，本發(fā)明所涉及的上面所述裝置中，交叉流動沉降分離器的組件寬(b1)和通道長(L)之比接近1。
另外，本發(fā)明所涉及的上面所述裝置中，進入沉降分離器的接收室的流入(35)發(fā)生在接收室底部以上大于接收室總高的一半并小于接收室總高的0.8倍的幾何高度。
此發(fā)明的一個變體包括由矩形組件(29)構(gòu)成的沉降分離器，此組件中個體通道(31)通過板(30)使其在空間上是彼此分開的，上述板被制導(dǎo)安裝在組件中的凹槽里，根據(jù)需要，它們可被裝配或拆卸。
本發(fā)明也涉及上面所述裝置，其中沉降分離器的矩形沉降通道或沉降管路長為50cm或更長，相應(yīng)的通道高度小于或等于10mm。
最優(yōu)選的通道高度為4到6mm。據(jù)發(fā)現(xiàn)對于沉降特性和沉降器體積，通道高度在4到6mm之間，為最佳高度。較小的通道高度導(dǎo)致了更不利的沉降特性，同時大的通道高度導(dǎo)致了不適宜的高沉降器體積。這些很小的通道高度不同于現(xiàn)有技術(shù)沉降器，例如，那些在廢水處理廠被用于淤渣再循環(huán)的沉降器。
本發(fā)明也涉及上面所述裝置，其中沉降分離器的矩形通道或沉降管道的長度，對于逆流分離器為50cm，對于交叉流動分離器為20cm或更長，相應(yīng)的通道高度小于或等于10mm。
另外，本發(fā)明還涉及上面所述裝置，其中沉降分離器的平行板或管道被安裝在矩形組件里面，其截面高度(a)對截面寬度的(b1)的比值近似地與裝配狀態(tài)組件的傾斜面(圖15)和水平線的夾角的正弦值相一致。
另外，本發(fā)明還涉及如上面所述裝置，其中沉降分離器的平行板或管道在其向上的表面上所具有的表面粗糙度小于Ra＝0.25um，或這些表面被涂上疏水涂層或具有蓮花效應(yīng)的表面罩面層。
本發(fā)明也涉及到一套裝置，其中沉降分離器的平行板或管道可被施加特定頻率和振幅的振動。
另外本發(fā)明也涉及一套實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，其包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、沉降分離器(4)和收集容器(6)，其中沉降分離器依照交叉流動原理操作(圖13、14)。
本發(fā)明也涉及實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵過程的裝置，其中預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)具有向下的漸縮的截面，預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(23)的攪拌器以偏心的方式懸掛，預(yù)培養(yǎng)的充氣是通過微噴射充氣裝置(25)實現(xiàn)的。
本發(fā)明也涉及實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵過程的裝置，其中在生產(chǎn)發(fā)酵罐中使用大面積的槳式攪拌器(13)和軸向充氣的無氣泡充氣裝置(14)。充氣裝置(17)可被額外地結(jié)合到這些裝置中，在靠近底部(13a)的區(qū)域，槳式攪拌器的攪拌葉片可被漸縮。
除了槳式攪拌器，也可使用框式攪拌器。槳式或框式攪拌器具有的優(yōu)選直徑最好大于容器直徑的一半，更優(yōu)選為容器直徑的70％或80％。
本發(fā)明也涉及實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵過程的裝置，其中安裝了大面積葉片攪拌器(18)和向外圍方向傾斜的擋板(19)，它們與罐壁，發(fā)酵罐底部和液體表面保持一定距離安裝，在生產(chǎn)發(fā)酵罐中還安裝了進行微噴射的充氣環(huán)(17)。
本發(fā)明最后也涉及實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵過程的裝置，其中在生產(chǎn)發(fā)酵罐中將大面積葉片攪拌器(21)以偏心的方式安裝，又在生產(chǎn)發(fā)酵罐中額外地結(jié)合了進行微噴射的充氣環(huán)(17)。
本發(fā)明也涉及到一些裝置，其中旋液分離器(11)或超聲波分離系統(tǒng)被安裝在沉降分離器的上游，并且也涉及到一些裝置，其中附聚物分離器(12)被安裝在沉降分離器(36)的再循環(huán)出口的下游。
本發(fā)明中所提到的附聚物分離器是將細胞附聚物從液體介質(zhì)中移除的裝置，其操作例如依照沉降原理。附聚物分離器允許細胞附聚物從連續(xù)流動的介質(zhì)流中的分離。
