專利名稱：從紅茶菌中分離純化釀酒酵母菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從普通混雜的紅茶菌液中純化獲得釀酒酵母菌菌株的方法。。
背景技術(shù)：
紅茶菌又名“海寶”、“紅茶菇”，是一種傳統(tǒng)保健飲料，廣泛流傳于我國、日本、東南亞和南歐諸國。一般家庭中用經(jīng)驗(yàn)方式培養(yǎng)紅茶菌，從他人處獲得紅茶菌液，將此菌液接進(jìn)配好的糖茶水中，根據(jù)溫度的區(qū)別培養(yǎng)約7～15天，得到新的紅茶菌。這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式存在以下缺點(diǎn)①容易污染雜菌，②菌種不易保藏，③產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，④不易大規(guī)模培養(yǎng)，⑤不易商業(yè)化開發(fā)。為解決這些問題，本報(bào)告擬用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)利用紅茶菌這一傳統(tǒng)飲料，提高生產(chǎn)紅茶菌的技術(shù)水平，穩(wěn)定產(chǎn)品的質(zhì)量，推動(dòng)傳統(tǒng)飲料的商業(yè)化生產(chǎn)和銷售。
現(xiàn)在已經(jīng)知道紅茶菌最主要的菌群是由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三類微生物構(gòu)成，各地的紅茶菌產(chǎn)品中這些菌群的菌種多少存在區(qū)別，例如酵母菌中有接合酵母、球擬酵母、不顯酵母、漢遜德氏酵母、熱帶假絲酵母、路德類酵母和釀酒酵母之分，醋酸菌中有巴氏醋酸菌、木醋酸菌、醋化醋酸菌、弱氧化醋酸菌等。由于地域性的差異導(dǎo)致紅茶菌中菌群組成的差異，最終導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味的差異，因此出現(xiàn)從不同地區(qū)引種的培養(yǎng)物風(fēng)味出現(xiàn)較大差異。
在紅茶菌中酵母菌的作用是將蔗糖、葡萄糖降解產(chǎn)生乙醇，醋酸菌氧化乙醇產(chǎn)生乙酸。酵母菌和醋酸菌還可以合成酯類、內(nèi)酯等產(chǎn)物，賦予紅茶菌特征性風(fēng)味。根據(jù)研究，對(duì)紅茶菌產(chǎn)品的膠狀外形和風(fēng)味具有最主要貢獻(xiàn)的微生物是醋酸菌和酵母菌。乳酸菌只是由于也耐一定的酸度，才能在糖茶液中生存，產(chǎn)生對(duì)人體有益的微量的乳酸和其他化合物。實(shí)際上可以認(rèn)為紅茶菌是酵母菌和醋酸菌的松散的共生體。在家庭培養(yǎng)的紅茶菌的表面通常形成很厚的膠狀的灰白色膜狀物，紅茶菌菌膜是由醋酸菌將葡萄糖聚合成纖維素而成，在膜中存在醋酸菌和少量的酵母菌，在膜的下方存在較多的酵母菌、乳酸菌和其他微生物，酸性膜的存在阻止了其他微生物的污染。在靜止培養(yǎng)條件下醋酸菌合成大量的膠膜導(dǎo)致糖類的不必要的浪費(fèi)。茶葉中的兒茶素和單寧對(duì)很多微生物具有抑制作用，而紅茶菌中的醋酸菌和酵母菌可以忍耐較高濃度的兒茶素和單寧，并且可以降解部分兒茶素和單寧，將其作為營養(yǎng)利用，降低了紅茶菌液的苦澀味，殘存的兒茶素也可作為營養(yǎng)保健成份。正是由于上述的各種原因?qū)е滦纬杉t茶菌的特征性的風(fēng)味。
一般家庭培養(yǎng)的紅茶菌中還存在耐酸的霉菌和其他細(xì)菌，這些微生物對(duì)紅茶菌產(chǎn)品沒有什么貢獻(xiàn)，但卻是產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、導(dǎo)致污染的根本原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種分離純化紅茶菌中重要菌種—釀酒酵母菌的工藝方法。
具體的操作方法如下從紅茶菌中分離純化釀酒酵母菌的方法，包括下述步驟(1)、從紅茶菌中分離純化釀酒酵母菌A、取家庭或市售的紅茶菌菌液，在無菌條件下，用取樣器從菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理鹽水進(jìn)行10倍、100倍、1000倍的梯度稀釋，得三份稀釋液；B、在超凈工作臺(tái)上，取融化后降溫至約50℃的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基倒平板，在平板中注入約20mL的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入0.1～100mg/L濃度的抑制細(xì)菌的抗生素，待培養(yǎng)基凝固后，取上述三份稀釋液0.05mL～0.2mL分別加入三個(gè)平板上，用三