專利名稱：淀粉海藻糖基合成酶及其編碼基因與表達(dá)方法和工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和酶工程領(lǐng)域中一種淀粉海藻糖基合成酶及其編碼基因與表達(dá)方法和工程菌。
背景技術(shù)：
海藻糖是一種非還原二糖，常態(tài)下為白色晶體，爽口甘甜且無后味，其甜度為砂糖的45％；因?yàn)樵撎蔷哂歇?dú)特的生物學(xué)功能，對(duì)多種生物大分子和細(xì)胞膜有顯著的保護(hù)作用，其用途和潛在作用十分廣泛，可作為生物制品及活菌制劑的保護(hù)劑和穩(wěn)定劑，也可在食品及化妝品中用做天然添加劑。傳統(tǒng)的海藻糖制備方法有酵母抽提法和磷酸化酶法等。近年來，在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了能利用淀粉合成海藻糖的新酶類，即淀粉海藻糖基合成酶。這種淀粉酶法合成海藻糖是至今各種海藻糖生產(chǎn)方法中最有發(fā)展前途的一種。1993年日本人發(fā)現(xiàn)從土壤中分離的根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCC M94031)和節(jié)桿菌(Artobacter sp.)Q36(CCTCC M94030)能產(chǎn)生淀粉海藻糖基合成酶，該酶與海藻糖基水解酶一起使用，可水解淀粉直接生產(chǎn)海藻糖(圖1)，海藻糖基水解酶能夠在常溫中性條件下水解以上方法產(chǎn)生的非還原性淀粉糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，生成海藻糖。
隨著全球生物技術(shù)的飛速發(fā)展，微生物基因組的研究方興未艾，每年都有大量新的微生物酶基因被發(fā)現(xiàn)報(bào)道。但據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已報(bào)道的微生物酶基因主要還是來自于實(shí)驗(yàn)室里可培養(yǎng)的微生物。然而這些微生物的數(shù)量還不及預(yù)計(jì)的所有微生物總量的1％。由于培養(yǎng)條件、分離手段等因素的限制，環(huán)境中大量的微生物基因資源被白白閑置；而通過未培養(yǎng)微生物技術(shù)，無需經(jīng)過微生物的分離、培養(yǎng)和鑒定，可直接獲得環(huán)境樣品中的DNA并構(gòu)建相關(guān)樣品的基因文庫(kù)；并通過合適的篩選方法，得以迅速地獲得所需的基因資源。
未培養(yǎng)微生物技術(shù)的關(guān)鍵之一是從各種樣品中高效地獲得可進(jìn)行分子操作的混合基因組DNA并進(jìn)行有效地純化。從環(huán)境樣品中提取DNA一般采用直接裂解法。直接裂解法是直接從環(huán)境樣品中裂解細(xì)胞釋放DNA，然后用堿法抽提回收DNA，最后通過乙醇沉淀、CsCl密度梯度離心和羥基磷灰石柱層析純化DNA的方法。它根據(jù)對(duì)細(xì)胞的裂解作用程度又可分為物理法和化學(xué)法。前者一般采用劇烈的物理處理來裂解細(xì)胞，這些物理處理包括多次凍融、超聲波、玻璃珠勻漿、微波加熱和研磨等方法；這些處理所得的DNA片段長(zhǎng)度一般在5kb至10kb或更小。化學(xué)法是指用化學(xué)手段處理來裂解細(xì)胞，它包括溶菌酶、蛋白酶K、SDS、熱酚、硫氰酸胍、蛋白水解酶、丙酮和EDTA等；這些處理所得的DNA片段一般較大(幾十個(gè)kb)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種淀粉海藻糖基合成酶及其編碼基因。
一種淀粉海藻糖基合成酶，名稱為G135，它是具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID №1的蛋白質(zhì)由732個(gè)氨基酸殘基組成。
為了便于純化，可在所述淀粉海藻糖基合成酶C-末端增加多肽標(biāo)簽，如6個(gè)組氨酸多肽尾巴的氨基酸序列。
淀粉海藻糖基合成酶編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №2由2243個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5′端第1位-2199位堿基。為了便于純化，可在SEQ ID №2的第2196位堿基后增加多肽標(biāo)簽的編碼基因，如編碼6個(gè)組氨酸多肽尾巴的核苷酸序列。
含有本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的載體、細(xì)胞系及宿主菌，如pM75質(zhì)粒(圖6)和于2004年04月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)、保藏號(hào)為CGMCC № 1133的工程菌—大腸埃希氏菌(Escherichia coli) DE3(pM75)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
pM75大小為6.3kb，由淀粉海藻糖基合成酶基因和載體pET3a的一個(gè)4.1kb片段組成。大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)包含該重組DNA分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的提供一種表達(dá)淀粉海藻糖基合成酶的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)淀粉海藻糖基合成酶的方法，是將含有上述淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌，表達(dá)得到淀粉海藻糖基合成酶。