本發(fā)明也涉及到一些裝置，其中通流熱交換器(3)于每種情況中被安裝在發(fā)酵罐的出口和沉降分離器的入口之間以及沉降分離器濃縮物出口(36)和發(fā)酵罐再循環(huán)入口之間。
然而本發(fā)明也涉及實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵過程的方法，其中使用了本發(fā)明的裝置。該方法可通過使用單級預(yù)培養(yǎng)來實現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)通過至少間歇地按分批進料過程來實現(xiàn)，由于分批進料，其中預(yù)培養(yǎng)物體積至少增加到初始體積的5倍。預(yù)培養(yǎng)也可通過作為帶有細胞再循環(huán)的連續(xù)過程間歇地被實現(xiàn)。
在本發(fā)明的方法中，預(yù)培養(yǎng)也可能作為一個連續(xù)的過程來實現(xiàn)，同時以細胞再循環(huán)作為生產(chǎn)培養(yǎng)基，以在相對長的時間內(nèi)為下一個主培養(yǎng)或同時平行進行的主培養(yǎng)提供種子。
(示意圖的簡要說明)在下面，在示意圖的幫助下，更具體地描述本發(fā)明的生產(chǎn)實例。
圖1過程裝置，包括基質(zhì)儲存罐(1)、泵(8)、管道(7)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、通流熱交換器(3)、帶有振動器(5)的細胞保留系統(tǒng)(4)、和收集容器(6)，預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)和培養(yǎng)基管(10)。
圖2該過程裝置的一部分，包括泵、通流熱交換器、旋風(fēng)分離器或超聲波分離系統(tǒng)和安裝在裝置中央并帶有振動器的細胞保留系統(tǒng)，安裝在下游的沉降罐。
圖3A型攪拌發(fā)酵罐，包括槳式攪拌器和對硅酮管充氣的充氣籠。
圖4B型攪拌發(fā)酵罐，包括大面積槳葉攪拌器，浸沒的、傾斜的靠近攪拌器的擋板，被安裝在靠近底部位置的微噴射裝置。
圖5C型攪拌發(fā)酵罐，包括以偏心的方式安裝的大面積槳葉攪拌器和安裝在靠近底部的微噴射裝置。
圖6接種發(fā)酵罐。
圖7逆流沉降分離器，帶有平行安裝的管道，并且徑向流入進入錐形接收室圖8逆流沉降分離器，帶有平行安裝的通道，并且徑向流入進入錐形接收室。
圖9逆流沉降分離器，帶有平行安裝的通道，切線方向流入以同一流向進入到環(huán)形通道(40)中，此環(huán)形通道被安裝在圓錐形接收室的外側(cè)。
圖10逆流沉降分離器，帶有平行安裝的通道，切線方向流入以相反方向進入圓錐形接收室。
圖11逆流沉降分離器，帶有平行安裝的通道，兩個分開的相反方向的切線流入液流進入圓錐形接收室。
圖12逆流沉降分離器，帶有平行安裝的通道，兩個分開的相反方向的切線流入液流進入金字塔形接收室。
圖13交叉流動沉降分離器，帶有平行安裝的通道，來自發(fā)酵罐的入流的入口(45)和清澈相出口(46)分別安裝在通道的各一邊，金字塔形接收室(44)安裝在通道的下面。
圖14交叉流動沉降分離器，帶有平行安裝的通道，來自發(fā)酵罐的入流的入口(48)和清澈相出口(46)分別安裝在通道的各一邊，圓錐形或金字塔形接收室(44)安裝在通道的下面。擋板(49)安裝在接近流入通道(48)和流出通道(46)的位置，優(yōu)選與流入通道和流出通道相垂直安裝。
圖15沉降分離器的幾何形狀。
實施例實施例1使用40升發(fā)酵罐，通過基于膜的氧供給和附加的噴射以及逆流細胞保留，進行雜交瘤細胞連續(xù)培養(yǎng)。
該方法裝置根據(jù)圖1和圖2，包括儲存罐(1)，里面裝有1g/L人血清白蛋白(HAS)的營養(yǎng)培養(yǎng)基，三臺泵速度為3-30l/h的泵，其中至少那些接觸細胞懸浮液的泵為低剪切管泵，管道(7)，具有40升操作體積的連續(xù)灌注發(fā)酵罐(2)，根據(jù)圖8的重力逆流沉降分離器(4)，其理論分離表面積為Ath＝0.56m2(Ath＝zb1L cosα；z通道數(shù)，b1通道寬度，L通道長度，α通道與垂直方向的夾角)，其中通道長度為L＝630mm，其它尺寸為z＝16；b1＝111mm；α＝60°，氣動控制振動器(5)，其向分離器施加加速度為b＝0.1g的振動。
因為沉降面積基于分離器體積的高比值(Ath/Vs63m2/m3)，所以逆流分離器是高效的。
根據(jù)圖3，發(fā)酵罐為攪拌發(fā)酵罐，帶有低速槳式攪拌器(13)和硅酮管固定片(14)，其比表面積為65m2/m3。槳式攪拌器(13)的四個槳葉與硅酮管(16)的距離為8mm，并且延伸至固定片(14)的整個高度。根據(jù)圖3，除了硅膜，帶0.5mm孔的環(huán)形噴射器(17)被安裝在接近底部的位置。如果細胞濃度超過2·107細胞/毫升，將進行表面氣體速度最高達2m/h的附加氧噴射。
