專利名稱：抑制輪狀病毒感染的乳酸菌發(fā)酵物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)抑制輪狀病毒感染有效的萃取物及發(fā)酵物的制備方法。該萃取物是通過(guò)對(duì)麥芽或蘑菇進(jìn)行熱萃取而制得，該發(fā)酵物是通過(guò)乳酸菌發(fā)酵這些萃取物而制得。具體地說(shuō)，向麥芽或蘑菇中加入約10倍量的水，加熱進(jìn)行熱萃取，向該麥芽或蘑菇萃取物中移植乳酸菌，于35℃～38℃發(fā)酵24小時(shí)，得到乳酸菌麥芽發(fā)酵物或蘑菇發(fā)酵物。這些發(fā)酵物對(duì)抑制輪狀病毒感染有效。
背景技術(shù)：
所謂麥芽，是指麥子的種子出芽干燥后的產(chǎn)物，其可被稱為“麥芽”或“麥豆芽”。麥芽被用于制作韓國(guó)的辣椒醬或調(diào)味醬，大麥的麥芽也被用作啤酒的原料。大家知道，生產(chǎn)麥芽時(shí)，芽的長(zhǎng)度為自身的1.5倍左右時(shí)最為合適。麥芽以富含消化酶聞名，過(guò)去在中醫(yī)中，遇到消化不良癥時(shí)作為消化開(kāi)胃劑使用。
香菇的學(xué)名被稱為L(zhǎng)entinus edodes。香菇中所含的香菇嘌呤(eritadenine)具有降低小鼠血液中的膽固醇和中性脂肪酸的作用。并且，有報(bào)道說(shuō)，香菇萃取物有增殖乳酸菌的作用(例如，參照下列非專利文獻(xiàn)1)。
輪狀病毒(Rotavirus)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)，作為在發(fā)展中國(guó)家或不發(fā)達(dá)國(guó)家里誘發(fā)急性小兒腸炎原因中最重要的因素而為人所知。輪狀病毒由抗原不同的6型(A-F)組成。A、B、C型的輪狀病毒被發(fā)現(xiàn)存在于人類和動(dòng)物，D、E、F型只在動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。按血清不同區(qū)分的病毒型，相互之間共通，或是具有交叉抗原。自從最早報(bào)道輪狀病毒的存在以來(lái)，關(guān)于其中A型的研究最為活躍，對(duì)其性質(zhì)的調(diào)查也取得較大進(jìn)展，幾乎分布在所有從人分離而來(lái)的菌株中。輪狀病毒是引起小兒及牛、馬、豬、猴等年幼動(dòng)物的急性腹瀉及腸炎的主要原因。結(jié)合幼兒和兒童中零散發(fā)生的腹瀉疾患，根據(jù)世界保健機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)資料表明，地球上5歲以下的兒童中因腹瀉死亡的兒童人數(shù)每年達(dá)到500萬(wàn)名，其中有20％，即100多萬(wàn)名死于由輪狀病毒引起的腹瀉。在美國(guó)，幼兒腹瀉中的35％-50％起因于輪狀病毒。而且，在發(fā)展中國(guó)家，這個(gè)問(wèn)題則更加嚴(yán)重，6-11個(gè)月的幼兒大約發(fā)生10次由輪狀病毒引起的腹瀉。并且，90％的幼兒在24個(gè)月之前就具有輪狀病毒抗體。以韓國(guó)漢城地區(qū)的小兒腹瀉人群為對(duì)象歷時(shí)12個(gè)月對(duì)12種以上的誘發(fā)腹瀉原因體進(jìn)行調(diào)查的研究報(bào)告顯示，從腹瀉人群的47％中檢測(cè)出輪狀病毒，出現(xiàn)頻率最高。該值大大超出世界保健機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)值20％，達(dá)到2倍以上。
輪狀病毒由糞便經(jīng)口感染，是引起不滿2歲的幼兒發(fā)生急性傳染性腹瀉的原因，此種感染狀態(tài)通常稱為幼兒胃腸炎或急性胃腸炎。由輪狀病毒引起的急性胃腸炎伴隨有發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、呼吸器官異常等臨床癥狀，在以韓國(guó)為首的溫帶地區(qū)，在晚秋至初冬幾乎都有發(fā)生，占此期間小兒腹瀉患者的70％-80％。從發(fā)現(xiàn)癥狀起在約第8天時(shí)病毒作為糞便大量排泄，每1g糞便中發(fā)現(xiàn)1011個(gè)病毒。而且，6個(gè)月至2歲的幼兒感染此病毒最為頻繁，感染時(shí)引起脫水和代謝酸中毒。腹瀉通常是在經(jīng)感染輪狀病毒后引起腸管粘膜細(xì)胞的吸收功能障礙時(shí)出現(xiàn)。病毒感染小腸的絨毛細(xì)胞，在這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中增殖，引起運(yùn)送系統(tǒng)的障礙。由于受損細(xì)胞從腸管脫落，釋放出大量的病毒，因此糞便中便可發(fā)現(xiàn)病毒。由輪狀病毒引起的腹瀉，是由于受損細(xì)胞被沒(méi)有吸收功能的未成熟腺窩細(xì)胞取代而產(chǎn)生的鈉和葡萄糖的吸收功能損傷造成的。
