專利名稱：基因型定型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)一種能夠同時(shí)以高可信度(fidelity)和高可用率(workablerate)擴(kuò)增多個(gè)DNA序列，具有高產(chǎn)出率以及低成本效益的方法，特別是關(guān)于一種結(jié)合條件化觸減策略(conditional touchdown strategies)的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)(Multiplex Polymerase Chain Reaction；MPCR)的基因型定型方法。
背景技術(shù)：
為了清楚說明，茲將爾后所用的關(guān)于生物分子的各種字詞給予進(jìn)一步定義。
1、定義“多型性”(Polymorphism)一般指的是一種物種或基因以兩種或更多的型式呈現(xiàn)的現(xiàn)象。特別對于本發(fā)明來說，“多型性”指的是同一個(gè)基因呈現(xiàn)兩種以上的型式。
“單一核甘酸多型性”(Single Nucleotide Polymorphism或SNP)指的是由于單一個(gè)核甘酸所產(chǎn)生的多型性現(xiàn)象。
“多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)”(Multiplex Polymerase Chain Reaction或MPCR)指的是在單一個(gè)鏈聚合酶連鎖反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA目標(biāo)片段的數(shù)量。
“高產(chǎn)出率”(High-throughput)指的是快速而且具有低成本效益的大規(guī)模制造方法。在本發(fā)明中，能夠在嚴(yán)苛要求的時(shí)間和預(yù)算下同時(shí)篩選在單一個(gè)DNA樣本中大量、多種的基因座(genetic loci)。
2、相關(guān)技術(shù)
“鏈聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)”鏈聚合酶連鎖反應(yīng)是科學(xué)上的一項(xiàng)偉大發(fā)明，它擴(kuò)大了從少量DNA料來源制造出大量DNA分子副本的應(yīng)用性，并使得應(yīng)用更多元化，也使得分子生物學(xué)的世界產(chǎn)生了革命性的變化。
這個(gè)方法包括使用能夠和與它們互補(bǔ)的DNA序列粘合(anneal)，且已預(yù)先決定序列的數(shù)組成對寡核甘酸分子，或稱為起始引子分子(primer)，并且通過熱穩(wěn)定的DNA鏈聚合酶限定特定的DNA片段擴(kuò)增其數(shù)量。這些DNA分子產(chǎn)物是通過一個(gè)重復(fù)的一系列循環(huán)操作過程被合成出來，每一個(gè)循環(huán)都包括了模版分子變性分離(template denaturation)，引子粘合反應(yīng)(primer annealing)，以及通過鏈聚合酶所進(jìn)行的粘合引子的延伸反應(yīng)(extension)。這些過程可以造成特定的DNA片段數(shù)量以指數(shù)函數(shù)的速度累積，這些DNA分子的末端特征是由引子的5’端來決定，可參考Saiki等人發(fā)表的“引子引導(dǎo)熱穩(wěn)定的DNA鏈聚合酶酵素?cái)U(kuò)增DNA數(shù)量”，Science(1988)239487-91。
“單一核甘酸多型性基因型定型(genotyping)”有許多種為了不同領(lǐng)域的特殊目的的PCR變化方法已經(jīng)被發(fā)展出來。PCR使用在基因型定型技術(shù)上，已經(jīng)為揭開基因組結(jié)構(gòu)的神秘面紗打開了一扇寬廣之窗，例如基因鑒定和辨認(rèn)在實(shí)際上已經(jīng)變得可行。目前科學(xué)界對于SNP的濃厚興趣使得對于基因型定型技術(shù)的要求已進(jìn)一步到以費(fèi)用、正確性、產(chǎn)出率和檢測的簡單程度作為判斷檢測是否可行的重要因子。如果有1000個(gè)人，每個(gè)人50萬個(gè)SNP要在一年內(nèi)完成分析，那么每天就要完成一百五十萬個(gè)SNP基因型定型，而且總花費(fèi)將達(dá)到五千萬美金。甚至，每個(gè)人需要數(shù)毫克的基因組DNA，例如收集十管以上的血液，也將增加樣本收集的費(fèi)用，使得這項(xiàng)工作變得不可行。即使是通過保守的估計(jì)，這個(gè)嚇人的花費(fèi)也將使得最大型的基因型定型中心望而卻步。因此，對于高產(chǎn)出率、具有低成本效益的方法的需求促成了許多創(chuàng)新的技術(shù)出現(xiàn)，包括PCR的衍生技術(shù)、以對偶基因座特異探針發(fā)展出來的雜交方法(例如TaqMan(商品名)PCR)、寡核甘酸嵌合反應(yīng)(例如寡核甘酸嵌合檢測(OLA))、單一核甘酸引子延伸反應(yīng)(例如基質(zhì)輔助雷射脫附游離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MassSpectrometry)以及模版引導(dǎo)的終止染料分子并入的熒光偏極化偵測(FP-TDI，template directed dye terminator incorporation with detection byfluorescence polarisation))、以及酵素切割方法(例如Invader(商品名))都已經(jīng)被設(shè)計(jì)來增強(qiáng)自動(dòng)化平臺(tái)或使基因型定型的生化反應(yīng)更多樣化，參考Syvnen的“獲取基因變異資料基因型定型單一核甘酸多型性”(Accessinggenetic variationgenotyping single nucleotide polymorphisms)，Nat RevGenet(2001)2930-42。
然而，這些技術(shù)沒有一個(gè)真正代表了基因型定型技術(shù)上的突破。昂貴的儀器和試劑伴隨著珍貴而稀少的基因組DNA樣本阻礙了市場的接受度，并且使得檢測的設(shè)計(jì)更加復(fù)雜。此外，大部分被發(fā)展出來的技術(shù)需要消耗大量的樣本DNA，也抑制了大規(guī)模SNP基因型定型的實(shí)行。
