專利名稱：：改良核酸表達(dá)的新序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更特別地，本發(fā)明涉及改良可在宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)的一或多種核酸的產(chǎn)生的手段和方法。可以在多種宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在生物學(xué)和生物技術(shù)學(xué)中具有廣泛應(yīng)用，例如可用于生物制藥學(xué)。這種產(chǎn)生方法已經(jīng)確立，通常是使編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸(也稱作轉(zhuǎn)基因)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)相關(guān)的一個(gè)問(wèn)題是其是不可預(yù)知的，這是由于轉(zhuǎn)基因由于基因沉默而將變得無(wú)活性的高度可能性(McBurneyetal.，2002)，因此對(duì)于轉(zhuǎn)基因的高表達(dá)需要測(cè)試許多宿主細(xì)胞克隆。另外，一旦這種克隆已經(jīng)確定，則所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通常是不穩(wěn)定的，在延長(zhǎng)的宿主細(xì)胞培養(yǎng)期間常常觀測(cè)到轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，這可能是由于異染色質(zhì)在轉(zhuǎn)基因座形成，阻止了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄所致(Whitelawetal，2001)。轉(zhuǎn)基因沉默是隨機(jī)的，其通常可以在轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)基因組之中后立刻發(fā)生，或者只是在細(xì)胞分化之后發(fā)生。這樣在延長(zhǎng)的培養(yǎng)之后產(chǎn)生異質(zhì)細(xì)胞群，其中一些細(xì)胞持續(xù)表達(dá)高水平的重組蛋白質(zhì)，而其它細(xì)胞表達(dá)低水平或者不可檢測(cè)水平的蛋白質(zhì)(Martin&Whitelaw，1996，McBurneyetal.，2002)。用于產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的細(xì)胞系衍生自單一細(xì)胞，通常對(duì)其按比例擴(kuò)大并長(zhǎng)期維持在1000升或更大體積的培養(yǎng)器中每毫升1千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上的密度。這些大細(xì)胞群(1014-1016個(gè)細(xì)胞)由于轉(zhuǎn)基因沉默而傾向于生產(chǎn)力明顯下降(Migliaccioetal.，2000，Strutzenbergeretal.，1999)?？朔鲜鰡?wèn)題的一種可能性是在表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用所謂的STAR序列。多種這樣的STAR序列在WO03/004704中描述。這些序列可用于在一些類型宿主細(xì)胞中使用表達(dá)構(gòu)建體而改良蛋白質(zhì)生產(chǎn)的可預(yù)測(cè)性、產(chǎn)量和/或穩(wěn)定性(WO03/004704；Kwaksetal，2003)。國(guó)際出版物WO03/106674描述了STAR序列在一些細(xì)胞系中表達(dá)編碼重組蛋白質(zhì)的核酸的應(yīng)用。國(guó)際出版物WO03/106684描述了STAR序列表達(dá)編碼多聚體蛋白質(zhì)如抗體的核酸的應(yīng)用。本發(fā)明提供了改良蛋白質(zhì)生產(chǎn)的另外的手段和方法。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了包含選自如下一組的具有抗阻抑物活性的核酸序列的重組核酸分子a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列；所述重組核酸分子進(jìn)一步包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含與感興趣核酸連接的異源啟動(dòng)子，且其中所述感興趣核酸優(yōu)選編碼全部或部分感興趣蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有抗阻抑物活性的核酸序列位于所述表達(dá)盒中所述啟動(dòng)子的上游，在其特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有抗阻抑物活性的序列和所述啟動(dòng)子間隔少于2kb。在某些實(shí)施方案中，所述編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸存在于多順?lè)醋踊蛑校龆囗樂(lè)醋踊蜻M(jìn)一步編碼可選擇標(biāo)記基因。在某些實(shí)施方案中，所述分子進(jìn)一步包含至少一個(gè)其它具有抗阻抑物活性的序列，所述至少一個(gè)其它序列選自a)SEQ.ID.NO.1-65任一序列；b)SEQ.ID.NO.1-65任一序列的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)與a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還提供了包含表達(dá)盒的重組核酸分子，其包含5’-抗阻抑物序列A-啟動(dòng)子-編碼全部或者部分感興趣蛋白質(zhì)的核酸-抗阻抑物序列B-3’，其中抗阻抑物序列A和B可以相同或不同，并選自(i)SEQ.ID.NO.1-65任一序列；(ii)SEQ.ID.NO.1-65任一序列的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；(iii)與a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及(iv)與(i)-(iii)任一序列互補(bǔ)的序列，特征在于所述表達(dá)盒在所述抗阻抑物序列A和B之間進(jìn)一步包含具有抗阻抑物活性的序列，該序列選自a)SEQ.ID.NO.66；b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)與a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明分子的細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在某些實(shí)施方案中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種生產(chǎn)感興趣蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的重組核酸分子的細(xì)胞，以在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼感興趣蛋白質(zhì)的所述核酸，其特征在于所述重組核酸分子包含具有抗阻抑物活性的、選自如下一組的核酸序列a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分離所述感興趣蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有抗阻抑物活性的核酸序列位于控制感興趣蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子的上游。在其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有抗阻抑物活性的序列與所述啟動(dòng)子間隔少于2kb。在某些實(shí)施方案中，所述編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸存在于多順?lè)醋踊蛑校龆囗樂(lè)醋踊蜻M(jìn)一步編碼可選擇標(biāo)記基因。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞。本發(fā)明還提供了選自如下一組的具有抗阻抑物活性的核酸序列在增加感興趣核酸表達(dá)中的應(yīng)用a)SEQ.ID.NO.66；b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)與a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生表達(dá)兩種感興趣多肽的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括a)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入一或多種核酸分子，所述一種核酸分子或多種核酸分子一起包含(i)與編碼第一種感興趣多肽和第一種可選擇標(biāo)記基因的序列功能性連接的啟動(dòng)子，及(ii)與編碼第二種感興趣多肽和第二種可選擇標(biāo)記基因的序列功能性連接的啟動(dòng)子，及(iii)具有抗阻抑物活性的至少一個(gè)序列，選自(a)SEQ.ID.NO.1-66任一序列，(b)SEQ.ID.NO.1-66任一序列的片段，所述片段具有抗阻抑物活性，(c)與(a)或(b)至少70％相同并具有抗阻抑物活性的序列，及(d)與(a)-(c)任一序列互補(bǔ)的序列；b)通過(guò)基本上同時(shí)選擇表達(dá)所述第一種和第二種可選擇標(biāo)記基因而選擇宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了表達(dá)兩種感興趣多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述第一種和第二種多肽，及任選分離所述多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有抗阻抑物活性的序列選自a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。在某些實(shí)施方案中，所述兩種多肽是多聚體蛋白質(zhì)的一部分。發(fā)明詳述抗阻抑物序列本發(fā)明使用的具有抗阻抑物活性的序列是當(dāng)HP1或HPC2蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合(tether)時(shí)，能至少部分抵消這些蛋白質(zhì)的阻抑作用的序列。適于本發(fā)明的具有抗阻抑物活性的序列(在本文有時(shí)也稱作抗阻抑物序列或者抗阻抑物元件)在WO03/004704中揭示，其并入本文參考，在該文章中將其稱作STAR序列(在本文中無(wú)論什么情況下將一序列稱作STAR序列，則該序列具有本發(fā)明的抗阻抑物活性)。作為非限制性的例子，稱作STAR1-65的65個(gè)抗阻抑物元件的序列(見(jiàn)WO03/004704)在本文分別以SEQ.ID.NO.1-65表示。根據(jù)本發(fā)明，一指定抗阻抑物元件的功能性片段或衍生物當(dāng)其仍具有抗阻抑物活性時(shí)，被認(rèn)為與所述抗阻抑物元件等同。這種抗阻抑物活性的存在可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如通過(guò)下述分析而檢測(cè)。功能性片段或者衍生物可易于由分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)用指定的抗阻抑物序列起始產(chǎn)生缺失、添加、取代、翻轉(zhuǎn)等而獲得(見(jiàn)例如WO03/004704)。功能性片段或者衍生物還包含其它物種的直向同源物(ortholog)，其可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)已知方法使用已知的抗阻抑物序列發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)例如WO03/004704)。因此，本發(fā)明涵蓋抗阻抑物序列的片段，其中所述片段仍具有抗阻抑物活性。對(duì)于指定序列的片段，相同性百分比是指在該片段中發(fā)現(xiàn)的參考天然序列的部分。本發(fā)明還涵蓋與所述具有抗阻抑物活性的序列或其具有抗阻抑物活性的功能片段在核苷酸序列水平至少70％相同的序列，只要這些至少70％相同的序列仍具有本發(fā)明的抗阻抑物活性。優(yōu)選地，所述序列與參考天然序列或其功能片段至少80％相同、更優(yōu)選至少90％相同、更優(yōu)選至少95％相同。根據(jù)本發(fā)明具有抗阻抑物活性的序列可以通過(guò)多種方法獲得，包括但不限于從人基因組或者另一種生物體的基因組中克隆，或者通過(guò)例如利用對(duì)序列的了解例如通過(guò)PCR從這種基因組中直接擴(kuò)增已知抗阻抑物序列，或者可以部分或全部化學(xué)合成。具有抗阻抑物活性的序列或其功能片段或衍生物在本發(fā)明通過(guò)其序列在結(jié)構(gòu)上加以限定，另外限定為具有抗阻抑物活性的序列進(jìn)行功能性限定，使用下文所述分析確定。本發(fā)明的具有抗阻抑物活性的任何序列應(yīng)至少能通過(guò)如下的功能分析(見(jiàn)WO03/004704，實(shí)施例1，并入本文作參考)。將人U-2OS細(xì)胞(ATCCHTB-96)用pTet-Off質(zhì)粒(ClontechK1620-A)及用編碼含有LexADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和HP1或HPC2編碼區(qū)的LexA-阻抑物融合蛋白的核酸(當(dāng)與DNA結(jié)合時(shí)抑制基因表達(dá)的果蠅Polycomb群蛋白質(zhì)；該分析對(duì)任一融合蛋白質(zhì)均起作用)，在Tet-Off轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)(GossenandBuiard，1992)控制下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞在下文抗阻抑物活性分析中稱作報(bào)道細(xì)胞。提供潮霉素抗性的報(bào)道質(zhì)粒位于四個(gè)LexA操縱基因位點(diǎn)與控制zeocin抗性基因的SV40啟動(dòng)子之間含有一個(gè)多接頭序列?？梢詫y(cè)試抗阻抑物活性的序列克隆在所述多接頭中。合適的報(bào)道質(zhì)粒如pSelect的構(gòu)建在WO00/004704的實(shí)施例1和圖1中描述。將該報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)報(bào)道細(xì)胞中，將該細(xì)胞在潮霉素選擇(25μg/ml；針對(duì)報(bào)道質(zhì)粒的存在而選擇)和四環(huán)素抑制(強(qiáng)力霉素，10ng/ml；防止LexA-阻抑物融合蛋白表達(dá))下培養(yǎng)。在這些條件下生長(zhǎng)一周后，將強(qiáng)力霉素的濃度降低至0.1ng/ml(或更低)以誘導(dǎo)LexA-阻抑物基因，兩天后加入250μg/ml的zeocin。將細(xì)胞培養(yǎng)5周，直至對(duì)照培養(yǎng)物(用空白報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，即在多接頭中沒(méi)有克隆的抗阻抑物序列)被zeocin殺死(在這個(gè)對(duì)照質(zhì)粒中，SV40啟動(dòng)子被與LexA操縱位點(diǎn)結(jié)合的LexA-阻抑物融合蛋白抑制，導(dǎo)致在這種細(xì)胞中無(wú)效的zeocin表達(dá)，以在zeocin選擇中存活)。