在本方法中，只要宿主菌表達(dá)本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶基因，重組DNA分子在宿主菌中可被復(fù)制并且整合的基因可被穩(wěn)定地保留，則對(duì)可利用的宿主/載體系統(tǒng)并無特殊限制。例如，宿主是大腸桿菌K-12的EK系統(tǒng)的成員和宿主為枯草芽孢桿菌的BS系統(tǒng)的成員都可以使用。利用包含許多種載體并且遺傳學(xué)上被深入地研究過的EK系統(tǒng)可獲得良好的結(jié)果，因而是優(yōu)選的。宿主細(xì)菌的特定的例子包括EK系統(tǒng)的DH5α、HB101、BE3、TOP010和JM109，以及BS系統(tǒng)的BD170、MI112和ISW1214。
其中，所述淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體可通過將本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因按照常規(guī)方法克隆入出發(fā)載體中得到，所述出發(fā)載體包括用于EK系統(tǒng)的pBR322、pET、pBV220、pBAD和pUC18，以及用于BS系統(tǒng)的pUB110和pHY300PLK。
對(duì)所述淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌的方法并無特殊的限制。例如在EK系統(tǒng)宿主的情況下可用氯化鈣法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物學(xué)雜志》，53，159(1970))，而在BS系統(tǒng)宿主的情況下可用原生質(zhì)體法(Chang，C.和Cohen，S.N.，Mol.Gen.Genet.)，168，111(1978))。可通過載體本身的篩選標(biāo)記進(jìn)行重組子微生物(工程菌)的初步篩選，再利用淀粉海藻糖基合成酶的性質(zhì)最終確定工程菌，例如，在利用EK系統(tǒng)的pBR322作載體并利用HindIII酶切本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因?qū)⑵洳迦雙BR322的HindIII酶切位點(diǎn)時(shí)，四環(huán)素抗性基因失活，可以通過AmprTets來初步篩選轉(zhuǎn)化子。隨后，將所選的轉(zhuǎn)化子利用如影印方法轉(zhuǎn)移至含有麥芽五糖的瓊脂平板上，然后進(jìn)行培養(yǎng)以便形成菌落。因此靶重組子微生物在集落周圍分解麥芽五糖，所以通過利用一種銅試劑溶液對(duì)在含有麥芽五糖的瓊脂平板中所含的麥芽五糖染色可以對(duì)其進(jìn)行篩選。
所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為pM75，可利用含有該載體的大腸埃希氏菌(Escherichia coli) DE3(pM75)CGMCC № 1133大規(guī)模生產(chǎn)淀粉海藻糖基合成酶，可使用常規(guī)方法從所獲的培養(yǎng)物中收集淀粉海藻糖基合成酶。
本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的DNA進(jìn)一步可被用來制備從其它微生物中分離其它的同源淀粉海藻糖基合成酶基因的探針。
本發(fā)明采用物理法與化學(xué)法相結(jié)合的未培養(yǎng)生物技術(shù)抽提云南騰沖溫泉中采集的泥漿樣品的DNA，即在SDS/蛋白酶K熱處理法抽提DNA之前，輔以某些物理方法的處理，如多次凍融、液氮研磨、玻璃珠勻漿等，最后對(duì)DNA樣品再進(jìn)行CTAB和PVPP的純化處理，獲得了有較高產(chǎn)率的高純度DNA樣品。這些DNA樣品再通過幾種內(nèi)切限制性酶切消化，片段進(jìn)行電泳分析和篩選回收作為插入片段，構(gòu)建起以pUC18為載體、大腸桿菌DH5α為受體細(xì)胞的未培養(yǎng)微生物基因組文庫(kù)。在對(duì)這些構(gòu)建的未培養(yǎng)微生物基因組文庫(kù)中獲得的亞克隆進(jìn)行液體誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用檢測(cè)淀粉海藻糖基合成酶酶活的方法進(jìn)行篩選；并通過蛋白電泳檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)情況；獲得了一個(gè)淀粉海藻糖基合成酶酶活陽性的菌株，通過對(duì)該重組子提取質(zhì)粒進(jìn)行電泳分析并進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)大約4.1kb的DNA片段內(nèi)含有編碼一種完整的糖苷酶G135基因序列信息。該基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，其編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因與其它微生物產(chǎn)生的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因同源性分別為93％(芝田硫化葉菌B12)、63％(嗜酸熱硫化葉菌ATCC33909)、48％(節(jié)桿菌Q36)、48％(根瘤菌M11)、50％(短桿菌)。