因此，盡管開(kāi)發(fā)并使用了相應(yīng)于輪狀病毒的疫苗，但由于副作用中斷其使用后，迄今為止仍沒(méi)有令人滿意的可替代藥品。因此，人們盼望盡早開(kāi)發(fā)出能夠抑制輪狀病毒感染的物質(zhì)。
乳酸菌大致可分為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬。若按年齡不同調(diào)查腸內(nèi)乳酸菌的變化會(huì)發(fā)現(xiàn)，出生后第3～4日出現(xiàn)雙歧桿菌，第5日成為最有優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌。而且，斷奶期結(jié)束后，厭氧菌和雙歧桿菌成為優(yōu)勢(shì)，作為其他乳酸菌的乳桿菌等則非常少。另外，隨著年齡的增長(zhǎng)，腸內(nèi)細(xì)菌平衡紊亂，曾經(jīng)處于優(yōu)勢(shì)的雙歧桿菌勢(shì)力減弱，乳桿菌的勢(shì)力則超過(guò)雙歧桿菌。因此，隨著老齡化的發(fā)展，越來(lái)越有必要通過(guò)服用雙歧桿菌以使腸內(nèi)菌群與幼兒或青壯年時(shí)期保持相同水平。作為韓國(guó)乳酸菌的短雙歧桿菌K-110的最主要特征是可對(duì)大腸癌、膀胱癌、腹水癌的進(jìn)行有效治療(例如，參照下述專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)2)，能夠?qū)?dǎo)致胃潰瘍的幽門(mén)螺旋桿菌的成長(zhǎng)進(jìn)行抑制，從而具有治療胃部疾病的效果(例如，參照下述非專利文獻(xiàn)3)。通常，作為乳酸菌的生理活性作用，可以例舉為抑制有害菌的增殖、緩和乳糖不耐性、降低血清膽固醇、抗癌、免疫、改善腹瀉及便秘、合成維生素等。雙歧桿菌在出生后第3～4日開(kāi)始出現(xiàn)，第5日左右便成長(zhǎng)為最具優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌，原有的大腸桿菌(E.coli)或作為其他乳酸菌的乳桿菌、鏈球菌等的數(shù)量減至百分之一。這是因?yàn)橹挥心溉橹写嬖诖龠M(jìn)雙歧桿菌增殖的因子，從而可知，與作為其他乳酸菌的乳桿菌相比，雙歧桿菌是腸內(nèi)菌群中最重要的細(xì)菌。
在以往的技術(shù)中就致力于使用乳酸菌制備酸奶等乳酸發(fā)酵制品，開(kāi)發(fā)了很多技術(shù)，不過(guò)這些技術(shù)幾乎都是向奶中接種乳酸菌，再加入脫脂奶粉制作增殖了乳酸菌的乳酸菌飲料的普遍方法。使用奶以外的谷類的乳酸菌飲料或是生產(chǎn)乳酸的技術(shù)還可以舉例如下利用胚芽乳酸桿菌從植物和中藥中得來(lái)的乳酸發(fā)酵飲料(例如，參照下述專利文獻(xiàn)2)、米胚芽飲料(例如，參照下述專利文獻(xiàn)3)、使用谷粒狀的米制備乳酸發(fā)酵品的方法(例如，參照下述專利文獻(xiàn)4)、使用谷粉制備液體乳酸發(fā)酵品的方法(例如，參照下述專利文獻(xiàn)5)、用來(lái)自豆的成分生產(chǎn)乳酸的方法(例如，參照下述專利文獻(xiàn)6)、用嗜酸乳桿菌菌株生產(chǎn)乳酸菌原料粉末的方法(例如，參照下述專利文獻(xiàn)7)、抑制胃腸內(nèi)的幽門(mén)螺旋桿菌增殖的乳酸菌(例如，參照下述專利文獻(xiàn)8至10)，重金屬吸附能較高的乳酸菌菌株及使用該乳酸菌菌株的制品(例如，參照下述專利文獻(xiàn)11)、預(yù)防及改善代謝性骨疾患的使用了乳酸菌發(fā)酵的食品材料(例如，參照下述專利文獻(xiàn)12)。然而，關(guān)于對(duì)輪狀病毒有效的乳酸菌研究卻并未開(kāi)展，也沒(méi)有相關(guān)專利。作為使用了蘑菇的乳酸菌發(fā)酵物的專利，可以例舉含有蘑菇粉末或蘑菇萃取物的乳酸菌培養(yǎng)液、使用此培養(yǎng)液的蘑菇乳酸發(fā)酵組合物(例如，參照下述專利文獻(xiàn)13)。此公報(bào)中，公開(kāi)了使用包含脫脂奶粉、蘑菇粉末(香菇粉末、紫芝粉末、食用傘菌粉末)、寡糖、糊精的乳酸菌培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)酵。不過(guò)，此技術(shù)與本發(fā)明中使用麥芽或香菇萃取物及其粉末自身時(shí)的技術(shù)大不相同。