如果一個(gè)序列克隆在報(bào)道質(zhì)粒的多接頭中，所述報(bào)道細(xì)胞在zeocin選擇下存活5周，則所述序列具有本發(fā)明的抗阻抑物活性。這種集落的細(xì)胞在zeocin選擇5周后仍可以在含有zeocin的新培養(yǎng)基上增殖，而用沒(méi)有抗阻抑物序列的報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有zeocin的新培養(yǎng)基上不能增殖。在這個(gè)分析中在5周后不能賦予在zeocin上這種生長(zhǎng)的任何序列不能認(rèn)為是本發(fā)明具有抗阻抑物活性的序列或者其功能片段或者功能衍生物。例如，已知的邊界序列如VanderVlag等(2000)測(cè)試的那些序列，包括果蠅scs(KellumandSchedl，1991)、雞β-球蛋白基因座的5’-HS4(Chungetal，1993，1997)或者M(jìn)atrixAttachmentRegions(MARs)(Phi-Vanetal.，1990)，在這個(gè)分析中不存活。另外，當(dāng)與報(bào)道基因兩側(cè)無(wú)抗阻抑物或者具有較弱的阻抑封閉序列如Drosophilascs相對(duì)比時(shí)，優(yōu)選位于整合進(jìn)U-2OS或CHO細(xì)胞基因組中的報(bào)道基因(例如熒光素酶，GFP)兩側(cè)的所述抗阻抑物序列或者其功能片段或者衍生物產(chǎn)生較高比例的報(bào)道基因過(guò)表達(dá)克隆。這可以使用例如pSDH載體或者相似的載體證實(shí)，如WO03/004704的實(shí)施例1和圖2所述。本發(fā)明的抗阻抑物元件可具有生產(chǎn)蛋白質(zhì)的三個(gè)結(jié)果的至少一個(gè)(1)在工業(yè)可接受水平提高鑒別表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞系的可預(yù)測(cè)性；(2)使得宿主細(xì)胞系的蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加；和/或(3)使得宿主細(xì)胞系在延長(zhǎng)的培養(yǎng)期間呈現(xiàn)更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這些特性在下文更詳細(xì)地論述(1)可預(yù)測(cè)性提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的整合可以在整個(gè)宿主細(xì)胞基因組的隨機(jī)位置發(fā)生。然而，許多基因組是轉(zhuǎn)錄沉默的異染色質(zhì)。當(dāng)所述表達(dá)盒在轉(zhuǎn)基因兩側(cè)包括抗阻抑物元件時(shí)，整合的位置對(duì)表達(dá)具有減弱的作用。所述抗阻抑物元件削弱相鄰異染色質(zhì)使轉(zhuǎn)基因沉默的能力。因此，含有可接受表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞比例增加。當(dāng)轉(zhuǎn)染同量的DNA時(shí)，抗阻抑物序列的摻入與無(wú)抗阻抑物序列的相同轉(zhuǎn)基因相比確實(shí)導(dǎo)致多至10倍的集落建立。(2)產(chǎn)量在轉(zhuǎn)基因整合后立即測(cè)定原始重組宿主細(xì)胞群中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。群體中的個(gè)體表達(dá)水平不同。然而，當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因被抗阻抑物元件保護(hù)時(shí)，可變性降低。這種降低的可變性在回收低水平表達(dá)的較少克隆中是最顯著的。另外，具有抗阻抑物元件的群體通常具有顯著高水平表達(dá)的個(gè)體。這些高產(chǎn)量的個(gè)體對(duì)于蛋白質(zhì)的產(chǎn)生是有利的，無(wú)論對(duì)于收獲還是改變細(xì)胞或者包含這種細(xì)胞的生物體的表型均有利。(3)增加的穩(wěn)定性抗阻抑物元件增加重組宿主細(xì)胞系中轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性，通過(guò)保證轉(zhuǎn)基因在延長(zhǎng)的培養(yǎng)期間不被轉(zhuǎn)錄沉默而實(shí)現(xiàn)。對(duì)比試驗(yàn)表明，在未被抗阻抑物元件保護(hù)的轉(zhuǎn)基因逐漸沉默的條件下(5-25傳代培養(yǎng))，抗阻抑物元件保護(hù)的轉(zhuǎn)基因持續(xù)高水平表達(dá)。這在蛋白質(zhì)樣分子的工業(yè)化生產(chǎn)期間是有利的，在此期間細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)延長(zhǎng)，從幾周延長(zhǎng)至幾個(gè)月。相似地，延長(zhǎng)期間的表達(dá)穩(wěn)定性在由于抗阻抑物保護(hù)的轉(zhuǎn)基因的重組表達(dá)而產(chǎn)生的表型改變的植物或動(dòng)物中是有利的。STAR67本發(fā)明提供了具有抗阻抑物活性的新序列，其被稱作STAR67(SEQ.ID.NO.66)。當(dāng)將這種抗阻抑物序列置于驅(qū)動(dòng)感興趣基因表達(dá)的啟動(dòng)子的上游時(shí)明顯增加表達(dá)，如本發(fā)明提供的實(shí)施例所揭示，而迄今為止已知的有效抗阻抑物序列如STAR6或者STAR7看起來(lái)在這種構(gòu)型中不太有利(它們特別在位于在轉(zhuǎn)基因兩側(cè)時(shí)起作用，即當(dāng)位于轉(zhuǎn)基因的上游和下游時(shí))。因此，STAR67提供了已知的抗阻抑物序列的一種替代，當(dāng)其被置于啟動(dòng)子上游時(shí)與已知的這類抗阻抑物序列相對(duì)比時(shí)具有增加的益處。STAR67不是增強(qiáng)子-阻斷劑，與測(cè)試這種性質(zhì)的其它抗阻抑物序列相反(Kwaksetal，2003)，其提供了STAR67與其它以前公開(kāi)的抗阻抑物序列之間的另一種不同之處。STAR67可以雙向方式操縱，如實(shí)施例7所示。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)盒中STAR67序列的存在提供了改良的可預(yù)測(cè)性和/或產(chǎn)量和/或表達(dá)穩(wěn)定性。本發(fā)明論證了STAR67與多種啟動(dòng)子組合在不同細(xì)胞系中起作用。表達(dá)盒本發(fā)明的核酸分子，包括STAR67，可以是任何形式，例如是DNA片段，任選存在于克隆載體如質(zhì)粒、優(yōu)選表達(dá)載體上，并且可用于例如使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)行克隆。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸包含表達(dá)盒，其可用于在例如宿主細(xì)胞中表達(dá)感興趣的序列。如本文所用，“表達(dá)盒”是指包含與希望表達(dá)的序列功能性連接的至少一個(gè)啟動(dòng)子的核酸序列，希望表達(dá)的序列優(yōu)選是編碼全部或部分感興趣蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀框。所述啟動(dòng)子優(yōu)選對(duì)于所述感興趣核酸而言是異源啟動(dòng)子，異源啟動(dòng)子是指不是所述感興趣序列的天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。換而言之，已經(jīng)使用了一些人類干預(yù)形式例如分子克隆將異源啟動(dòng)子與感興趣核酸功能組合，在本文中異源啟動(dòng)子可以衍生自與感興趣序列相同或者不同的生物體。優(yōu)選地，表達(dá)盒進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。也可以包括其它調(diào)節(jié)序列如增強(qiáng)子。本發(fā)明的表達(dá)單位進(jìn)一步包含至少一個(gè)抗阻抑物序列，如STAR67。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗阻抑物序列，優(yōu)選STAR67，被置于所述啟動(dòng)子的上游，優(yōu)選所述抗阻抑物序列的3’末端與啟動(dòng)子序列起始點(diǎn)之間間隔少于2kb。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗阻抑物序列的3’末端與啟動(dòng)子序列的起始點(diǎn)之間間隔少于1kb，更優(yōu)選少于500個(gè)核苷酸(nt)，更優(yōu)選少于大約200、100、50或者30個(gè)nt。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗阻抑物序列直接克隆在啟動(dòng)子的上游，導(dǎo)致抗阻抑物序列的3’末端與啟動(dòng)子序列起始點(diǎn)之間僅間隔大約0-20個(gè)nt。為了獲得編碼重組蛋白質(zhì)的核酸序列的表達(dá)，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可以將能驅(qū)動(dòng)這種表達(dá)的序列與編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列功能性連接，產(chǎn)生可表達(dá)形式的編碼重組蛋白質(zhì)的重組核酸分子。通常，所述啟動(dòng)子序列置于編碼感興趣蛋白質(zhì)的序列的上游。可用的表達(dá)載體可在本領(lǐng)域獲得，例如Invitrogen的pcDNA和pEF載體系列，BDSciences的pMSCV和pTK-Hyg，Stratagene的pCMV-Script等等。在編碼感興趣多肽的序列正確插入控制編碼的多肽的轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列中的情況中，所得表達(dá)盒可用于產(chǎn)生感興趣蛋白質(zhì)，這即稱作表達(dá)。驅(qū)動(dòng)表達(dá)的序列可包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，及其組合。這些序列應(yīng)能在宿主細(xì)胞中起作用，從而驅(qū)動(dòng)與其功能性連接的核酸序列的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以使用多種啟動(dòng)子獲得感興趣基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是組成型或者被調(diào)節(jié)的，可以得自多種來(lái)源，包括病毒、原核生物或者真核生物來(lái)源，或者是人工設(shè)計(jì)的。感興趣核酸的表達(dá)可以從天然啟動(dòng)子或其衍生物或者從完全異源的啟動(dòng)子中表達(dá)(Kaufman，2000)。用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的一些熟知和常用的啟動(dòng)子包含衍生自病毒如腺病毒的啟動(dòng)子，例如E1A啟動(dòng)子，衍生自巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子，如CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子(在本文稱作CMV啟動(dòng)子)(可得自例如pcDNA，Invitrogen)，衍生自猿猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子(Dasetal，1985)等等。合適的啟動(dòng)子也可以衍生自真核細(xì)胞，如金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子，延伸因子1a(EF-1α)啟動(dòng)子(Gilletal.，2001)，遍在蛋白C或UB6啟動(dòng)子(Gilletal.，2001；Schorppetal，1996)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，免疫球蛋白啟動(dòng)子，熱激啟動(dòng)子等等。適合本發(fā)明的在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)的一些優(yōu)選啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子，哺乳動(dòng)物EF1-α啟動(dòng)子，哺乳動(dòng)物遍在蛋白啟動(dòng)子如遍在蛋白C啟動(dòng)子，或者SV40啟動(dòng)子(例如可得自pIRES，cat.no.631605，BDSciences)。測(cè)試啟動(dòng)子功能和強(qiáng)度由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行，通?？衫绨ㄔ趩?dòng)子序列之后克隆一個(gè)測(cè)試基因如lacZ、熒光素酶、GFP等，并測(cè)試該測(cè)試基因的表達(dá)。當(dāng)然，啟動(dòng)子可以通過(guò)對(duì)序列進(jìn)行缺失、添加、突變而改變，并測(cè)試其功能性以發(fā)現(xiàn)新的弱化的或者改良的啟動(dòng)子序列。本發(fā)明的表達(dá)盒可以是單順?lè)醋?、雙順?lè)醋踊蛘叨囗樂(lè)醋拥摹Ｐg(shù)語(yǔ)“雙順?lè)醋踊颉笔侵改芴峁┚幋a兩種蛋白質(zhì)/多肽的RNA分子的基因。術(shù)語(yǔ)“單順?lè)醋踊颉笔侵改芴峁┚幋a一種蛋白質(zhì)/多肽的RNA分子的基因。術(shù)語(yǔ)“多順?lè)醋踊颉笔侵改芴峁┚幋a兩或多種蛋白質(zhì)/多肽的RNA分子的基因，雙順?lè)醋踊蛞虼税诙囗樂(lè)醋踊虻姆懂爟?nèi)。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“基因”可包含染色體DNA，cDNA，人工DNA，其組合等，并且也可以是其它核酸形式，例如RNA。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)表達(dá)單位包含一個(gè)多順?lè)醋踊?。包含一些順?lè)醋拥膯挝豢梢赞D(zhuǎn)錄為單一mRNA。該RNA上存在的第二個(gè)及其它編碼區(qū)的翻譯可以多種方式實(shí)現(xiàn)，包括使用翻譯再引發(fā)位點(diǎn)或者內(nèi)在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，優(yōu)選后者。雙或多順?lè)醋訂挝坏囊粋€(gè)優(yōu)勢(shì)是可以易于選擇表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的克隆，通過(guò)將編碼可選擇標(biāo)記蛋白的核酸置于編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核酸下游而進(jìn)行。對(duì)于多聚體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，可以使用兩或多個(gè)表達(dá)盒。