本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶可以在高溫環(huán)境下(最高達(dá)約75℃)特異性利用淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。任何物質(zhì)只要是淀粉水解產(chǎn)生的還原性淀粉糖，就可作為本發(fā)明酶的底物，如麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖和麥芽七糖等。除這些底物外，其它通過用淀粉酶或酸部分水解淀粉類物質(zhì)如淀粉、支鏈淀粉和直鏈淀粉而制備的還原性淀粉部分水解物也作為本發(fā)明酶的底物。
可用于部分水解淀粉的淀粉酶的可以是在Handbook of Amyloses and RelatedEnzymes(由Pergamon Press；Tokyo，Japan(1988)出版)中公開的α-淀粉酶、麥芽五糖形成淀粉酶和麥芽六糖形成淀粉酶等。也可以將這些淀粉酶與脫支酶如支鏈淀粉酶和異淀粉酶結(jié)合使用。
本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶對(duì)用作底物的淀粉部分水解物的濃度沒有特別的限制，甚至可以在含0.1％或50％底物的溶液中進(jìn)行酶反應(yīng)，形成非還原性淀粉糖。也可使用含過量底物的不可溶懸浮物。在本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶反應(yīng)中可用的反應(yīng)溫度可以是本發(fā)明酶不失活的溫度，即最高達(dá)約75℃，優(yōu)選的在55-70℃。在本發(fā)明酶反應(yīng)中可用的反應(yīng)pH是4.5-8.0，優(yōu)選在pH5.0-6.0。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)酶反應(yīng)條件來選擇本發(fā)明酶反應(yīng)所用的時(shí)間，通常當(dāng)以0.1-100單位/g底物使用本發(fā)明的酶時(shí)，大約需0.1-100小時(shí)。本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶及其編碼基因與工程菌-大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)CGMCC № 1133將在海藻糖的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。


圖1為酶法合成海藻糖示意2為本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶的最適反應(yīng)溫度曲線圖3為本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶的最適反應(yīng)pH曲線圖4為本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶的溫度穩(wěn)定性曲線圖5為本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶的pH穩(wěn)定性曲線圖6為質(zhì)粒pM75的構(gòu)建過程示意圖
具體實(shí)施例方式
下面將要通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)被認(rèn)為是將本發(fā)明限定于此。在實(shí)施例中的濃度都是以(W/V)的％為基礎(chǔ)。
實(shí)施例1、本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶的表達(dá)1、本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的克隆(1)環(huán)境樣品的處理和DNA的提取從云南騰沖溫泉中采集泥漿樣品，60℃烘干后，稱取少許樣品，放置于研缽中，然后加入液氮，充分研磨至樣品呈均勻粉末狀。研磨后的樣品放置于50mL的離心管中，加入DNA抽提緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，100mM磷酸鈉緩沖液，pH8.0，1.5M NaCl，1％CTAB)，充分混勻。然后反復(fù)進(jìn)行三次液氮凍融處理。隨后向混合液中加入蛋白酶K(20mg/mL)和SDS(10％)，混勻后，60℃水浴保溫2-3小時(shí)，每隔15-20分鐘上下顛倒混勻幾次；7000g室溫離心10分鐘，收集上清，沉淀中加入水，60℃洗兩次，每次10分鐘；合并三次上清，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次；水相中加入酸洗PVPP，37℃水浴保溫30分鐘，經(jīng)孔徑為0.45nm的濾膜過濾除去PVPP，隨后加入0.6倍體積的異丙醇，室溫30分鐘后，12000g 4℃離心15分鐘，70％乙醇洗；沉淀用TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA pH8.0)溶解。