本發(fā)明的最大特點(diǎn)是，通過(guò)使用韓國(guó)乳酸菌短雙歧桿菌K-110、市面上銷售的長(zhǎng)雙歧桿菌KCT3215、短雙歧桿菌JCM1192、嬰兒雙歧桿菌JCM7007等乳酸菌發(fā)酵麥芽和香菇，制備對(duì)導(dǎo)致腹瀉的病毒—輪狀病毒感染具有益效果的發(fā)酵物。并且，這些發(fā)酵物也可以用于斷奶食品或奶粉的原料、幼兒食品的原料，還可以用作功能性食品的原料。
大韓民國(guó)專利登錄第0232639號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)2]大韓民國(guó)專利公開(kāi)第2000-0055832號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)3]大韓民國(guó)專利申請(qǐng)第1996-042486號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)4]大韓民國(guó)專利公開(kāi)92-16030號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)5]大韓民國(guó)專利公開(kāi)97-14592號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)6]大韓民國(guó)專利申請(qǐng)10-1999-0017375號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)7]大韓民國(guó)專利登錄148340號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)8]大韓民國(guó)專利公開(kāi)2002-0072486號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)9]大韓民國(guó)專利公開(kāi)2002-0061040號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)10]大韓民國(guó)專利公開(kāi)2002-0045496號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)11]大韓民國(guó)專利公開(kāi)2000-0065010號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)12]大韓民國(guó)專利公開(kāi)2002-0048959號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)13]大韓民國(guó)專利公開(kāi)2002-0085159號(hào)公報(bào)[非專利文獻(xiàn)1]韓國(guó)食品科學(xué)會(huì)志，28(5)，947，(1996)[非專利文獻(xiàn)2]J.Microbiol.Biotechnol.9(3)，368(1999)[非專利文獻(xiàn)3]J.Microbiol.Biotechnol.10(4)，532(2000)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了通過(guò)向麥芽或蘑菇中加水進(jìn)行熱萃取來(lái)制備對(duì)抑制輪狀病毒感染有效的萃取物的方法。
本發(fā)明的其他目的在于提供了通過(guò)向麥芽或蘑菇的熱水萃取物或是向麥芽香菇本身移植乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵來(lái)制備對(duì)抑制輪狀病毒感染有效的乳酸菌發(fā)酵物的方法。
本發(fā)明的其他目的還在于提供了含有對(duì)抑制輪狀病毒感染有效的麥芽和香菇萃取物及其乳酸菌發(fā)酵物作為材料的斷奶食品、奶粉、幼兒食品、齋飯、生吃食品、功能性食品。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具有的特征為，通過(guò)向麥芽或蘑菇中加10倍量的水并加熱進(jìn)行熱萃取，制備對(duì)抑制輪狀病毒感染有效的萃取物。
