專利名稱：用特定序列組合體檢測核酸的方法
技術領域：
本發(fā)明提供了用于結合、檢測和擴增樣品中特定靶核酸序列檢測結果(即使在有密切相關但不同的核酸存在下)的具有真實性和準確性的方法和組合體(composition)。所說的結合可以涉及將特定分子陪伴和裝配成靶結合裝配體，該裝配體特異性地與由探針核酸和靶核酸序列雜交形成的靶結合區(qū)結合。所說的擴增可以涉及將特定分子陪伴和/或裝配成輔助(booster)結合裝配體，該裝配體特異性地與由輔助核酸和探針核酸、靶核酸序列或其它輔助核酸雜交形成的輔助靶結合區(qū)結合。本發(fā)明也提供了一種涉及發(fā)夾核酸的方法和組合體，其提供來控制用于擴增中的特異性或非特異性伸延的輔助核酸和輔助結合裝配體的大小。所說的檢測涉及提供一種或幾種檢測標記，包括放射性、光或熒光發(fā)射酶以其它可檢測的或可產(chǎn)生信號的分子，這些標記與探針核酸、靶結合裝配體、輔助核酸、輔助核酸裝配體或者發(fā)夾核酸相關聯(lián)。本發(fā)明也提供了一種用于從生物體分離核酸片段的方法，所說核酸片段具有產(chǎn)生探針核酸和對所說片段和/或生物體唯一的TBA的TBA組份結合位點。本發(fā)明還提供了靶結合裝配體在預防和治療上的用途和用于這種用途的組合物(composition)。
2.背景和相關技術的描述在越來越多的場合，從樣品中檢測包含特定序列的核酸(此后稱為靶核酸(TNA))是十分重要的。需要能夠用最少的步驟，最簡單的組份檢測TNA，并排除其它類似的但不同的核酸(此后稱為表親核酸(CNA))的干擾。不需要擴增或其它檢測后的步驟就可以檢測特定的TNA并可以排除任何和所有表親分子是合乎需要的。
盡管具有許多用固定化的或者標記的核酸作為探針檢測TNA的方法，但是使用目前已知手段來區(qū)分與探針核酸(PNA)結合的TNA和與PNA結合的CNA。例如，CNA和PNA之間的一個或多個錯配堿基仍可以導致無法和TNA-PNA雜交區(qū)分開來的CNA-PNA雜交。因此雜交本身并不是一個可用來表明PNA已經(jīng)和唯一的TNA雜交的理想的指示。
具有許多場合，其中PNA會被用來試圖確定在含有CNA的樣品中TNA存在與否。如果沒有附加的證實，在這種情況下PNA和任何CNA雜交會限制PNA用來檢測TNA的應當具有的診斷值。而且，可以從含有許多CNA拷貝的樣品中檢測和定位低拷貝數(shù)的TNA而不需要產(chǎn)生額外的TNA拷貝是合乎需要的?？梢宰C實CNA的存在(不依賴于TNA)而不需要樣品中的TNA和CNA也是合乎需要的。
另外，能夠擴增信號即使是特定TNA-PNA低頻率雜交的信號是合乎需要的。為此目的，一種聚合標記的多個拷貝(此后稱為輔助核酸(BNA))到TNA-PNA上的方法將是合乎需要的。
本發(fā)明提供了達到以上所期望的目的的方法，正如如下所綜述的，本發(fā)明的組合體和方法在現(xiàn)有技術中還沒有被報道過或者提示過。Keller，H.，M.M.Manak(1989)的DNA探針一書提供了本領域核酸檢測狀態(tài)的全面的和廣泛的回顧。
一種用化學方法檢測堿基錯配以決定PNA雜交于CNA而不是TNA的方法已有報道。在Ford等的美國專利4,794,075中，討論了一種把含有單一堿基錯配的DNA片段和其完全配對的類似物區(qū)分開來的方法。雙鏈片段中的單鏈區(qū)域被碳化二亞胺修飾，碳化二亞胺與未配對的鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)殘基反應。線性雙鏈DNA分子則不和碳化二亞胺反應，但含有單個堿基錯配的DNA則定量地反應。在和碳化二亞胺反應后，將DNA分子在高濃度的聚丙烯酰胺凝膠上分級分離，以便區(qū)分修飾和非修飾的片段。Ford等人使用這一技術來定位并純化DNA序列(由于表型變異和遺傳疾病產(chǎn)生了差異)。盡管這一方法在跟蹤遺傳物質的變異上有用，但這一方法需要許多步驟，需要昂貴的組份，而且這一方法不能提供直接的手段來確定PNA已雜交到樣品中的除CNA之外的TNA上。