“多重PCR”多重PCR，在單一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)以上的基因座，參考Chamberlain，“杜馨氏肌肉營養(yǎng)不良癥基因座通過多重DNA擴(kuò)增的缺失篩檢”(Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus viamultiplex DNA amplification)，Nucleic Acids Res(1988)1611141-56，此法是一個(gè)能大量減少時(shí)間、費(fèi)用及所需基因組DNA樣本的強(qiáng)大基因分析技術(shù)。這個(gè)方法已經(jīng)被成功的運(yùn)用在許多的DNA檢測領(lǐng)域上，包括基因多型性的判斷。然而多重的PCR引子同時(shí)置于一個(gè)反應(yīng)中可能會(huì)造成許多問題，包括假性PCR產(chǎn)物形成增加、引子形成雙聚體、以及較短的DNA片段數(shù)量會(huì)有擴(kuò)增的傾向。所有這些可能的問題如果加諸于SNP基因型定型會(huì)導(dǎo)致不正確的結(jié)果。一個(gè)關(guān)于各種情況以及所會(huì)遇到的困難的詳細(xì)敘述已經(jīng)在Henegariu等人所著的“多重PCR關(guān)鍵參數(shù)和詳盡的操作流程”(Multiplex PCRcritical parameters andstep-by-step protocol)，BioTechniques(1997)23504-511，被討論過了。
“傳統(tǒng)技術(shù)的問題”如同前述所討論到的技術(shù)，總括的說，至少有如下三項(xiàng)缺點(diǎn)沒有被克服1、最近的SNP基因型定型技術(shù)需要昂貴的設(shè)備和試劑，加上珍貴而稀少的基因組DNA樣本，阻礙了市場的接受度，并且使得檢測的設(shè)計(jì)更加復(fù)雜；2、多重PCR將多對PCR引子置于同一個(gè)反應(yīng)中可能會(huì)造成許多問題，包括假性PCR產(chǎn)物形成增加、引子形成雙聚體和傾向于偏極性擴(kuò)增較短的DNA片段，因此降低了它的可用率；3、由于上述所提到的可能產(chǎn)生的問題，從文獻(xiàn)中記載多重PCR的成功比率幾乎很難超過50％。
當(dāng)然，有許多技術(shù)已經(jīng)被提出來要解決該領(lǐng)域的各種問題。例如，美國專利第5,736,365號(hào)，由Walker等人在單一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中使用多重分子鏈取代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)。這項(xiàng)技術(shù)能夠同時(shí)鑒定出結(jié)核桿菌(M.tuberculosis)，并提供大量篩檢所有臨床相關(guān)的分支桿菌屬的物種。
頒給Shuber的第5,882,856號(hào)和第6,207,372號(hào)美國專利則提供了通用的多重PCR擴(kuò)增的引子序列，讓多重PCR反應(yīng)能夠在不需要繁雜的最佳化步驟下被設(shè)計(jì)并且進(jìn)行，不必管不同的引子可能造成的不一樣的性質(zhì)，而且每一個(gè)被擴(kuò)增的產(chǎn)物能同時(shí)被制造出相等數(shù)量。
Diamandis等人設(shè)計(jì)出一套能夠快速診斷和專一篩檢p53基因的突變的方法、試劑和套裝試劑，這項(xiàng)美國第6,071,726號(hào)專利可以快速而且經(jīng)濟(jì)的診斷出病人樣本中p5 3基因的突變。不過這些方法都無法解決上面所提到的問題。
在美國專利公開第20020058281號(hào)中，Matsuzaki等人提出了一套多重核酸分子數(shù)量擴(kuò)增的方法以及組成成分，這個(gè)方法能夠以相同的效率擴(kuò)增不同序列的DNA分子數(shù)量，因此能夠得到相同摩爾數(shù)的分子產(chǎn)物。這個(gè)方法需要高濃度的引子并且使用相同的粘合溫度，而且它的產(chǎn)物是非特異性的，可用率也很低。
為了解決使用少量的基因組DNA做為模版，以及在多重PCR中置入大量的引子對所遭遇到的困難，Nakamura等人在美國專利公開第20020182622號(hào)中揭露一個(gè)SNP定型的方法，此法借著在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中使用熱起始的Taq(商品名)鏈聚合酶，可以用很少量的基因組DNA為成千上萬的SNP位置進(jìn)行基因型定型。然而，這個(gè)方法仍然使用了高濃度的引子和單一粘合溫度，而且借著這個(gè)方法所得到的PCR產(chǎn)物仍有非特異性的問題，并且可用率仍然偏低(不超過50％)。因此，如何提供一種高產(chǎn)出率，并具有經(jīng)濟(jì)效益，能以高可信度和高可用率同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)DNA數(shù)量的方法，成為人們所期盼。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種條件化觸減多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，通過快速而且負(fù)擔(dān)得起的方法，借著多重PCR伴隨著條件化觸減策略，能夠用來進(jìn)行多重目標(biāo)DNA序列分子的同時(shí)擴(kuò)增，應(yīng)用在SNP基因型定型，達(dá)到進(jìn)行SNP基因型定型所需的DNA模版的數(shù)量相較于傳統(tǒng)的方法大幅度地減少的目的。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種條件化觸減多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，其特征是它包括下列步驟(1)首先，在第一粘合溫度的同步鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，以增加許多引子粘合到模版上；(2)然后，在第二粘合溫度的特異性鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，以豐富許多指定的序列；其中，該第二粘合溫度高于該第一粘合溫度。
該第一粘合溫度等于一最佳化的粘合溫度，該第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度，該最佳化的粘合溫度是通過兩個(gè)基因組DNA樣本和混和的多個(gè)引子對被置入以各種觸減熱循環(huán)條件，執(zhí)行的擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，調(diào)整出最佳化的粘合溫度。
該第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，該第二粘合溫度等于該最佳化的粘合溫度。該第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，該第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。