這個(gè)實(shí)施方案經(jīng)證實(shí)提供良好結(jié)果，例如抗體重鏈和輕鏈的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，至少一種表達(dá)盒，但優(yōu)選每種表達(dá)盒，均應(yīng)包含STAR序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體蛋白質(zhì)的不同亞單位或部分存在于一個(gè)表達(dá)盒中。代替或除了置于表達(dá)盒中啟動(dòng)子上游的抗阻抑物序列的存在之外，在表達(dá)盒的兩側(cè)具有抗阻抑物序列經(jīng)證實(shí)是非常有益的，這樣包含轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒的兩側(cè)具有兩個(gè)抗阻抑物序列，這兩個(gè)序列在某些實(shí)施方案中基本上彼此相同。當(dāng)然，這也可以用STAR67進(jìn)行，獲得在兩側(cè)具有兩個(gè)STAR67序列的表達(dá)盒。表達(dá)盒中一個(gè)STAR67序列的其它位置例如在轉(zhuǎn)基因之后也是可能的，優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號(hào)之后，STAR67序列的3’末端面對(duì)轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的表達(dá)盒可任選包含一個(gè)選擇標(biāo)記基因。術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記或者可選擇標(biāo)記”典型用于描述其存在可以直接或者間接在細(xì)胞中檢測(cè)的基因和/或蛋白質(zhì)，例如使選擇劑失活并且保護(hù)宿主細(xì)胞免于該制劑的致死或者生長(zhǎng)抑制作用的基因和/或蛋白質(zhì)(例如抗生素抗性基因和/或蛋白質(zhì))。另一種可能性是所述選擇標(biāo)記誘導(dǎo)熒光或者顏色沉積(例如綠色熒光蛋白及衍生物，熒光素酶，lacZ，堿性磷酸酶等等)。在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的選擇標(biāo)記是zeocin，對(duì)于選擇第二種表達(dá)盒使用嘌呤霉素。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以獲得及利用其它選擇標(biāo)記，例如新霉素、殺稻瘟素、嘌呤霉素、博來(lái)霉素、潮霉素、dhfr等等。術(shù)語(yǔ)“選擇”典型是指使用選擇標(biāo)記/可選擇標(biāo)記和選擇劑鑒別具有特殊遺傳性質(zhì)的宿主細(xì)胞的過(guò)程(例如宿主細(xì)胞含有整合進(jìn)其基因組中的轉(zhuǎn)基因)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以將選擇標(biāo)記組合?？赡艿目股乩尤缟衔奶峁?。特別有利的一種抗生素是zeocin，因?yàn)閦eocin-抗性蛋白(zeocin-R)通過(guò)結(jié)合藥物并使其無(wú)害而起作用。因此，易于滴定測(cè)定殺死低水平表達(dá)zeocin-R的細(xì)胞的藥物量，同時(shí)使得高水平表達(dá)的細(xì)胞存活。常用的所有其它抗生素抗性蛋白是酶，并因此通過(guò)催化起作用(與藥物不是1∶1)。當(dāng)進(jìn)行兩步選擇時(shí)，因此優(yōu)選使用具有這種1∶1結(jié)合作用模式的抗生素抗性蛋白。因此，抗生素zeocin是優(yōu)選的選擇標(biāo)記。為方便起見(jiàn)，在兩步選擇方法中，zeocin抗生素可以組合例如嘌呤霉素、殺稻瘟素或者潮霉素，例如可存在于單順?lè)醋踊蛑小Ｒ部梢詫⒖股剡x擇標(biāo)記與提供誘導(dǎo)熒光或者提供顏色沉積的選擇標(biāo)記組合?？梢允褂貌煌膯?dòng)子，只要其在使用的細(xì)胞中起作用即可。在某些實(shí)施方案中，提供了一種表達(dá)盒，其在例如感興趣蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀框與選擇標(biāo)記開(kāi)放讀框之間具有(弱)內(nèi)在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)作為具有降低翻譯效力的蛋白質(zhì)翻譯起始位點(diǎn)的例子。蛋白質(zhì)從IRES元件中的翻譯比帽依賴性翻譯的效力低從IRES依賴性開(kāi)放讀框(ORF)中翻譯的蛋白質(zhì)的量比從第一個(gè)ORF中翻譯的蛋白質(zhì)的量低20％-50％(Mizuguchietal.，2000)。另外，IRES元件的突變可以使其活性弱化，并使從IRES依賴性O(shè)RF中的表達(dá)降低至低于從第一個(gè)ORF中表達(dá)的10％(LopezdeQuinto&Martinez-Salas，1998，Reesetal.，1996)。當(dāng)IRES依賴性O(shè)RF編碼一種可選擇標(biāo)記蛋白時(shí)，其相對(duì)低翻譯水平意味著必須存在絕對(duì)高的轉(zhuǎn)錄水平以選擇重組宿主細(xì)胞。因此，選擇的重組宿主細(xì)胞分離株必需表達(dá)高量的轉(zhuǎn)基因mRNA。因?yàn)橹亟M蛋白質(zhì)是從帽依賴性O(shè)RF中翻譯的，因此其可以大量產(chǎn)生，導(dǎo)致高產(chǎn)物產(chǎn)量。常規(guī)的表達(dá)系統(tǒng)是重組質(zhì)?；蛘咧亟M病毒基因組形式的DNA分子。通過(guò)本領(lǐng)域已知方法將質(zhì)粒或者病毒基因組導(dǎo)入(真核宿主)細(xì)胞中，并優(yōu)選整合進(jìn)其基因組中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還使用這些類型的DNA分子輸送其改良的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是使用質(zhì)粒DNA輸送表達(dá)系統(tǒng)。質(zhì)粒含有許多成分本領(lǐng)域已知的常規(guī)成分是復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記以使得質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中增殖；在真核細(xì)胞中起作用以鑒別和分離攜帶整合的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記；編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，其高水平轉(zhuǎn)錄通過(guò)在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子進(jìn)行(例如人巨細(xì)胞病毒主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，pCMV(Boshartetal.，1985)；及感興趣的轉(zhuǎn)基因和可選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄終止子(例如SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)(Kaufman&Sharp，1982)。使用的載體可以是適于克隆DNA并且可用于轉(zhuǎn)錄感興趣核酸的任何載體。當(dāng)使用宿主細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選所述載體是一種整合載體?；蛘撸鲚d體可以是附加型復(fù)制載體。圖1提供了表達(dá)盒的可能構(gòu)型的一些非限制性示意圖。這是質(zhì)粒中以及整合進(jìn)基因組中之后表達(dá)盒的DNA元件的構(gòu)型。構(gòu)建體A含有包含編碼蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀框的一個(gè)表達(dá)單位(基因)。其位于弱化的EMCVIRES(Martinez-Salasetal1999；Mizuguchietal2000；Reesetal1996)和編碼zeocin抗性可選擇標(biāo)記蛋白(zeo)的開(kāi)放讀框的上游。所述基因盒在其3’末端具有SV40轉(zhuǎn)錄終止子(t)。這種雙順?lè)醋愚D(zhuǎn)基因從CMV啟動(dòng)子中高水平轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建體B衍生自構(gòu)建體A，但是將STAR67克隆在CMV啟動(dòng)子的上游。構(gòu)建體C衍生自構(gòu)建體B，但是將兩種抗阻抑物元件(在這種情況中是STAR7)克隆在完整表達(dá)盒的兩側(cè)。表達(dá)盒中抗阻抑物序列的組合本發(fā)明示出組合啟動(dòng)子上游的第一個(gè)抗阻抑物元件及表達(dá)盒兩側(cè)的兩個(gè)其它抗阻抑物序列提供了極佳的結(jié)果。特別地，當(dāng)在CHO細(xì)胞中使用SV40啟動(dòng)子時(shí)，在沒(méi)有抗阻抑物序列的條件下表達(dá)已經(jīng)非常高，但是當(dāng)將STAR67置于所述啟動(dòng)子上游及在完整表達(dá)盒兩側(cè)具有兩個(gè)抗阻抑物元件如STARβ、STAR7或STAR40時(shí)，表達(dá)顯著增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含表達(dá)盒的重組核酸分子，所述表達(dá)盒包含(從5’至3’)抗阻抑物序列A-啟動(dòng)子-編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸-抗阻抑物序列B，特征在于所述表達(dá)盒在所述抗阻抑物序列A與B之間進(jìn)一步包含一個(gè)抗阻抑物序列C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗阻抑物序列C存在于所述啟動(dòng)子的上游，如上述標(biāo)題為“表達(dá)盒”的段落中描述的構(gòu)型。抗阻抑物序列A與B之間的表達(dá)盒可進(jìn)一步包含如上述表達(dá)盒的元件，例如轉(zhuǎn)錄終止子序列、聚腺苷酸化信號(hào)、選擇標(biāo)記基因、增強(qiáng)子等等，并且可以是如上述單順?lè)醋?、雙順?lè)醋踊蛘叨囗樂(lè)醋?。抗阻抑物序列A、B和C的兩個(gè)或所有三個(gè)可以相同或所有三個(gè)可以不同?？棺枰治镄蛄蠥和B可以與抗阻抑物序列C相同或不同。在某些實(shí)施方案中，抗阻抑物序列A和B彼此(基本)相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗阻抑物序列C是STAR67或者其功能片段或衍生物?？棺枰治镄蛄蠥和B可以是任何抗阻抑物序列，在某些實(shí)施方案中包含SEQ.ID.NO.1-65之一或其功能片段或衍生物。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)盒含有一個(gè)多順?lè)醋踊?，在其?yōu)選的實(shí)施方案中，所述多順?lè)醋踊虬幋a感興趣蛋白質(zhì)和選擇標(biāo)記基因的序列。或者，選擇標(biāo)記基因在單獨(dú)的啟動(dòng)子控制下存在。在某些實(shí)施方案中，在STAR序列A與B之間可以存在第四個(gè)抗阻抑物序列D。在這種實(shí)施方案中，所述抗阻抑物序列D優(yōu)選位于編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸的下游。再者，這個(gè)抗阻抑物序列D與重組核酸分子中的其它抗阻抑物序列可以相同或不同，其可以是任何抗阻抑物序列，在某些實(shí)施方案中其選自SEQ.ID.NO.1-66任一序列或其功能片段或衍生物。由于至少一些抗阻抑物序列可以是有方向的(WO00/004704)，因此在表達(dá)盒兩側(cè)的抗阻抑物序列(抗阻抑物序列A和B)可以彼此相反方向放置，由此這些抗阻抑物的3’末端向內(nèi)面向表達(dá)盒(及彼此向內(nèi)面向)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗阻抑物元件的5’末端面向DNA/染色質(zhì)，其對(duì)轉(zhuǎn)基因的影響通過(guò)所述抗阻抑物元件而降低。對(duì)于表達(dá)盒中啟動(dòng)子上游的抗阻抑物序列而言，3’末端面向啟動(dòng)子。除非特別指出，則序列表中的抗阻抑物元件的序列(SEQ.ID.NO.1-66)是以5’至3’方向提供的。本發(fā)明的細(xì)胞包含本發(fā)明的STAR序列和/或表達(dá)盒的核酸分子可用于改良核酸的表達(dá)，優(yōu)選在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞‘V’宿主細(xì)胞”及“細(xì)胞系‘V’宿主細(xì)胞系”典型分別是指通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法在細(xì)胞培養(yǎng)中可以保持并且具有表達(dá)異源或者同源蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞及其同種群。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞，更優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如嚙齒動(dòng)物細(xì)胞或者人細(xì)胞或者不同細(xì)胞的融合體。在某些非限制性實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是U-2OS骨肉瘤、CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)、HEK293、HuNS-1骨髓瘤、WERI-Rb-1成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、BHK、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO、NCI-H295R腎上腺癌或者PER.C6細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是表達(dá)腺病毒的至少E1A、優(yōu)選也表達(dá)E1B的細(xì)胞。作為非限制性的例子，這種細(xì)胞可以衍生自例如人體細(xì)胞，例如衍生自腎(例如HEK293細(xì)胞，見(jiàn)Grahametal，1977所述)、肺(例如A549，見(jiàn)例如WO98/39411所述)或者視網(wǎng)膜(例如HER細(xì)胞，商品名為PER.C6，見(jiàn)美國(guó)專利5,994,128所述)，或者衍生自羊水(例如N52.E6，見(jiàn)美國(guó)專利6,558,948所述)及相似地衍生自其它細(xì)胞。獲得這種細(xì)胞的方法見(jiàn)例如美國(guó)專利5,994,128和US6,558,948所述。本發(fā)明應(yīng)用的PER.C6細(xì)胞是在ECACC保藏號(hào)為96022940的細(xì)胞的上游或下游傳代或者上游或下游傳代的后代。先前已經(jīng)示出這種細(xì)胞能高水平表達(dá)蛋白質(zhì)(例如WO00/63403及Jonesetal，2003所述)。表達(dá)本發(fā)明所需蛋白質(zhì)的這種宿主細(xì)胞可以通過(guò)將本發(fā)明的核酸分子、優(yōu)選表達(dá)盒形式導(dǎo)入細(xì)胞中而獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將STAR67序列定向整合進(jìn)染色體區(qū)域中以改良已經(jīng)整合進(jìn)該基因組中的感興趣基因的表達(dá)，例如天然發(fā)生的基因，任選在靶向所述基因上游的異源啟動(dòng)子控制下調(diào)節(jié)所述基因的表達(dá)。