有些嘗試試圖確定至少一部份PNA和其它核酸之間的雜交是互補的。一種方法涉及檢測轉錄產(chǎn)物，如果PNA雜交到核酸上足以被從包含在探針中的啟動子轉錄，則產(chǎn)生該轉錄產(chǎn)物。在授給Dattagupta的美國專利5,215,899中公開了如何經(jīng)過發(fā)夾探針擴增特定核酸序列，所說發(fā)夾探針在雜交并連接到靶序列上后能夠被轉錄。所說探針包含單鏈的自身互補的序列，其在雜交條件下形成具有功能性啟動子區(qū)的發(fā)夾結構，該探針還包含從發(fā)夾序列3′末端延伸的單鏈探針序列。一旦與互補于探針序列的靶序列雜交并且雜交的靶序列的3′末端和發(fā)夾探針的5′末端連接，在合適的RNA聚合酶和適當?shù)暮颂呛塑杖姿?rNTPs)存在下，所說靶序列就成為可轉錄的。通過將所需TNA序列與探針雜交，將TNA與PNA連接，將RNA聚合酶和rNTPs添加到分離的雜交體中，并使轉錄進行直到積累所需量的RNA轉錄產(chǎn)物來完成擴增。所說方法一般來說和具體地說涉及使用由單鏈未配對末端形成的發(fā)夾DNA來退火靶序列。當靶序列結合后，就能產(chǎn)生RNA轉錄產(chǎn)物。因此，所說方法涉及檢測二級轉錄產(chǎn)物而不是用核酸結合裝配體直接固定化和/或定位靶序列。CNA易于結合探針，互補性的缺乏并不一定于擾CNA-PNA雜交體的形成，所述雜交體會支持不需要的轉錄產(chǎn)物的形成。
如果互補性的缺乏干擾被限制性內切酶切割的雜交體CHA-PNA對的敏感性，結合到PNA上的CNA也可被檢測。在Urdea的美國專利5,118,605和4,775,619提供了一些新的檢測核酸分析物的方法。這些方法使用具有基本上同源于分析物中興趣序列的寡核苷酸的多核苷酸。在預定的嚴格條件下，雜交的存在與否決定標記從支持物上的釋放。多種方法被用來將標記結合到支持物上。當單鏈或雙鏈裂解后，標記便可以從支持物釋放，標記的釋放可以被檢測，作為樣品中是否存在特定的多核苷酸序列的指示。但這一技術具有其缺點，因為盡管具有錯，只要這一錯配在內切酶識別位點之外，CNA-PNA對仍然可被限制性內切酶切割，此缺點將導致鑒別CNA-PNA雜交體的失敗。
另一種方法用分支的DNA探針來檢測核酸，授給Urdea的美國專利5,124,246公開了在生化分析中作為擴增子有用的直鏈或分支寡核苷酸多聚體，其包含①至少一個和興趣單鏈寡核苷酸序列(TNA)互補的第一單鏈寡核苷酸單位(PNA)，和②多重的第二單鏈寡核苷酸單位，其互補于單鏈標記的寡核苷酸。盡管描述了擴增的夾心核酸雜交和使用多聚體的免疫測定，但由于PNA-CNA間的雜交仍可以發(fā)生并導致產(chǎn)生不需要的信號，該方法具有局限性。
除了用來鑒別TNA的方法外，用來擴增這一DNA的方法也以公開。在授給Urdea的美國專利5,200,314中，具有分析物序列(TNA)的分析物多核苷酸鏈通過將所說的分析物多核苷酸在雜交條件下與捕獲探針(PNA)接觸在含有多核苷酸的樣品中進行檢測，所述捕獲探針具有特異于TNA的第一結合配偶體(partner)，和特異于固相第三結合配偶體的第二結合序列。然后經(jīng)結合配偶體之間的特異性結合將所形成的雙鏈固定化，并從結合的物種上分離非結合的寡核苷酸。分析物多核苷酸可以也可以不從固相轉移，然后經(jīng)PCR擴增。每個PCR引物都具有可以和分析物多核苷酸雜交的多核苷酸區(qū)，至少一個引物還含有可以和固相結合配偶體結合的附加結合配偶體，擴增的產(chǎn)物經(jīng)結合配偶體間的特異性結合從反應物混合物分離。并檢測擴增產(chǎn)物。盡管(通過PCR)證實特定的核酸已和PNA雜交是可能的，但此種證實費用昂貴并且涉及多個步驟。
至于牽涉到雙鏈核酸和DNA結合蛋白相互作用的報道，用含有單一蛋白結合位點的固定化DNA序列用于提純此單一蛋白的方法已有描述。授給Kawaguchi的美國專利5,122,600公開了包含DNA鏈和載體的DNA-固定化的小球以及用此小球分離蛋白的方法，所述DNA鏈具有特異性結合特定蛋白質的堿基序列，所述載體具有不大于50μm不少于0.01μm的粒子大小，并不吸附任何蛋白質，所說的載體和所說的DNA鏈由化學鍵相互連接。由于這是一種蛋白質純化方法，它既沒有公開檢測TNA的方法，也沒有披露為了檢測和定位特定TNA序列而使多于一種以上的蛋白質結合到雙鏈核酸上的方法。