在該同步鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的步驟之前，它更包括一最佳化引子混合物和相關(guān)鏈聚合酶連鎖反應(yīng)條件的步驟；該最佳化步驟是通過使用同一個(gè)基因組DNA樣本和每一個(gè)引子對進(jìn)行鏈聚合酶連鎖反應(yīng)來完成觸減鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的循環(huán)模式，包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環(huán)，該第一循環(huán)包括第二種模版分子變性分離的第一時(shí)間區(qū)段，跟隨著第二時(shí)間區(qū)段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應(yīng)，然后第三時(shí)間區(qū)段的第一種引子延伸反應(yīng)；(3)許多的第二循環(huán)，該第二循環(huán)包括第三種模版分子變性分離的第四時(shí)間區(qū)段，跟隨著第五時(shí)間區(qū)段在最終觸減點(diǎn)的第二種引子粘合反應(yīng)，然后第六時(shí)間區(qū)段的第二種引子延伸反應(yīng)；(4)第三種引子延伸反應(yīng)。
本發(fā)明又提供一種基因型定型方法，其特征是它包括下列步驟(1)通過采用第一觸減程序的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)在一帶有許多引子對及基因組DNA的混合液中同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子；(2)采用第二觸減程序的多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，每一該獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)通過一對指定的引子擴(kuò)增來自前一步驟制造的多重PCR產(chǎn)物中的一特定的核甘酸序列分子。
該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度一溫度減量，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度實(shí)質(zhì)上高于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度實(shí)質(zhì)上等于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。該基因組DNA的數(shù)量低于50微毫克。該基因組DNA的數(shù)量等于或大于50微毫克。該同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子的步驟采用一觸減熱循環(huán)模式。該循環(huán)模式包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環(huán)，該第一循環(huán)包括第二種模版分子變性分離的第一時(shí)間區(qū)段，跟隨著第二時(shí)間區(qū)段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應(yīng)，然后第三時(shí)間區(qū)段的第一種引子延伸反應(yīng)；(3)許多的第二循環(huán)，該第二循環(huán)包括第三種模版分子變性分離的第四時(shí)間區(qū)段，跟隨著第五時(shí)間區(qū)段在最終觸減點(diǎn)的第二種引子粘合反應(yīng)，然后第六時(shí)間區(qū)段的第二種引子延伸反應(yīng)；(4)第三種引子延伸反應(yīng)。
它更包括在該多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的步驟之前的純化該多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)產(chǎn)物的步驟。
該多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的步驟采用一觸減熱循環(huán)模式，該循環(huán)模式包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環(huán)，該第一循環(huán)包括第二種模版分子變性分離的第一時(shí)間區(qū)段，跟隨著第二時(shí)間區(qū)段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應(yīng)，然后第三時(shí)間區(qū)段的第一種引子延伸反應(yīng)；(3)許多的第二循環(huán)，該第二循環(huán)包括第三種模版分子變性分離的第四時(shí)間區(qū)段，跟隨著第五時(shí)間區(qū)段在最終觸減點(diǎn)的第二種引子粘合反應(yīng)，然后第六時(shí)間區(qū)段的第二種引子延伸反應(yīng)；(4)第三種引子延伸反應(yīng)。
它更包括在該同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子的步驟之前的一最佳化引子混合物和相關(guān)鏈聚合酶連鎖反應(yīng)條件的步驟。它更包括一凝膠分析及定序分析的步驟以評估鏈聚合酶連鎖反應(yīng)和基因型定型結(jié)果。
本發(fā)明還提供一種熒光偏極化偵測法的方法，其特征是它包括下列步驟(1)通過采用第一觸減程序的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)在一帶有許多引子對以及基因組DNA的混合液中，同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子；(2)采用第二觸減程序的多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，每一該獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)通過一對指定的引子擴(kuò)增來自前一步驟制造的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)產(chǎn)物中的一特定的核甘酸序列分子。
該第一觸減程序使用一粘合溫度實(shí)質(zhì)上等于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度實(shí)質(zhì)上等于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。它更包括一設(shè)計(jì)該引子的步驟，以具備一融解溫度在一范圍內(nèi)，供一數(shù)量的鏈聚合酶連鎖反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增。