在試運行大約12天以后，細胞濃度可達30到50·107活細胞/毫升。細胞發(fā)酵罐沉降系統(tǒng)的這一擬穩(wěn)態(tài)條件在灌注率為6.9發(fā)酵罐體積每天時獲得。在此灌注率下，所用的細胞分離器所具有的活細胞平均保留度為R＝94.5％，死細胞的平均保留度為Rd＝92％，這樣正好可以在長時間的長期操作中保證這樣的細胞濃度，而細胞存活率(活細胞數(shù)對總細胞數(shù)的比例)在75％和85％之間，抗體濃度在100mg/L。70天以后培養(yǎng)結(jié)束。
實施例2使用100升的發(fā)酵罐，通過膜基供氧和逆流細胞保留系統(tǒng)，進行BHK細胞連續(xù)培養(yǎng)。
該方法的裝置根據(jù)圖1和圖2，包括儲存罐(1)，里面裝有帶有1g/l HAS的營養(yǎng)培養(yǎng)基，三臺泵速度為20-100l/h的泵，其中至少那些接觸細胞懸浮液的泵為低剪切管泵，管道(7)，其直徑大于10mm，具有100升填充體積的連續(xù)灌注發(fā)酵罐(2)，通流熱交換器(3)，其比熱交換表面積大于300m2/m3，重力逆流沉降分離器(4)，其理論分離表面積為Ath＝1.4m2，其中通道長度為L＝960mm，其它尺寸為z＝20；b1＝148mm；α＝60°(參見圖8)，氣動控制的振動器(5)，其對分離器施加加速度為b＝0.2g的振動。由于高比沉降面積(Ath/Vs＝77m2/m3)，逆流分離器是高效的。從發(fā)酵罐出來的溫度為37℃的發(fā)酵液被熱交換器冷卻到20℃再進入細胞分離器，然后進入發(fā)酵罐之前再加熱到37℃。
根據(jù)圖3，發(fā)酵罐為攪拌發(fā)酵罐，帶有低速槳式攪拌器(13)和硅酮管固定片(14)，其比傳質(zhì)表面積為33m2/m3。槳式攪拌器(13)的四個槳葉與硅酮管(16)的距離為10mm，并且延伸至固定片(14)的整個高度。在攪拌器轉(zhuǎn)速為20r.p.m.，相應(yīng)的輸入功率為15W/m3，當(dāng)使用純氧并且內(nèi)部管壓為2bar時，對于1.5到2×107活BHK細胞/m3的培養(yǎng)，可獲得充分的氧輸入。
對于1.5到2×107活BHK細胞/毫升的營養(yǎng)物的供給，10發(fā)酵罐體積/d的灌注率是必要的。所用細胞分離器的平均活細胞保留度為R＝97％，并且觀察到的增長率為μ＝0.4/d時，正好可以在3個月時間的長期操作中保證這樣的細胞濃度，而細胞存活率大于Vi＝90％。
通過在細胞分離器里面的較低溫度可以獲得培養(yǎng)物的高細胞存活率。大約10天以后可獲得穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)條件。
實施例3CHO細胞的連續(xù)培養(yǎng)，使用微噴射和逆流細胞保留，200L發(fā)酵罐。
此過程裝置根據(jù)圖1和圖2包括儲存罐(1)，里面裝有帶有1g/Lpluronic的營養(yǎng)培養(yǎng)基，三臺輸送能力為20-100l/h的泵(8)，其中至少那些接觸細胞懸浮液的泵為低剪切排帶泵(8)，管道(7)，其直徑大于15mm，具有200升填充體積的連續(xù)灌注發(fā)酵罐(2)，通流熱交換器(3)，其比熱交換表面積大于300m2/m3，根據(jù)圖14的重力逆流沉降分離器，其理論分離表面積為Ath＝2.4m2，其中通道長度為L＝960mm，其它尺寸為z＝26；b1＝194mm；α＝60°，根據(jù)圖11，電驅(qū)動的振動器(5)，其對分離器施加加速度為0.2g的振動。
由于沉降面積基于分離器體積的高比值(Ath/Vs＝84m2/m3)，所以逆流分離器是高效的。
根據(jù)圖4，發(fā)酵罐為攪拌發(fā)酵罐，被大面積裝有多級葉片的葉輪(18)攪拌，直徑比為0.6，傾斜擋板(19)與罐壁、液面和底部沒有接觸。環(huán)形分布器安裝在接近底部的位置，分布器裝有8個金屬燒結(jié)板，具有0.5微米的小孔尺寸和10毫米的直徑。在表面氧速度僅為0.2m/h，和攪拌器轉(zhuǎn)速為25r.p.m.時，其相應(yīng)的輸入功率為9W/m3，獲得了足以培養(yǎng)4×107活BHK細胞/毫升的充分的氧輸入。
對于4×107活CHO細胞/毫升的營養(yǎng)物的供給，4發(fā)酵罐體積/d的灌注率是必要的。對于這一灌注率，所用細胞分離器的平均活細胞保留度為R＝90％。觀察到的細胞的增長率為μ＝0.4/d時，則在110天的長期操作中保證這種細胞濃度是可能的。在整個培養(yǎng)時間里細胞的存活率保持大于90％。起始階段15天以后可獲得高細胞密度的穩(wěn)態(tài)條件。
