專(zhuān)利名稱(chēng)：用甲基營(yíng)養(yǎng)菌生產(chǎn)l－氨基酸的方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)氨基酸的微生物工程技術(shù)，更具體地說(shuō)，是一種利用發(fā)酵生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用于該生產(chǎn)方法的微生物。
背景技術(shù)：
工業(yè)上利用短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、青霉菌屬(Penicillium)、假絲酵母屬(Candida)等微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，比如L-賴(lài)氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸。為了提高這些微生物的產(chǎn)率，通常使用天然分離的菌株或者這些菌株的人工突變體。此外，通過(guò)用重組DNA技術(shù)提高這些菌株L-氨基酸生物合成酶活性以增加L-氨基酸產(chǎn)量的各種技術(shù)已經(jīng)公開(kāi)。
通過(guò)培育如上面提到的微生物以及改進(jìn)相關(guān)的生產(chǎn)方法，L-氨基酸的產(chǎn)量已經(jīng)得到很大提高。然而，為了滿足未來(lái)增加的需求量，發(fā)展以更低成本提供更高產(chǎn)量的方法顯然仍十分必要，因此仍然需要發(fā)展相關(guān)技術(shù)。
甲醇是一種已知的發(fā)酵原材料，用低成本即可大量獲得。用甲醇發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法是已知的，包括利用產(chǎn)堿菌屬(Achromobacter)或者假單胞菌屬(JP45-25273 A)，精朊桿菌屬(Protaminobacter)(JP49-125590 B)，精朊桿菌屬或者甲烷單胞菌屬(Methanomonas)(JP50-25790 A)，屈曲桿菌屬(Microcyclus)(JP52-18886 A)，甲基小桿菌屬(methylobacillus)(JP4-91793A)，芽孢桿菌屬(JP3-505284 A)等微生物進(jìn)行的方法。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)展出了通過(guò)人工誘變和DNA重組技術(shù)培育嗜甲基菌屬和甲基小桿菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法(國(guó)際申請(qǐng)WO00/61723；JP2001-120269 A)。
近年來(lái)，已經(jīng)鑒定出了一些能夠?qū)⒛撤N特定L-氨基酸分泌到細(xì)胞外或者微生物體外的蛋白質(zhì)及其編碼基因。特別是，Vrljic等已經(jīng)鑒定了一個(gè)與棒桿菌屬細(xì)菌分泌L-賴(lài)氨酸到細(xì)胞外有關(guān)的基因(Moleucular Microbiology 22815-826(1996))。該基因被命名為lysE，據(jù)報(bào)道通過(guò)增加細(xì)菌中這個(gè)基因的表達(dá)量可以提高棒桿菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-賴(lài)基酸的能力(國(guó)際申請(qǐng)WO97/23597)。還已知增加大腸桿菌中氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量可以提高幾種氨基酸的產(chǎn)量(JP 2000-189180 A)。例如，據(jù)報(bào)道提高大腸桿菌中ORF306基因的表達(dá)量可以提高胱氨酸、半胱氨酸等的產(chǎn)量(EP885962 A)。
然而，至今為止，還未有報(bào)道明確表明，提高甲醇同化細(xì)菌(methanol-assimilating bacteria)發(fā)酵過(guò)程中L-氨基酸的分泌量可以增加L-氨基酸的產(chǎn)量。此外，有關(guān)甲醇同化細(xì)菌中表現(xiàn)分泌活性的氨基酸分泌基因尚無(wú)報(bào)道。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)發(fā)明目的是提供一種利用豐富而且廉價(jià)易得的甲醇高效生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼棒狀細(xì)菌中l(wèi)ysE蛋白突變體或者相關(guān)同源蛋白的DNA，其中當(dāng)所述突變體或其同源蛋白被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，會(huì)賦予該細(xì)菌產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物抗性的能力。
本發(fā)明的另一目的是提供一種如上所述的DNA，其中所述突變體是一種定義為下面(A)或者(B)的蛋白質(zhì)(A)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中至少第56位的甘氨酸殘基被其它氨基酸取代，或者(B)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中至少第56位的甘氨酸殘基被其它氨基酸取代，并且除56位氨基酸殘基以外有一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失、插入或者添加，當(dāng)所述突變體被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，會(huì)對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物產(chǎn)生抗性。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供如上所述的DNA，其中所述DNA選自A)一種具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，其具有一個(gè)突變導(dǎo)致至少被編碼蛋白質(zhì)的第56位甘氨酸殘基被其它氨基酸取代，或者B)一種在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO1核苷酸序列雜交的DNA，或者由所述核苷酸序列制備的探針，當(dāng)其被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，會(huì)對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物產(chǎn)生抗性。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供如上所述的DNA，其中所述其它氨基酸殘基是絲氨酸殘基。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供如上所述的DNA，其中所述L-賴(lài)基酸類(lèi)似物是S-(2-氨乙基)半胱氨酸。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供如上所述的DNA，其中所述甲醇同化細(xì)菌是屬于嗜甲基菌屬或甲基小桿菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供一種屬于嗜甲基菌屬或甲基小桿菌屬的細(xì)菌，當(dāng)上述DNA以可表達(dá)形式被導(dǎo)入該細(xì)菌時(shí)，該細(xì)菌能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供一種生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的方法，包括如下步驟A)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的細(xì)菌，以在培養(yǎng)物中積累L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸，和B)從培養(yǎng)物中收集L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸。
本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供如上所述的方法，其中培養(yǎng)基含有甲醇，作為主要碳源。
根據(jù)本發(fā)明，甲醇同化細(xì)菌的L-氨基酸產(chǎn)率，特別是L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸的產(chǎn)率能夠得到提高。


圖1顯示了有tac啟動(dòng)子的pRStac質(zhì)粒圖譜和將lysE基因插入pRStac質(zhì)粒而構(gòu)建的pRSlysE質(zhì)粒圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)辛勤的研究達(dá)到了本發(fā)明上述的發(fā)明目的。最初，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)用甲醇同化細(xì)菌，特別是嗜甲基菌屬和甲基小桿菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸時(shí)，細(xì)胞不能向外分泌這些L-氨基酸。后來(lái)，發(fā)明人成功地獲得了表現(xiàn)有氨基酸分泌活性的基因，尤其是在以上這些微生物中，因此發(fā)現(xiàn)利用這些獲得的基因可有效生產(chǎn)氨基酸。
本發(fā)明的發(fā)明人將已知的來(lái)源于棒桿菌屬細(xì)菌的lysE基因?qū)胍环N甲醇同化細(xì)菌，并檢測(cè)它的氨基酸產(chǎn)率。發(fā)現(xiàn)將lysE基因?qū)爰状纪?xì)菌導(dǎo)致突變或者缺失，因而使lysE喪失功能。負(fù)責(zé)分泌的蛋白質(zhì)通常需要進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)以發(fā)揮功能，因此蛋白質(zhì)和膜的條件，比如脂質(zhì)的組分，必須相互適合?？梢酝茢啵磉_(dá)異源膜蛋白比如lysE以便使它發(fā)揮功能是困難的，前述的結(jié)果可以支持這個(gè)結(jié)論。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人在研究前述的L-氨基酸和分泌基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變基因能夠在甲醇同化細(xì)菌中發(fā)揮功能。此外，他們發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變基因用于甲醇同化細(xì)菌生產(chǎn)氨基酸時(shí)有明顯的效果。他們作了進(jìn)一步研究，成功地獲得了多個(gè)能在甲醇同化細(xì)菌中發(fā)揮功能的突變基因。
在下文中，本發(fā)明將作詳細(xì)的解釋。
本發(fā)明的DNA本發(fā)明的DNA編碼來(lái)源于棒狀細(xì)菌lysE蛋白的一種突變體或者同源蛋白，但當(dāng)它被導(dǎo)入一種甲醇同化細(xì)菌時(shí)，能夠表現(xiàn)lysE蛋白的功能。
這里所說(shuō)的“l(fā)ysE蛋白的功能”是指至少具有如下(1和/或2)定義的一種功能(1)當(dāng)前述編碼突變體的DNA被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物有抗性的功能。
這里所說(shuō)的細(xì)菌“對(duì)有L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物有抗性”是指當(dāng)上述編碼lysE突變體的DNA被導(dǎo)入上述甲醇同化細(xì)菌時(shí)，與不含有該DNA的細(xì)菌例如野生型的甲醇同化細(xì)菌相比，這種細(xì)菌能夠在更高濃度L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物存在的情況下生長(zhǎng)。例如，在含有一定濃度L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，導(dǎo)入了上述DNA的甲醇同化細(xì)菌的轉(zhuǎn)化菌株能夠形成菌落，而非轉(zhuǎn)化菌株則不能形成菌落，上述轉(zhuǎn)化菌株被賦予了對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物的抗性。L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物的例子包括S-(2-氨乙基)半胱氨酸。
(2)當(dāng)上述突變體被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，具有提高L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸中一種或者兩種的細(xì)胞外分泌量的功能。
這里所說(shuō)的“提高L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸中一種或者兩種的細(xì)胞外分泌量”是指當(dāng)培養(yǎng)一種含有本發(fā)明DNA的甲醇同化細(xì)菌時(shí)，與不含有本發(fā)明DNA的甲醇同化細(xì)菌相比，分泌到培養(yǎng)基中的L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的量有所提高，或者這兩種氨基酸的量均有所增加。DNA轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明在培養(yǎng)過(guò)程中，含有本發(fā)明DNA的甲醇同化細(xì)菌與不含有本發(fā)明DNA的甲醇同化細(xì)菌相比，培養(yǎng)基中累積的L-氨基酸的濃度增加，說(shuō)明了L-氨基酸胞外分泌量有所提高。此外，將本發(fā)明DNA導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌后，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)L-氨基酸濃度的下降也能證明L-氨基酸胞外分泌量的提高。
本發(fā)明中，甲醇同化細(xì)菌即甲基營(yíng)養(yǎng)菌，是一種能利用甲醇作為主要碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，當(dāng)其中導(dǎo)入了本發(fā)明DNA時(shí)，將表達(dá)lysE蛋白的功能。具體的例子包括嗜甲基菌屬細(xì)菌，例如甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌，以及甲基小桿菌屬細(xì)菌，例如產(chǎn)糖甲基小桿菌和鞭毛甲基小桿菌。
甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌的例子包括但不限于AS1菌株(NCIMB10515)等等。甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)可在工業(yè)和海洋細(xì)菌國(guó)際保藏中心得到(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，AberdeenAB9 8DG，United Kingdom)。
產(chǎn)糖甲基小桿菌的例子包括但不限于T-11菌株(NCIMB11375)，ATCC21276菌株，ATCC21371菌株，ATR80菌株(在Appl.Microbiol.Biotechnol.42，pp.67-72(1994)中有描述)，A513菌株(在Appl.Microbiol.Biotechnol.42，pp.67-72(1994)中有描述)等等。產(chǎn)糖甲基小桿菌NCIMB11375菌株在工業(yè)和海洋細(xì)菌國(guó)際保藏中心可以得到(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)。鞭毛甲基小桿菌的例子包括但不限于KT菌株(在Arch.Microbiol.，149，pp.441-446(1998)中有描述)等等。
本發(fā)明DNA的一個(gè)具體例子是一種編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中至少第56位甘氨酸殘基被其它氨基酸取代。
此外，本發(fā)明DNA一個(gè)更加具體的例子是一種編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，并且含有以下任何一種情況的突變(i)SEQ ID NO2中第56位甘氨酸殘基被其它氨基酸取代；(ii)SEQ ID NO2中第56位甘氨酸殘基和第55位丙氨酸殘基都被其它氨基酸取代；(iii)SEQ ID NO2中第56位甘氨酸殘基和第137位天冬氨酸殘基都被其它氨基酸取代。
第56位取代的具體例子包括但不限于用絲氨酸殘基取代甘氨酸殘基。第55位取代的具體例子包括但不限于用蘇氨酸殘基取代丙氨酸殘基。第137位取代的具體例子包括但不限于用甘氨酸殘基取代天冬氨酸殘基。
本發(fā)明中編碼具有上述取代的蛋白質(zhì)的DNA的更加具體的例子是命名為lysE562、lysE564、lysE565的DNA，在實(shí)施例中描述了這些DNA。它們是分離自乳發(fā)酵短桿菌的基因突變體，與報(bào)道的棒狀細(xì)菌的lysE基因是同源基因。因此，本發(fā)明的DNA也被稱(chēng)作“l(fā)ysE突變體”，為了方便，本發(fā)明DNA編碼的蛋白質(zhì)被稱(chēng)作“LysE突變體”。
作為一種編碼棒狀細(xì)菌LysE蛋白的DNA，野生型谷氨酸棒桿菌lysE的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
在lysE564編碼的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，與野生型lysE編碼的SEQ ID NO2氨基酸序列相比，其氨基末端第56位氨基酸由甘氨酸變成了絲氨酸。在lysE562編碼的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，與野生型lysE編碼的SEQ ID NO2氨基酸序列相比，其氨基末端第56位氨基酸由甘氨酸變成絲氨酸，第137位氨基酸由天冬氨酸變成甘氨酸。在lysE565編碼的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，與野生型lysE編碼的SEQ IDNO2氨基酸序列相比，其氨基末端第56位氨基酸由甘氨酸變成絲氨酸，第55位氨基酸由丙氨酸變成蘇氨酸。發(fā)現(xiàn)它們共有的突變點(diǎn)是第56位的甘氨酸被絲氨酸取代。推斷該位點(diǎn)的變化，對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌中有分泌L-賴(lài)氨酸活性的分泌載體的生產(chǎn)尤其具有重要意義。
本發(fā)明的DNA可以編碼除第55位、第56位、第137位位點(diǎn)之外的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列，只要編碼的LysE突變體屬于上述突變形式，并且在甲醇同化細(xì)菌中表現(xiàn)LysE蛋白的功能。這里用的術(shù)語(yǔ)“幾個(gè)”依據(jù)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置和氨基酸種類(lèi)而定。然而，優(yōu)選指2-10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選是2-5個(gè)，最優(yōu)選是2-3個(gè)。
編碼與上述LysE突變體實(shí)質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過(guò)修飾lysE突變體的核苷酸序列獲得。例如，使用定向突變可在某一特定位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸取代、缺失、插入或者添加。此外，上述經(jīng)修飾的DNA可以通過(guò)常用已知的突變手段獲得。這樣的突變手段例子包括一種在突變處理前，用羥胺等體外處理DNA的處理方法，一種微生物的處理方法，例如，將一種含有DNA的埃希氏菌在突變處理前，用紫外光或者常用的誘變?cè)噭┍热鏝-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)(NTG)或者亞硝酸處理等等。Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.在“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版”，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等中描述了這些方法。
編碼與上述LysE突變體實(shí)質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA，可以通過(guò)在一種甲醇同化細(xì)菌中表達(dá)任何一種上述突變體和檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的活性獲得。
本發(fā)明中，氨基酸殘基的位置不一定是在每個(gè)LysE蛋白中的絕對(duì)位置，而是在氨基酸序列SEQ ID NO2中的相對(duì)位置。例如，當(dāng)SEQ ID NO2氨基酸序列第56位氨基酸N-末端一側(cè)的某個(gè)氨基酸殘基被缺失時(shí)，那么上述的第56位氨基酸殘基就變成了N-末端的第55位氨基酸殘基。在這種情況下，既然N-末端第55位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的是SEQ ID NO2中第56位氨基酸殘基，那么它就是第“56”位氨基酸殘基。
編碼棒狀細(xì)菌LysE蛋白或者同源蛋白的DNA，即lysE基因或者同源基因，可以在任何微生物中獲得，只要該生物有能夠在甲醇同化細(xì)菌中表達(dá)L-賴(lài)氨酸分泌活性的各種基因。具體來(lái)說(shuō)，這些微生物的例子包括，但不限于，棒狀細(xì)菌例如谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和乳發(fā)酵短桿菌(brevibacterium lactofermentum)，埃希氏菌屬細(xì)菌例如大腸桿菌(Escherichiacoli)，假單胞菌屬細(xì)菌例如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，分枝桿菌屬細(xì)菌例如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tubercalosis)等等。
lysE同源基因的例子包括一種在嚴(yán)格條件下能夠與具有SEQ ID NO1核苷酸序列或其部分序列的探針雜交的編碼蛋白質(zhì)的DNA，其編碼的蛋白質(zhì)在甲醇同化細(xì)菌中表現(xiàn)出LysE蛋白的功能，該功能是由于前述的氨基酸取代而引起。因此可作為上述氨基酸的替代物。上述“嚴(yán)格條件”包括一種只形成特異性雜交，而不形成非特異性雜交的條件。這種條件很難用數(shù)值參數(shù)表示清楚。然而，舉例來(lái)說(shuō)，嚴(yán)格條件包括這樣的條件該條件下，有高度同源性的DNA，例如有80％或者以上的同源性，優(yōu)選是90％或者以上，更優(yōu)選是95％或者以上的DNA，可以相互雜交，然而低于以上同源性的DNA則不能相互雜交。換句話說(shuō)，相互雜交的DNA在DNA印跡中洗脫時(shí)常用的鹽濃度條件，即1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選60℃，0.1×SSC，0.1％SDS可作為嚴(yán)格條件的例子。
SEQ ID NO1核苷酸序列的部分序列也可作為探針。用基于SEQ ID NO1所示核苷酸序列的寡聚核苷酸作引物，用含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段作模板，利用PCR生產(chǎn)探針。當(dāng)使用大約300bp長(zhǎng)度的DNA片段作為探針，雜交的洗脫條件可以是，例如50℃，2×SSC，0.1％SDS。
為了提高lysE突變體基因在甲醇同化細(xì)菌例如嗜甲基菌屬細(xì)菌或者甲基小桿菌屬細(xì)菌中的表達(dá)量，將含有l(wèi)ysE突變體基因的基因片段連接到可在甲醇同化細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體上，優(yōu)選多拷貝載體，以制備重組DNA，用于轉(zhuǎn)化比如甲醇同化細(xì)菌的宿主。換句話說(shuō)，可以將lysE突變體基因插入轉(zhuǎn)座子，并導(dǎo)入染色體。此外，可將在甲醇同化細(xì)菌中能夠有效誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子連接到lysE突變體基因的上游。
參考文獻(xiàn)WO97/23597公開(kāi)了lysE，但只表明棒狀細(xì)菌的lysE基因可被導(dǎo)入棒狀細(xì)菌。此外，它只提到L-賴(lài)氨酸是分泌型氨基酸，并公開(kāi)了一個(gè)新的蛋白質(zhì)分泌體系，其中包括含有6個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的LysE。然而，本發(fā)明的發(fā)明人證明來(lái)源于棒狀細(xì)菌的LysE在甲醇同化細(xì)菌中根本不發(fā)揮功能。
此外，本發(fā)明獲得了一種新的L-賴(lài)氨酸分泌載體，其包含特定位點(diǎn)的氨基酸替換突變，而這些因素是根本無(wú)法從先前有關(guān)lysE的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)推知的。本發(fā)明的甲醇同化細(xì)菌本發(fā)明的甲醇同化細(xì)菌是一種以可表達(dá)形式導(dǎo)入了本發(fā)明上述DNA的、并且具有L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)活性的甲醇同化細(xì)菌。本發(fā)明的甲醇同化細(xì)菌可通過(guò)將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入一種具有L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)活性的甲醇同化細(xì)菌而獲得。本發(fā)明的甲醇同化細(xì)菌也可以通過(guò)使導(dǎo)入了本發(fā)明DNA的甲醇同化細(xì)菌獲得L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)活性而得到。此外，本發(fā)明的甲醇同化細(xì)菌可通過(guò)以可表達(dá)形式導(dǎo)入本發(fā)明DNA而被賦予L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)活性。
甲醇同化細(xì)菌的例子包括，但不限于上述的嗜甲基菌屬細(xì)菌或者甲基小桿菌屬細(xì)菌。
一種具有L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)能力的甲醇同化細(xì)菌可通過(guò)使一種甲醇同化細(xì)菌的野生型菌株獲得L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)能力的方式來(lái)獲得。棒狀細(xì)菌和埃希氏菌屬細(xì)菌等等的傳統(tǒng)培育方法可以用于賦予L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的生產(chǎn)能力。例如，這些方法包括但不限于，獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株、類(lèi)似物抗性株或者代謝調(diào)節(jié)突變株，制備L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生物合成系統(tǒng)酶有所增加的重組菌株(見(jiàn)“氨基酸發(fā)酵”，the Japan Scientific Societies Press[Gakkai Shuppan Center]，1stEdition，published on May 30，1986，pp.70 to 100)等等。當(dāng)制備L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌時(shí)，可分別賦予營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類(lèi)似物抗性、代謝調(diào)節(jié)突變等特性中的一種，也可以賦予兩種或更多結(jié)合的特性。生物合成系統(tǒng)酶可被單獨(dú)增加，或者兩種或以上的酶同時(shí)被增加。此外，營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類(lèi)似物抗性、代謝調(diào)節(jié)突變等特性可和生物合成系統(tǒng)酶的增加結(jié)合起來(lái)。
例如，L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)細(xì)菌能被培育成L-高絲氨酸或者L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型(JP 48-28078和JP56-6499)，或者培育成肌醇或乙酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(JP 55-9784 A和JP56-8692 A)，或者培育成溶菌素、異羥肟酸賴(lài)氨酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、γ-甲基賴(lài)氨酸、α-氯代己內(nèi)酰胺、DL-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺、α-氨基-月桂內(nèi)酰胺、天冬氨酸類(lèi)似物、磺胺類(lèi)藥物、醌型化合物或者N-月桂亮氨酸抗性菌株。