在本發(fā)明的方法中，將觸減PCR結(jié)合到多重PCR是為了要解決在PCR多重化時(shí)所遭遇到的引子起始錯(cuò)誤的困難。觸減PCR是一個(gè)PCR的變化方法，它已經(jīng)被采用來避開為了要判斷粘合溫度所需的更復(fù)雜的最佳化過程。它包含了每下一個(gè)回合降低溫度1℃，一般大約使用10個(gè)回合，以觸減(touchdown)方式達(dá)到最適合的粘合溫度。
它的精髓在于任何正確和不正確于融解溫度(Tm)的粘合之間的差異會(huì)造成每回合產(chǎn)物數(shù)量2倍的差異，因此會(huì)造成正確的產(chǎn)物數(shù)量超過任何不正確的產(chǎn)物，參考Don等人的“在基因擴(kuò)增過程中，觸減PCR以回避假性的引子起始”(Touchdown PCR to circumvent spurious priming during geneamplification)，Nucleic Acids Res(1991)194008。這個(gè)將觸減策略整合到多重PCR的發(fā)明方法，在需要大量引子對時(shí)是非常有價(jià)值的，尤其是在SNP基因型定型操作。本發(fā)明的方法被設(shè)計(jì)來改進(jìn)高度要求正確度、低成本效益和高產(chǎn)出率的SNP基因型定型的表現(xiàn)。
此外，在所有傳統(tǒng)SNP基因型定型過程，每個(gè)SNP位置至少都需要數(shù)十毫微克(ng)的基因組DNA。因?yàn)槊總€(gè)個(gè)體有數(shù)以萬計(jì)的SNP位置需要檢測，所以實(shí)際上要得到足夠的基因組DNA是不可能的。相反的，利用本發(fā)明的方法進(jìn)行多重SNP位置的定型，可以大量減少每個(gè)個(gè)體所需的基因組DNA的數(shù)量，因此它在臨床樣品收集上相當(dāng)具有價(jià)值，甚至，它的檢測的簡單設(shè)計(jì)也令人相當(dāng)向往能在SNP基因型定型繁瑣、冗長的過程中使用這個(gè)方法。
根據(jù)本發(fā)明的方法，在一個(gè)條件化的觸減多重PCR反應(yīng)的中，包括同步PCR和特異性PCR。在同步PCR中，擴(kuò)增的目的是要增加各引子粘合到模版上的機(jī)會(huì)，而特異性PCR則是用來增加想要的特定序列的數(shù)量。這兩種PCR的粘合溫度都可以采用觸減策略。特別是特異性PCR的粘合溫度高于同步PCR的粘合溫度。
在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例當(dāng)中，一個(gè)基因型定型包括采用寬松觸減策略(Loose Touchdown Strategy；LTS)的多重PCR的同步擴(kuò)增步驟，加上采用嚴(yán)謹(jǐn)觸減策略(Stringent Touchdown Strategy；STS)的特異性PCR產(chǎn)物擴(kuò)增步驟。另外，在使用預(yù)先調(diào)整好的引子對的多重PCR的擴(kuò)增步驟的前可包含最佳化步驟，以改善其后的擴(kuò)增步驟的效率。
在本發(fā)明的最佳化步驟中，例如，一個(gè)全面性的引子最佳化提供了一個(gè)用來增加后續(xù)的PCR反應(yīng)的可用率的方法。這個(gè)方法是利用觸減PCR操作流程，并且縮小最佳溫度下降梯度區(qū)段到70～60℃和75～65℃。之后引子對能夠被置于這兩個(gè)溫度梯度區(qū)段。在一實(shí)際運(yùn)作中，96個(gè)引子對被置入反應(yīng)中，而多重PCR產(chǎn)物的可用率達(dá)到92.7％。在之后的基因型定型應(yīng)用中，成功的比率能夠達(dá)到84.4％。
在PCR反應(yīng)中，較佳者，是使用熱穩(wěn)定的Taq DNA鏈聚合酶加上能夠校讀產(chǎn)物的pfu(商品名)DNA鏈聚合酶，以提高PCR產(chǎn)物的序列可信度。
同步PCR擴(kuò)增反應(yīng)是采用多重PCR和寬松觸減策略來進(jìn)行，如此整體的目標(biāo)DNA序列分子可以通過這個(gè)步驟被增加。在一同步擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)際操作中，粘合溫度梯度(例如67～57℃和72～62℃)的3℃溫度下降量已經(jīng)被證實(shí)是一個(gè)適當(dāng)?shù)臏囟认陆盗俊＿@些數(shù)量增加的目標(biāo)序列分子群在純化處理之后就可以進(jìn)行接下來的特異性擴(kuò)增。
特定引子的特異性擴(kuò)增反應(yīng)可以借著采用PCR和嚴(yán)謹(jǐn)觸減策略，擴(kuò)增特定目標(biāo)序列分子的數(shù)量。在一特異性擴(kuò)增的實(shí)際操作中，粘合溫度梯度(例如73-63℃和78-68℃)的3℃的溫度增加量已經(jīng)被證實(shí)是適當(dāng)?shù)臏囟仍黾恿俊Ｌ禺愋缘腜CR產(chǎn)物需要進(jìn)一步的純化處理，然后使用在其它的應(yīng)用中。要判斷SNP位置的比較好的具體運(yùn)用方法，是將PCR產(chǎn)物予以定序。在一含有96個(gè)引子對的實(shí)際操作中，SNP定型的成功率達(dá)到88.5％。
在第二模版引導(dǎo)的終止染料分子并入的熒光偏極化偵測(FP-TDI)的實(shí)際運(yùn)用過程中，根據(jù)本發(fā)明的方法，PCR的引子被設(shè)計(jì)成具有52～56℃的融解溫度(melting temperature)，用以擴(kuò)增100到250個(gè)堿基對的PCR產(chǎn)物，而觸減程序在同步PCR時(shí)是設(shè)定在50～60℃之間，在特異性PCR時(shí)是設(shè)定在56～66℃。
因此，它展現(xiàn)了高產(chǎn)出率、具有低成本效益，而且正確進(jìn)行例如SNP基因型定型和偵測的應(yīng)用。臨床樣本進(jìn)行多重PCR所需費(fèi)用的減少對于大規(guī)模的基因型定型也有所助益。在一個(gè)PCR反應(yīng)中以高度序列可信度進(jìn)行96個(gè)或更多樣本的多重?cái)U(kuò)增的能力，使得這項(xiàng)創(chuàng)新方法的應(yīng)用極具有價(jià)值，尤其是使用在高產(chǎn)出率的SNP研究上。
從本發(fā)明的觀點(diǎn)來看，獲得解決的問題至少包括(1)進(jìn)行多重PCR的引子對數(shù)目限制；(2)多重PCR由于假性PCR產(chǎn)物形成和較短DNA片段擴(kuò)增效果增強(qiáng)所造成的可用率低下；(3)使用多重PCR時(shí)，SNP基因型定型的成功率低下。
由于它的各種特性，這個(gè)方法在以PCR為基礎(chǔ)的基因型定型應(yīng)用上占有優(yōu)勢地位。
對于熟悉本技藝的人士而言，從以下所作的詳細(xì)敘述配合附圖，本發(fā)明將能夠更清楚地被了解，其上述及其它目的及優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯。