(2)目的DNA片段的制備分別用EcoRI或Pst I兩種限制性內(nèi)切酶部分酶切步驟(1)中制備的DNA樣品。經(jīng)0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)電泳，在長(zhǎng)波長(zhǎng)(365nm)紫外燈下，于分子量為3kb處切一切口，插入DEAE-纖維素膜，繼續(xù)電泳，直至分子量為8kb的DNA酶切片段到達(dá)膜上，停止電泳，從膜上回收DNA。將最終回收的DNA酶切片段溶于20μl的TE緩沖液中。
(3)環(huán)境樣品DNA文庫(kù)的構(gòu)建將經(jīng)過同樣EcoRI或Pst I酶切的質(zhì)粒pUC18用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化后和步驟(2)中制備的EcoRI或Pst I酶切回收的DNA片段用T4DNA連接酶在16℃，進(jìn)行連接反應(yīng)2-14小時(shí)后，立即用感受態(tài)E.coli DH5α進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，并隨后冰置30分鐘，加SOC培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，1％葡萄糖，pH值7.0)在37℃，225rpm搖動(dòng)恢復(fù)培養(yǎng)45-60分鐘，涂于氨芐青霉素(Amp)-LB平板上(1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，1.5％瓊脂，60μg/ml氨芐青霉素、8μg/mL異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和9μg/mL X-gal，pH值7.0)37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，挑取白斑。將陽性菌落挑至含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)后，用含Amp的LB液體培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl)洗下平皿上的菌落，加入含10％甘油的LB液體培養(yǎng)基混勻，室溫放置2小時(shí)，液氮速凍，-70℃保存。
(4)篩選從步驟(3)中已構(gòu)建的騰沖溫泉微生物基因組文庫(kù)中進(jìn)行酶活篩選，通過培養(yǎng)誘導(dǎo)，檢測(cè)海藻糖基合成酶的酶活并通過蛋白電泳檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)情況；對(duì)具有酶活性表達(dá)的陽性重組子提取質(zhì)粒并進(jìn)行電泳分析并進(jìn)行部分測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在該質(zhì)粒的DNA片段內(nèi)含有一個(gè)部分的開放閱讀框架。利用基因庫(kù)中已發(fā)表的微生物相關(guān)糖苷酶基因序列的信息，對(duì)已獲得的部分測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上檢索和生物軟件分析，獲得一系列糖苷酶基因序列對(duì)比資料，確定該基因片段中含有其他幾個(gè)海藻糖基合成酶共有保守活性序列。順次對(duì)其余片段進(jìn)行全基因測(cè)序，拼接出完整的新酶基因G135(本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因)序列信息。該基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，其編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。經(jīng)過同源性比較，結(jié)果表明本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因與其它微生物產(chǎn)生的淀粉海藻糖基合成酶編碼基因同源性分別為93％(芝田硫化葉菌B12)、63％(嗜酸熱硫化葉菌ATCC33909)、48％(節(jié)桿菌Q36)、48％(根瘤菌M11)、50％(短桿菌)。
其中，按下述方法檢測(cè)本發(fā)明海藻糖基合成酶的活性將0.1ml酶溶液加到0.1ml 2％(w/v)麥芽五糖的50mm醋酸緩沖液(pH5.5)中，60℃反應(yīng)10分鐘后沸水浴10分鐘以滅活，反應(yīng)混合物用水稀釋20倍，然后取稀釋液400ul用Somogyi-Nelson方法確定還原能力。作為對(duì)照，在100℃將酶溶液預(yù)熱15分鐘以使酶失活，按與上述相同的方法檢測(cè)。將1單位的酶活性定義為在該條件下，每分鐘去除1μmol麥芽五糖還原能力所需的酶量。
表1.G135基因的序列分析

2、本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶的表達(dá)(1)表達(dá)載體的構(gòu)建參照已知序列，設(shè)計(jì)G135基因的PCR引物(上游5′-GCGCCATATGATAATAGGTACGTA-3′下游5′-CGCGGATCCCTGAGTAATGCATATCTG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1分鐘，94℃變性1分鐘，48℃退火1分鐘，71℃延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)，71℃后保溫10分鐘，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物約2.2kb。擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符。將片段純化、經(jīng)NdeI和BamHI酶切，與經(jīng)NdeI和BamHI酶切的載體pET-3a相連后，轉(zhuǎn)入受體菌大腸桿菌DE3中，用NdeI和BamHI酶切檢測(cè)篩選出含重組質(zhì)粒的菌株大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)(圖6)。