實施例4HSK細胞在無HAS的培養(yǎng)基中的連續(xù)培養(yǎng)，使用微噴射和交叉流動細胞保留，200L發(fā)酵罐。
該方法的裝置根據(jù)圖1和圖2，包括儲存罐(1)，里面裝有帶有1g/L pluronic的營養(yǎng)培養(yǎng)基，三臺輸送能力為75-300l/h的泵(8)，其中至少那些接觸細胞懸浮液的泵為低剪切排帶泵(8)，管道(7)，其直徑大于15mm，具有200升填充體積的連續(xù)灌注發(fā)酵罐(2)，通流熱交換器(3)，其比熱交換表面積大于200m2/m3，根據(jù)圖14的重力交叉流動沉降分離器，其理論分離表面積為Ath＝2.8m2，其中通道長度為L＝345mm，其它尺寸為z＝46；b1＝345mm；α＝60°，電驅(qū)動的振動器，其對分離器施加加速度為0.1g的振動。
由于沉降面積基于分離器體積的高比(Ath/Vs＝75m2/m3)，并且如實施例1-3所用的逆流系統(tǒng)，通道長度短很多，所以根據(jù)圖14的交叉流動分離器是高效的。
根據(jù)圖3，發(fā)酵罐為攪拌發(fā)酵罐，被大面積裝有多級葉片的葉輪(18)攪拌，直徑比為0.6，傾斜擋板(19)與罐壁、液面和底部沒有接觸。環(huán)形分布器安裝在接近底部的位置，分布器裝有8個金屬燒結(jié)板，具有0.5微米的小孔尺寸和10毫米的直徑。在表面氧速度僅為0.15m/h，和攪拌器轉(zhuǎn)速為25r.p.m.時，其相應(yīng)的輸入功率為9W/m3，獲得了足以培養(yǎng)3×107活BHK細胞/毫升的充分的氧輸入。
對于3×107活BHK細胞/毫升的營養(yǎng)物的供給，15發(fā)酵罐體積/d的灌注率是必要的。所用細胞分離器的平均活細胞保留度為R＝96.8％。觀察到的細胞的增長率為μ＝0.5/d時，正好可以在100天的長期操作中保證這樣的這種細胞濃度。在整個培養(yǎng)時間里細胞的存活率保持大于95％。起始階段12天以后可獲得高細胞密度的穩(wěn)態(tài)條件。
灌注率越高，增長率越高，并且與實施例1-3相比，交叉流動分離器原理導(dǎo)致了培養(yǎng)物的存活率增加，這導(dǎo)致細胞在分離器中的更短的停留時間。
該方法包括一個特殊設(shè)計和根據(jù)圖6操作的接種發(fā)酵罐，其填充體積小于生產(chǎn)發(fā)酵罐體積的6％，其允許在兩周里細胞計數(shù)大約增加120到150倍。接種本身開始于用50毫升的小瓶接種，起始體積為2升。2周以后體積添加到5L，4周以后添加到12L。在最初的4天里，發(fā)酵罐以分批方式運行，5天以后以連續(xù)的方式運行。最終細胞濃度為2到2.5·107活細胞/毫升，僅12天以后就足夠滿足200L發(fā)酵罐的接種。用于接種發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵的細胞保留系統(tǒng)被設(shè)計為，根據(jù)圖9，理論分離表面面積Ath＝0.12m2，其中通道長度為500mm。
實施例5湍性剪切應(yīng)力τ的測定。
低剪切泵被用于此過程中。泵是通過特殊的泵測試來選擇的，其中泵所產(chǎn)生的應(yīng)力以一種模型實驗中使用合適的模型顆粒系統(tǒng)來測試，該模型顆粒系統(tǒng)具有與含水發(fā)酵培養(yǎng)基相關(guān)的已知界面表面張力σ。經(jīng)過長時間的泵送確定了均衡的顆粒直徑dp，其給出了泵所施加的最大湍性剪切應(yīng)力τ＝σ/dp。如果此顆粒系統(tǒng)的均衡直徑與發(fā)酵過程所用的細胞或細胞附聚物的直徑不同，則通過應(yīng)用各向同性湍動理論原理，就能測定泵所產(chǎn)生的應(yīng)力。湍性剪切應(yīng)力是根據(jù)分散范圍定律來計算的，即τ細胞/τ微粒模型＝d細胞/d微粒模型。
權(quán)利要求
1.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)和沉降分離器，其特征在于沉降分離器的基于分離器體積的分離器表面面積為Ath/Vs≥30m2/m3。
2.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)和沉降分離器(4)以及收集容器(6)，其特征在于當(dāng)該裝置可以以5至15發(fā)酵罐體積/天的灌注率運轉(zhuǎn)時，沉降分離器的分離器表面面積Ath≥0.5m2/m3，并且同時比表面面積Ath/Vs≥30m2/m3(基于分離器體積)或比表面面積Ath/Vs≥5m2/m3(基于發(fā)酵罐體積)。