圖1是本發(fā)明所采用的較好的觸減策略及其步驟；
圖2是本發(fā)明所采用的三種觸減策略的粘合溫度；圖3是本發(fā)明的基因型定型流程，其中包括有最佳化步驟、同步擴(kuò)增步驟和特異性擴(kuò)增步驟；圖4-圖5是圖標(biāo)SNP基因型定型擴(kuò)增步驟結(jié)果的凝膠分析；圖6是以fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白(fas-associated death domain；FADD)基因的特定DNA區(qū)域圖標(biāo)示范性的序列分析的傳統(tǒng)PCR；圖7是以fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白(fas-associated death domain；FADD)基因的特定DNA區(qū)域圖標(biāo)示范性的序列分析的采用結(jié)合觸減策略的多重PCR的基因型定型方法；圖8-圖9是在多重-熒光偏極化檢測中的特異性PCR結(jié)果的凝膠分析；圖10是本發(fā)明的多重-熒光偏極化檢測的分別圖標(biāo)示范性的點(diǎn)狀圖表；圖11是傳統(tǒng)的單純-熒光偏極化檢測的分別圖標(biāo)示范性的點(diǎn)狀圖表。
具體實(shí)施例方式
參閱圖1-圖3所示，根據(jù)本發(fā)明，在條件化的觸減策略多重PCR中包括用來增加粘合到模版上的引子的同步擴(kuò)增步驟，接著是特異性擴(kuò)增步驟，它是用來增加所要的序列的數(shù)量，如圖1所示，同步擴(kuò)增PCR和特異性PCR都采用了觸減策略。特別是，寬松的觸減策略(LTS)被加入同步擴(kuò)增PCR之中，目的是為了大量增加粘合到模版的引子數(shù)量，這里是以低于理想粘合溫度(To)一個(gè)溫度下降量(Td)的粘合溫度來進(jìn)行。相反的，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠|減策略(STS)是用在特異性PCR，以高于理想粘合溫度一個(gè)溫度增加量(Ti)的粘合溫度，特異性地?cái)U(kuò)增指定的DNA序列。這個(gè)結(jié)合了觸減策略的同步擴(kuò)增PCR和特異性PCR的方式，達(dá)到了快速而且經(jīng)濟(jì)上能夠負(fù)擔(dān)的多重目標(biāo)DNA序列分子同步擴(kuò)增的目的。
不過，這兩個(gè)擴(kuò)增步驟的任何一個(gè)都能夠以觸減策略進(jìn)行。詳細(xì)的說，有兩個(gè)不同于圖1所顯示的運(yùn)用方法的變化方法。
如圖2所示，除了圖1所顯示的以第三型所設(shè)計(jì)運(yùn)用的方法以外，第一型是寬松觸減策略的同步擴(kuò)增PCR，而第二型是嚴(yán)謹(jǐn)觸減策略的特異性PCR。
關(guān)于多重基因型定型根據(jù)本發(fā)明的方法，在典型的基因型定型應(yīng)用中會(huì)使用多個(gè)引子對一起擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列，例如使用基因組DNA分析多重SNP位置，這可以以三個(gè)步驟完成(1)對預(yù)先調(diào)整好的引子對進(jìn)行最佳化步驟；(2)對多重PCR的引子對進(jìn)行寬松觸減策略的同步擴(kuò)增步驟；(3)以嚴(yán)謹(jǐn)觸減策略對數(shù)種PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。
圖3為示范性的工作流程。圖3說明了一個(gè)比較好的基因型定型工作流程，其中整合了本發(fā)明的條件化觸減策略多重PCR，它包含最佳步驟10、同步擴(kuò)增步驟20、以及特異性擴(kuò)增步驟30。
在標(biāo)準(zhǔn)的最佳化過程(MOPCR)中，兩個(gè)基因組DNA樣本和混和的多個(gè)引子對被置入以各種觸減熱循環(huán)條件執(zhí)行的擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，以便調(diào)整出最佳化的多重PCR條件。接著凝膠分析40、DNA定序分析50被用來評估PCR和基因型定型的成果。
在PCR條件最佳化步驟之后，大規(guī)模的多重PCR在96孔的檢測盤上進(jìn)行，每一個(gè)孔包含了一個(gè)來自特定個(gè)體的基因組DNA樣本。該結(jié)果由凝膠分析40和定序分析50進(jìn)行解析。這個(gè)方法的核心技術(shù)包括了分別采用LTS和STS的同步擴(kuò)增20和特定擴(kuò)增30步驟。
相較于傳統(tǒng)的多重PCR，這個(gè)方法使用寬松觸減策略和嚴(yán)謹(jǐn)觸減策略，因此增加多重PCR的可用率、其后的應(yīng)用的成功率、以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列可信度。
1、最佳化步驟使用在多重PCR中的引子，最好是以多個(gè)預(yù)先調(diào)整參數(shù)仔細(xì)設(shè)計(jì)，這些參數(shù)包括產(chǎn)物大小、引子寡核甘酸長度、融解溫度、GC堿基含量、以及其它參數(shù)，如表1所示。要設(shè)計(jì)數(shù)十個(gè)或數(shù)百個(gè)引子時(shí)建議使用精密的引子設(shè)計(jì)軟件。在一較佳實(shí)施例中，采用Primer3(麻省理工學(xué)院，美國麻州)。
表1

最佳化步驟是通過使用同一個(gè)基因組DNA樣本和每一個(gè)引子對進(jìn)行PCR來完成觸減PCR的循環(huán)模式，也就是所謂的觸減程序包括(1)模版置于94℃4分鐘變性分離；(2)模版置于94℃變性分離40秒，接著置于粘合溫度40秒，此時(shí)粘合溫度依照設(shè)計(jì)的溫度梯度每個(gè)循環(huán)粘合溫度下降1℃，之后置于72℃進(jìn)行引子延伸反應(yīng)，總共要進(jìn)行10個(gè)循環(huán)下降10℃；(3)模版置于94℃變性分離40秒，接著置于最終觸減點(diǎn)(touchdownpoint)溫度40秒，然后在72℃進(jìn)行引子延伸反應(yīng)3分鐘，總共要進(jìn)行25次循環(huán)；(4)引子置于72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)5分鐘。為了要調(diào)整到最佳的觸減策略多重PCR的反應(yīng)條件，有多個(gè)粘合溫度溫度梯度下降區(qū)段被拿來測試，用以判斷出多重PCR最佳的溫度區(qū)段。在較佳實(shí)施例中，這些溫度區(qū)段包括60～50℃、65～55℃、70～60℃、以及75～65℃。在例示程序中，70～60℃涵蓋了大部分各種多重PCR的最佳區(qū)段。較佳者，在最佳化過程的某個(gè)溫度梯度中被證實(shí)有最佳表現(xiàn)的引子對最好混合在一起，并且使用在之后的多重PCR中。
