專利名稱：水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌檢測方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種水和土壤中微量馬鈴薯青枯病菌檢測方法，屬于微生物技術領域。
背景技術：
馬鈴薯青枯病由Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)Yabuuchi et al引起的細菌性病害，是南方馬鈴薯產區(qū)的主要細菌性病害。每年因此造成的產量損失大約在10％-15％，發(fā)病嚴重的地塊產量損失達80％乃至失收，給馬鈴薯生產帶來嚴重威脅。由于馬鈴薯青枯病為細菌性病害，植株感病是系統(tǒng)性侵染，而且青枯病可經水、土壤和種薯傳播蔓延。在馬鈴薯無病種薯繁育中，水和土壤中微量細菌可能會成為健康種薯的侵染源，繼而使這些帶菌種薯成為歷年發(fā)病和遠距離傳播的主要侵染源。解決這一危害的有效途徑就是在馬鈴薯無菌種薯生產中，避免在有病菌的土壤中種植馬鈴薯和避免澆灌帶菌水，保證種薯健康。常用的馬鈴薯青枯病菌鑒定檢測方法如革蘭氏染色法和血清學方法。革蘭氏染色法需要加上對菌體形態(tài)特征進行觀察，對生理生化反應特性進行測定，才能最終判定，這種檢測方法需要對病原菌進行分離和純化，試驗的結果因培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間長短、培養(yǎng)基成分和確定陰性陽性的標準不同而變化，穩(wěn)定性差，且費時費力，不便于生產上的應用。血清學方法盡管靈敏度有所提高，但仍然存在缺點，在與其它相近病菌的交叉反應或制備的抗血清不能和所有的待檢測的某一種病菌的所有菌株雜交。隨著分子生物學技術在許多領域的發(fā)展和應用，尤其是利用各種生物所特有的基因組堿基序列，而發(fā)展起來的特異性聚合酶鏈反應(PCR)技術的應用，大大提高了細菌檢測的準確性和靈敏度，但是這種技術要足夠的DNA模板濃度，實際上在某些條件下足夠數量的DNA很難獲得，如水體和土壤中目標菌體有時極為微量，很難獲得足夠的目標生物DNA用于PCR擴增。

發(fā)明內容
本發(fā)明克服了現有技術的不足，提供了一種高效、準確、靈敏的水和土壤中微量馬鈴薯青枯病菌的檢測技術。
通過如下技術方案實現。
(1)機械離心富集A、收集水樣本500-1000ml，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾細，過80-100目網篩，加水800-1200ml，浸漬10-16小時，攪動，取水相，在5000-6000rpm下離心5-8min，棄上清液相，加100-200ml滅菌水，沖洗沉淀物，手動振蕩1-2min，在5000-6000rpm下離心1-2min，棄沉淀，取水相，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)。
(2)半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集取滅菌的TZC培養(yǎng)基(葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸餾水1000ml，使用時加0.005％氯化三苯四氮唑(TZC))80-100ml，在無菌條件下加入機械離心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天；培養(yǎng)液變紅色進行第(3)檢測，如培養(yǎng)液為其他顏色，則樣本中不帶有馬鈴薯青枯病菌。
(3)健康馬鈴薯塊接種檢測培養(yǎng)液變紅色，取300-500μl菌液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃。第4—第5天直接檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，如馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細菌粘液，即所檢樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌(圖1)；如未發(fā)病，則在5000-8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細菌。
(4)聚合酶鏈反應(PCR)DNA分子水平上的富集A、細菌裂解液制備取約0.5g收集到的細菌，置于1.5ml離心管中，加入400μl 1％的TritonX-100，用Parafilm封口，劇烈振蕩，使固體重新懸浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR擴增。
B、PCR擴增以馬鈴薯青枯病菌Hrp基因部分區(qū)段設計特異性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列體系和反應程序，在PCR儀上進行擴增。
25ul PCR反應體系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0μl
反應程序T＝95℃ 5min C、PCR產物檢測取PCR擴增產物5-10μl在1％瓊脂糖凝膠中，于80-100V/cm下電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察結果，可以看到1993bp(圖2)的擴增片段。即所檢測的樣本中含有馬鈴薯青枯病細菌。