3.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)和沉降分離器(4)，其特征在于沉降分離器具有圓錐形或金字塔形接收室(32、44)，并且向沉降分離器的接收室的流入借助于至少兩個導(dǎo)管進行，這些導(dǎo)管成徑向(35)并在同一方向(39、42)或相反的方向(41、43)成切線地安裝，它們被以矩形方式安裝在截面上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的裝置，其中向沉降分離器(4)中的流入是借助于以相同方向切線安裝在環(huán)形通道里的導(dǎo)管進行的，該通道安裝在接收室外側(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的裝置，其中向(35)沉降分離器(4)的接收室的流入在接收室底部以上大于接收室總高的一半并小于總高的0.8倍，最好小于接收室總高的0.75倍的幾何高度處進行。
6.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)和沉降分離器(4)，其特征在于沉降分離器根據(jù)交叉流動原理操作。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其中在接近流入通道(45、48)和流出通道(46)的位置，安裝有擋板(49)，并與流入通道(48)和流出通道(46)相垂直。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的裝置，其中附加流入通道直接將發(fā)酵培養(yǎng)基運輸?shù)浇邮帐?32、44)，因此減少了細胞在所述接收室中的保留時間。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的裝置，其中沉降分離器的平行板或管道被安裝在矩形組件里面，其截面高度對截面寬度的比值近似地與裝配狀態(tài)的組件的傾斜面和水平線的夾角的正弦值相一致。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的裝置，其中向沉降分離器的流入是借助于圓形擴散器(35)或扁平擴散器(39)進行的，圓形擴散器具有最大為6°的半錐角；扁平擴散器的截面面積除以周長的縱向微分(1/P dA/ds)為0.1或更小，速度最大為0.1m/s。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的裝置，其中所述沉降分離器包括矩形組件(29)，該組件中個體通道(31)通過板(30)使其在空間上是彼此相隔的，上述板被指導(dǎo)安裝在組件中的凹槽里，根據(jù)需要，它們可被裝配或拆卸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、9、10、11中任一項所述的裝置，其中沉降分離器的傾斜矩形沉降通道或管路長為50cm或更長，相應(yīng)的通道高度小于或等于10mm。
13根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、9、10、11中任一項所述的裝置，其中沉降分離器的傾斜矩形沉降通道或管路長為50cm或更長，通道高度為4到6mm。
14.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的裝置，其中交叉流動沉降分離器具有傾斜矩形通道，其長度為20cm或更長，通道高度為10mm或更小。
15.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的裝置，其中交叉流動沉降分離器具有傾斜矩形通道，其長度為20cm或更長，通道高度為4到6mm。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的裝置，其中沉降分離器的平行板或管道在其向上的表面上所具有的表面粗糙度小于Ra＝0.25μm，或這些表面被涂上疏水涂層或具有蓮花效應(yīng)的表面罩面層。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的裝置，其中沉降分離器的平行板或管道可被施加特定頻率和振幅的振動。
18.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐、基質(zhì)儲存罐、生產(chǎn)發(fā)酵罐和沉降分離器，其特征在于預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)具有向下的漸縮的截面，預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(23)的攪拌器以偏心的方式懸掛，預(yù)培養(yǎng)的充氣是通過微噴射充氣裝置(25)實現(xiàn)的。