2、同步擴(kuò)增步驟在同步擴(kuò)增步驟20中，借著引進(jìn)多個(gè)會(huì)粘合在目標(biāo)序列兩旁的引子，對到每一個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)中，想要的DNA片段就能被同時(shí)擴(kuò)增。在這個(gè)例子中，96個(gè)引子對被混合，并且在96孔的檢測盤中被使用來進(jìn)行多重PCR，每一個(gè)孔都含有一個(gè)不同個(gè)體的基因組DNA樣本。為了要增加目標(biāo)序列能同時(shí)被他們的特異性引子對粘合上，并且一起擴(kuò)增的機(jī)率，在這里采用了一個(gè)寬松的條件，例如LTS。在一較佳實(shí)施例中，在溫度梯度(例如67～57℃以及72～62℃)中采用3℃的溫度下降量已經(jīng)被證實(shí)是適當(dāng)?shù)臏囟认陆盗俊?br> 借著使用寬松的觸減策略以及將試劑調(diào)整到適當(dāng)?shù)臈l件來進(jìn)行PCR。在較佳實(shí)施例中，使用熱穩(wěn)定的DNA鏈聚合酶(例如Taq DNA鏈聚合酶)加上pfu DNA鏈聚合酶(一個(gè)具校讀功能的DNA鏈聚合酶)，而且緩沖液中的氯化鉀(KCl)和氯化鎂(MgCl2)的濃度要調(diào)整到制造廠商所建議的濃度的1.5倍。
另外一種選擇是使用TPC(Taiwan Proteomics Company，臺(tái)灣蛋白體生物科技公司)的Taq DNA鏈聚合酶(最后濃度0.04U/微升(μl))、pfu DNA鏈聚合酶(最后濃度0.0005U/微升；美國加州Stratagene公司制造)、1.5倍濃度的制造商的10X PCR緩沖液(內(nèi)含100毫摩爾濃度的三氫氧甲胺基甲烷-氯化氫鹽(Tris-HCl)pH9.0、15毫摩爾濃度的MgCl2、500毫摩爾濃度的KCl、1％明膠蛋白(gelatin)、以及1％Triton X-100(接口活性劑商品名))、0.25毫摩爾濃度的dNTP、0.025或0.05微摩爾濃度(μM)的每一種引子、以及25-50毫微克(ng)的基因組DNA。同步擴(kuò)增所使用的熱循環(huán)模式已經(jīng)在具有延長的延伸反應(yīng)時(shí)間和寬松觸減程序的最佳化步驟20的部分描述過了。所有的PCR產(chǎn)物會(huì)被70％的酒精或是其它過濾方法來純化(clean up)。較佳者，使用多重篩選PCR96孔過濾系統(tǒng)(Multi-screen PCR96-well filtration system，美國麻州的Millipore公司所制造)。在純化之后，這些PCR產(chǎn)物已經(jīng)可以準(zhǔn)備用在下一步的特異性擴(kuò)增步驟。在每一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物都擁有大量的目標(biāo)DNA序列分子，例如想要的SNP位置的序列分子群。
3、特異性擴(kuò)增步驟在特異性擴(kuò)增步驟30中使用特異性的引子對，并且進(jìn)一步地?cái)U(kuò)增每一個(gè)PCR反應(yīng)中特定目標(biāo)序列分子的數(shù)量。這里會(huì)采用一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，也就是采用較高的粘合溫度梯度的STS，以便能夠達(dá)到引子粘合到模版的的特異性。在一較佳實(shí)施例中，在溫度梯度(例如73～63℃以及78～68℃)中采用3℃的溫度升高量已經(jīng)被證實(shí)是適當(dāng)?shù)臏囟仍隽俊?br> 這里的PCR反應(yīng)的細(xì)節(jié)，除了DNA模版是來自于擴(kuò)增步驟20的產(chǎn)物，以及采用了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠|減程序之外，就如同最佳化步驟10中所提到的一樣。此外，在每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中引子延伸反應(yīng)的時(shí)間縮短到1分30秒，而不是同步擴(kuò)增步驟20的3分鐘。
在較佳實(shí)施例中，將同步擴(kuò)增反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的1/150置入PCR反應(yīng)。如果要進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用，純化的步驟是需要的。例如，最后的PCR產(chǎn)物為了要做SNP基因型定型，以美商應(yīng)用生命系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的DNA分析儀3700做DNA定序。
提供下列的資料是為了要以更具體的方式描述上述的DNA基因型定型過程，不過本發(fā)明的技術(shù)范疇并不局限于這個(gè)例子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，從國立臺(tái)灣大學(xué)附設(shè)醫(yī)院收集了96個(gè)基因組DNA樣本。樣本的詳細(xì)使用經(jīng)過完善的說明，并且從每個(gè)樣本捐贈(zèng)者取得了同意書。所有的基因組DNA樣本都經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)程序純化，并且在使用之前都儲(chǔ)存在零下20℃。為了要達(dá)到多重PCR最好的條件，先將兩個(gè)基因組DNA樣本使用在最佳化步驟10。在同步擴(kuò)增步驟20中，96個(gè)引子對被混合在100微升的PCR試劑中，試劑中包括了的前所敘述的成分。操作PCR試劑的詳細(xì)過程也被敘述在相關(guān)的地方。在特異性擴(kuò)增步驟30中，每一個(gè)被設(shè)計(jì)來判定特定基因座的96個(gè)引子對分別被置于檢測盤的96個(gè)不同的孔中。從同步擴(kuò)增步驟20所得到的PCR產(chǎn)物的1/150，被當(dāng)作模版使用在這每一個(gè)平行的嚴(yán)謹(jǐn)觸減策略PCR反應(yīng)之中。這些PCR反應(yīng)所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物利用2％凝膠以及美商應(yīng)用生命系統(tǒng)公司的DNA分析儀3700進(jìn)行解析，用以確認(rèn)它們的基因型。在同步擴(kuò)增和特異性擴(kuò)增步驟中，所得的PCR產(chǎn)物被置入美商密理博生命科學(xué)公司(Millipore)的多重篩選PCR96孔過濾系統(tǒng)進(jìn)行純化。