生產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌可以被培育成對(duì)某一特定試劑具有抗性，例如，磺胺類(lèi)藥物、2-噻唑丙氨酸、α-氨基-β-羥基戊酸或者類(lèi)似物；培育成除對(duì)2-噻唑丙氨酸有抗性之外，還具有L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸或者L-色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(JP 54-44096 A)；對(duì)酮丙二酸、氟丙二酸或者單氟乙酸有抗性(JP 57-18989 A)；對(duì)精氨基醇(argininol)有抗性(JP62-24075A)；對(duì)X-胍有抗性(X代表脂肪酸或者脂肪鏈的衍生物，JP2-186995 A)；對(duì)5-氮尿嘧啶、6-氮尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氮雜胞嘧啶(azacytosine)、6-氮雜胞嘧啶等等有抗性；對(duì)異羥肟酸精氨酸(argininehydroxamate)和2-硫脲嘧啶有抗性；對(duì)異羥肟酸精氨酸和6-氮尿嘧啶有抗性(見(jiàn)JP57-150381 A)；對(duì)組氨酸類(lèi)似物或者色氨酸類(lèi)似物有抗性(見(jiàn)JP52-114092A)；至少一種甲硫氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和尿嘧啶(或者尿嘧啶前體)營(yíng)養(yǎng)缺陷(見(jiàn)JP52-99289 A)；對(duì)異羥肟酸精氨酸有抗性(見(jiàn)JP51-6754)；琥珀酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型或者對(duì)核酸堿基類(lèi)似物有抗性(見(jiàn)JP58-9692 A)；不能代謝精氨酸、對(duì)精氨酸拮抗物和刀豆氨酸有抗性以及賴(lài)氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(見(jiàn)JP57-8729 A)；對(duì)精氨酸、異羥肟酸精氨酸、高精氨酸、D-精氨酸和刀豆氨酸有抗性，或者對(duì)異羥肟酸精氨酸和6-氮尿嘧啶有抗性(見(jiàn)JP53-143288 A)；對(duì)刀豆氨酸有抗性(見(jiàn)JP53-3586 A)等等。
在下文中，用例子說(shuō)明了通過(guò)增加L-氨基酸生物合成酶基因以賦予或者提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法。
例如，L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)能力可通過(guò)提高二氫吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate)和天冬氨酸激酶的活性而獲得。通過(guò)用重組DNA轉(zhuǎn)化甲醇同化細(xì)菌宿主的方法可以提高甲醇同化細(xì)菌中二氫吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的活性，其中所述重組DNA可通過(guò)將編碼二氫吡啶二羧酸合成酶基因和天冬氨酸激酶基因的片段連接到一個(gè)能在甲醇同化細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體上(優(yōu)選其多拷貝載體)而制備得到。二氫吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶活性的提高是轉(zhuǎn)化細(xì)菌中編碼酶的基因的拷貝數(shù)增加的結(jié)果。在下文中，二氫吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III被分別稱(chēng)為DDPS、AK和AKIII。
任何微生物都可提供編碼DDPS和AK的基因，只要所選的微生物具有能夠在甲醇同化細(xì)菌中表達(dá)DDPS和AK活性的基因。這些微生物可以是野生型菌株或者由它們衍生的突變株。具體來(lái)說(shuō)，這些微生物的例子包括但不限于，大腸桿菌(E.coli)(Escherichia coli)K-12菌株，甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)、產(chǎn)糖甲基小桿菌T-11菌株(NCIMB11375)等等。這些基因可用PCR獲得，在已知的DDPS(dapA，Richaud，F(xiàn).et al.，J.Bacteriol.，297(1986))和AKIII(lysC，Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.and Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))的核苷酸序列基礎(chǔ)上合成引物，用例如E.coli K-12的微生物染色體DNA作為模板，使用PCR獲得這些基因。具體的例子包括，但不限于本文所述的來(lái)源于E.coli的dapA和lysC。
更優(yōu)選地，本發(fā)明所用的DDPS和AK不會(huì)受到L-賴(lài)氨酸的反饋抑制。已知E.coli野生型的DDPS會(huì)受到L-賴(lài)氨酸的反饋抑制(見(jiàn)US5,661,012和US6,040,160)，E.coli野生型的AKIII會(huì)受到L-賴(lài)氨酸的阻抑反饋抑制。因此，dapA和lysC分別編碼DDPS和AKIII，它們各含有一個(gè)在導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌之后，能夠消除L-賴(lài)氨酸反饋抑制的突變。在下文中，含有一個(gè)能夠消除L-賴(lài)氨酸反饋抑制的突變的DDPS也可稱(chēng)為“DDPS突變體”，而編碼DDPS突變體的DNA也可稱(chēng)為“dapA突變體”或者“dapA*”。含有一個(gè)能夠消除L-賴(lài)氨酸反饋抑制的突變的大腸桿菌AKIII也可稱(chēng)為“AKIII突變體”，而編碼AKIII突變體的DNA也可稱(chēng)為“l(fā)ysC突變體”。
然而，在本發(fā)明中DDPS和AK的突變不一定是必須的。例如，已知來(lái)源于棒桿菌屬細(xì)菌的DDPS不會(huì)受L-賴(lài)氨酸的反饋抑制(見(jiàn)KR92-8382，US5,661,012和US6,040,160)。
來(lái)源于E.coli的野生型dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，由它編碼的野生型DDPS的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
編碼不受L-賴(lài)氨酸反饋抑制的DDPS突變體的DNA可以是編碼具有SEQID NO4氨基酸序列的DDPS的DNA，其中SEQ ID NO4中第118位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代。此外，編碼不受L-賴(lài)氨酸反饋抑制的AKIII突變體的DNA可以是編碼其氨基酸序列中第352位蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代的AKIII的DNA(AKIII序列見(jiàn)US5,661,012和US6,040,160)。
用于基因克隆的質(zhì)粒可以是任何可在微生物比如埃希氏菌屬細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒。具體來(lái)說(shuō)，這樣的細(xì)菌例子包括pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等等。
在嗜甲基菌屬細(xì)菌中能夠發(fā)揮功能的載體包括，例如，一種能在嗜甲基菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的載體。具體來(lái)說(shuō)，例子包括RSF1010及其衍生物，它是一種擁有廣譜宿主的載體，以及pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))、pMFY42(Gene，44，53(1990))、pRP301、pTB70(Nature，287，396，(1980))等等。
此外，能夠在甲基小桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體例子包括，例如，一種能在甲基小桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的載體。具體來(lái)說(shuō)，例子包括RSF1010，它是一種有廣譜宿主的載體，以及它的衍生物例如pMFY42(Gene，44，53(1990))。
為了通過(guò)連接dapA和lysC到一個(gè)能在甲醇同化細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體上來(lái)制備重組DNA，用適合作用含dapA和lysC的DNA片段末端的限制性?xún)?nèi)切酶消化該載體。常用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。dapA和lysC基因可并入不同或相同的載體。
廣譜宿主載體質(zhì)粒RSFD80是已知的(WO95/16042)，可用作本發(fā)明容納編碼DDPS突變體的dapA突變基因和編碼AKIII突變體的lysC突變基因的質(zhì)粒。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli JM109菌株被命名為AJ12396，并于1993年10月28日保藏在National Institute of Bioscience of Advanced Industrial Science andTechnology，其保藏號(hào)為FERM P-13936。然后，在1994年11月1日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-4859。RSFD80可用已知的方法由AJ12396菌株獲得。
含有dapA突變基因的RSFD80，其中如SEQ ID NO3所示的野生型dapA的核苷酸序列中第597位由C變成T。以上核苷酸替換的結(jié)果是具有SEQ IDNO4的野生型DDPS的第118位的組氨酸殘基變成酪氨酸殘基，其中所述野生型DDPS由具有SEQ ID NO3的野生型dapA編碼。此外，含有l(wèi)ysC突變基因的RSFD80，其野生型lysC核苷酸序列的第1638位由C變成T。該突變形成了突變體AKIII，其第352位的蘇氨酸殘基變成了異亮氨酸殘基。
可使用任何方法將如上制備的重組DNA導(dǎo)入嗜甲基菌屬細(xì)菌或者甲基小桿菌屬細(xì)菌，只要它能提供足夠的轉(zhuǎn)化效率。例如，可使用電穿孔(Canadian Journalof Microbiolgy，43，197(1997))。
可通過(guò)將基因的多個(gè)拷貝導(dǎo)入嗜甲基菌屬細(xì)菌的染色體DNA來(lái)獲得目的基因的提高表達(dá)。dapA和lysC的多個(gè)拷貝可以用同源重組的方法導(dǎo)入嗜甲基菌屬細(xì)菌染色體DNA。這可以通過(guò)靶定染色體DNA有多個(gè)拷貝的序列來(lái)完成?？赊D(zhuǎn)座元件末端的重復(fù)DNA或反向重復(fù)序列可用作這種多拷貝的染色體DNA序列。換句話說(shuō)，正如JP 2-109985 A公開(kāi)的，通過(guò)將目的基因的多個(gè)拷貝并入轉(zhuǎn)座子將其轉(zhuǎn)移的方法，可使它們導(dǎo)入染色體DNA。在這兩種方法中，轉(zhuǎn)化子細(xì)菌中目的基因拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致了目的基因活性的增強(qiáng)。
除了上述基因放大的方法，通過(guò)替換表達(dá)控制序列的方法，例如更強(qiáng)的dapA和lysC啟動(dòng)子(見(jiàn)JP1-215280 A)，也可提高目的基因的表達(dá)量。強(qiáng)啟動(dòng)子的例子包括lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ嗜菌體的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、amyE啟動(dòng)子和spac啟動(dòng)子等等。使用這些啟動(dòng)子可以提高目的基因的表達(dá)，因此這些基因產(chǎn)物的活性得以增強(qiáng)。這些增加基因表達(dá)量的方法可和上述基因擴(kuò)增(增加目的基因的拷貝數(shù))的方法結(jié)合使用。
制備重組DNA可以通過(guò)利用相應(yīng)于基因片段末端的限制性?xún)?nèi)切酶消化載體，再將基因片段連接到載體上來(lái)完成。連接通常使用T4DNA連接酶來(lái)完成。那些對(duì)所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)常用的已知方法可用作消化方法，包括DNA的連接、染色體DNA的制備、PCR、質(zhì)粒DNA的制備、轉(zhuǎn)化、引物寡聚核苷酸的設(shè)計(jì)等等。這些方法在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.著的“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等等中有描述。
為了增強(qiáng)DDPS和AK基因的表達(dá)或者其活性，還可能需要增強(qiáng)參與L-賴(lài)氨酸生物合成的其它酶。這樣的酶包括二氨基庚二酸鹽途徑酶，如二氫吡啶二羧酸還原酶，二氨基庚二酸鹽脫羧酶，二氨基庚二酸鹽脫氫酶(所有前述的酶參見(jiàn)WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(JP60-87788A)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(JP6-1020280A)，二氨基庚二酸鹽差向酶和天冬氨酸半醛脫氫酶；氨基己二酸途徑酶如高烏頭酸水合酶等等。
WO00/61723描述了來(lái)源于甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌的天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸鹽脫羧酶。