在EP0 453 301中，描述了一種用來檢測樣品中多核苷酸靶的方法。在此方法中，TNA中的序列由第一和第二PNA雜交到TNA上來檢測。所述第一和第二PNA各自具有一段預先形成的雙鏈序列或含有由鏈延伸形成的雙鏈，其可以和核苷酸序列特異結合蛋白結合。沒有公開也沒有指出僅基于PNA與TNA之間形成雙鏈，將核苷酸特異性結合蛋白結合到TNA和PNA之間形成的雙鏈上的方法。
在美國專利4,556,643中，公開了一種非放射檢測樣品中的特定核苷酸序列的方法，其涉及含有DNA結合蛋白特異序列的探針的雜交。但這一公開既沒有教導也沒有提示這樣一種方法，即僅基于存在于PNA中的序列與存在于TNA中的序列之間形成雙鏈，將核苷酸特異性結合蛋白結合到TNA和PNA之間形成的雙鏈上。
發(fā)明概要本發(fā)明公開了一種經(jīng)采用探針核酸(PNA)檢測特定靶核酸(TNA)序列的方法，所述探針在和TNA雜交后，可以和靶結合裝配體(TBA)結合。每一個TBA結合至少一個PNA-TNA雜交對特異性區(qū)，靶結合區(qū)(TBR)。TBA由一個或多個分子組成，一個或多個此種分子以特異性和序列或構象依賴性方式結合到TBR上。TBA可含有一個或多個先導(piloting)序列，叫做“PILOTS”或“不對稱序列”，其裝配并限制TBA的核酸結合部份到特定的區(qū)域。PILOTS的作用是按照事先決定的方式形式裝配特定核酸識別單位或其它先導物(pilots)(特定核酸識別單位連接到其上)成TBA。TBA也可含有一個或多個能夠錨定或定位TBA的分子。本發(fā)明也公開了具有獨特特征的新TBA，所述特征出人意料地不僅使TBA作為診斷工具有用，也使其作為預防和治療化合物有用。本發(fā)明所公開的是有關利用PNA、TBR、TBA和TBA PILOTS的方法和組合體，包括用它們作為診斷及法醫(yī)試驗試劑盒的組份，和用新TBA作為預防和治療劑。
除了TNA特異性序列外，PNA還可以含有一種或幾種可以和在輔助核酸(BBR)中1/2BBR互補雜交的序列1/2BBR。通過加入BNA到存在于PNA中起始1/2BBR上的雜交，以PNA-BNA的形式，然后以BNA-BNA雜交體的形式進行PNA的延伸。這些延伸產(chǎn)物可以含有一個或多個輔助結合區(qū)(BBR)，每一個BBR都具有結合輔助結合裝配體(BBA)的能力。BBA由分子組成，其中的一個或多個分子可以以特異性和序列或構象依賴性方式和BBR結合。BBA可含有一個或多個先導序列，叫做“PILOTS”或“不對稱序列”，其裝配并限制TBA的核酸結合部份到特定的區(qū)域。PILOTS的作用是按照事先決定的方式形式裝配特定核酸識別單位或其它先導物(pilots)(特定核酸識別單位連接到其上)成BBA。BBA也可含有錨定或定位BBA的分子，或者使得可以檢測結合的BBA并從而檢測TBA-TNA-PNA復合體(它們依次結合于其上)。本發(fā)明所公開的是有關利用1/2BBR、BNA、BBR、BBA和BBA PILOTS的方法和組合體，包括用它們作為診斷及法醫(yī)試驗試劑盒的組份。
本發(fā)明公開了使用發(fā)夾核酸(HNA)作為加帽結構的方法和組合體。所述HNA含有自我雜交區(qū)和1/2BBR單鏈區(qū)，在雜交條件下，其可和PNA中的1/2BBR或者已結合到PNA上的BNA中的1/2BBR雜交，終止BNA延伸到PNA或其它BNA上。