圖4說明了從特異性擴(kuò)增步驟所得到的部分結(jié)果。96個(gè)PCR產(chǎn)物中的24個(gè)被圖標(biāo)在圖4，此處有兩個(gè)不同的引子濃度0.05微摩爾濃度和0.025微摩爾濃度。結(jié)果從凝膠上的觀察得知這在兩個(gè)濃度之間的引子濃度所得到的結(jié)果并無不同，甚至使用0.025微摩爾濃度時(shí)所得的結(jié)果也是一樣。
另一方面，在圖5中，以50和25毫微克的基因組DNA在同步擴(kuò)增步驟中當(dāng)作模版證實(shí)了較低量的基因組DNA，25微毫克在多重PCR中可以達(dá)到較高的可用率。換句話說，以25微毫克的基因組DNA在同步擴(kuò)增步驟中當(dāng)作模版，在相同的方法的下被發(fā)現(xiàn)相較于50微毫克的基因組DNA，可以提高特異性擴(kuò)增步驟所得的可用率。由這些資料證實(shí)了以本發(fā)明的方法進(jìn)行基因型定型只需要微量的基因組DNA，25微毫克或是更少的量。
提供圖6和圖7是為了提出一個(gè)實(shí)例，證實(shí)只使用傳統(tǒng)PCR和使用LTS與STS的多重PCR進(jìn)行SNP基因型定型所得的結(jié)果之間的一致性。定序結(jié)果的型態(tài)的一致性分別被顯示在圖6及圖7，以封閉長方形圈出的是SNP的位置。使用本發(fā)明的多基因型定型方法被發(fā)現(xiàn)不會(huì)有偏向判定出某個(gè)特定的基因型，在兩個(gè)基因定序結(jié)果的型態(tài)上也沒有不同之處。
除此之外，已經(jīng)檢驗(yàn)過了50個(gè)SNP基因座，而且使用兩種中任何一種方法都不會(huì)有偏向特定的基因型的結(jié)果出現(xiàn)。
模版引導(dǎo)的終止染料分子并入的熒光偏極化偵測法(FP-TDI)雖然FP-TDI測量是目前數(shù)種不同的自動(dòng)化基因型定型方法中的一種，但是它有許多優(yōu)點(diǎn)，例如容易使用、穩(wěn)定的表現(xiàn)和能夠負(fù)擔(dān)的費(fèi)用。它也是本發(fā)明的一種相當(dāng)好的應(yīng)用。
下面是一個(gè)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)，用以說明目前本發(fā)明的特點(diǎn)。
1、引子的設(shè)計(jì)PCR引子被設(shè)計(jì)成具有52～56℃的融解溫度，用來擴(kuò)增100個(gè)堿基對到250個(gè)堿基對長的PCR產(chǎn)物。
2、多重PCR擴(kuò)增方法與前面所敘述的方法相同，除了在同步PCR步驟的觸減程序改為60～50℃，而特異性擴(kuò)增PCR步驟的觸減程序則為66～56℃。
圖8-圖9是多重?zé)晒馄珮O化檢測(multiplex-FP)中的特異性PCR產(chǎn)物的凝膠分析，有46個(gè)引子對，而且其可用率將近89.1％。
圖10顯示的是根據(jù)本發(fā)明所做的多重?zé)晒馄珮O化檢測的點(diǎn)狀圖，而圖11是傳統(tǒng)的單一熒光偏極化檢測(simplex-FP)的點(diǎn)狀圖。TAMRA的學(xué)名為Carboxytetramethylrhodamine，即羧基四甲基若丹明，為一熒光標(biāo)記分子，此處并使用另一種若丹明熒光標(biāo)記分子R110。此圖可分成四個(gè)區(qū)域，左上和右下角區(qū)域都是同型合子(homozygote)基因型，右上角為異型合子(heterozygote)基因型，左下角為陰性控制組(negtive control)。XY軸的數(shù)值代表的是測得的熒光偏極化值的千分之一(milli-polarization(mP))。
將條件化的觸減策略整合到這里所提的多重PCR是從未有過，首次出現(xiàn)的，而且已經(jīng)被證實(shí)對于解決在基因型定型中所采用的多重PCR技術(shù)所遭遇到的，由于引子錯(cuò)誤起始造成的PCR產(chǎn)物的困難有所助益。在多重PCR中的引子有效數(shù)目，已經(jīng)不再像傳統(tǒng)的方法無法超過10對，而能夠達(dá)到至少96個(gè)引子對。
當(dāng)本發(fā)明被運(yùn)用在疾病診斷上時(shí)，至少有96個(gè)基因上的位置能夠被判斷出來，就如同例子中所描述的，而不像傳統(tǒng)方法只能判斷1個(gè)或多個(gè)基因。
此外，相較于其它方法用在大規(guī)模基因型定型上時(shí)，本發(fā)明的方法只需要少量的基因組DNA樣本。更有甚者，相較于其它基因型定型方法必需配備昂貴、復(fù)雜的設(shè)備和試劑，本發(fā)明的高產(chǎn)出率和具低成本效益的特性也不會(huì)妨礙到檢測設(shè)計(jì)上的簡單性。
關(guān)于本發(fā)明的有力的應(yīng)用本發(fā)明可以運(yùn)用在下面所舉列的不同方面，但不僅限于此1、從少量的基因組DNA進(jìn)行大規(guī)模和高產(chǎn)出率的基因型定型；2、作為多重疾病或復(fù)雜疾病的篩檢套件；3、作為遺傳或感染疾病的篩檢套件；4、作為藥物效力的預(yù)測套件。
以上對于本發(fā)明的較佳實(shí)施例所作的敘述是為闡明的目的，并非限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡從本發(fā)明的實(shí)施例學(xué)習(xí)而作修改或變化，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基因型定型方法，其特征是它包括下列步驟(1)通過采用第一觸減程序的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)在一帶有許多引子對及基因組DNA的混合液中同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子；(2)采用第二觸減程序的多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，每一該獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)通過一對指定的引子擴(kuò)增來自前一步驟制造的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)產(chǎn)物中的一特定的核甘酸序列分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是該第一觸減程序使用第一粘合溫度等于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度；該最佳化的粘合溫度是通過兩個(gè)基因組DNA樣本和混和的多個(gè)引子對被置入以各種觸減熱循環(huán)條件，執(zhí)行的擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，調(diào)整出最佳化的粘合溫度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是該第一觸減程序使用第