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞來(lái)自可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法選擇和增殖的穩(wěn)定克隆。這種克隆的培養(yǎng)物能產(chǎn)生感興趣的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選能在無(wú)血清的培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)。本發(fā)明的感興趣蛋白質(zhì)可以是任何蛋白質(zhì)，可以是單體蛋白質(zhì)或者多聚體蛋白質(zhì)。多聚體蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)多肽鏈。感興趣蛋白質(zhì)的非限制性例子是酶、激素、免疫球蛋白鏈、治療性蛋白質(zhì)如抗癌蛋白質(zhì)、血液凝聚蛋白如因子VIII，、多功能蛋白質(zhì)如紅細(xì)胞生成素、診斷性蛋白質(zhì)、或者用于接種目的的蛋白質(zhì)或其片段，所有這些蛋白質(zhì)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其抗原結(jié)合部分、衍生物和/或相似物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)單位，其中所述感興趣蛋白質(zhì)是免疫球蛋白重鏈。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)單位，其中所述感興趣蛋白質(zhì)是免疫球蛋白輕鏈。當(dāng)這兩種蛋白質(zhì)表達(dá)單位存在于同一(宿主)細(xì)胞中時(shí)，裝配成多聚體蛋白質(zhì)，更特別地裝配成抗體。因此在某些實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是免疫球蛋白，如抗體，其是多聚體蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，這種抗體是人或人源化抗體。在其某些實(shí)施方案中，這種抗體是IgG、IgA或者IgM抗體。免疫球蛋白可以由不同表達(dá)盒或者一個(gè)表達(dá)盒上的重鏈和輕鏈編碼，其中編碼每個(gè)鏈的基因可以在多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單位中單獨(dú)啟動(dòng)子的控制下，或者這兩個(gè)鏈均可在多順?lè)醋踊蛏暇幋a。感興趣蛋白質(zhì)可以來(lái)自任何來(lái)源，在某些實(shí)施方案中是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，人工蛋白質(zhì)(例如融合蛋白或者突變蛋白)，優(yōu)選是人蛋白質(zhì)。顯而易見(jiàn)，當(dāng)最終的目的不是生產(chǎn)蛋白質(zhì)而是RNA自身時(shí)，也可以使用本發(fā)明的抗阻抑物序列和表達(dá)盒構(gòu)型，例如從表達(dá)盒中生產(chǎn)增加數(shù)量的RNA，這可用于調(diào)節(jié)其它基因(例如RNAi，反義RNA)、基因治療、體外蛋白質(zhì)產(chǎn)生等目的。生產(chǎn)感興趣蛋白質(zhì)的方法一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)感興趣序列、優(yōu)選編碼感興趣蛋白質(zhì)的序列的方法，通過(guò)提供具有本發(fā)明的核酸分子或者表達(dá)盒的宿主細(xì)胞、培養(yǎng)該細(xì)胞并表達(dá)感興趣序列而進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”典型用于描述細(xì)胞中特異的一或多種RNA產(chǎn)物或者特異的一或多種蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在RNA產(chǎn)物的情況中，表達(dá)是指轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的情況中，表達(dá)是指轉(zhuǎn)錄、翻譯及任選翻譯后修飾(例如糖基化、二硫鍵形成等)的過(guò)程。在分泌的蛋白質(zhì)的情況中，表達(dá)是指轉(zhuǎn)錄、翻譯、及任選翻譯后修飾及隨后的分泌過(guò)程。導(dǎo)入要在細(xì)胞中表達(dá)的核酸可以通過(guò)如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法之一進(jìn)行，也依賴于導(dǎo)入的核酸的形式。所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、感染、注射、轉(zhuǎn)化等。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)是使其能代謝和/或生長(zhǎng)和/或分裂和/或產(chǎn)生感興趣的重組蛋白質(zhì)。這種培養(yǎng)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。所述方法包括附著在表面生長(zhǎng)、懸浮生長(zhǎng)或其組合。培養(yǎng)可以例如在培養(yǎng)皿、滾瓶或者在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，使用分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、持續(xù)系統(tǒng)如灌注系統(tǒng)等方式進(jìn)行。為了達(dá)到在細(xì)胞培養(yǎng)期間大規(guī)模(持續(xù))產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選使細(xì)胞能懸浮生長(zhǎng)，及優(yōu)選使細(xì)胞能在無(wú)得自動(dòng)物或人的血清或者得自動(dòng)物或人的血清成分的條件下培養(yǎng)。生長(zhǎng)或者繁殖細(xì)胞的條件(見(jiàn)例如TissueCulture，AcademicPress，KruseandPaterson，editors(1973))及表達(dá)重組產(chǎn)物的條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。通常，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)力最大化的原理、方案及實(shí)踐技術(shù)可見(jiàn)于MammalianCellBiotechnologyaPracticalApproach(M.Butler，ed.，IRLPress，1991)所述。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從細(xì)胞或者培養(yǎng)基或者這兩者中收集(分離)表達(dá)的蛋白質(zhì)。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的方法進(jìn)一步純化，例如通過(guò)過(guò)濾、柱層析等。新的選擇方法本發(fā)明揭示了一種產(chǎn)生表達(dá)兩種感興趣多肽的宿主細(xì)胞的新方法，所述方法提供了令人驚奇的良好結(jié)果，不使用抗阻抑物序列則幾乎沒(méi)有或沒(méi)有集落出現(xiàn)，而存在抗阻抑物序列則導(dǎo)致克隆在選擇下存活，這些克隆通常高水平表達(dá)感興趣的兩種多肽(實(shí)施例7，圖11)。本發(fā)明因此提供了一種產(chǎn)生表達(dá)兩種感興趣多肽的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括a)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入一或多種核酸分子，所述核酸分子包含(i)與編碼第一種感興趣多肽和第一種可選擇標(biāo)記基因的序列功能性連接的啟動(dòng)子，及(ii)與編碼第二種感興趣多肽和第二種可選擇標(biāo)記的序列功能性連接的啟動(dòng)子，及(iii)至少一種抗阻抑物序列，其選自(a)SEQ.ID.NO.1-66任一序列，(b)SEQ.ID.NO.1-66任一序列的片段，所述片段具有抗阻抑物活性，(c)與(a)或(b)至少70％相同并具有抗阻抑物活性的序列，及(d)與(a)-(c)任一序列互補(bǔ)的序列；b)通過(guò)基本上同時(shí)選擇表達(dá)所述第一種和第二種可選擇標(biāo)記基因而選擇宿主細(xì)胞。選擇的宿主細(xì)胞可便利地用于表達(dá)所述兩種多肽，通過(guò)培養(yǎng)所述選擇的宿主細(xì)胞進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種核酸分子用于導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述分子之一含有(i)，另一分子含有(ii)。在這個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)核酸分子優(yōu)選含有至少一種所述抗阻抑物序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用含有(i)和(ii)兩者的一個(gè)核酸分子，其然后必須含有至少一個(gè)所述抗阻抑物序列。在一個(gè)核酸分子上具有這兩種多肽的編碼序列的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是在將核酸導(dǎo)入細(xì)胞之前僅需要一種核酸制品。另外，在這種實(shí)施方案中，一次整合對(duì)于兩種多肽的編碼序列即足夠，從而避免了編碼第一種多肽的核酸與編碼第二種多肽的核酸整合位置不同或者具有不同拷貝數(shù)的可能性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述兩種多肽可以形成多聚體蛋白質(zhì)如免疫球蛋白的部分。所述方法因此特別適于表達(dá)抗體。所述兩個(gè)啟動(dòng)子可以相同或不同，可以是前述任何啟動(dòng)子。當(dāng)使用含有(i)和(ii)兩者的一個(gè)核酸分子時(shí)，這一個(gè)核酸分子上的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的方向可例如是同向的或者彼此面向反向或者彼此向外反向的。在后者情況中，所述抗阻抑物序列可以置于兩個(gè)啟動(dòng)子之間(例如圖HB所示)。適合本發(fā)明這方面的一個(gè)抗阻抑物序列是SEQ.ID.NO.66(見(jiàn)實(shí)施例7)，但是其它抗阻抑物序列也可以起作用。這可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本文揭示的方法測(cè)試，因此本發(fā)明這方面使用其它抗阻抑物序列也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。另外，抗阻抑物序列可以添加在一或兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位兩側(cè)。標(biāo)記基因必須是不同的，可例如選自如前述的標(biāo)記基因。在某些實(shí)施方案中，一種可選擇標(biāo)記是zeocin，另一可選擇標(biāo)記是例如嘌呤霉素。然而，應(yīng)清楚可以使用其它組合，這也包含在本發(fā)明這方面范圍內(nèi)。標(biāo)記的表達(dá)應(yīng)優(yōu)選依賴于感興趣多肽的表達(dá)。這可以通過(guò)將標(biāo)記基因的表達(dá)與感興趣多肽的表達(dá)聯(lián)系起來(lái)而建立，例如使用多順?lè)醋踊蜻M(jìn)行，例如使用如前述IRES序列?！盎旧贤瑫r(shí)”選擇是指至少在部分時(shí)間、優(yōu)選至少一天、更優(yōu)選至少兩天、更優(yōu)選至少五天，這兩種選擇劑均存在，這可以通過(guò)將這兩種選擇劑同時(shí)加入培養(yǎng)基中或者加入包含這兩種選擇劑的培養(yǎng)基而進(jìn)行(例如實(shí)施例7所述)。應(yīng)清楚在第一種選擇劑已經(jīng)存在于培養(yǎng)基中之后只是幾小時(shí)或幾天加入第二種選擇劑在本發(fā)明仍意味著是基本上同時(shí)選擇。這種情況有別于其中將細(xì)胞首先用第一種選擇劑選擇，一旦集落形成則將細(xì)胞在加入了第二種選擇劑而沒(méi)有第一種選擇劑的新的培養(yǎng)基上選擇的情況(連續(xù)選擇，例如實(shí)施例5和WO03/106684所述)。通過(guò)基本上同時(shí)選擇這兩種可選擇標(biāo)記，本發(fā)明令人驚奇地提供了快速和強(qiáng)力的選擇，從而消除了許多低產(chǎn)量的克隆，明顯降低了發(fā)現(xiàn)具有所需表達(dá)特性的克隆的工作量。這對(duì)于生物技術(shù)工業(yè)特別有利，該行業(yè)在鑒別具有高表達(dá)水平的所需克隆之前通常需要篩選幾百甚至幾千個(gè)集落。另外，該系統(tǒng)提供了測(cè)試抗阻抑物元件、至少STAR67但也可以是其它抗阻抑物序列在這個(gè)系統(tǒng)中起作用的部分的功能性的可能性。這個(gè)簡(jiǎn)單篩選在許多情況中提供了幾乎或者甚至完全顯而易見(jiàn)的差異，因此有助于鑒別抗阻抑物序列的功能部分或衍生物，和/或有助于鑒定新的抗阻抑物序列。所述篩選甚至可用于發(fā)現(xiàn)新的抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)序列(因?yàn)檫@種類型的篩選不是僅針對(duì)抗阻抑物活性而是針對(duì)增強(qiáng)表達(dá)的活性進(jìn)行選擇，因此其也可以發(fā)現(xiàn)具有后者而非前者活性的序列)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種鑒別抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)序列或其功能片段或衍生物的方法，所述方法包括a)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入一或多種核酸分子，所述一種核酸分子或多種核酸分子一起包含(i)與第一種可選擇標(biāo)記基因功能連接的啟動(dòng)子，及(ii)與第二種可選擇標(biāo)記功能連接的啟動(dòng)子，及(iii)要測(cè)試抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)活性的至少一個(gè)序列；b)通過(guò)基本同時(shí)選擇所述第一種和第二種可選擇標(biāo)記基因的表達(dá)選擇宿主細(xì)胞。經(jīng)過(guò)這種篩選存活的細(xì)胞很可能含有功能性抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)元件。然后對(duì)這種元件可易于進(jìn)一步分析，例如通過(guò)確定其序列和/或通過(guò)將其進(jìn)行如上述抗阻抑物活性的其它功能測(cè)試而分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，(i)和(ii)均在一個(gè)核酸分子上，例如由啟動(dòng)子分隔(第一個(gè)和第二個(gè)可選擇標(biāo)記向外反向)，在此之間可以克隆測(cè)試序列以進(jìn)行分析。