本發(fā)明公開了用于檢測、定位和區(qū)分特定核酸序列的試驗方法和產(chǎn)生包含PNA、TBA、TBR、BNA、BBR、BBA和HNA的試驗試劑盒的方法和組合體，所述核酸序列包括在人細胞、人免疫缺損病毒(HIV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)和包括病毒和細胞在內的其它含核酸的體系中發(fā)現(xiàn)的核酸序列。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于結合、檢測和擴增檢測樣品中特定靶核酸序列(即使在有密切相關但不同的核酸存在下)的具有真實性和準確性的方法和組合體。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于制備特異地和由探針核酸序列和靶核酸序列雜交所形成的靶結合區(qū)結合的靶結合裝配體的方法和組合體。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于制備特異地和由輔助核酸序列和探針核酸、輔助核酸和發(fā)夾核酸雜交所形成的輔助結合區(qū)結合的輔助結合裝配體的方法和組合體。
本發(fā)明的另一目的是提供涉及發(fā)夾核酸的方法和組合體，所述發(fā)夾核酸可以控制用于擴增PNA-TNA雜交事件中的特異或非特異延伸的輔助核酸和輔助結合裝配體的大小。
本發(fā)明的另一目的是提供用于選擇、裝配和陪伴特定核酸分子(每一個都具有核酸結合的辨別能力)成為靶和輔助結合裝配體的方法和組合體。
本發(fā)明的另一目的是提供用于用輔助結合裝配體和輔助核酸擴增檢測結合到靶結合區(qū)上的靶結合裝配體的方法和組合體。
本發(fā)明的另一目的是提供使得可以使用一種或多種可檢測標記的方法和組合體，所述標記包括但不限于放射性標記，發(fā)光，熒光、酶促或其它信號產(chǎn)生分子。這些標記物在與探針核酸、靶結合裝配體、輔助結合裝配體、輔助核酸或發(fā)夾核酸相關的場合下使用。
本發(fā)明的另一目的是提供用于從生物體分離核酸片段的方法，所說核酸片段具有產(chǎn)生探針核酸和對所說片段或生物體唯一的TBA的TBA組份結合位點。
附圖簡要說明下列說明包含在

圖1中圖1-I是含有1/2TBR和1/2BBR的PNA，其是互補于TNA的單鏈序列；圖1-IIA是TNA，圖1-I的組份添加于其上，在雜交條件下，其結合PNA形成圖1-IIIA的組份PNA-TNA雜交體，該雜交體含有至少一個TBR；圖1-IVA是BNA，圖1-IIIA的組份添加于其上，在雜交條件下，其結合圖1-IIIA的1/2BBR形成圖PNA-BNA雜交體，該雜交體含有圖1-VA所示的BBR。
圖1-IIB是BNA，圖1-I的組份添加于其上，在雜交條件下，其結合PNA形成圖1-IIIB的組份PNA-TNA雜交體，該雜交體含有BBR；圖1-VIA是TNA，圖1-IIIB的組份添加于其上，在雜交條件下，其結合圖1-IIIB的1/2TBR形成PNA-BNA雜交體，該雜交體含有圖1-VB所示的TBR。
圖1-IIC是HNA，圖1-I的組份添加于其上，在雜交條件下，其結合PNA形成圖1-IIIC的組份PNA-HNA雜交體，該雜交體含有BBR；圖1-VIC是TNA，圖1-IIIC的組份添加于其上，在雜交條件下，其結合圖1-IIIC的1/2TBR形成PNA-BNA雜交體，該雜交體含有圖1-VC所示的BBR。
所說的形成TBR和BBR的雜交體在本發(fā)明中是有用的，如圖1所示，PNA和BNA可以包含非連接的支持物和/或指示劑(OSA)，或者連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；圖2A是BNA聚合到PNA上和由HNA加帽的策略的示意圖。
圖2B是經(jīng)聚合BNA和加帽HNA來擴增PNA-TNA信號的策略的示意圖。
圖2C-D為擴增PNA-TNA信號的附加策略，其是通過BNA聚合及HNA加帽。
圖3是顯示使用每個BNA含有多個1/2BBR的BNA的示意圖。
圖4A是顯示TBA和BBA與TBR和BBR結合，以及TBA辨別TNA和CNA的能力的示意圖。按照這一實施方案，如果TBA固定在小珠、微量滴定平板表面或任何其它這樣的表面上，則只有復合體例如復合體X被保留和檢測，而諸如復合體XI之類的復合體不被保留和檢測。
圖4B是解釋類似圖4A所示的但在發(fā)生的順序上略有不同那些事件的示意圖。