19.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐、基質(zhì)儲存罐、生產(chǎn)發(fā)酵罐、沉降分離器和收集容器，其特征在于在生產(chǎn)發(fā)酵罐中使用接近膜的大面積的槳式攪拌器(13)和軸向充氣的無氣泡充氣系統(tǒng)(14)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的裝置，其中在靠近底部(13a、23a)的區(qū)域，槳式攪拌器的攪拌葉片是漸縮的(13a)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的裝置，其中另外安裝充氣裝置(17)用于充氣。
22.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、沉降分離器(4)和收集容器(6)，其特征在于在生產(chǎn)發(fā)酵罐中安裝了大面積葉片攪拌器(21)和傾斜的擋板(19)，它們與罐壁，發(fā)酵罐底部和液體表面保持一定距離安裝。
23.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的裝置，該裝置包括預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(9)、基質(zhì)儲存罐(1)、生產(chǎn)發(fā)酵罐(2)、沉降分離器(4)和收集容器(6)，其特征在于在生產(chǎn)發(fā)酵罐中偏心安裝了大面積葉片攪拌器(21)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的裝置，其中充氣環(huán)(17)被另外地安裝到生產(chǎn)發(fā)酵罐中，用于微噴射。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項所述的裝置，其中旋液分離器(11)或超聲波分離系統(tǒng)被安裝在沉降分離器(4)的上游。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項所述的裝置，其中附聚物分離器(12)被安裝在沉降分離器(36、47)的再循環(huán)出口的下游。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項所述的裝置，其中通流熱交換器(3)于每種情況中被安裝在發(fā)酵罐的出口和沉降分離器(34、45、48)的入口之間以及沉降分離器(36、47)濃縮物出口和發(fā)酵罐再循環(huán)入口之間。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項所述的裝置，其中使用低剪切泵(8)以湍性剪切應(yīng)力小于或等于0.1N/m2。
29.實現(xiàn)連續(xù)高細胞密度發(fā)酵的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1到27中任一項所述的裝置。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，使用了單級預(yù)培養(yǎng)步驟，其特征在于預(yù)培養(yǎng)作為批料進料過程至少間歇地進行，并且由于批料進料，所以預(yù)培養(yǎng)物體積至少增加到初始體積的3到6倍。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中預(yù)培養(yǎng)作為帶有細胞再循環(huán)的連續(xù)過程至少間歇地進行。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中預(yù)培養(yǎng)作為與細胞再循環(huán)一起進行的連續(xù)過程，同時也作為生產(chǎn)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及懸浮動物或植物細胞系的高細胞密度連續(xù)培養(yǎng)方法，目的在于有效地生產(chǎn)生物制品。本發(fā)明也涉及到一些裝置和儀器，在這些裝置和儀器中，可以進行依照本發(fā)明來培養(yǎng)懸浮動物或植物細胞系的操作過程。
文檔編號C12N5/02GK1578830SQ02821458
公開日2005年2月9日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者H·-J·亨茨勒, J·考林, F·施密特, E·貝克爾斯, B·貝德克爾, H·馮胡戈, K·孔斯坦蒂諾夫, D·納維, U·施泰納 申請人:拜耳醫(yī)藥保健股份公司