優(yōu)選地，所述可選擇標(biāo)記基因不是高表達(dá)的，例如通過(guò)使用相對(duì)弱啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)可選擇標(biāo)記基因，所述相對(duì)弱啟動(dòng)子是已知的和/或可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)分析鑒別，或者例如使用強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，及使用IRES、優(yōu)選如前述相對(duì)弱的IRES翻譯標(biāo)記基因。所述標(biāo)記基因也可以便利地置于編碼多肽的核酸序列的下游，并在多順?lè)醋踊蛑欣缤ㄟ^(guò)IRES與其表達(dá)連接(例如實(shí)施例7所述，圖11示出可能的構(gòu)型)。這種多肽可同樣是感興趣的多肽，由此獲得表達(dá)所述感興趣多肽的直接可用克隆，但對(duì)于篩選目的也可以是其表達(dá)可易于量化的標(biāo)記，例如GFP或其衍生物、SEAP、lacZ、熒光素酶等等。在這種組合中，多肽的表達(dá)可以直接量化以挑選在同時(shí)選擇期間提供足夠的集落及提供高轉(zhuǎn)錄水平的抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)元件或其片段。當(dāng)“隨機(jī)”核酸(即仍未知其具有抗阻抑物或表達(dá)增強(qiáng)活性的核酸)，例如基因組片段形式，用作測(cè)試序列測(cè)試抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)活性時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)新的抗阻抑物和/或表達(dá)增強(qiáng)序列。當(dāng)測(cè)試已知抗阻抑物序列時(shí)，這個(gè)分析可用于對(duì)其進(jìn)一步鑒定。當(dāng)測(cè)試已知抗阻抑物序列的片段時(shí)，所述分析將提供這種已知抗阻抑物序列的功能片段。除非特別指出，實(shí)踐本發(fā)明應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及重組DNA等常規(guī)技術(shù)。見(jiàn)例如Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelFM，etal，eds，1987；theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress，Inc.)；PCR2APracticalApproach，MacPhersonMJ，HamsBD，TaylorGR，eds，1995；AntibodiesALaboratoryManual，HarlowandLane，eds，1988所述。本發(fā)明在如下實(shí)施例中得以進(jìn)一步解釋。所述實(shí)施例非以任何方式限制本發(fā)明。所述實(shí)施例只是為了闡明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1STAR67載體的構(gòu)建使用如WO03/004704所述遺傳篩選方法分離到一種新的抗阻抑物序列，將這個(gè)新序列稱作STAR67(SEQ.ID.NO.66)。測(cè)試了STAR67對(duì)轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的作用。在此我們描述了各種構(gòu)建體的構(gòu)建。材料和方法產(chǎn)生三種質(zhì)粒(圖1)A)CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV對(duì)照)，B)STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)，C)STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(CMV-STAR677/7)構(gòu)建體A的構(gòu)建如下所述。將質(zhì)粒pd2EGFP(Clontech6010-1)通過(guò)在BsiWI位點(diǎn)插入一個(gè)接頭而修飾，產(chǎn)生pd2EGFP-link。通過(guò)退火寡核苷酸GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG(SEQ.ID.NO.67)和GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT(SEQ.ID.NO.68)產(chǎn)生的這一接頭導(dǎo)入PacI、BglII和EcoRV限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生了多克隆位點(diǎn)MCSII用以插入STAR元件。然后使用引物GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG(SEQ.ID.NO.69)和(AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG(SEQ.ID.NO.70)擴(kuò)增pd2EGFP中的一個(gè)0.37kb區(qū)域，將其插入在pIRES(Clontech6028-1)的BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生pIRES-stuf。這樣在MCSI導(dǎo)入AscI和SwaI限制性核酸內(nèi)切酶的位點(diǎn)，并且作為“填充片段”避免STAR元件與相鄰啟動(dòng)子之間的潛在干擾。將pIRES-stuf用BglII和FspI消化以釋放由填充片段、CMV啟動(dòng)子、IRES元件(兩側(cè)為多克隆位點(diǎn)MCSA和MCSB)及SV40聚腺苷酸化信號(hào)組成的DNA片段。將這個(gè)片段與通過(guò)BamHI和StuI消化產(chǎn)生的pd2EGFP-link的載體主鏈連接，產(chǎn)生pIRES-link。如下所述將zeocin抗性基因的開(kāi)放讀框插入pIRES下游的BamHI/NotI位點(diǎn)通過(guò)使用引物GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC(SEQ.ID.NO.71)和AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC(SEQ.ID.NO.72)經(jīng)PCR從質(zhì)粒pCMV/zeo(Invitrogen，cat.no.V50120)中擴(kuò)增zeocin-抗性O(shè)RF，用BamHI和NotI消化，并與BamHI/NotI-消化的pIRES-link連接，產(chǎn)生pIRES-link-zeo。將d2EGFP報(bào)道ORF導(dǎo)入pIRES-link-zeo中，這通過(guò)使用引物GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG(SEQ.ID.NO.73)和AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG(SEQ.ID.NO.74)擴(kuò)增pd2EGFP(Clontech6010-1)，及將EcoRI-消化的d2EGFP表達(dá)盒插入pIRES-link-zeo質(zhì)粒中的EcoRI位點(diǎn)而進(jìn)行。這樣產(chǎn)生構(gòu)建體A，即CMV-d2EGFP-IRES-Zeo(CMV對(duì)照)。將STAR67克隆在CMV啟動(dòng)子上游AscI位點(diǎn)(在STAR67與啟動(dòng)子之間保留大約15個(gè)核苷酸)。這樣產(chǎn)生構(gòu)建體B，即STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)。還將STAR67置于還含有STAR7(SEQ.ID.NO.7)的表達(dá)盒中進(jìn)行了測(cè)試，所述STAR7被定向克隆在5’SalI和XbaI位點(diǎn)以及3’BglII和PacI位點(diǎn)以使STAR7位于整個(gè)表達(dá)盒的兩側(cè)。這是構(gòu)建體C(CMV-STAR677/7)。實(shí)施例2在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中STAR67增強(qiáng)從CMV、EF1α和UB6啟動(dòng)子的表達(dá)水平我們測(cè)試了CMV、EF1α和UB6啟動(dòng)子鄰近存在STAR67是否影響這些啟動(dòng)子在CHO細(xì)胞中的表達(dá)水平。用于這個(gè)目的的構(gòu)建體是實(shí)施例1所述的構(gòu)建體A和B(圖1)，它們針對(duì)各自的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾1CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV對(duì)照)2STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)3EF1α-d2EGFP-ires-Zeo(EF1α對(duì)照)4STAR67-EF1α-d2EGFP-ires-Zeo(EF1α-STAR67)5UB6-d2EGFP-ires-Zeo(UB6對(duì)照)6STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo(UB6-STAR67).材料和方法將圖1所述質(zhì)粒中的CMV啟動(dòng)子更換為UB6和EF1α啟動(dòng)子。UB6啟動(dòng)子如下克隆。如實(shí)施例1所述，將pd2EGFP質(zhì)粒的0.37kbDNA填充片段經(jīng)使用SEQ.ID.NO.69和70引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將所得DNA填充片段克隆進(jìn)pUB6/V5-His[InvitrogenV250-20]的BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生pUB6-stuf。從pUB6-stuf中，將一個(gè)AscI-SacI片段克隆進(jìn)CMV-d2EGFP-IRES-Zeo中，從中除去CMV啟動(dòng)子。用pEF1α/V5-His[InvitrogenV920-20]作為模板使用引物GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG(SEQ.ID.NO.79)和AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(SEQ.ID.NO.80)經(jīng)PCR擴(kuò)增EF1α啟動(dòng)子。將PCR片段克隆進(jìn)CMV-d2EGFP-IRES-Zeo的AscI和PpuMI位點(diǎn)，從中除去CMV啟動(dòng)子。將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)在HAMS-F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清及2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素中在37℃/5％CO2條件下培養(yǎng)。使用SuperFect(QIAGEN)根據(jù)廠商所述將細(xì)胞用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞接種在培養(yǎng)容器中并生長(zhǎng)過(guò)夜至70-90％鋪滿。將SuperFect試劑與質(zhì)粒DNA以6μl/μg比率組合(例如對(duì)于10cmPetri培養(yǎng)皿，使用20μgDNA和120μlSuperFect)并加入細(xì)胞中。在過(guò)夜保溫后，將轉(zhuǎn)染混和物用新鮮培養(yǎng)基置換并進(jìn)一步保溫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在過(guò)夜培養(yǎng)后，將細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并接種在具有新鮮培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)容器中。在再次過(guò)夜保溫之后，加入zeocin至濃度為50μg/ml并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞。過(guò)三天后，將培養(yǎng)基用含有zeocin(100μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基置換并進(jìn)一步培養(yǎng)。當(dāng)可見(jiàn)各個(gè)集落時(shí)(大約轉(zhuǎn)染后10天)，除去培養(yǎng)基，用無(wú)zeocin的新鮮培養(yǎng)基更換。分離各個(gè)克隆并移至無(wú)zeocin的24孔平板中。在分離集落1天后，向培養(yǎng)基中加入zeocin。在轉(zhuǎn)染后大約3周評(píng)定d2EGFP報(bào)道基因的表達(dá)。兩周后測(cè)定集落中的d2EGFP表達(dá)水平。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后最初的兩周后第一次測(cè)定d2EGFP時(shí)，將集落在無(wú)zeocin或者其它抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。結(jié)果圖2示出了與無(wú)STAR67的“空白”對(duì)照CMV對(duì)照相比，含有克隆在CMV啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了許多表達(dá)顯著較高水平d2EGFP蛋白的CHO集落。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)，用CMV對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為34。在轉(zhuǎn)染后60天，這10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值降低為13，表明表達(dá)隨著時(shí)間的推移是不穩(wěn)定的。對(duì)比之下，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)用STAR67-CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均值為42，在轉(zhuǎn)染后60天測(cè)定時(shí)為32。因此在轉(zhuǎn)染后60天，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆中包含STAR67的CMV構(gòu)建體比CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道蛋白表達(dá)水平高2.5倍。重要的是在轉(zhuǎn)染25天后，在第一次測(cè)定之后，通過(guò)將集落在無(wú)zeocin的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而除去選擇壓力。因此，含有STAR67構(gòu)建體的集落在無(wú)選擇壓力的條件下與不含STAR67構(gòu)建體的集落相比隨著時(shí)間的推移是更穩(wěn)定的。