此外，本發(fā)明的微生物可能已降低了催化從L-賴(lài)氨酸生物合成路徑中分支出去的產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸以外化合物反應(yīng)的酶活性，或者是該酶缺陷。此處所說(shuō)催化從L-賴(lài)氨酸生物合成路徑中分支出去的產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸以外化合物反應(yīng)的酶可以是高絲氨酸脫氫酶(見(jiàn)WO95/23864)。
前述的增強(qiáng)L-賴(lài)氨酸的相關(guān)生物合成酶活性的技術(shù)可同樣用于L-精氨酸。
通過(guò)增強(qiáng)乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；富钚裕琋-乙酰谷氨酸-g-半醛脫氫酶活性，N-乙酰谷氨酸激酶活性以及精氨琥珀酸酶的活性可提高L-精氨酸的生產(chǎn)能力(見(jiàn)JP5-23750)。
通過(guò)增強(qiáng)谷氨酸脫氫酶(EP1057893A1)，精氨琥珀酸合成酶(EP0999267A1)，氨甲酰磷酸合成酶(EP1026247A1)或N-乙酰谷氨酸合成酶(JP57-5693A)的活性，或者是通過(guò)破壞編碼精氨酸抑制物的基因(argR)，可提高L-精氨酸的生產(chǎn)能力。
L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的生產(chǎn)可以通過(guò)培養(yǎng)一種能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的甲醇同化細(xì)菌，例如嗜甲基屬細(xì)菌或者甲基小桿菌屬細(xì)菌，生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸。經(jīng)過(guò)生產(chǎn)和積累，L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸可以從如上述所說(shuō)的培養(yǎng)基中獲得，然后可以從培養(yǎng)物中收集L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸。
本發(fā)明的微生物可以利用一種典型的甲醇同化細(xì)菌培養(yǎng)方法培育。本發(fā)明的培養(yǎng)基可使用天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，只要它含有碳源，氮源，無(wú)機(jī)離子和其它所需的痕量有機(jī)成分。
如果使用甲醇用作主要碳源，可以降低L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸的生產(chǎn)成本，如果使用甲醇作為主要碳源，培養(yǎng)基中甲醇的添加濃度是0.001-30％。至于氮源，可將硫酸銨等添加到培養(yǎng)基中。除此之外，還可以少量添加痕量成分，例如磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳。
培養(yǎng)通常通過(guò)振蕩或攪拌在有氧條件下進(jìn)行，pH值維持5-9之間，溫度維持20-45℃之間，培養(yǎng)通常在24-120小時(shí)內(nèi)完成。
L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸通?？梢酝ㄟ^(guò)結(jié)合使用離子交換樹(shù)脂方法、沉淀方法以及其它已知方法來(lái)收集。
實(shí)施例下文中，我們將以?xún)?yōu)選的實(shí)施例的方式，來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
除非另有說(shuō)明外，本發(fā)明所使用的試劑均由Wako Pure Chemical Industriesof Nalarai Tesque生產(chǎn)。實(shí)施例中所用培養(yǎng)基的組分如下，其pH值是用NaOH、KOH，或HCl來(lái)調(diào)節(jié)。
LB培養(yǎng)基Bacto蛋白胨(Difco) 10g/L酵母提取物(Difco) 5g/LNaCl 10g/LpH7.0120℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
LB瓊脂培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基Bacto瓊脂 15g/L120℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
SEII培養(yǎng)基K2HPO41.9g/LNaH2PO41.56g/LMgSO4·7H2O 0.2g/L(NH4)2SO45g/LCuSO4·5H2O 5μg/LMnSO4·5H2O 25μg/lZnSO4·7H2O 23μg/LCaCl2·2H2O 72mg/LFeCl3·6H2O 9.7mg/LCaCO3(Kanto Kagaku) 30g/L甲醇2％(v/v)pH7.0除甲醇外的其它組分于121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘，待其冷卻后再加入甲醇。
SEII瓊脂培養(yǎng)基
K2HPO41.9g/LNaH2PO41.56g/LMgSO4·7H2O 0.2g/L(NH4)2SO45g/LCuSO4·5H2O 5μg/LMnSO4·5H2O 25μg/lZnSO4·7H2O 23μg/LCaCl2·2H2O 72mg/LFeCl3·6H2O 9.7mg/L甲醇 0.5％(v/v)pH7.0Bacto瓊脂(Difco) 15g/L除甲醇外的其它組分于121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘，待其冷卻后再加入甲醇。
實(shí)施例1突變體lysE基因文庫(kù)的構(gòu)建首先，將已知能增強(qiáng)棒狀細(xì)菌體內(nèi)L-賴(lài)氨酸分泌的基因的同源基因lysE從短桿菌細(xì)菌內(nèi)克隆出來(lái)，并使其在嗜甲基菌細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)。
(1)pRSlysE的構(gòu)建為了將lysE基因?qū)氲绞燃谆鷮偌?xì)菌體內(nèi)，本發(fā)明采用了已知質(zhì)粒pRS(見(jiàn)JP3-501682)來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒pRSlysE以表達(dá)lysE。pRS質(zhì)粒是具有pVIC40質(zhì)粒的載體片段的一種質(zhì)粒(見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)專(zhuān)利WO90/04636，JP3-501682)，通過(guò)缺失pVIC40中一個(gè)編碼蘇氨酸操縱子的DNA片段而獲得。pVIC40質(zhì)粒來(lái)源于一個(gè)具有廣譜宿主的載體質(zhì)粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)，該質(zhì)粒來(lái)源于RSF1010。
具體而言，pRS是通過(guò)如下方式構(gòu)建的。將pVIC40質(zhì)粒用EcoRI酶切，然后加入到苯酚/氯仿溶液中，混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離。通過(guò)使用EASY TRAPVer.2可收集到一個(gè)包含載體部分的大約8千個(gè)堿基對(duì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“kbp”)的DNA片段。通過(guò)DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)使上述pVIC40質(zhì)粒的載體片段進(jìn)行自身連接。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara Shuzo)細(xì)胞，并將細(xì)胞涂布于含20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)，并將瓊脂培養(yǎng)基上形成的克隆接種于含20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。使用堿性SDS方法從每份培養(yǎng)液中抽提質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切來(lái)證實(shí)并獲得pRS。
接下來(lái)，根據(jù)圖1所示方案來(lái)構(gòu)建包含tac啟動(dòng)子的質(zhì)粒pRStac。其構(gòu)建如下。首先，使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和PstI消化載體pRS，然后加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，通過(guò)使用EASY TRAP Ver.2可收集到一個(gè)包含載體部分的大約8千個(gè)堿基對(duì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“kbp”)的DNA片段。另一方面，以pKK223-3質(zhì)粒(表達(dá)載體，Pharmacia)為模板，以SEQ ID NO7和8所示序列為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增tac啟動(dòng)子序列(一個(gè)循環(huán)包括94℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán))。PCR反應(yīng)中使用PyrobestDNA聚合酶。使用PCR prep(Promega)來(lái)純化含有擴(kuò)增啟動(dòng)子的DNA片段，再對(duì)預(yù)先設(shè)計(jì)的引物中限制性酶位點(diǎn)(即EcoRI和EcoT22I位點(diǎn))進(jìn)行限制性酶切。再加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，通過(guò)使用EASY TRAPVer.2可收集到一個(gè)大約0.15kbp的DNA片段。
將上述制備的pRS載體和tac啟動(dòng)子片段的消化產(chǎn)物通過(guò)DNA連接試劑盒Ver.2(Kakara Shuzo)連接起來(lái)。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara Shuzo)細(xì)胞。并將細(xì)胞涂布于含20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將瓊脂培養(yǎng)基上形成的克隆接種于含20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。使用堿性SDS方法從每份培養(yǎng)液中抽提質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切來(lái)證實(shí)并獲得pRStac。選擇出pRS載體上鏈霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄方向和tac啟動(dòng)子一致的質(zhì)粒，即為pRStac。
將上面所述的pRStac用Sse8387I(Takara Shuzo)和SapI(New England Biolabs)消化，加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，獲得大約9.0kbp的DNA片段。
同樣，以從乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC13869)中提取的染色體為模板，以SEQ ID NO9和10所示序列為引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增lysE基因(94℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒)。PCR反應(yīng)中使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)。為了使lysE基因能夠在嗜甲基菌細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)，引物的設(shè)計(jì)使得距離lysE基因翻譯起始密碼子9-15個(gè)堿基對(duì)的核苷酸被嗜甲基菌細(xì)菌內(nèi)的一個(gè)已知功能序列所取代(Wyborn，N.R.，Mills.j.，Williamis，S.G.and Jones，C.W.，Eur，J.Biochem.，240，314-322(1996))。通過(guò)PCR prep(Promega)純化所獲得目的片段，并用Sse8387I和SapI消化。加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)一步收集。
將上述制備的pRStac載體和lysE基因片段的消化產(chǎn)物通過(guò)DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)進(jìn)行連接。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara Shuzo)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布于含20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將瓊脂培養(yǎng)基上形成的克隆接種于含20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。使用堿性SDS方法從培養(yǎng)液中抽提質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切來(lái)證實(shí)每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，并確定核苷酸序列獲得pRSlysE(圖1)。在pRSlysE中，lysE基因的安置方向使得其轉(zhuǎn)錄方向與tac啟動(dòng)子的一致。
(2)pRSlysE向嗜甲基菌細(xì)菌中的導(dǎo)入將如上所獲的pRSlysE通過(guò)電穿孔方法導(dǎo)入甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。此外，以與pRSlysE同樣的方式，將pRS也導(dǎo)入AS1菌株中作為對(duì)照。結(jié)果，pRS對(duì)照組中1μgDNA形成了上千個(gè)克隆，而pRSlysE卻僅獲得幾個(gè)克隆。