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)工程菌大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)表達(dá)本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶將獲得的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)于2ml含有50ug/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。將2ml培養(yǎng)物接種于50ml LB培養(yǎng)基(含有50ug/ml氨芐青霉素)中，然后在37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，當(dāng)三角瓶中培養(yǎng)液的菌體密度OD600為0.6-0.8左右時(shí)，加入5ul 20％的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，于6000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分別收集菌體和培養(yǎng)液上清。將通過離心分離收集的細(xì)胞懸于醋酸緩沖液(pH5.5)中，并通過超聲處理破壞細(xì)胞。細(xì)胞被超聲處理后，通過離心分離清除細(xì)胞碎片，并將所獲的細(xì)胞上清液作一種無細(xì)胞提取物。以轉(zhuǎn)入pET-3a的大腸桿菌DE3(pET)菌株的無細(xì)胞提取物作為對(duì)照。分別檢測(cè)培養(yǎng)上清液、細(xì)胞上清液中淀粉海藻糖基合成酶的活性，結(jié)果如表2所示。
其中，按下述方法檢測(cè)本發(fā)明海藻糖基合成酶的活性將0.1ml酶溶液加到0.1ml 2％w/v麥芽五糖的50mm醋酸緩沖液(pH5.5)中，60℃反應(yīng)10分鐘后沸水浴10分鐘以滅活，反應(yīng)混合物用水稀釋20倍，然后取稀釋液400ul用Somogyi-Nelson方法確定還原能力。作為對(duì)照，在100℃將酶溶液預(yù)熱15分鐘以使酶失活，按與上述相同的方法檢測(cè)。將1單位的酶活性定義為在該條件下，每分鐘去除1μmol麥芽五糖還原能力所需的酶量。
表2

實(shí)施例2、本發(fā)明的海藻糖基合成酶的純化合并大腸桿菌DE3(pM75)培養(yǎng)上清液和細(xì)胞上清液作為海藻糖基合成酶G135的粗酶液，并在70℃水浴中加熱30分鐘后再次離心，棄去熱變性蛋白沉淀，收集上清，用VIVAFLOW50超濾膜包進(jìn)行超濾，濃縮液連續(xù)上DEAE-Sepharose FAST FLOW離子交換柱和Phenyl-Sepharose疏水柱層析和Sephacryl S-200分子凝膠過濾柱進(jìn)行分離純化，其總酶活性、比活性及收率如表3所示，表明獲得電泳純的酶蛋白。
表3.純化步驟中新酶G135的總酶活性、比活性及收率。

實(shí)施例3、本發(fā)明的海藻糖基合成酶G135的性質(zhì)用SDS-PAGE測(cè)得本發(fā)明的海藻糖基合成酶G135的分子量約為84kD，與序列分析結(jié)果相似。根據(jù)對(duì)酶活性的分析來研究溫度和pH對(duì)該酶活性和穩(wěn)定性的影響。pH5.5時(shí)，在不同溫度條件下測(cè)定G135酶的活力，獲得溫度—活力曲線(圖2)；60℃時(shí)，在不同pH條件下測(cè)定G135酶的活力，獲得pH-活力曲線(圖3)；將酶液在不同溫度中分別保溫60分鐘后，各自測(cè)定殘余酶活力，以未保溫的酶液活力為100％，獲得溫度—穩(wěn)定性曲線(圖4)；將酶液在不同pH條件下分別在30℃保溫30分鐘，各自測(cè)定殘余酶活力，以未處理的原酶液活力為100％，獲得pH-穩(wěn)定性曲線(圖5)。結(jié)果表明當(dāng)于pH5.5保存30分鐘時(shí)，該酶的適宜溫度為75℃，在30℃保存30分鐘時(shí)，該酶的適宜pH為約5.5；該酶在溫度高達(dá)約70℃和pH約4-11下是穩(wěn)定的。
序列表<160>2<210>1<211>732<212>PRT<213>未知<400>1Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Lys Phe Thr Phe1 5 10 15Tyr Asp Val Ile Glu Asn Leu Asp Tyr Phe Lys Glu Leu Gly Val Ser20 25 30His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile Leu Asn Gly Arg Pro Gly Ser Ala His35 40 45Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Glu Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly50 