圖3示出了與無(wú)STAR67的“空白”對(duì)照EF1α對(duì)照相比，含有克隆在EF1α啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了表達(dá)顯著較高水平d2EGFP蛋白的許多CHO集落。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)，用EF1α對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為31。在轉(zhuǎn)染后60天，這10個(gè)集落中信號(hào)平均值為26。對(duì)比之下，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)用EF1α-STAR67質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均值為60，在轉(zhuǎn)染后60天測(cè)定時(shí)為76。因此在轉(zhuǎn)染后25和60天，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆中包含STAR67的EF1α構(gòu)建體比EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道蛋白表達(dá)水平高2.9倍。圖4示出了與無(wú)STAR67的“空白”對(duì)照UB6對(duì)照相比，含有克隆在UB6啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了許多表達(dá)顯著較高水平d2EGFP蛋白的CHO集落。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)，用UB6對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為51。在轉(zhuǎn)染后60天，這10個(gè)集落中信號(hào)平均值為29，表明該表達(dá)隨著時(shí)間的推移是不穩(wěn)定的。對(duì)比之下，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)用UB6-STAR67質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均值為218，在轉(zhuǎn)染后60天測(cè)定時(shí)為224。因此在轉(zhuǎn)染后25天，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆中包含STAR67的UB6構(gòu)建體比UB6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道蛋白表達(dá)水平高4.3倍。在60天后高7.7倍，這是由于對(duì)照集落的表達(dá)不穩(wěn)定性和UB6-STAR67集落的穩(wěn)定性所致。重要的是在轉(zhuǎn)染25天后，在第一次測(cè)定后，通過(guò)將集落在無(wú)zeocin的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而除去選擇壓力。因此，含有STAR67構(gòu)建體的集落在無(wú)選擇壓力的條件下與不含有STAR67構(gòu)建體的集落相比隨著時(shí)間的推移是更穩(wěn)定的?？傊琒TAR67增加從三種不同的彼此不相關(guān)的啟動(dòng)子的表達(dá)。實(shí)施例3在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PER.C6細(xì)胞中STAR67增強(qiáng)從CMV、EF1α和UB6啟動(dòng)子的表達(dá)水平我們測(cè)試了在CMV、EF1α和UB6啟動(dòng)子鄰近存在STAR67是否影響這些啟動(dòng)子在除了CHO細(xì)胞之外的另一種細(xì)胞類型即人PER.C6細(xì)胞中的表達(dá)水平。使用如實(shí)施例1中的相同構(gòu)建體。材料和方法PER.C6細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)和分析將PER.Cβ細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基+吡哆醇+9％胎牛血清(非加熱而失活)、8.9mMMgCl2、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素中在37℃/10％CO2條件下培養(yǎng)。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)如廠商所述將細(xì)胞用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞接種在6孔平板中并生長(zhǎng)過(guò)夜至70-90％鋪滿。將Lipofectamine試劑與質(zhì)粒DNA以15μl/3μ比g率組合(例如對(duì)于10cmPetri培養(yǎng)皿，使用20μgDNA和120μlLipofectamine)，在25℃保溫30分鐘之后加入細(xì)胞中。在保溫β小時(shí)之后，將轉(zhuǎn)染混合物用新鮮培養(yǎng)基置換，并進(jìn)一步保溫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在培養(yǎng)過(guò)夜后，將細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并接種于(1∶15、1∶30、1∶60、1∶120稀釋)新鮮petri培養(yǎng)皿(90mm)中的含有100μg/ml濃度的zeocin的新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)可見(jiàn)集落時(shí)，通過(guò)刮擦分離各個(gè)集落并移至24孔平板中的含有zeocin的培養(yǎng)基中。當(dāng)生長(zhǎng)至大約70％鋪滿時(shí)，將細(xì)胞移至6孔平板中。將穩(wěn)定的集落在6孔平板中擴(kuò)增2周，之后在XL-MCLBeckmanCoulter流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x上確定d2EGFP信號(hào)。取d2EGFP信號(hào)的平均值作為d2EGFP表達(dá)水平的量值。2周后對(duì)集落再次測(cè)量。之后將集落在無(wú)zeocin的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)。結(jié)果圖5示出了與無(wú)STAR67的“空白”對(duì)照CMV對(duì)照相比，含有克隆在CMV啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了許多表達(dá)顯著較高水平d2EGFP蛋白的PER.C6集落。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后30天測(cè)定時(shí)，用CMV對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為37。在轉(zhuǎn)染后60天，這10個(gè)集落中信號(hào)平均值降低為14，表明該表達(dá)隨著時(shí)間的推移是不穩(wěn)定的。對(duì)比之下，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后30天測(cè)定時(shí)用STAR67-CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均值為101，在轉(zhuǎn)染后60天測(cè)定時(shí)為45。因此在轉(zhuǎn)染后60天，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆中包含STAR67的CMV構(gòu)建體比CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道蛋白表達(dá)水平高3.2倍。圖6示出與無(wú)STAR67的“空白”對(duì)照EF1α對(duì)照相比，含有克隆在EF1α-啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了許多表達(dá)顯著較高水平d2EGFP蛋白的PER.C6集落。在轉(zhuǎn)染30天后測(cè)定時(shí)，用EF1α對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均值為5。在轉(zhuǎn)染60天后這10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為6。對(duì)比之下，當(dāng)在30天后測(cè)定時(shí)，用EF1α-STAR67質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為25，在轉(zhuǎn)染后60天測(cè)定時(shí)為20。因此，在轉(zhuǎn)染后30和60天，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆中包含STAR67的EF1α構(gòu)建體比EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道蛋白表達(dá)水平高4倍。圖7示出與無(wú)STAR67的“空白”對(duì)照UB6對(duì)照相比，含有克隆在UB6啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了許多表達(dá)顯著較高水平d2EGFP蛋白的PER.C6集落。在轉(zhuǎn)染30天后測(cè)定時(shí)，用UB6對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均值為4。在轉(zhuǎn)染60天后這10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為2。對(duì)比之下，當(dāng)在30天后測(cè)定時(shí)，用UB6-STAR67質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的10個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)平均值為27，在轉(zhuǎn)染后60天測(cè)定時(shí)為18。因此，在轉(zhuǎn)染后30和60天，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆中包含STAR67的UB6構(gòu)建體比UB6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道蛋白表達(dá)水平高7-9倍。因此，與無(wú)STAR67的構(gòu)建體相對(duì)比，將STAR67置于啟動(dòng)子上游在PER.C6細(xì)胞中產(chǎn)生顯著較高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。因此STAR67在不同的彼此不相關(guān)的細(xì)胞類型中均起作用。實(shí)施例4STAR67組合其它抗阻抑物元件的新構(gòu)型在CHO細(xì)胞中增強(qiáng)SV40啟動(dòng)子我們測(cè)試了SV40啟動(dòng)子鄰近單獨(dú)存在STAR67或者存在STAR67與另一種抗阻抑物元件(在這個(gè)實(shí)施例中是STAR7)的組合是否影響這個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)水平。用于這個(gè)目的的構(gòu)建體是(見(jiàn)圖8)1SV40-d2EGFP-ires-Zeo(SV40Control)2STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo(SV40-STAR67)3STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(SV40-STAR7/7)4STAR7-STAR67-SV40--d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(SV40-STAR677/7)材料和方法使用pIRES作模板，使用如下引物將SV40啟動(dòng)子經(jīng)PCR擴(kuò)增TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGG(SEQ.ID.NO.81)和TTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC(SEQ.ID.NO.82)。將PCR片段克隆進(jìn)CMV-d2EGFP-IRES-Zeo的AscI和SacI位點(diǎn)，從中除去CMV啟動(dòng)子。如實(shí)施例2所述轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、分離集落及增殖和分析。結(jié)果圖8示出了與無(wú)抗阻抑物元件的“空白”對(duì)照(SV40對(duì)照)相比，含有克隆在SV40啟動(dòng)子上游的STAR67的構(gòu)建體(SV40-STAR67)或者含有克隆在完整構(gòu)建體兩側(cè)的STAR7的構(gòu)建體(SV40-STAR7/7)的轉(zhuǎn)染不產(chǎn)生表達(dá)明顯較高水平d2EGFP蛋白的CHO集落。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后40天測(cè)定時(shí)，用SV40對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的18個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均水平為86。對(duì)比之下，當(dāng)在40天后測(cè)定用SV40-STAR67質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的18個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均水平為82，在40天后測(cè)定用SV40-STAR7/7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的18個(gè)集落中信號(hào)平均水平為91。因此，觀測(cè)到這些抗阻抑物元件對(duì)CHO細(xì)胞中SV40啟動(dòng)子無(wú)明顯作用?？雌饋?lái)在這些細(xì)胞中從SV40啟動(dòng)子的表達(dá)水平已經(jīng)非常高，甚至高于用被認(rèn)為是非常強(qiáng)的啟動(dòng)子的CMV啟動(dòng)子所觀察到的表達(dá)水平。這種在CHO細(xì)胞中使用SV40啟動(dòng)子在無(wú)抗阻抑物元件的條件下的高背景表達(dá)，可以解釋為什么觀察到單獨(dú)的STAR67或者位于轉(zhuǎn)基因兩側(cè)的STAR7無(wú)明顯作用。然而，當(dāng)在40天后測(cè)定時(shí)，用SV40-STAR677/7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的18個(gè)集落中d2EGFP信號(hào)的平均水平為209，這比18個(gè)對(duì)照集落的平均水平(86)高2.4倍。因此，當(dāng)STAR67元件與另一種抗阻抑物元件組合使用時(shí)，產(chǎn)生了許多示出顯著較高d2EGFP表達(dá)水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO集落。