從估計(jì)導(dǎo)入了pRSlysE的轉(zhuǎn)化菌株中提取質(zhì)粒，并研究其核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)，在所有被研究質(zhì)粒的編碼lysE基因序列中都引入了一個(gè)自發(fā)突變，在有些質(zhì)粒中該突變?yōu)闊o(wú)意突變，即一個(gè)編碼氨基酸的密碼子被終止翻譯的終止密碼子替代。此外，在其它一些質(zhì)粒中，還觀察到lysE基因的缺失。從而認(rèn)為由該質(zhì)粒所攜帶的lysE基因應(yīng)該不具備功能。
如上所述，攜帶全長(zhǎng)lysE基因的質(zhì)粒pRSlysE被導(dǎo)入到甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌中的幾率是非常低的，只有含有突變因而喪失功能的lysE突變基因才能被被導(dǎo)入。綜合考慮這些事實(shí)，我們認(rèn)為lysE基因的導(dǎo)入起到致命效應(yīng)。這表明lysE基因?qū)τ诋愒醇?xì)菌中L-賴(lài)氨酸的分泌不能普遍發(fā)揮作用。
將含有引入突變的質(zhì)粒pRSlysE的甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1涂布于含有50mg/L鏈霉素的SEII培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。然后，從培養(yǎng)基表面刮取大約10cm2的細(xì)胞接種于含有50mg/L鏈霉素的SEII生產(chǎn)培養(yǎng)基中(20ml)，37℃振蕩培養(yǎng)34小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除細(xì)胞，并使用氨基酸分析儀來(lái)測(cè)定培養(yǎng)基上清液中L-賴(lài)氨酸的濃度(Nihon Bunko，高效液相色譜)。結(jié)果表明，盡管導(dǎo)入了突變lysE基因，但沒(méi)有任何菌株的L-賴(lài)氨酸分泌有所增強(qiáng)。
如上所述，將來(lái)源于棒桿菌細(xì)菌的已知基因lysE導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌導(dǎo)致了致命效應(yīng)。在這些僅導(dǎo)入了少量lysE基因的菌株中，被導(dǎo)入的lysE基因或突變，或缺失，從而不能發(fā)揮作用。由于負(fù)責(zé)氨基酸分泌的蛋白只有當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞膜中才發(fā)揮功能，因此蛋白和細(xì)胞膜的條件，如磷脂的組成，必須相互匹配。因此，認(rèn)為很難以此種維持蛋白功能的方式來(lái)表達(dá)來(lái)源于異源組織的細(xì)胞膜蛋白。相應(yīng)地，我們估計(jì)，如果使用人工突變導(dǎo)入方法，那么與自然突變相比，將會(huì)得到更多陽(yáng)性突變，從這些突變中很可能成功獲得具有L-賴(lài)氨酸分泌能力的突變lysE菌株?；谶@一設(shè)想，我們使用本文所述的羥胺突變導(dǎo)入方法來(lái)構(gòu)建突變體lysE文庫(kù)。
此外，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，如果在甲醇同化細(xì)菌中表現(xiàn)出L-賴(lài)氨酸分泌活性的突變lysE基因被導(dǎo)入到甲醇一吸收細(xì)菌中，對(duì)AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)，即化合物L(fēng)-賴(lài)氨酸的類(lèi)似物的抗性程度可能會(huì)有所提高?；谶@一觀念，發(fā)展了本文所述的篩選系統(tǒng)。首先，將詳細(xì)描述突變體lysE文庫(kù)的構(gòu)建。
(3)pRSlysE質(zhì)粒的突變處理將含有攜帶著野生型lysE(從Takara Shuzo獲得)基因的pRSlysE質(zhì)粒的E.coliJM109菌株接種于含有20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，再用堿性SDS方法從每管培養(yǎng)基中提取質(zhì)粒DNA。
接下來(lái)，使用羥胺進(jìn)行體外突變法，將突變引入制備好的pRSlysE中。也就是說(shuō)，將濃度為250mM的磷酸鉀緩沖液pH調(diào)節(jié)為6.0，將濃度為400mM的羥胺溶液pH調(diào)節(jié)為6.0，這兩個(gè)濃度均為其終濃度，取2μg pRSlysE質(zhì)粒和200μl水，并于75℃培養(yǎng)2小時(shí)或3小時(shí)。接下來(lái)，使用EASY TRAP Ver.2方法(DNA收集試劑盒，Takara Shuzo)從溶液中收集pRSlysE質(zhì)粒。將與羥胺反應(yīng)2個(gè)小時(shí)和3個(gè)小時(shí)的質(zhì)?；旌显谝黄?，獲得質(zhì)粒集合體，這些質(zhì)粒以不同比例引入了突變。
以如上方法獲得了突變體pRSlysE質(zhì)粒集合體，該質(zhì)粒集合體被認(rèn)為在不同位置引入了突變，擴(kuò)增質(zhì)粒，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara Shuzo)細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，構(gòu)建大腸桿菌文庫(kù)。將瓊脂培養(yǎng)基上形成的所有克隆刮下來(lái)，接種于含20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。通過(guò)堿性SDS方法從每份培養(yǎng)液中提取質(zhì)粒DNA作為突變體pRSlysE質(zhì)粒文庫(kù)。突變體pRSlysE質(zhì)粒向嗜甲基菌細(xì)菌中的導(dǎo)入過(guò)程以及L一氨基酸的產(chǎn)生。
(1)從帶有人工突變體的lysE文庫(kù)中篩選功能型lysE通過(guò)電穿孔方法將按上述方法獲得的突變體pRSlysE質(zhì)粒文庫(kù)(CanadianJournal of Microbiology，43，197(1997))導(dǎo)入到甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)中。同時(shí)又將野生型質(zhì)粒pRSlysE導(dǎo)入的AS1菌株作為對(duì)照。結(jié)果表明，作為對(duì)照的樣品又再現(xiàn)了以前的檢測(cè)結(jié)果，即1μgDNA只獲得了幾個(gè)克隆。而導(dǎo)入突變體質(zhì)粒文庫(kù)時(shí)，卻產(chǎn)生了成百上千個(gè)克隆。到目前為止的檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)導(dǎo)入野生型質(zhì)粒時(shí)，所獲得的幾個(gè)克隆幾乎全部都是由于引入了自然突變而使lysE喪失了功能。也就是說(shuō)，攜帶全長(zhǎng)lysE基因的pRSlysE導(dǎo)入到甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌中的幾率是非常低的，只有含有導(dǎo)致功能喪失的突變的lysE基因質(zhì)粒才能夠被導(dǎo)入。綜合考慮這些事實(shí)，我們認(rèn)為lysE基因向甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌的導(dǎo)入產(chǎn)生了一個(gè)致命效應(yīng)。另一方面，由于導(dǎo)入突變體pRSlysE質(zhì)粒文庫(kù)時(shí)，所產(chǎn)生的克隆要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于導(dǎo)入野生型質(zhì)粒，因此通過(guò)羥胺處理而產(chǎn)生的突變體會(huì)達(dá)到一個(gè)很高的頻率。
如上所述，我們獲得了突變體lysE文庫(kù)作為突變體pRSlysE質(zhì)粒文庫(kù)。那么，我們就建立了一個(gè)篩選系統(tǒng)來(lái)獲得表現(xiàn)出細(xì)胞外分泌L-賴(lài)氨酸活性的功能型lysE。
將按上述方式獲得的含有突變體pRSlysE質(zhì)粒文庫(kù)的甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌菌株進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)沟妹總€(gè)平板上能長(zhǎng)出幾百個(gè)克隆，并將其涂布于含有50mg/L的鏈霉素和3g/L蘇氨酸的SEII瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。將長(zhǎng)出的克隆復(fù)制到含3g/L蘇氨酸和0、5、7或10g/L AEC的SEII瓊脂培養(yǎng)基上。當(dāng)這些克隆被復(fù)制到不含有AEC的平板上時(shí)，所長(zhǎng)出的克隆數(shù)目和最初平板中克隆的數(shù)目一致，而當(dāng)它們被復(fù)制到含有AEC的平板上時(shí)，所長(zhǎng)出的克隆的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最初平板中克隆的數(shù)目。將在含有AEC的復(fù)制平板上形成的克隆以其各自的濃度轉(zhuǎn)移到新的含有AEC的SEII瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)，在同樣的培養(yǎng)基上形成了單一菌落，基于該發(fā)現(xiàn)，我們證實(shí)其獲得了AEC抗性。從這些菌株中，隨機(jī)挑選100個(gè)菌株用于進(jìn)一步篩選。
(2)利用引入突變體pRSlysE質(zhì)粒的菌株來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸。
在含有突變質(zhì)粒pRSlysE(該突變質(zhì)粒被預(yù)計(jì)能夠以帶有突變的形式被導(dǎo)入，并能夠賦予宿主AEC抗性)的甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株中，取出100個(gè)菌株涂布于含有50mg/L鏈霉素的SEII平板上37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后刮取培養(yǎng)基表面上約10cm2的細(xì)胞，接種于含有50mg/L鏈霉素的SEII(20ml)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除細(xì)胞，通過(guò)薄層色譜分離培養(yǎng)液上清中含有的L-氨基酸，并利用水合印三酮檢測(cè)法粗略定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸以不同的濃度被分泌到胞外。根據(jù)它們的方式，可將這100個(gè)菌株大致分為5組。
從這5組中選擇一個(gè)典型的菌株，并將它們體內(nèi)的質(zhì)粒分別命名為pRSlysE561、pRSlysE562、pRSlysE563、pRSlysE564、pRSlysE565。純化這些質(zhì)粒，并分析它們的lysE區(qū)域的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pRSlysE562和pRSlysE563，pRSlysE561和pRSlysE564的序列完全相同。因此，我們接下來(lái)著重研究pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565。
分析了pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565內(nèi)LysE蛋白編碼區(qū)域的核苷酸序列，我們發(fā)現(xiàn)，與SEQ ID NO1所示的野生型LysE堿基序列相比，lysE564在第166位上發(fā)生了堿基替換，即由A(腺嘌呤)替換了G(鳥(niǎo)嘌呤)。結(jié)果導(dǎo)致在SEQ ID NO2所示的野生型lysE的氨基酸序列中第56位上由Ser(絲氨酸)替換了Gly(甘氨酸)。還發(fā)現(xiàn)，lysE562的堿基也發(fā)生了替換，SEQID NO1所示的野生型LysEDNA序列中第166位上A(腺嘌呤)替換了G(鳥(niǎo)嘌呤)，第410位上A(腺嘌呤)替換了G(鳥(niǎo)嘌呤)，結(jié)果，導(dǎo)致SEQ ID NO2所示的野生型lysE的氨基酸序列中第56位上Ser(絲氨酸)替換了Gly(甘氨酸)，第137位上Gly(甘氨酸)替換了Asp(天冬氨酸)。研究還發(fā)現(xiàn)，lysE565的堿基替換為SEQ ID NO1所示的野生型LysE DNA序列中第166位上A(腺嘌呤)替換G(鳥(niǎo)嘌呤)，第163位上A(腺嘌呤)替換G(鳥(niǎo)嘌呤)，結(jié)果導(dǎo)致氨基酸的替換為SEQ ID NO2所示的野生型lysE的氨基酸序列中第56位上Ser(絲氨酸)替換了Gly(甘氨酸)，第55位上Thr(蘇氨酸)替換Ala(丙氨酸)。當(dāng)pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565被再一次導(dǎo)入菌株中時(shí)，這些質(zhì)粒能以與pRS同樣的頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)化。導(dǎo)入質(zhì)粒后的菌株按上述方法進(jìn)行培養(yǎng)，并使用氨基酸分析儀(Nihon Bμnko，高效液相色譜)對(duì)培養(yǎng)基上清液中的L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸的濃度進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。
表1

以上結(jié)果顯示，pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565具有顯著增強(qiáng)L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸分泌的活性，而且即使pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565被導(dǎo)入到AS1菌株中，增強(qiáng)L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸分泌的活性仍然存在。因此，表明獲得ACE抗性的菌株的突變被引入在質(zhì)粒上，而不是在宿主細(xì)胞上。