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；C、將上述制備好的平板置于25℃～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7天；D、用接種環(huán)挑取經(jīng)純化的過各種典型的酵母菌菌株的菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于25℃～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7天；E、持續(xù)D步驟的操作至少2次，直至菌落完全純化；得到20株以上純的酵母菌菌株；(2)、按照《微生物分類學(xué)》的方法對(duì)分離獲得的多個(gè)純的酵母菌菌株進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)鑒定獲得管囊酵母菌、釀酒酵母菌、德氏酵母菌、畢赤氏酵母菌共4種酵母菌；(3)、用斜面菌種接種靜止培養(yǎng)紅茶菌的方法以篩選釀酒酵母菌菌株將鑒定為管囊酵母菌、釀酒酵母菌、德氏酵母菌、畢赤氏酵母菌的4株釀酒酵母菌菌株與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株分別進(jìn)行兩兩組合接種試驗(yàn)，即一種釀酒酵母菌加一種醋酸菌的組合接種試驗(yàn)，具體操作步驟如下
A、紅茶菌糖茶液的配制，取原料茶葉3～10g，糖30～100g，水1000mL，用沸水沖泡茶葉和糖，保持微沸1～10min，靜置使茶葉沉淀，取上清液，分裝至試管、150mL或250mL三角瓶，108℃～121℃滅菌處理10～25min；B、按兩兩組合用接種環(huán)從上述純化的4株酵母菌菌株和4醋酸菌菌株的純培養(yǎng)中挑取一環(huán)混合分別接進(jìn)紅茶菌糖茶液中，20℃～35℃靜止培養(yǎng)6～15天；即管囊酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌菌株混合接種；即釀酒酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即德氏酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即畢赤氏酵母分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；結(jié)果是，釀酒酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種后均可以形成典型的帶有膠膜的紅茶菌液。
上述的紅茶菌中釀酒酵母菌的分離純化方法，從紅茶菌菌液中分離純化釀酒酵母菌的B步驟、D步驟中的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基配方糖50～100g，酵母膏5～10g，CaCO315～30g，瓊脂12～20g，水1000mL。
上述的紅茶菌中酵母菌的分離純化方法，所述葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基和紅茶菌糖茶液配方中的糖為紅糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或飴糖或蜂蜜，或者任意幾種糖類的混合物。
上述的紅茶菌中酵母菌的分離純化方法，從紅茶菌菌液中分離純化酵母菌的B步驟中的抗生素為青霉素或鏈霉素或氯霉素或紅霉素或慶大霉素，其濃度在1～100mg/L。
上述的紅茶菌中酵母菌的分離純化方法，所述的茶葉為綠茶、紅茶、烏龍茶、茶末、各類茶葉提取物、幾種茶葉的混合物。
釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其生長特征在于在GYC固體培養(yǎng)基上3-5天菌落大小2～4mm，圓形，邊緣整齊，凸起，表面潮濕，奶酪狀，乳白色；菌落粘狀，接種環(huán)易挑起；在GYC液體培養(yǎng)基生長有沉淀；最高生長溫度37℃。
細(xì)胞一般呈卵圓形，3～8×5～15μm，以出芽方式無性生殖，有性孢子為子囊孢子，無假菌絲。
本發(fā)明的菌種已按專利法實(shí)施細(xì)則第二十五條第三款的規(guī)定在國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位——中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2006年4月6日，保藏號(hào)CGMCC1670，并附具存活性報(bào)告書。