55 60Lys Glu Gly Tyr Phe Thr Leu Val Lys Glu Ala Lys Ser Arg Gly Leu65 70 75 80Gly Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro Asn His Met Ala Ile His His Thr85 90 95Asn Trp Arg Leu Met Asp Leu Leu Lys Asn Trp Lys Asn Ser Lys Tyr100 105 110Tyr Asn Tyr Phe Asp His Tyr Asp Asp Asn Lys Ile Ile Leu Pro Ile115 120 125Leu Glu Asp Glu Leu Asp Thr Val Ile Asp Lys Gly Leu Ile Lys Val130 135 140Gln Lys Asp Lys Ile Glu Tyr Arg Gly Phe Ile Leu Pro Ile Asn Asp145 150 155 160Glu Gly Val Glu Phe Leu Lys Lys Ile Asn Cys Phe Asp Asn Ser Cys165 170 175
Leu Lys Lys Glu Asp Ile Lys Lys Leu Leu Leu Met Gln Tyr Tyr Arg180 185 190Leu Thr Tyr Trp Lys Lys Asp Tyr Pro Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala195 200 205Val Asn Asp Leu Ile Ala Val Arg Val Glu Leu Asp Glu Val Phe Arg210 215 220Glu Ser His Glu Ile Ile Gly Lys Leu Leu Val Asp Gly Leu Arg Ile225 230 235 240Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys Glu Tyr Leu Asp Lys Leu245 250 255Arg Gln Leu Val Gly Asn Asp Lys Ile Ile Tyr Val Glu Lys Ile Leu260 265 270Ser Ile Asn Glu Lys Leu Arg Asp Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr275 280 285Gly Tyr Asp Phe Val Asn Tyr Val Asn Met Leu Leu Val Asp Gly Ser290 295 300Gly Glu Glu Glu Leu Thr Lys Phe Tyr Glu Asn Phe Ile Gly Arg Lys305 310 315 320Ile Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys Lys Leu Val Ala Asn325 330 335Gln Leu Phe Lys Ala Asp Ile Glu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asn Val340 345 350Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Asp Phe Leu Ala Cys Met Lys Lys Tyr Arg355 360 365Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys Asp Lys370 375 380Glu Gly Lys Leu Lys Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Leu Gln Gln Tyr385 390 395 400Met Pro Ala Ile Phe Pro Lys Gly Tyr Glu Asp Thr Thr Leu Phe Ile405 410 415Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Leu Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Arg420 425 430
Phe Ser Leu Ser Ile Asp Asp Phe His Asn Phe Asn Gln Ser Arg Val435 440 445Asn Thr Ile Ser Met Asn Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser450 455 460Glu Glu Leu Arg Ala Arg Ile Ser Val Leu Ser Glu Ile Pro Lys Glu465 470 475 480Trp Glu Glu Arg Val Ile Tyr Trp His Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile485 490 495Asp Lys Asn Asp Glu Tyr Arg Phe Tyr Gln Thr Leu Val Gly Ser Tyr500 505 510Glu Gly Phe Asp Asn Lys Glu Arg Ile Lys Asn His Met Ile Lys Val515 520 525Ile Arg