本發(fā)明的有益效果是，克服了常用的馬鈴薯青枯病菌鑒定檢測方法如革蘭氏染色法和血清學方法不足。革蘭氏染色法需要加上對菌體形態(tài)特征進行觀察，對生理生化反應特性進行測定，才能最終判定，這種檢測方法需要對病原菌進行分離和純化，試驗的結果因培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間長短、培養(yǎng)基成分和確定陰性陽性的標準不同而變化，穩(wěn)定性差，且費時費力，不便于生產上的應用。血清學方法盡管靈敏度有所提高，但仍然存在缺點，在與其它相近病菌的交叉反應或制備的抗血清不能和所有的待檢測的某一種病菌的所有菌株雜交。隨著分子生物學技術的發(fā)展和應用，尤其是特異性聚合酶鏈反應(PCR)技術的應用，大大提高了細菌檢測的準確性和靈敏度，但是這種技術要足夠的DNA模板濃度，本發(fā)明通過三級富集法克服了現有技術的不足，在未能獲得足夠DNA模板濃度，如水體和土壤中目標菌體有時極為微量，很難獲得足夠的目標生物DNA時，仍用于PCR擴增，大大提高了檢測的準確度和靈敏度。


圖1是經本發(fā)明處理后，二級富集培養(yǎng)液接種馬鈴薯塊發(fā)生青枯病癥狀。
圖2是經本發(fā)明處理后，馬鈴薯青枯病菌DNA分子水平上PCR擴增的結果(1-馬鈴薯軟腐病菌，2-馬鈴薯環(huán)腐病菌，3-不帶有馬鈴薯青枯病菌土壤第二級富集后混合菌，4-第二級富集后，培養(yǎng)液顏色淡紅色，培養(yǎng)液中帶有馬鈴薯青枯病菌的混合菌，5-馬鈴薯青枯病菌標準菌株，6-井水水樣第二級富集后不含馬鈴薯青枯病菌的混合菌，7-1kb梯度分子標記)。
具體實施例方式
實施例一1、取水樣取一個飲用水的水庫水500ml，在15000rpm下離心10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)。
2、半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集取滅菌的TZC培養(yǎng)基(葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸餾水1000ml，使用時加入0.005％氯化三苯四氮唑(TZC))80ml，在無菌條件下加入機械離心富集液，于28-30℃，250rpm下振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)液變紅色。
3、健康馬鈴薯塊接種檢測取500μl培養(yǎng)液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃。第5天檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，結果馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細菌粘液，即所檢水樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌；與此同時，在8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細菌。
4、聚合酶鏈反應(PCR)DNA分子水平上的富集A、細菌裂解液制備取約0.5g收集到的細菌，置于1.5ml離心管中，加入400μl 1％的TritonX-100，用Parafilm封口，劇烈振蕩，使固體重新懸浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，取裂解液1.0μl直接用于PCR擴增。
B、PCR擴增以馬鈴薯青枯病菌Hrp基因部分區(qū)段設計特異性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列體系和反應程序，在PCR儀上進行擴增25ul PCR反應體系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0μl反應程序T＝95℃ 5min C、PCR產物檢測取PCR擴增產物10μl在1％瓊脂糖凝膠中，于100V/cm下電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察結果，可以看到1993bp的擴增片段。即所檢測的樣本中含有馬鈴薯青枯病細菌。
實施例二
1、取水樣水樣來源于實例一中的同一水庫，但自一馬鈴薯種薯企業(yè)的入水口處經紫外線處理過，取水1000ml，在15000rpm下離心10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)。
2、半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集在實例一同樣條件下振蕩培養(yǎng)4天，培養(yǎng)液變成品紅色。
3、健康馬鈴薯塊接種檢測取500μl培養(yǎng)液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃。第5天檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，結果馬鈴薯塊未出現典型青枯病癥狀。在8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細菌。
4、聚合酶鏈反應(PCR)DNA分子水平上的富集和富集產物的檢測所用方法同實例一，結果仍然檢測到了一條1993bp的擴增片段。表明經紫外線處理后，入水口中的水含的青枯病菌量非常低，經本發(fā)明的三級富集仍能有效地檢測到馬鈴薯青枯病菌。
實施例三1、取土樣自一發(fā)生馬鈴薯青枯病的地塊耕作層5cm深土壤100g和200g及一荒坡上表層5cm深土壤100g和200g，碾細，過80目網篩，加水1200ml，浸漬16小時，攪動，取水相，在6000rpm下離心8min，棄上清液相，加200ml滅菌水，沖洗沉淀物，手動振蕩2min，在5000rpm下離心2min，棄沉淀，取水相，在15000rpm下離心8min，棄上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)。