與SEQ ID NO2所示的野生型lysE基因的氨基酸序列相比，pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565均在第56位引入了同義突變，即該位置的氨基酸由Ser(絲氨酸)替換了原來(lái)的Gly(甘氨酸)。轉(zhuǎn)化了只有這一同義突變的質(zhì)粒pRSlysE564的大腸桿菌菌株JM109被命名為AJ110086。根據(jù)布達(dá)佩斯國(guó)際公約對(duì)國(guó)際保藏的要求，此菌株已于2002年9月26日被保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏中心，national institute of advanced industrial science and technology，保藏號(hào)為FERM BP-8196。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已知方法很容易從lysE564獲得lysE562和lysE565。具體而言，可將來(lái)自pRSlysE564的lysE564編碼區(qū)域的一個(gè)片段并入到例如pSELECTIM-1載體中來(lái)獲得lysE562基因，其中所述pSELECTTM-1載體為由Promega公司生產(chǎn)的用于導(dǎo)入定點(diǎn)突變的載體，定點(diǎn)突變的引入是通過(guò)AlteredStesTM，其為Promega公司生產(chǎn)的用于引入位點(diǎn)一定向突變?cè)噭┖?，將SEQ IDNO1第410位由堿基G(鳥(niǎo)嘌呤)替換A(腺嘌呤)。例如，在上述過(guò)程中，將序列SEQ ID NO5的合成寡核苷酸作為引物。在野生型lysE基因中，SEQ IDNO5第20位核苷酸被替換。同樣的，可通過(guò)在SEQ ID NO1的第166位上由A(腺嘌呤)替換G(鳥(niǎo)嘌呤)，得到lysE565。為了引入突變，使用例如SEQ IDNO6的合成寡核苷酸。野生型lysE基因中SEQ ID NO6的第16位和19位核苷酸被替換。
實(shí)施例2L-賴(lài)氨酸生物合成酶基因和lysE562、lysE564或lysE565基因向甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌中的導(dǎo)入由于發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入lysE562、lysE564或lysE565基因可增強(qiáng)L-賴(lài)氨酸的細(xì)胞外分泌，因此可通過(guò)導(dǎo)入lysE562、lysE564或lysE565來(lái)增強(qiáng)L-賴(lài)氨酸的生物合成，從而進(jìn)一步提高它們的產(chǎn)量。
(1)攜帶dapA*基因的pRSdapA質(zhì)粒的構(gòu)建首先準(zhǔn)備一個(gè)載體，該載體含有編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的基因作為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸生物合成體系酶基因，所述酶并不受L-賴(lài)氨酸(dapA*)的反饋抑制。
將實(shí)施例1中準(zhǔn)備的pRStac用Sse8387I和XbaI消化，然后將其加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，獲得大約9kbp的DNA片段。
使用含有dapA*基因的已知質(zhì)粒RSFD80(見(jiàn)WO90/16042)為模板，SEQ IDNO11和12所示序列為引物，通過(guò)PCR方法(94℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒)擴(kuò)增dapA*基因片段。PCR反應(yīng)中使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)。將獲得的dapA*擴(kuò)增片段用PCR prep(Promega)純化，再用限制性?xún)?nèi)切酶Sse8387I和XbaI消化。將反應(yīng)混合物中加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，獲得大約01kbp的DNA片段。
將上述制備好的pRStac載體和dapA*基因片段酶切產(chǎn)物用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)進(jìn)行連接。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara Shuzo)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布于含20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將瓊脂培養(yǎng)基上形成的克隆接種于含20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。使用堿性SDS方法從每份培養(yǎng)液中抽提質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切來(lái)證明每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，并確定核苷酸序列，得到pRSdapA質(zhì)粒。在pRSdapA質(zhì)粒中，dapA*基因安置的方向使得其轉(zhuǎn)錄方向與tac啟動(dòng)子的一致。
(2)含有dapA*基因和lysE562、lysE564或lysE565任一基因的質(zhì)粒的構(gòu)建為了評(píng)價(jià)lysE562、lysE564或lysE565任一基因與dapA*基因結(jié)合的效應(yīng)，通過(guò)插入dapA*基因，構(gòu)建質(zhì)粒pRSlysE562、pRSlysE564和pRSlysE565。將實(shí)施例1中制備好的pRSlysE562、pRSlysE564和pRSlysE565質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶SapI消化，并使用DNA平頭試劑盒(Kakara Shuzo)處理成平頭末端。此外，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和SapI消化質(zhì)粒pRSdapA，并通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離得到大約1kb的片段，該片段含有tac啟動(dòng)子和dapA*序列，用EASYTRAP Ver.2收集該片段。按上述方法平頭處理該片段，用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)將其連接到前面提及的pRSlysE562、pRSlysE564和pRSlysE565質(zhì)粒消化產(chǎn)物上。
用先前提及的連接好的反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara)，并將細(xì)胞涂布于含20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將瓊脂培養(yǎng)基上形成的克隆接種于含20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。使用堿性SDS方法從培養(yǎng)液中抽提質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切來(lái)證實(shí)每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，并確定核苷酸序列，得到pRSlysE562dapA，pRSlysE564dapA和pRSlysE565dapA質(zhì)粒。在這些質(zhì)粒中，lysE562，lysE564和lysE565的安置方向使得其轉(zhuǎn)錄方向與dapA*的轉(zhuǎn)錄方向相反。
當(dāng)通過(guò)電穿孔法將按上述方法獲得的pRSlysE562dapA，pRSlysE564dapA和pRSlysE565dapA質(zhì)粒導(dǎo)入甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)中時(shí)，我們得到了pRSlysE562dapA和pRSlysE564dapA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，而沒(méi)有得到pRSlysE565dapA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株。這可能是因?yàn)樵撡|(zhì)粒在AS1菌株中穩(wěn)定性降低的緣故。
(3)含有l(wèi)ysE562或lysE564和dapA*的嗜甲基屬細(xì)菌中L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)將上述獲得的導(dǎo)入了pRSlysE562dapA或pRSlysE564dapA質(zhì)粒的AS1菌株，以及作為對(duì)照菌株的導(dǎo)入了pRSlysEdapA的AS1菌株涂布于含20mg/L鏈霉素的SEII培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)基表面細(xì)菌中刮取0.3cm2的細(xì)胞，接種于含有20mg/L鏈霉素的SEII生產(chǎn)培養(yǎng)基(20ml)上，37℃振蕩培養(yǎng)34小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除細(xì)胞，并通過(guò)氨基酸分析儀(Nihon Bunko，高效液相色譜)測(cè)量培養(yǎng)基上清液中L-賴(lài)氨酸的濃度。表2顯示了測(cè)量結(jié)果。導(dǎo)入了pRSlysE562dapA或pRSlysE564dapA質(zhì)粒的菌株L-賴(lài)氨酸的聚積有所提高。而且它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的聚積程度明顯超出了僅導(dǎo)入pRSlysE562或pRSlysE564質(zhì)粒的菌株。因此，可以看出，分泌的限速因素已被消除，dapA*基因的增強(qiáng)效應(yīng)被明顯展現(xiàn)出來(lái)。
表2

實(shí)施例3lysE564基因向產(chǎn)糖甲基小桿菌的導(dǎo)入和L-氨基酸的生產(chǎn)(1)pRS-lysE564-Tc的制備接下來(lái)需要證實(shí)是，含有突變lysE的lysE562、lysE564和lysE565三個(gè)基因是否能夠在甲基菌屬細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮功能。為此，我們選擇了lysE564，并將表達(dá)它的質(zhì)粒pRSlysE564做了改進(jìn)。pRSlysE564質(zhì)粒攜帶有鏈霉素抗性基因。然而，由于產(chǎn)糖甲基小桿菌本身就具有鏈霉素抗性，所以，pRSlysE質(zhì)粒不能被篩選出來(lái)。因此，通過(guò)在pRSlysE質(zhì)粒中插入可在產(chǎn)糖甲基小桿菌中使用的四環(huán)素抗性基因來(lái)構(gòu)建改進(jìn)的質(zhì)粒。
首先，從pRSlysE564質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建攜帶有四環(huán)素抗性基因的pRS-lysE564-Tc質(zhì)粒。將pRSlysE564質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI消化，并加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，用乙醇沉淀收集DNA，使用DNA平頭試劑盒(Takara Shuzo)將其消化的末端處理成平頭。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離DNA片段，使用EASY TRAP Ver.2(DNA收集試劑盒，Takara Shuzo)收集一段大約9千堿基對(duì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“kbp”)的DNA片段。
此外，以pRK310質(zhì)粒(Pansegrau et al.，J.Mol.Biol.239，623-663(1994))為模板，以SEQ ID NO13和14所示序列為引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因區(qū)域(一個(gè)循環(huán)包括94℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán))，PCR反應(yīng)中使用PyrobestDNA聚合酶。用PCR prep(Promega)對(duì)擴(kuò)增后的含有四環(huán)素抗性基因區(qū)域的DNA片段進(jìn)行純化，然后通過(guò)乙醇沉淀法收集DNA，并使用TaKaRa BKL試劑盒對(duì)其進(jìn)行末端平頭處理和磷酸化處理(Blunting Kination Ligation Kit，Takara Shuzo)，再加入到苯酚/氯仿溶液中混合終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離。通過(guò)使用EASYTRAP Ver.2可收集到一個(gè)大約1.5kbp的DNA片段。
可通過(guò)與上述類(lèi)似的方法，使用其它質(zhì)粒如pRK2質(zhì)粒作為替代Prk310的模板，獲得四環(huán)素抗性基因。
將如上制備的pRSlysE564載體片段和含有四環(huán)素抗性基因區(qū)域的DNA片段通過(guò)DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)連接起來(lái)。用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，Takara Shuzo)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有20mg/L鏈霉素和15mg/L四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將瓊脂培養(yǎng)基上形成的克隆接種于含20mg/L鏈霉素和15mg/L四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。使用堿性SDS方法從每份培養(yǎng)液中提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶消化來(lái)確認(rèn)每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，得到pRSlysE-564-Tc。