Glu Ala Lys Val His Thr Thr Trp Glu Asn Pro Asn Ile Glu530 535 540Tyr Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Ile Asp Glu Ala Phe Glu Asn Ser545 550 555 560Asn Phe Thr Asn Asp Phe Glu Thr Phe Glu Lys Arg Ile Val Tyr Phe565 570 575Ala Tyr Met Lys Ser Leu Val Ala Thr Thr Leu Lys Phe Leu Ser Pro580 585 590Gly Val Pro Asp Ile Tyr Gln Gly Thr Glu Val Trp Arg Phe Leu Leu595 600 605Thr Asp Pro Asp Asn Arg Met Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu Arg Glu610 615 620Leu Leu Asn Asn Leu Thr Gln Lys Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg625 630 635 640Val Lys Met Leu Tyr Val Lys Lys Leu Leu Gln Leu Arg Arg Glu Tyr645 650 655Ser Leu Asn Asp Tyr Lys Pro Leu Pro Phe Gly Phe Gln Arg Gly Lys660 665 670Val Thr Val Leu Phe Ser Pro Ile Val Thr Arg Glu Val Lys Glu Lys675 680 685
Ile Ser Ile Arg Gln Lys Ser Val Asp Trp Ile Arg Asn Glu Glu Ile690 695 700Ser Ser Gly Val Tyr Asn Leu Ser Glu Leu Ile Gly Glu His Arg Val705 710 715 720Val Ile Leu Thr Glu Lys Val Gly Glu Leu Pro Ile725 730<210>2<211>2243<212>DNA<213>未知<220>
<221>
<222>
<223>
<400>2atgataatag gtacgtatag gctacagctc aataagaaat tcacttttta tgatgtaata 60gaaaatttgg attattttaa agaattagga gtatcacatc tatacctatc tccaatactt120aacggtaggc cagggagtgc tcacggttac gatgtagtag accatagtga aattaatgag180gaattaggag ggaaagaggg atattttaca ctagtcaagg aagctaagag tagaggttta240ggaatcatac aagatatagt gccaaatcac atggcaatac atcatactaa ttggaggctt300atggatctac taaagaattg gaaaaatagt aaatattaca actattttga tcattatgat360gataacaaaa taatccttcc aattcttgag gacgagttgg ataccgttat agataaggga420ttgataaaag tacaaaagga taaaatagag tataggggat tcatattacc aataaatgat480gaaggagtcg agttcttgaa aaaaattaat tgctttgata attcatgttt aaagaaagag540gatataaaga aattactatt aatgcaatac tataggttaa cttactggaa aaaagattac600ccaaattata ggagattttt cgcggtaaat gatttgatag ctgttagagt agagttggat660gaagtattta gagagtccca tgagataatt ggcaagctac ttgttgacgg tttaagaatt720gaccacatag atggactata taaccctaag gagtatttag ataagctaag acagttagta780ggaaatgata agataatata cgtagagaag atattatcaa tcaacgagaa attaagagat840gattggaaag tagatggtac tactggatat gatttcctga actacgttaa tatgctatta900
gtagatggaa gtggtgagga ggagttaact aagttttatg agaatttcat tggaagaaaa960atcaatatag acgagttaat aatacaaagt aaaaagttag ttgcaaatca gttgtttaaa 1020gctgatattg aaacattaag caacttactg aacgttaatt acgattattt agtagatttt 1080ctagcatgta tgaaaaaata caggacgtat ttaccatatg aggatattaa cggaataagg 1140gaatgcgata aggagggaaa gttaaaagat garaagggaa tcatgagact ccaacaatac 1200atgccagcaa tcttccctaa gggctatgag gatactaccc