另外，本發(fā)明的特征還在于，通過(guò)向麥芽或蘑菇萃取物或是向麥芽或香菇本身移植乳酸菌并于35℃～38℃發(fā)酵24小時(shí)，制備對(duì)抑制輪狀病毒感染有效的乳酸菌發(fā)酵物。
另外，本發(fā)明提供了以上述對(duì)輪狀病毒感染具有抑制效果的麥芽和香菇萃取物及其乳酸菌發(fā)酵物作為原料的斷奶食品、奶粉、幼兒食品、齋飯、生吃食品、功能性食品。
本發(fā)明可以利用麥芽或香菇萃取物以及經(jīng)乳酸菌發(fā)酵上述萃取物而得到的乳酸菌發(fā)酵物來(lái)制備對(duì)輪狀病毒有效的制品，其中所述輪狀病毒是造成腹瀉原因的病毒。并且，這些發(fā)酵物也可以用作斷奶食品或奶粉的原料、幼兒食品的原料、齋飯和生吃食品的原料，還可以用作功能性食品的原料。
具體實(shí)施例方式
關(guān)于本發(fā)明的具體實(shí)施例，舉例如下。并且，對(duì)本發(fā)明的簡(jiǎn)單變形或改變也包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，故本發(fā)明的保護(hù)范圍根據(jù)權(quán)利要求進(jìn)行明確。
實(shí)施例1 麥芽或蘑菇萃取物的制備向500g麥芽或香菇中加10倍的水，加熱進(jìn)行熱萃取。此操作反復(fù)進(jìn)行兩次。然后，濃縮上清液，以此作為抑制輪狀病毒的試料使用。
實(shí)施例2 采用乳酸菌的麥芽發(fā)酵物及蘑菇發(fā)酵物的制備向按照實(shí)施例1的方法制備的麥芽或蘑菇萃取物中移植乳酸菌，每1ml的萃取物中移植108個(gè)乳酸菌，于35℃～38℃發(fā)酵24小時(shí)就得到乳酸菌發(fā)酵液。以此發(fā)酵液作為試料使用。
實(shí)施例3 MA-104細(xì)胞的培養(yǎng)用添加了10％的FBS、1％的抗生素-抗真菌劑混合液及3.5g/L的碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)基(DulbeccoTs modified eagleTs medium)培養(yǎng)MA-104細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在燒瓶中增殖到80％左右時(shí)，用0.25％的胰蛋白酶處理，分離細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使用充滿5％CO2的CO2溫箱。
實(shí)施例4 輪狀病毒保存液的制備向組織培養(yǎng)燒瓶(25cm2)中等分加入2×106個(gè)MA-104細(xì)胞，放置于37℃的CO2溫箱1小時(shí)使之貼壁，然后去掉培養(yǎng)液，用不含F(xiàn)BS的洗凈用DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞表面2次。然后，向400μl的Wa病毒(Wa virus)溶液中添加含有100μg/ml胰蛋白酶的感染性DMEM培養(yǎng)基20μl，于37℃活化30分鐘后，將病毒溶液均勻地涂在細(xì)胞的表面，于37℃感染1小時(shí)后除去，添加5ml不含F(xiàn)BS但含有5μg/ml胰蛋白酶的感染性DMEM培養(yǎng)基，于37℃的CO2溫箱中培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后確認(rèn)細(xì)胞變性效果(CPE)，反復(fù)3次冷凍及快速解凍后細(xì)胞膜完全破裂，于4℃、5000rpm的條件下離心分離20分鐘，取含有病毒的上清液于-70℃冷凍保存后使用。
實(shí)施例5 乳酸菌及發(fā)酵物對(duì)輪狀病毒感染的抑制效果的測(cè)定以0.25％的胰蛋白酶處理后從燒瓶中分離MA-104細(xì)胞，以洗凈用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次后，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至3×105個(gè)，用感染性DMEM培養(yǎng)基將按實(shí)施例4方法同樣制備的Wa病毒貯存液稀釋500倍。向96孔板中，涂布濃度調(diào)至0.4mg/ml的麥芽或香菇萃取物(實(shí)施例1)、50μl的麥芽或香菇發(fā)酵物(實(shí)施例2)、50μl Wa病毒稀釋液及3×105cell/ml的MA-104細(xì)胞100μl，于37℃的CO2溫箱培養(yǎng)5天后，觀察細(xì)胞變性效果(CPE)并測(cè)定對(duì)輪狀病毒感染的抑制活性。乳酸菌對(duì)輪狀病毒感染的抑制效果的結(jié)果，如表1所示，與市面上銷售的長(zhǎng)雙歧桿菌KCT3215、短雙歧桿菌JCM1192、嬰兒雙歧桿菌JCM7007等乳酸菌相比，短雙歧桿菌K-110顯示出了最出色的效果。