因此在這種新的構(gòu)型中(5’-STAR序列A-STAR序列C-啟動(dòng)子-編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸-STAR序列B-3’，其中在本實(shí)施例中STAR序列A和B是STAR7，STAR序列C是STAR67)，STAR元件的功能看起來(lái)均好于迄今為止揭示的構(gòu)型。我們進(jìn)行了其中兩側(cè)的STAR7元件由兩側(cè)的STAR6元件(SEQ.ID.NO.6)或者兩側(cè)的STAR4元件(SEQ.ID.NO.4)置換，組合SV40啟動(dòng)子上游的STAR67(分別為SV40-STAR676/6和SV40-STAR674/4，使用如上述相同命名法)的實(shí)驗(yàn)，使用這些組合也觀測(cè)到改良的表達(dá)。這證實(shí)了兩側(cè)的STAR7元件可以用其它STAR序列置換，并仍觀測(cè)到具有STAR序列的表達(dá)盒的新構(gòu)型的改良作用。實(shí)施例5STAR67與STAR7的組合在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中增強(qiáng)UB6驅(qū)動(dòng)的抗體表達(dá)水平在實(shí)施例4中，我們示出STAR67與STAR7的組合增強(qiáng)了CHO細(xì)胞中d2EGFP蛋白的表達(dá)水平。在此我們測(cè)試了STAR67與STAR7的組合是否可用于產(chǎn)生抗體。我們選擇抗EpCAM分子的抗體(Hulsetal，1999)作為測(cè)試蛋白，并使用UB6啟動(dòng)子。材料和方法質(zhì)粒將重鏈cDNA(HC-EpCAM)克隆進(jìn)包含UB6啟動(dòng)子的構(gòu)建體中。將HC-EpCAM通過(guò)IRES序列與Zeocin抗性基因結(jié)合。將輕鏈cDNA(LC-EpCAM)也克隆進(jìn)包含UB6啟動(dòng)子的構(gòu)建體中。將LC-EpCAM通過(guò)IRES序列與嘌呤霉素抗性基因結(jié)合。這兩個(gè)質(zhì)粒代表UB6(HC+LC)對(duì)照質(zhì)粒(圖9)。為了測(cè)試STAR67和STAR7的作用，將STAR67克隆進(jìn)這兩個(gè)HC+LC構(gòu)建體中UB6啟動(dòng)子的上游。STAR7克隆在完整表達(dá)盒的兩側(cè)5’和3’末端(圖9)。這兩個(gè)質(zhì)粒代表STAR7-STAR67-UB6(HC+LC)STAR7。CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)如實(shí)施例2所述轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)，使用zeocin(100μg/ml)和嘌呤霉素(2.5μg/ml)進(jìn)行選擇。在轉(zhuǎn)染后1天，向培養(yǎng)基中加入zeocin。當(dāng)可見(jiàn)第一個(gè)集落時(shí)(大約加入zeocin7天后)，除去培養(yǎng)基并用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基置換。在大約7天后，分離集落并移至24孔平板中僅含有zeocin的培養(yǎng)基中。結(jié)果圖9示出與沒(méi)有STAR67和STAR7的“空白”對(duì)照UB6(HC+LC)對(duì)照相對(duì)比，含有克隆在UB6啟動(dòng)子上游的STAR67及克隆在完整表達(dá)盒兩側(cè)的兩個(gè)STAR7元件的抗體構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了大量表達(dá)顯著較高水平EpCAM抗體的CHO集落(使用抗人IgG抗體通過(guò)ELISA測(cè)定)。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)，用UB6(HC+LC)對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的18個(gè)集落中EpCAM的產(chǎn)量平均為2.7pg/細(xì)胞/天。25天后除去選擇劑zeocin和嘌呤霉素。轉(zhuǎn)染后45天，這18個(gè)集落中EpCAM的產(chǎn)量平均為2.7pg/細(xì)胞/天。對(duì)比之下，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)，用STAR7-STAR67-UB6(HC+LC)-STAR7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的18個(gè)集落中EpCAM產(chǎn)量信號(hào)平均為6.7pg/細(xì)胞/天，在轉(zhuǎn)染后45天測(cè)定時(shí)是7.7pg/細(xì)胞/天。因此，在轉(zhuǎn)染30和45天后，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO克隆中包含STAR67/STAR7的UB6構(gòu)建體與UB6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EpCAM表達(dá)水平相比高2.5-2.9倍。因此，與不含STAR67/STAR7的構(gòu)建體相比，將STAR67置于啟動(dòng)子上游及將兩個(gè)STAR7元件置于表達(dá)盒兩側(cè)導(dǎo)致CHO細(xì)胞中顯著較高的EpCAM抗體表達(dá)水平。實(shí)施例6STAR67不是增強(qiáng)子阻斷劑(enhancerblocker)，而STAR6和STAR7是增強(qiáng)子阻斷劑已對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)試的迄今為止所有已知STAR元件，包括STAR6和STAR7，均是增強(qiáng)子阻斷劑(WO03/004704，Kwaksetal，2003)。增強(qiáng)子阻斷劑活性是通過(guò)將STAR元件置于強(qiáng)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間而測(cè)試。在此我們測(cè)試了STAR67是否是一種增強(qiáng)子阻斷劑。材料和方法將d2EGFP基因使用引物TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC(SEQ.ID.NO.75)和ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC(SEQ.ID.NO.76)經(jīng)PCR擴(kuò)增，并克隆進(jìn)質(zhì)粒pGL3-啟動(dòng)子(Promega)中，使用NcoI和XbaI限制位點(diǎn)代替螢光素酶基因以產(chǎn)生質(zhì)粒pGL3-promoter-GFP。將一接頭(通過(guò)退火寡核苷酸CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT(SEQ.ID.NO.77)和GATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT(SEQ.ID.NO.78)而產(chǎn)生)克隆進(jìn)SacI和BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生多克隆位點(diǎn)。原始的BglII位點(diǎn)基于接頭的連接而被破壞，產(chǎn)生接頭DNA內(nèi)一新的唯一的BglII位點(diǎn)。使用BsaBI和BamHI將SV40-增強(qiáng)子從質(zhì)粒pGL3-basic(Promega)中切下，并使用EcoRV和BglII位點(diǎn)克隆進(jìn)pGL3-linker-promoter-GFP中，產(chǎn)生質(zhì)粒pGL3-enhancer-promoter-GFP。使用KpnI和SacI位點(diǎn)將STAR40元件(SEQ.ID.NO.40)置于SV40增強(qiáng)子上游，以防止增強(qiáng)子對(duì)上游序列的作用。最后，使用SpeI和AscI限制位點(diǎn)將抗阻抑物元件STAR6、STAR7和STAR67置于SV40增強(qiáng)子和SV40最小啟動(dòng)子之間。CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)如實(shí)施例2所述轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后1天，在EpicsXL流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(BeckmanCoulter)上測(cè)定d2EGFP水平。結(jié)果圖10示出STAR67不是增強(qiáng)子阻斷劑，而STAR6和STAR7在相同分析中發(fā)揮增強(qiáng)子阻斷劑作用。將STAR6、STAR7和STAR67克隆在d2EGFP基因上游的SV40增強(qiáng)子和最小SV40啟動(dòng)子之間。當(dāng)在增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間無(wú)STAR元件克隆時(shí)，發(fā)生強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活作用(設(shè)定為100％)。當(dāng)STAR6或STAR7置于增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間時(shí)，轉(zhuǎn)錄降低至背景水平，表明STAR6和STAR7是強(qiáng)增強(qiáng)子阻斷劑。相反，當(dāng)STAR67克隆在增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間時(shí)，相對(duì)的轉(zhuǎn)錄水平仍為對(duì)照組的80％，表明STAR67不是好的增強(qiáng)子阻斷劑，這與如先前所述的STAR6和STAR7以及其它抗阻抑物元件(WO03/004704，Kwaksetal，2003)相反。實(shí)施例7STAR67增強(qiáng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中UB6和CMV驅(qū)動(dòng)的抗體表達(dá)水平在實(shí)施例5中，我們示出使用含有重鏈和輕鏈的兩種不同的質(zhì)粒，組合STAR67和STAR7增強(qiáng)CHO細(xì)胞中EpCAM抗體表達(dá)水平。在本實(shí)施例中，我們測(cè)試了當(dāng)重鏈和輕鏈被置于一個(gè)質(zhì)粒上時(shí)STAR67是否可以用于產(chǎn)生EpCAM抗體。我們針對(duì)每個(gè)選擇標(biāo)記使用同時(shí)選擇方法。材料和方法質(zhì)粒重鏈cDNA(HC-EpCAM)在UB6啟動(dòng)子的控制下，并通過(guò)IRES序列與Zeocin抗性基因結(jié)合。輕鏈cDNA(LC-EpCAM)在CMV啟動(dòng)子的控制下，并通過(guò)IRES序列與嘌呤霉素抗性基因結(jié)合?；旧线@些是實(shí)施例5中使用的構(gòu)建體。將這兩種表達(dá)盒置于一個(gè)質(zhì)粒上，使這兩個(gè)表達(dá)單位的轉(zhuǎn)錄具有相反方向。在對(duì)照質(zhì)粒中，UB6與CMV啟動(dòng)子由一500bp填充片段間隔(EpCAM對(duì)照)(圖10)。在另一個(gè)質(zhì)粒中，將STAR67置于UB6與CMV啟動(dòng)子之間(EpCAMSTAR67)(圖10)。CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)如實(shí)施例2所述轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)，使用zeocin(100μg/ml)和嘌呤霉素(2.5μg/ml)進(jìn)行選擇。在實(shí)施例5中，使用針對(duì)兩種選擇標(biāo)記的相繼選擇方法。相反，在此這兩種選擇標(biāo)記同時(shí)存在于培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后1天，向培養(yǎng)基中加入zeocin和嘌呤霉素。持續(xù)存在選擇培養(yǎng)基直至分離集落(轉(zhuǎn)染后大約14天)。在分離集落并移至24孔平板中之后，將細(xì)胞在存在zeocin和嘌呤霉素的條件下培養(yǎng)。結(jié)果圖11示出含有克隆在UB6和CMV啟動(dòng)子之間的STAR67的抗體構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了許多表達(dá)EpCAM抗體的CHO集落(使用抗人IgG抗體通過(guò)ELISA測(cè)定)。當(dāng)在轉(zhuǎn)染后25天測(cè)定時(shí)，用EpCAMSTAR67質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的19個(gè)集落中EpCAM產(chǎn)量的平均值為9.8pg/細(xì)胞/天。相反，令人驚奇地，用EpCAM對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無(wú)集落存活。當(dāng)只用zeocin或者嘌呤霉素進(jìn)行選擇時(shí)，EpCAM對(duì)照集落存活。然而，當(dāng)通過(guò)對(duì)重鏈和輕鏈均施加選擇壓力而增加選擇壓力時(shí)，這些條件使得只有在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中存在STAR67的集落存活。該結(jié)果還示出摻入STAR67對(duì)置于一個(gè)STAR67元件的上游和下游的兩種啟動(dòng)子(UB6和CMV啟動(dòng)子)均具有有益作用。這表明STAR67可以雙向方式操縱。EpCAM對(duì)照和EpCAMSTAR67質(zhì)粒之間的差異是顯著的，當(dāng)選擇壓力較高時(shí)，只有EpCAMSTAR67轉(zhuǎn)染導(dǎo)致集落建立。這使得有機(jī)會(huì)使用這種質(zhì)粒構(gòu)型鑒別STAR67中介導(dǎo)這種作用的區(qū)域。將STAR67的較小的重疊部分置于驅(qū)動(dòng)EpCAM分子的UB6和CMV啟動(dòng)子之間。當(dāng)STAR67的一部分有功能時(shí)，集落在zeocin和嘌呤霉素同時(shí)用作選擇劑時(shí)存活。當(dāng)STAR67的一部分沒(méi)有功能時(shí)，在相同選擇條件下無(wú)集落存活。因此，將STAR67置于啟動(dòng)子上游導(dǎo)致與沒(méi)有這種抗阻抑物元件的構(gòu)建體對(duì)比在CHO細(xì)胞中明顯較高的EpCAM抗體表達(dá)水平。進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)使用SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗-EpCAM抗體的重鏈和輕鏈的表達(dá)。在其它實(shí)驗(yàn)中，將STAR67用其它STAR序列置換。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，改變編碼重鏈和輕鏈的兩個(gè)表達(dá)單位的方向，由此這兩個(gè)單位的方向一致。