tcttcatcta caatagatta 1260atttccctta acgaggttgg gagcgaccta agaagattca gtttaagcat agacgatttt 1320cataacttta accaaagcag agtaaatacc atttcaatga acactctctc tacgcatgat 1380actaagttca gtgaagagct tagagctaga atatcagtac tatctgagat accaaaggag 1440tgggaggaga gggtaatata ctggcatgat ttgttaaggc caaatataga taaaaatgac 1500gagtatagat tttatcaaac acttgtagga agttacgagg gatttgataa taaggagaga 1560attaagaacc acatgattaa ggtcataaga gaagctaagg tacatacaac gtgggaaaat 1620cctaatatag agtatgaaaa taaagttttg gatttcatag atgaagcgtt cgagaacagt 1680aattttacaa atgattttga aacttttgaa aagagaatag tttatttcgc ttatatgaaa 1740tcattagttg caacgacact taaattcctt tcgcctggtg taccagatat ttatcaagga 1800actgaagttt ggagattctt acttacagac ccagataaca gaatgccggt ggatttcaag 1860aaactaaggg aattattaaa taatttgact caaaagaact tagaactctc agatccaaga 1920gtcaaaatgt tatatgttaa gaaattgcta caacttagaa gagagtactc actaaacgat 1980tataaaccat taccctttgg cttccaaagg ggaaaagtaa ctgtcctttt ctcaccaata 2040gtgactaggg aggttaaaga gaagattagt ataaggcaaa aaagcgttga ttggatcaga 2100aatgaggaaa ttagtagtgg agtatacaat ttaagtgagt tgattgggga gcatagagtc 2160gttatattaa ctgaaaaagt gggtgaacta cctatataga tttattcctg aactactctt 2220gtcagatatg cattactcag atc 224權(quán)利要求
1.一種淀粉海藻糖基合成酶，它是具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶，其特征在于所述淀粉海藻糖基合成酶具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.一種淀粉海藻糖基合成酶編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述淀粉海藻糖基合成酶編碼基因具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的的載體、細(xì)胞系及宿主菌。
6.大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)CGMCC № 1133。
7.一種表達(dá)淀粉海藻糖基合成酶的方法，是將含有淀粉海藻糖基合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌，表達(dá)得到淀粉海藻糖基合成酶；所述淀粉海藻糖基合成酶編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌K-12的EK系統(tǒng)成員或枯草芽孢桿菌的BS系統(tǒng)成員。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述EK系統(tǒng)成員包括DH5α、HB101、BE3、TOPO10和JM109；所述BS系統(tǒng)成員包括BD170、MI112和ISW1214。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體包括用于EK系統(tǒng)的pBR322、pET、pBV220、pBAD和pUC18，以及用于BS系統(tǒng)的pUB110和pHY300PLK；所述重組表達(dá)載體為pM75。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種淀粉海藻糖基合成酶及其編碼基因與表達(dá)方法和工程菌。本發(fā)明所提供的淀粉海藻糖基合成酶，它是具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的淀粉海藻糖基合成酶及其編碼基因與工程菌－大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)CGMCC № 1133將在海藻糖的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1712525SQ20041004807
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月14日
發(fā)明者吳襟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所