乳酸菌對(duì)輪狀病毒感染的抑制效果

向?qū)嵤├?的麥芽或蘑菇萃取物的制備中得到的麥芽或香菇的萃取物及實(shí)施例2的麥芽或蘑菇萃取物中移植乳酸菌，每1ml的萃取物中移植108個(gè)乳酸菌，于35℃～38℃發(fā)酵24小時(shí)得到乳酸菌發(fā)酵液。測(cè)定此乳酸菌發(fā)酵液的抗輪狀病毒效果，在表2中表示了其結(jié)果。而且，以對(duì)輪狀病毒最有效的短雙歧桿菌K-110發(fā)酵麥芽和香菇制得的發(fā)酵液，顯示出比單獨(dú)的麥芽或單獨(dú)的乳酸菌更出色的抑制輪狀病毒感染的效果。另外，表中雖未顯示，嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、干酪乳桿菌(L.casei)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)和長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)等的效果則低于本發(fā)明的發(fā)酵液。
乳酸菌發(fā)酵物對(duì)輪狀病毒感染的抑制效果

將乳酸菌生產(chǎn)的細(xì)胞壁成分和細(xì)胞質(zhì)成分的最終濃度調(diào)至0.1mg/ml，測(cè)定這些乳酸菌的抑制感染效果，表3表示了其結(jié)果。如表3所示，與乳酸菌細(xì)胞壁相比，細(xì)胞質(zhì)成分顯示出更出色的效果。從此結(jié)果可以看出，無(wú)論乳酸菌是活菌還是死菌，都可以使用能夠用水或有機(jī)溶劑萃取的細(xì)胞質(zhì)成分。
乳酸菌對(duì)Wa輪狀病毒感染的抑制效果

我們認(rèn)為，這樣的乳酸菌或乳酸菌發(fā)酵液有益于預(yù)防輪狀病毒感染及治療輪狀病毒性腹瀉。并且，考慮到輪狀病毒性腹瀉發(fā)生于斷奶期的兒童，通過(guò)向斷奶食品中添加此發(fā)酵干燥物來(lái)進(jìn)行攝取，就能夠預(yù)防輪狀病毒性腹瀉，而這種輪狀病毒性腹瀉占斷奶期腹瀉的50％。
權(quán)利要求
1.能夠抑制輪狀病毒感染的麥芽或蘑菇萃取物的制備方法，其特征為，向麥芽或蘑菇中加入10倍量的水，加熱進(jìn)行熱萃取。
2.能夠抑制輪狀病毒感染的麥芽或蘑菇的乳酸菌發(fā)酵物的制備方法，其特征為，向按照權(quán)利要求1所述方法制備的麥芽或蘑菇萃取物或者向麥芽或香菇本身移植乳酸菌，于35℃～38℃發(fā)酵24小時(shí)。
3.能夠抑制輪狀病毒感染的麥芽或蘑菇萃取物，其特征為，所述萃取物是通過(guò)向麥芽或蘑菇中加入10倍量的水，并加熱進(jìn)行熱萃取來(lái)制備的。
4.能夠抑制輪狀病毒感染的麥芽或蘑菇的乳酸菌發(fā)酵物，其特征為，所述發(fā)酵物是通過(guò)向按照權(quán)利要求1所述方法制備的麥芽或蘑菇萃取物或者向麥芽或香菇本身移植乳酸菌，于35℃～38℃發(fā)酵24小時(shí)進(jìn)行制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供了可以抑制輪狀病毒感染的麥芽或香菇的乳酸菌發(fā)酵物的制備方法。本發(fā)明的特征是，可利用麥芽或香菇萃取物以及將上述萃取物經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而得到的乳酸菌發(fā)酵物來(lái)制備對(duì)輪狀病毒有效的物質(zhì)，所述輪狀病毒是造成腹瀉的一種原因。并且，這些萃取物和發(fā)酵物也可以在斷奶食品、奶粉、幼兒食品、齋飯、功能性食品中被用作能夠抑制輪狀病毒感染的原料。
文檔編號(hào)A23L1/30GK1731937SQ200380108052
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者李慶守, 金東玹, 金尚郁 申請(qǐng)人:株式會(huì)社巴魯明