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將重鏈和輕鏈的表達(dá)單位分別置于不同的核酸分子上(如實(shí)施例5所述)，對(duì)所得克隆針對(duì)兩個(gè)選擇標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行選擇。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，改變宿主細(xì)胞類型。組合這些變化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。附圖描述圖1本發(fā)明的示意圖。A)含有(從5’至3’)轉(zhuǎn)基因(編碼例如d2EGFP基因)、IRES和可選擇標(biāo)記(zeo，賦予zeocin抗性)的在CMV啟動(dòng)子控制下的雙順?lè)醋踊?。表達(dá)單位在其3’末端具有SV40轉(zhuǎn)錄終止子(t)。該構(gòu)建體的名稱是CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV對(duì)照)。B)如A的構(gòu)建體，但是STAR67克隆在CMV啟動(dòng)子的上游。該構(gòu)建體的名稱是STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)。C)如B的構(gòu)建體，但是上游和下游STAR7元件克隆在完整構(gòu)建體的兩側(cè)。該構(gòu)建體的名稱是STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(CMV-STAR677/7)。圖2STAR67改良CHO細(xì)胞中CMV驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。對(duì)10個(gè)單獨(dú)的穩(wěn)定集落的d2EGFP信號(hào)平均值針對(duì)CHO細(xì)胞中指定構(gòu)建體進(jìn)行繪圖。A)CMV對(duì)照；B)STAR67-CMV。X(10)10個(gè)集落的平均d2EGFP表達(dá)水平。見(jiàn)實(shí)施例2詳述。圖3STAR67改良CHO細(xì)胞中EF1α驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。與圖2相同，但是使用EF1α啟動(dòng)子。A)EF1α對(duì)照；B)STAR67-EF1α。圖4STAR67改良CHO細(xì)胞中UB6驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。與圖2和3相同，但是使用UB6啟動(dòng)子。A)UB6對(duì)照；B)STAR67-UB6。圖5STAR67改良PER.C6細(xì)胞中CMV驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。與圖2相同，但是是在PER.C6細(xì)胞中。A)CMV對(duì)照；B)STAR67-CMV。圖6STAR67改良PER.C6細(xì)胞中EF1α驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。與圖3相同，但是是在PER.C6細(xì)胞中。A)EF1α對(duì)照；B)STAR67-EF1α。圖7STAR67改良PER.Cβ細(xì)胞中UB6驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。與圖4相同，但是是在PER.C6細(xì)胞中。A)UBβ對(duì)照；B)STAR67-UB6。圖8STAR67組合其它STAR元件改良CHO-K1細(xì)胞中SV40驅(qū)動(dòng)的d2EGFP表達(dá)。與圖2相似，但在CHO細(xì)胞中使用SV40啟動(dòng)子及指定的構(gòu)建體。對(duì)在轉(zhuǎn)染60天后的18-20個(gè)單獨(dú)的穩(wěn)定集落的d2EGFP信號(hào)進(jìn)行繪圖。A)SV40對(duì)照，SV40-STAR67，SV40-STAR7/7；B)SV40對(duì)照及SV40-STAR677/7。見(jiàn)實(shí)施例4詳述。圖9STAR67改良CHO-K1細(xì)胞中UB6驅(qū)動(dòng)的EpCAM抗體表達(dá)水平。見(jiàn)實(shí)施例5詳述。A)無(wú)STAR元件的構(gòu)建體；B)具有啟動(dòng)子上游STAR67和兩側(cè)STAR7元件的構(gòu)建體?？?EpCAM抗體濃度以pg/細(xì)胞/天表示。X(18)18個(gè)集落的平均產(chǎn)生水平。圖10STAR67不是增強(qiáng)子阻斷劑，而STAR6和7是。見(jiàn)實(shí)施例6詳述。圖11STAR67增強(qiáng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中UB6和CMV-驅(qū)動(dòng)的抗體表達(dá)水平。見(jiàn)實(shí)施例7詳述。A)含有抗-EpCAM重鏈(HC)和輕鏈(LC)的DNA分子，所述重鏈和輕鏈均在啟動(dòng)子之后，均與不同的可選擇標(biāo)記基因連接(同時(shí)選擇用于這兩種標(biāo)記)無(wú)STAR元件的構(gòu)建體。未發(fā)現(xiàn)集落；B)相同構(gòu)建體，在兩個(gè)啟動(dòng)子之間具有STAR67?？?EpCAM抗體濃度以pg/細(xì)胞/天表示。X(19)19個(gè)集落的平均產(chǎn)生水平。參考文獻(xiàn)Boshart，M，Weber，F(xiàn)，Jahn，G，Dorsch-Hasler，K，F(xiàn)leckenstein，B，andSchaffner，W.(1985)AverystrongenhancerislocatedupstreamofanimmediateearlygeneofhumancytomegalovirusCell41，521-530.ChungJH，WhiteleyM，andFelsenfeldG.(1993)A5’elementofthechickenbeta-globindomainservesasaninsulatorinhumanerythroidcellsandprotectsagainstpositioneffectinDrosophila.Cell74505-514.ChungJH，BellAC，F(xiàn)elsenfeldG.(1997).Characterizationofthechickenbeta-globininsulator.ProcNatlAcadSciUSA94575-580.Das，GC，Niyogi，SK，andSalzman，NP.(1985)SV40promotersandtheirregulationProgNucleicAcidResMolBiol32，217-236.GillDR，SmythSE，GoddardCA，PringleIA，HigginsCF，ColledgeWH，andHydeSC.(2001)IncreasedpersistenceoflunggeneexpressionusingplasmidscontainingtheubiquitinCorelongationfactor1αpromoter.GeneTherapy81539-1546.GossenM，andBujardH.(1992)Tightcontrolofgeneexpressioninmammaliancellsbytetracycline-responsivepromoters.ProcNatlAcadSciUSA895547-5551.GrahamFO，SmileyJ，RussellWandNairnR.(1977).CharacteristicsofahumancelllinetransformedbyDNAfromhumanaden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3>primerforamplificationofSV40promoter<400>82ttggttgggagctcaagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctc5權(quán)利要求1.一種重組的核酸分子，其包含選自如下一組的具有抗阻抑物活性的核酸序列a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列；所述重組核酸分子進(jìn)一步包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含與感興趣核酸連接的一個(gè)異源啟動(dòng)子，其中所述感興趣核酸優(yōu)選編碼全部或者部分感興趣蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1的分子，其中具有抗阻抑物活性的所述核酸序列位于所述表達(dá)盒中所述啟動(dòng)子的上游。3.權(quán)利要求2的分子，其中所述具有抗阻抑物活性的序列和所述啟動(dòng)子相隔少于2kb。4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的分子，其中所述編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸存在于多順?lè)醋踊蛑校龆囗樂(lè)醋踊蜻M(jìn)一步編碼一個(gè)可選擇標(biāo)記基因。5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的分子，進(jìn)一步包含至少一個(gè)其它的具有抗阻抑物活性的序列，所述至少一個(gè)其它序列選自a)SEQ.ID.NO.1-65任一序列，b)SEQ.ID.NO.1-65任一序列的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，及c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。6.一種包含表達(dá)盒的重組核酸分子，其包含5’-抗阻抑物序列A-啟動(dòng)子-編碼全部或部分感興趣蛋白質(zhì)的核酸-抗阻抑物序列B-3’，其中抗阻抑物序列A和B可以相同或者不同，選自(i)SEQ.ID.NO.1-65任一序列，(ii)SEQ.ID.NO.1-65任一序列的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，(iii)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及(iv)與(i)-(iii)任一序列互補(bǔ)的序列，特征在于所述表達(dá)盒在所述抗阻抑物序列A和B之間進(jìn)一步包含選自如下一組的具有抗阻抑物活性的序列a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。7.一種包含權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的分子的細(xì)胞。8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其是CHO細(xì)胞。10.一種生產(chǎn)感興趣蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的重組核酸分子的細(xì)胞，以在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼感興趣蛋白質(zhì)的所述核酸，特征在于所述重組核酸分子包含選自如下一組的具有抗阻抑物活性的核酸序列a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。11.權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)一步包括分離所述感興趣蛋白質(zhì)。12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述具有抗阻抑物活性的核酸序列位于控制感興趣蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子的上游。13.權(quán)利要求12的方法，其中具有抗阻抑物活性的所述序列和所述啟動(dòng)子間隔少于2kb。14.權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中編碼感興趣蛋白質(zhì)的所述核酸存在于多順?lè)醋踊蛑?，所述多順?lè)醋踊蜻M(jìn)一步編碼一個(gè)可選擇標(biāo)記基因。15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。17.選自如下一組的具有抗阻抑物活性的核酸序列在增加感興趣核酸表達(dá)中的應(yīng)用a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。18.一種產(chǎn)生表達(dá)兩種感興趣多肽的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括a)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入一或多種核酸分子，所述一種核酸分子或多種核酸分子一起包含(i)與編碼第一種感興趣多肽和第一種可選擇標(biāo)記基因的序列功能連接的啟動(dòng)子，及(ii)與編碼第二種感興趣多肽和第二種可選擇標(biāo)記基因的序列功能連接的啟動(dòng)子，及(iii)至少一個(gè)具有抗阻抑物活性的序列，選自(a)SEQ.ID.NO.66，(b)SEQ.ID.NO.66任一序列的片段，所述片段具有抗阻抑物活性，(c)與(a)或(b)至少70％相同并具有抗阻抑物活性的序列，及(d)與(a)-(c)任一序列互補(bǔ)的序列；b)通過(guò)基本上同時(shí)選擇表達(dá)所述第一種和第二種可選擇標(biāo)記基因而選擇宿主細(xì)胞。19.一種表達(dá)兩種感興趣多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)通過(guò)權(quán)利要求18的方法獲得的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述第一種和第二種多肽，任選分離所述多肽。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述具有抗阻抑物活性的序列選自a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)與a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)與a)-c)任一序列互補(bǔ)的序列。21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的方法，其中所述兩種多肽是多聚體蛋白質(zhì)的一部分。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的抗阻抑物元件，其可用于改良核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明還提供了使用所述新的抗阻抑物元件生產(chǎn)感興趣蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供了包含抗阻抑物元件的表達(dá)盒的新構(gòu)型。文檔編號(hào)C12N15/67GK1981057SQ200580022970公開(kāi)日2007年6月13日申請(qǐng)日期2005年7月7日優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日發(fā)明者阿里·彼得·奧特,特奧多魯斯·亨德里克斯·雅各布斯·科瓦克斯,理查德·喬治·安東尼厄斯·伯納德斯·斯瓦爾特,亨里克斯·約翰內(nèi)斯·馬里亞·范布洛克蘭申請(qǐng)人:科羅邁吉尼科斯公司