(2)pRSlysE-564-Tc向甲基小桿菌屬細(xì)菌中的導(dǎo)入和L-氨基酸的生產(chǎn)通過(guò)電穿孔方法將如上所獲得的pRSlysE-564-Tc導(dǎo)入產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株NCIMB11375中(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。將pRK310以同樣的方式導(dǎo)入到產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株NCIMB11375中，作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得了與對(duì)照相同轉(zhuǎn)化率的含pRSlysE-564-Tc的克隆。
通過(guò)在攜帶有野生型lysE基因的質(zhì)粒pRSlysE中插入四環(huán)素抗性基因，構(gòu)建得到了pRSlysET質(zhì)粒，并試著將該質(zhì)粒以同樣的方式被導(dǎo)入到產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株中。然而，并沒(méi)有獲得轉(zhuǎn)化菌株，在甲基營(yíng)養(yǎng)型嗜甲基菌AS1菌株中也觀察到了同樣的現(xiàn)象，因此，估計(jì)野生型lysE基因在甲基菌屬細(xì)菌中也不能正常發(fā)揮功能。
將含有pRS-lysE-564-Tc質(zhì)粒的產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株NCIMB11375涂布于含有10mg/L四環(huán)素的SEII平板上30℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后，從培養(yǎng)基表面刮取大約10cm2的細(xì)胞接種于含有10mg/L四環(huán)素的SEII生產(chǎn)培養(yǎng)基中(20ml)，30℃振蕩培養(yǎng)60小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除細(xì)胞，并使用氨基酸分析儀來(lái)測(cè)定培養(yǎng)上清液中L-賴(lài)氨酸的濃度(Nihon Bunko，高效液相色譜)。結(jié)果如下表3
表3

(3)pRS-lysE564-dapA-Tc已發(fā)現(xiàn)lysE564基因?qū)氲疆a(chǎn)糖甲基小桿菌菌株中可使L-賴(lài)氨酸在培養(yǎng)基中積聚，認(rèn)為這是由于L-賴(lài)氨酸分泌的增強(qiáng)的緣故。
相應(yīng)地，在產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株中共同表達(dá)L-賴(lài)氨酸生物合成基因和lysE564基因而產(chǎn)生的增強(qiáng)效應(yīng)根據(jù)與實(shí)施例2相同的方式檢測(cè)。
按照與實(shí)施例3(1)相同的方法，將四環(huán)素抗性基因融入到在實(shí)施例2(2)中制備好的pRSlysE564dapA質(zhì)粒中，來(lái)構(gòu)建另一個(gè)質(zhì)粒，該質(zhì)粒被命名為pRS-lysE564-dapA-Tc。
(4)pRS-lysE564-dapA-Tc向產(chǎn)糖甲基小桿菌中的導(dǎo)入和L-氨基酸的生產(chǎn)通過(guò)電穿孔法，將按上述方法獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入到產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株NCIMB11375中，并檢測(cè)所獲轉(zhuǎn)化菌株(以下稱(chēng)為NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc)的培養(yǎng)基上清液中L-氨基酸的濃度，使用上述導(dǎo)入了pRS-lysE564-Tc質(zhì)粒的產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株(以下稱(chēng)為NCIMB11375/pRS-lysE564-Tc)和導(dǎo)入了pRK310質(zhì)粒的產(chǎn)糖甲基小桿菌菌株(以下稱(chēng)為NCIMB11375/pRS310)作為對(duì)照。
將每一個(gè)轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)于含有10mg/L四環(huán)素的SEII平板上，30℃培養(yǎng)兩天。然后從培養(yǎng)基表面刮取10cm2細(xì)胞，接種于含有10mg/L四環(huán)素的SEII生產(chǎn)培養(yǎng)基上，30℃振蕩培養(yǎng)60小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除培養(yǎng)基表面的細(xì)胞，使用氨基酸分析儀來(lái)測(cè)定培養(yǎng)基上清液中L-氨基酸的濃度。
表4顯示了檢測(cè)結(jié)果。在含有導(dǎo)入了NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc質(zhì)粒的菌株的培養(yǎng)基中，L-賴(lài)氨酸大量積聚，且該積聚程度與只導(dǎo)入了pRS-lysE564-Tc的菌株相比有所提高。因此，認(rèn)為分泌的限速因素由于lysE564基因的導(dǎo)入而被消除，dap*基因的增強(qiáng)效應(yīng)被展現(xiàn)出來(lái)。
表4

以上我們以?xún)?yōu)選的實(shí)施方式詳細(xì)描述了本發(fā)明，對(duì)其進(jìn)行各種修改以及等同手段的替換對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講是顯而易見(jiàn)的，并不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述的每篇文獻(xiàn)均全文并入本文作為參考，其中包括作為外國(guó)優(yōu)先權(quán)文本的JP2002-336315。
序列表解釋SEQ ID NO1野生型lysE核苷酸序列SEQ ID NO2野生型lysE氨基酸序列SEQ ID NO3野生型dapA核苷酸序列SEQ ID NO4野生型DDPS氨基酸序列SEQ ID NO5和6用于lysE562點(diǎn)特異突變的引物SEQ ID NO7和8用于tac啟動(dòng)子擴(kuò)增的引物SEQ ID NO9和10克隆lysE的引物SEQ ID NO11和12克隆dapA*的引物SEQ ID NO13和14擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因序列的引物序列表<110>味之素公司<120>用甲基營(yíng)養(yǎng)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>0P1627<140>
<141>2003-11-<150>JP 2002-336315<151>2002-11-20<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>711<212>DNA<213>乳發(fā)酵短桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(711)<400>1atg gtg atc atg gaa atc ttc att aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt 48Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser1 5 10 15ctt tta ctg tcc atc gga ccg cag aat gta ctg gtg att aaa caa gga 96Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly20 25 30att aag cgc gaa gga ctc att gcg gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct 144Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser35 40 45gac gtc ttt ttg ttc atc gcc ggc acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc 192Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser50 55 60aat gcc gcg ccg atc gtg ctc gat att atg cgc tgg ggt ggc atc gct 240Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala65 70 75 80tac ctg tta tgg ttt gcc gtc atg gca gcg aaa gac gcc atg aca aac 288
Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn85 90 95aag gtg gaa gcg cca cag atc att gaa gaa aca gaa cca acc gtg ccc 336Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro100 105 110gat gac acg cct ttg ggc ggt tcg gcg gtg gcc act gac acg cgc aac 384Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn115 120 125cgg gtg cgg gtg gag gtg agc gtc gat aag cag cgg gtt tgg gta aag 432Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys130 135 140ccc atg ttg atg gca atc gtg ctg acc tgg ttg aac ccg aat gcg tat 480Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr145 150 155 160ttg gac gcg ttt gtg ttt atc ggc ggc gtc ggc gcg caa tac ggc gac 528Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp165 170 175acc gga cgg tgg att ttc gcc gct ggc gcg ttc gcg gca agc ctg atc 576Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile180 185 190tgg ttc ccg ctg gtg ggt ttc ggc gca gca gca ttg tca cgc ccg ctg 624Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu195 200 205tcc agc ccc aag gtg tgg cgc tgg atc aac gtc gtc gtg gca gtt gtg 672Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val210 215 220atg acc gca ttg gcc atc aaa ctg atg ttg atg ggt tag 711Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly225 230 235<210>2<211>236<212>PRT<213>乳發(fā)酵短桿菌<400>2Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly20 25 30Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser35 40 45Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser50 55 60
Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala65 70 75 80Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn85 90 95Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro100 105 110Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn115 120 125Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys130 135 140Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr145 150 155 160Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp165 170 175Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile180 185 190Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu195 200 205Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val210 215 220Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly225 230 235<210>3<211>1197<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(272)..(1153)<400>3ccaggcgact gtcttcaata ttacagccgc aactactgac atgacgggtg atggtgttca 60caattccacg gcgatcggca cccaacgcag tgatcaccag ataatgtgtt gcgatgacag 120tgtcaaactg gttattcctt taaggggtga gttgttctta aggaaagcat aaaaaaaaca 180tgcatacaac aatcagaacg gttctgtctg cttgctttta atgccatacc aaacgtacca 240ttgagacact tgtttgcaca gaggatggcc c atg ttc acg gga agt att gtc292Met Phe Thr Gly Ser Ile Val1 5gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa ggt aat gtc tgt cgg gct agc 340Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser10 15 20ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc gcc agc ggt act tcg gcg atc 388
Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile25 30 35gtt tct gtt ggc acc act ggc gag tcc gct acc tta aat cat gac gaa436Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu40 45 50 55cat gct gat gtg gtg atg atg acg ctg gat ctg gct gat ggg cgc att484His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile60 65 70ccg gta att gcc ggg acc ggc gct aac gct act gcg gaa gcc att agc532Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser75 80 85ctg acg cag cgc ttc aat gac agt ggt atc gtc ggc tgc ctg acg gta580Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val90 95 100acc cct tac tac aat cgt ccg tcg caa gaa ggt ttg tat cag cat ttc628Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe105 110 115aaa gcc atc gct gag cat act gac ctg ccg caa att ctg tat aat gtg676Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val120 125 130 135ccg tcc cgt act ggc tgc gat ctg ctc ccg gaa acg gtg ggc cgt ctg724Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu140 145 150gcg aaa gta aaa aat att atc gga atc aaa gag gca aca ggg aac tta772Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu155 160 165acg cgt gta aac cag atc aaa gag ctg gtt tca gat gat ttt gtt ctg820Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu170 175 180ctg agc ggc gat gat gcg agc gcg ctg gac ttc atg caa ttg ggc ggt868Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly185 190 195cat ggg gtt att tcc gtt acg act aac gtc gca gcg cgt gat atg gcc916His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala200 205 210 215cag atg tgc aaa ctg gca gca gaa gaa cat ttt gcc gag gca cgc gtt964Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val220 225 230att aat cag cgt ctg atg cca tta cac aac aaa cta ttt gtc gaa ccc1012Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro235 240 245aat cca atc ccg gtg aaa tgg gca tgt aag gaa ctg ggt ctt gtg gcg1060Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala250 255 260
acc gat acg ctg cgc ctg cca atg aca cca atc acc gac agt ggt cgt 1108Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg265 270 275gag acg gtc aga gcg gcg ctt aag cat gcc ggt ttg ctg taa 1150Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu280 285 290agtttaggga gatttgatgg cttactctgt tcaaaagtcg cgcctgg 1197<210>4<211>292<212>PRT<213>大腸桿菌<400>4Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys1 5 10 15Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val20 25 30Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser35 40 45Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu50 55 60Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn65 70 75 80Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly85 90 95Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln100 105 110Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu115 120 125Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu130 135 140Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile145 150 155 160Lys Glu Ala Thr Gly Ash Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu165 170 175Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu180 185 190Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn195 200 205Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu210 215 220His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His225 230 235 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys245 250 255Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr260 265 270Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His275 280 285Ala Gly Leu Leu290<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5cgggtggagg tgagcgtcgg taagcagcgg gtttgg36<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6gtctttttgt tcatcaccag caccttgggc gtt 33<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7agggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgac 39<210>8<211>58
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8cggatgcatc tagagttaac ctgcagggtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacac58<210>9<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9catttcctgc aggcaaagga gatgagcgta atggtgatca tggaaatctt cattacaggt 60ctgc 64<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10gggcgagcta gaagagctcc aaaacccgcg aaaactaacc catcaacatc 50<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11tgacctgcag gtttgcacag aggatggccc atgtt 35<210>12
<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12cattctagat ccctaaactt tacagcaaac cggcat36<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13gcacggatca ctgtattcgg ctgcaacttt 30<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14gccgtgttgc taggatggtt gttcttggat ca3權(quán)利要求
1.一種編碼棒狀細(xì)菌(coryneform bacterium)LysE蛋白突變體或其同源蛋白的DNA，其特征在于所述突變體或其同源蛋白當(dāng)被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，能夠賦予該細(xì)菌對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物產(chǎn)生抗生的能力。
2.如權(quán)利要求1的DNA，其中所述突變體是一種選自下述的蛋白A)一種具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中至少第56位的甘氨酸殘基被其它氨基酸殘基取代，或B)一種具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中至少第56位的甘氨酸殘基被其它氨基酸殘基取代，并且除第56位氨基酸殘基以外有一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失、插入或者添加，而且當(dāng)所述突變體被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，能夠賦予該細(xì)菌對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物產(chǎn)生抗性的能力。
3.如權(quán)利要求2的DNA，其中所述的DNA選自A)一種具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，其中有一個(gè)突變導(dǎo)致所編碼蛋白質(zhì)中至少第56位甘氨酸殘基被其它氨基酸取代；B)一種在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO1核苷酸序列雜交的DNA，或者由所述核苷酸序列制備的探針，當(dāng)所述DNA或者探針被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)，由它們編碼的蛋白質(zhì)能夠賦予該細(xì)菌對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物產(chǎn)生抗性的能力。
4.如權(quán)利要求2的DNA，其中所述的其它氨基酸殘基是絲氨酸殘基。
5.如權(quán)利要求1的DNA，其中所述的L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物是S-(2-氨乙基)半胱氨酸。
6.如權(quán)利要求1的DNA，其中所述的甲醇同化細(xì)菌是屬于嗜甲基菌屬或者甲基小桿菌屬的細(xì)菌。
7.一種屬于嗜甲基菌屬或者甲基小桿菌屬的細(xì)菌，該細(xì)菌中導(dǎo)入了可表達(dá)形式的權(quán)利要求1的DNA，該細(xì)菌能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸。
8.一種生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的方法，包括如下步驟A)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7的細(xì)菌，在培養(yǎng)物中生產(chǎn)并積累L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸，和B)從培養(yǎng)物中收集L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸。
9.如權(quán)利要求8的一種生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸或者L-精氨酸的方法，其中培養(yǎng)基含有甲醇作為主要碳源。
全文摘要
一種編碼來(lái)源于棒狀細(xì)菌lysE蛋白突變體或者相關(guān)同源蛋白的DNA，其中所述突變體當(dāng)被導(dǎo)入一種甲醇同化細(xì)菌時(shí)能夠賦予對(duì)L－賴(lài)氨酸類(lèi)似物的抗性。該編碼LysE蛋白的突變體或者相關(guān)同源蛋白的DNA，當(dāng)其被導(dǎo)入甲醇同化細(xì)菌時(shí)能夠提高甲醇同化細(xì)菌中L－賴(lài)氨酸或者L－精氨酸的產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1618970SQ20031012045
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者郡司義哉, 安枝壽 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社