2、半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集同實例一培養(yǎng)條件，發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層5cm深土壤100g和200g及一荒坡上表層5cm深土壤100g和200g，培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)液顏色分別為發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層的兩個樣本全變紅色，荒坡地表層土5cm深土壤的兩個樣本未變紅色，而呈半混濁狀。
3、健康馬鈴薯塊接種檢測同實例一的第5天檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，結果來自發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層5cm深土壤100g和200g的兩個樣本接種菌液使馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細菌粘液，即所檢水樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌；而來自荒坡上表層5cm深土壤100g和200g的兩個樣本未見發(fā)病。與此同時，在8000rpm下離心培養(yǎng)液5min，棄上清和收集細菌。
4、聚合酶鏈反應(PCR)DNA分子水平上的富集和富集產物的檢測所用方法同實例一，結果在來自發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層5cm深土壤100g和200g的兩個樣本檢測到了一條1993bp的擴增片段，而在來自荒坡上表層5cm深土壤100g和200g的兩個樣本中未見到這一1993bp的擴增片段。表明采用土壤中馬鈴薯青枯病菌三級富集檢測法，發(fā)生馬鈴薯青枯病地塊的耕作層土壤中兩個土樣均檢測到馬鈴薯青枯病菌，荒坡上表層5cm土壤中兩個土樣均不帶青枯病菌。
權利要求
1.一種水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌檢測方法，其步驟如下(1)機械離心富集A、收集水樣本500-1000ml，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾細，過80-100目網篩，加水800-1200ml，浸漬10-16小時，攪動，取水相，在5000-6000rpm下離心5-8min，棄上清液相，加100-200ml滅菌水，沖洗沉淀物，手動振蕩1-2min，在5000-6000rpm下離心1-2min，棄沉淀，取水相，在13000-15000rpm下離心8-10min，棄上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下稱機械離心富集液)；(2)半選擇性培養(yǎng)基TZC培養(yǎng)富集取滅菌的TZC培養(yǎng)基80-100ml，在無菌條件下加入機械離心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天；培養(yǎng)液變紅色進行第(3)檢測，如培養(yǎng)液為其他顏色，則樣本中不帶有馬鈴薯青枯病菌；(3)健康馬鈴薯塊接種檢測培養(yǎng)液變紅色，取300-500μl菌液接種馬鈴薯切塊，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)于28-30℃，第4至第5天直接檢查馬鈴薯塊發(fā)病情況，如馬鈴薯塊組織變軟腐爛，其上有乳白色細菌粘液，即所檢樣本攜帶有馬鈴薯青枯病菌；如未發(fā)病，則在5000-8000rpm下離心培養(yǎng)液，棄上清和收集細菌；(4)聚合酶鏈反應(PCR)DNA分子水平上的富集A、細菌裂解液制備取約0.5g收集到的細菌，置于1.5ml離心管中，加入400μl1％的TritonX-100，用Parafilm封口，劇烈振蕩，使固體重新懸浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR擴增。B、PCR擴增以馬鈴薯青枯病菌Hrp基因部分區(qū)段設計特異性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列體系和反應程序，在PCR儀上進行擴增25ul PCR反應體系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0ul反應程序T＝95℃ 5min C、PCR產物檢測取PCR擴增產物5-10μl在1％瓊脂糖凝膠中，于80-100V/cm下電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察結果，可以看到1993bp的擴增片段，即所檢測的樣本中含有馬鈴薯青枯病細菌。
2.根據權利要求1所述的水和土壤中馬鈴薯青枯病菌檢測方法，其特征是，所述半選擇性TZC培養(yǎng)基由葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸餾水1000ml構成，使用時加入氯化三苯四氮唑(TZC)至終濃度為0.005％。
全文摘要
本發(fā)明為一種水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌檢測方法。它采用機械離心富集，TZC半選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)富集和DNA分子水平上的PCR擴增富集等三級富集方法，檢測水和土壤中的馬鈴薯青枯病菌。它靈敏、準確，在馬鈴薯無病種薯繁育和大田生產上有廣泛應用前景。
文檔編號C12Q1/02GK1793867SQ20051004873
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權日2005年12月22日
發(fā)明者何月秋, 趙明富, 姬廣海, 周惠萍 申請人:云南農業(yè)大學