采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)發(fā)掘改進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)品和工藝，是我國食品工業(yè)發(fā)展的重要方向。本發(fā)明采用微生物學(xué)技術(shù)從傳統(tǒng)的紅茶菌飲料中分離純化出紅茶菌的主要釀酒酵母菌菌株，以利于用純菌株培養(yǎng)出具有醇、酸、甜、香獨(dú)特風(fēng)格的紅茶菌。這種工藝具有無雜菌污染、菌種易保藏、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、降低消耗、易于工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品商業(yè)化的特點(diǎn)。
紅茶菌具有廣泛的營養(yǎng)保健功能，生產(chǎn)紅茶菌的原料價(jià)格低廉，采用現(xiàn)代生物技術(shù)提升傳統(tǒng)的飲料產(chǎn)品的技術(shù)含量和質(zhì)量水平，促進(jìn)其商業(yè)化開發(fā)，具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明分離純化的釀酒酵母菌為工業(yè)化開發(fā)利用紅茶菌提供了保證。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。
實(shí)施例1釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其生長特征在于在GYC固體培養(yǎng)基上3-5天菌落大小2～4mm，圓形，邊緣整齊，凸起，表面潮濕，奶酪狀，乳白色；菌落粘狀，接種環(huán)易挑起；在GYC液體培養(yǎng)基生長有沉淀；最高生長溫度37℃。
細(xì)胞一般呈卵圓形，3～8×5～15μm，以出芽方式無性生殖，有性孢子為子囊孢子，無假菌絲。
分離純化釀酒酵母菌的方法如下(1)A、取家庭或市售的紅茶菌菌液，在超凈工作臺(tái)上，在無菌條件下，用無菌的取樣器從菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理鹽水進(jìn)行10倍、100倍、1000倍的梯度稀釋，逐漸稀釋樣品，得三份稀釋液；B、在超凈工作臺(tái)上，取融化后降溫至約50℃的葡萄糖酵母膏GYC固體培養(yǎng)基倒平板，在直徑9cm的平板中注入約20mL的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入0.1～100mg/L濃度的抑制細(xì)菌的抗生素，待培養(yǎng)基凝固后，取不同稀釋度的三份稀釋液菌液0.05mL～0.2mL加入三個(gè)平板上，用無菌的三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；
C、將上述制備好的平板置于25℃～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7天；D、用接種環(huán)挑取經(jīng)純化的各種典型的酵母菌菌株的菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏GYC固體培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于25℃～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7天；持續(xù)D步驟的操作至少2次，直至菌落完全純化；上述B步驟、D步驟中的葡萄糖酵母膏GYC固體培養(yǎng)基配方白糖75g，酵母膏7g，CaCO325g，瓊脂16g，水1000mL。
葡萄糖酵母膏GYC固體培養(yǎng)基和紅茶菌糖茶液配方中的糖，可為紅糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或飴糖或蜂蜜，或者任意幾種糖類的混合物。
上述B步驟中的抗生素可以是青霉素或鏈霉素或氯霉素或紅霉素或慶大霉素，其濃度在1～100mg/L。
(2)、按照《微生物分類學(xué)》(張紀(jì)忠主編，復(fù)旦大學(xué)出版社，1990)的方法對(duì)分離獲得的多個(gè)純的釀酒酵母菌菌株進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)鑒定獲得管囊酵母菌、釀酒酵母菌、德氏酵母菌、畢赤氏酵母菌共4種酵母菌菌株。
按照微生物學(xué)研究的原則，在分離到某一純菌株后，要根據(jù)微生物分類和鑒定的通用方法，對(duì)種名未知的菌株進(jìn)行鑒定，獲取有關(guān)其分類的信息，為進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供分類學(xué)的依據(jù)。