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度等于該最佳化的粘合溫度；該最佳化的粘合溫度是通過兩個(gè)基因組DNA樣本和混和的多個(gè)引子對被置入以各種觸減熱循環(huán)條件，執(zhí)行的擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，調(diào)整出最佳化的粘合溫度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是該第一觸減程序使用第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度；該最佳化的粘合溫度是通過兩個(gè)基因組DNA樣本和混和的多個(gè)引子對被置入以各種觸減熱循環(huán)條件，執(zhí)行的擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，調(diào)整出最佳化的粘合溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是該基因組DNA的數(shù)量低于50微毫克。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是該基因組DNA的數(shù)量等于或大于50微毫克。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是該同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子的步驟采用一觸減熱循環(huán)模式，該循環(huán)模式包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環(huán)，該第一循環(huán)包括第二種模版分子變性分離的第一時(shí)間區(qū)段，跟隨著第二時(shí)間區(qū)段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應(yīng)，然后第三時(shí)間區(qū)段的第一種引子延伸反應(yīng)；(3)許多的第二循環(huán)，該第二循環(huán)包括第三種模版分子變性分離的第四時(shí)間區(qū)段，跟隨著第五時(shí)間區(qū)段在最終觸減點(diǎn)的第二種引子粘合反應(yīng)，然后第六時(shí)間區(qū)段的第二種引子延伸反應(yīng)；(4)第三種引子延伸反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是它更包括在該多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的步驟之前的純化該多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)產(chǎn)物的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是該多重獨(dú)立鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的步驟采用一觸減熱循環(huán)模式，該循環(huán)模式包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環(huán)，該第一循環(huán)包括第二種模版分子變性分離的第一時(shí)間區(qū)段，跟隨著第二時(shí)間區(qū)段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應(yīng)，然后第三時(shí)間區(qū)段的第一種引子延伸反應(yīng)；(3)許多的第二循環(huán)，該第二循環(huán)包括第三種模版分子變性分離的第四時(shí)間區(qū)段，跟隨著第五時(shí)間區(qū)段在最終觸減點(diǎn)的第二種引子粘合反應(yīng)，然后第六時(shí)間區(qū)段的第二種引子延伸反應(yīng)；(4)第三種引子延伸反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是它更包括在該同步擴(kuò)增多種核甘酸序列分子的步驟之前的一最佳化引子混合物和相關(guān)鏈聚合酶連鎖反應(yīng)條件的步驟；該最佳化步驟是通過使用同一個(gè)基因組DNA樣本和每一個(gè)引子對進(jìn)行鏈聚合酶連鎖反應(yīng)來完成觸減鏈聚合酶連鎖反應(yīng)的循環(huán)模式，包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環(huán)，該第一循環(huán)包括第二種模版分子變性分離的第一時(shí)間區(qū)段，跟隨著第二時(shí)間區(qū)段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應(yīng)，然后第三時(shí)間區(qū)段的第一種引子延伸反應(yīng)；(3)許多的第二循環(huán)，該第二循環(huán)包括第三種模版分子變性分離的第四時(shí)間區(qū)段，跟隨著第五時(shí)間區(qū)段在最終觸減點(diǎn)的第二種引子粘合反應(yīng)，然后第六時(shí)間區(qū)段的第二種引子延伸反應(yīng)；(4)第三種引子延伸反應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是它更包括一凝膠分析及定序分析的步驟，以評估鏈聚合酶連鎖反應(yīng)和基因型定型結(jié)果。
全文摘要
一種基因型定型方法，改良的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)包括一個(gè)同步鏈聚合酶連鎖反應(yīng)以及一個(gè)特異性鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，而且這兩個(gè)擴(kuò)增步驟皆可以觸減策略來進(jìn)行，其中寬松的觸減策略是以低于最佳粘合溫度的溫度來使用，而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠|減策略是以高于最佳粘合溫度的溫度來使用。通過整合一個(gè)兩階段的擴(kuò)增反應(yīng)以及采用條件化觸減策略的多重鏈聚合酶連鎖反應(yīng)，達(dá)成同時(shí)以高可信度和高可用率擴(kuò)增多個(gè)DNA序列，且具有高產(chǎn)出率以及低成本效益的方法。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1854310SQ20061006552
公開日2006年11月1日 申請日期2003年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者黃渝棋, 鄭蕓蕓 申請人:賽亞基因科技股份有限公司