酵母菌不是分類學(xué)上的名稱，而是單細(xì)胞的真菌的通稱，酵母菌在分類學(xué)上分屬于子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌。酵母菌的形態(tài)特征簡(jiǎn)單，基本為球形、卵園形，因此對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定主要是以生理生化特征為主、形態(tài)學(xué)特征為輔。本研究是以張紀(jì)忠主編的《微生物分類學(xué)》第四篇(第368頁—第428頁)中規(guī)定的方法和技術(shù)對(duì)分離獲得的酵母菌菌株進(jìn)行鑒定，將這些菌株定為接合酵母、漢遜德氏酵母、路德酵母和釀酒酵母共4個(gè)種。
(3)、用斜面菌種接種靜止培養(yǎng)紅茶菌的方法以篩選釀酒酵母菌菌株將鑒定為管囊酵母菌、釀酒酵母菌、德氏酵母菌、畢赤氏酵母菌的4株釀酒酵母菌菌株與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株分別進(jìn)行兩兩組合接種試驗(yàn)，即一種釀酒酵母菌加一種醋酸菌的組合接種試驗(yàn)，具體操作步驟如下A、紅茶菌糖茶液的配制，取原料綠茶3～10g，蔗糖30～100g，水1000mL，用沸水沖泡茶葉和糖，保持微沸1～10min，靜置使茶葉沉淀，小心取出取上清液，分裝至試管、150mL或250mL三角瓶，108℃～121℃滅菌處理10～25min；B、按兩兩組合用接種環(huán)從上述純化的4株酵母菌菌株和4株醋酸菌菌株的純培養(yǎng)中挑取一環(huán)混合分別接進(jìn)紅茶菌糖茶液中，20℃～35℃靜止培養(yǎng)6～15天；即管囊酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即釀酒酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即德氏酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即畢赤氏酵母分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；結(jié)果是，釀酒酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種后均可以形成典型的帶有膠膜的紅茶菌液。
利用純化取得的釀酒酵母菌菌株與醋酸菌菌株配合，采用液體菌種培養(yǎng)靜止紅茶菌和振蕩通氣培養(yǎng)紅茶菌的方法即可生產(chǎn)出典型的具有醇、香、酸、甜特征的紅茶菌液。
實(shí)施例2在分離純化釀酒酵母菌的方法中，上述B步驟、D步驟中的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基配方葡萄糖50g，酵母膏5g，CaCO315g，瓊脂12g，水1000mL。
配制紅茶菌糖茶液的茶為紅茶上述步驟中的糖也可以是任意幾種糖類的混合物，比例任意調(diào)配。
其它同實(shí)施例1。
實(shí)施例3在分離純化釀酒酵母菌的方法中，上述B步驟、D步驟中的葡萄糖酵母膏GYC固體培養(yǎng)基配方蜂蜜100g，酵母膏10g，CaCO330g，瓊脂20g，水1000mL。
配制紅茶菌糖茶液的茶為烏龍茶，也可以是茶末、各類茶葉提取物、幾種茶葉的混合物。
其它同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.從紅茶菌中分離純化釀酒酵母菌的方法，其特征在于(1)、從紅茶菌中分離純化釀酒酵母菌A、取家庭或市售的紅茶菌菌液，在無菌條件下，用取樣器從菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理鹽水進(jìn)行10倍、100倍、1000倍的梯度稀釋，得三份稀釋液；B、在超凈工作臺(tái)上，取融化后降溫至約50℃的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基倒平板，在平板中注入約20mL的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入0.1～100mg/L濃度的抑制細(xì)菌的抗生素，待培養(yǎng)基凝固后，取上述三份稀釋液0.05mL～0.2mL分別加入三個(gè)平板上，用三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；C、將上述制備好的平板置于25℃～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7天；D、用接種環(huán)挑取經(jīng)純化的過各種典型的酵母菌菌株的菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于25℃～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7天；E、持續(xù)D步驟的操作至少2次，直至菌落完全純化；得到20株以上純的酵母菌菌株；(2)、按照《微生物分類學(xué)》的方法對(duì)分離獲得的多個(gè)純的酵母菌菌株進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)鑒定獲得管囊酵母菌、釀酒酵母菌、德氏酵母菌、畢赤氏酵母菌共4種酵母菌；(3)、用斜面菌種接種靜止培養(yǎng)紅茶菌的方法以篩選釀酒酵母菌菌株將鑒定為管囊酵母菌、釀酒酵母菌、德氏酵母菌、畢赤氏酵母菌的4株釀酒酵母菌菌株與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株分別進(jìn)行兩兩組合接種試驗(yàn)，即一種釀酒酵母菌加一種醋酸菌的組合接種試驗(yàn)，具體操作步驟如下A、紅茶菌糖茶液的配制，取原料茶葉3～10g，糖30～100g，水1000mL，用沸水沖泡茶葉和糖，保持微沸1～10min，靜置使茶葉沉淀，取上清液，分裝至試管、150mL或250mL三角瓶，108℃～121℃滅菌處理10～25min；B、按兩兩組合用接種環(huán)從上述純化的4株酵母菌菌株和4醋酸菌菌株的純培養(yǎng)中挑取一環(huán)混合分別接進(jìn)紅茶菌糖茶液中，20℃～35℃靜止培養(yǎng)6～15天；即管囊酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌菌株混合接種；即釀酒酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即德氏酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；即畢赤氏酵母分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種；結(jié)果是，釀酒酵母菌分別與木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌混合接種后均可以形成典型的帶有膠膜的紅茶菌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅茶菌中釀酒酵母菌的分離純化方法，其特征在于從紅茶菌菌液中分離純化釀酒酵母菌的B步驟、D步驟中的葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基配方糖50～100g，酵母膏5～10g，CaCO315～30g，瓊脂12～20g，水1000mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅茶菌中酵母菌的分離純化方法，其特征在于所述葡萄糖酵母膏(GYC)固體培養(yǎng)基和紅茶菌糖茶液配方中的糖為紅糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或飴糖或蜂蜜，或者任意幾種糖類的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅茶菌中酵母菌的分離純化方法，其特征在于從紅茶菌菌液中分離純化酵母菌的B步驟中的抗生素為青霉素或鏈霉素或氯霉素或紅霉素或慶大霉素，其濃度在1～100mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅茶菌中酵母菌的分離純化方法，其特征在于所述的茶葉為綠茶、紅茶、烏龍茶、茶末、各類茶葉提取物、幾種茶葉的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及從普通混雜的紅茶菌液中純化獲得釀酒酵母菌菌株的方法。所要解決的問題是提供一種分離純化紅茶菌中重要菌種—釀酒酵母菌的工藝方法。特點(diǎn)是包括下述步驟，取家庭或市售的紅茶菌菌液進(jìn)行純化分離；按照《微生物分類學(xué)》一書中的方法對(duì)分離獲得的多個(gè)純的酵母菌菌株進(jìn)行菌種鑒定；用斜面菌種接種靜止培養(yǎng)紅茶菌的方法以篩選釀酒酵母菌菌株；本發(fā)明采用微生物學(xué)技術(shù)從傳統(tǒng)的紅茶菌飲料中分離純化出紅茶菌的主要釀酒酵母菌菌株，以利于用純菌株培養(yǎng)出具有醇、酸、甜、香獨(dú)特風(fēng)格的紅茶菌。這種工藝具有無雜菌污染、菌種易保藏、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、易于工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品商業(yè)化的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/865GK1935980SQ20061003995
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者唐欣昀 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)