圖4C是解釋類似圖4A所示的但在發(fā)生的順序上略有不同那些事件的示意圖。
圖5是解釋含有一個1/2TBR和不含1/2BBR的PNA到含有高達五個1/2TBR和一個1/2BBR的PNA的示意圖。每一數(shù)碼(I，II，III，IV，V)的(A)和(B)成員形成一組，其在雜交到TNA上時，給((A)成員)或不給((B)成員)TBR提供可利用的1/2BBR(用于經(jīng)雜交到具有互補1/2BBR的BNA上的擴增)。
圖6A是解釋含兩個1/2TBR的特定的TNA的示意圖，當與PNA結合時，其形成兩個密切相關的TBR，這兩個TBR可以和兩個TBA結合。一個1/2BBR也被提供來供擴增使用。
圖6B是顯示與與圖6A中相同的事件的示意圖，所不同的是使用雙TBA，以便在正常細胞樣品中出現(xiàn)的單個TBR之間的區(qū)別可以與異常的雙TBR相區(qū)別。
圖6C是顯示與圖6A相同的方案的示意圖，所不同的是TNA中的5個TBR被辨明。每一TBR可以與相同或不相同的TBA結合。TBA可以用不同的標記物標記，以便確定TNA中存在五個位點。
圖6D是顯示與圖6C相似的相同事件的示意圖，所不同的是顯示了雙TBA，擴展了圖6B所示的對雙TBA的使用。圖6A，6B，6C和6D中的II項是HIV單鏈DNA或RNA。
圖6E是顯示與圖6C相似的相同事件的示意圖，所不同的是顯示了雙TBA，擴展了圖6B所示的對雙TBA的使用。圖6A，6B，6C和6D中的II項是HIV單鏈DNA或RNA。
圖7顯示作為TNA的HIV LTR和兩個PNA以及用此PNA檢測TNA的策略。
圖8是本發(fā)明的一個實施方案的圖解其中靶結合裝配體用于結合雜交體TNA-PNA。輔助結合裝配體用于結合聚合的BNA。
圖9是模(modular)TBA的圖解，其中，裝配序列，接頭序列和不對稱序列用于陪伴核酸識別位點一起形成TBA。
圖10顯示在HIV-特異性序列檢測中有用的模TBA。
圖11顯示在人乳頭瘤病毒序列檢測中有用的模TBA。各E2單位實際上是E2DNA結合部分的雙體。
圖12A是顯示由于TBA的結合，TNA分級分離和遷移率變化的圖解。
圖12B是顯示由于除TBA外的BBA的結合，TNA分級分離和遷移率增加的變化的圖解。
圖13顯示檢測缺失序列的策略。使用這一策略的例子是人類乳頭瘤的整合測定。
圖14顯示經(jīng)采用核酸識別單位、接頭、裝配和不對稱序列裝配高級TBA，以便形成對HIV LTR中結合位點特異性的各種靶結合裝配體。
圖15顯示經(jīng)采用DNA識別單位、接頭、裝配和不對稱序列裝配高級TBA，以便形成對HPV基因組中結合位點特異性的各種靶結合裝配體。
圖16顯示由使用復合TBA獲得的區(qū)別，內源競爭靶結合分子消除TBA結合到表親核酸上的(但不是從含有多于一個被TBA識別的位點的合適的取向的TNA上消除)能力。
圖17顯示TBA被特異性地靶引以結合到序列錯配位點上(并且優(yōu)先結合在不含有所有的靶錯配的表親位點上的那些位點)的能力。
序列簡要描述SEQ ID NO.1相應于圖5-IA-1，顯示第一類MHC NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.2相應于圖5(IA)，顯示B2微球蛋白NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.3相應于圖5(IA)，顯示K免疫球蛋白NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.4相應于圖5(IA)，顯示一個HIV NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.5相應于圖5(IA)，顯示一個HIV NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.6相應于圖5(IA)，顯示c-myc NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.7相應于圖5(IIA)，顯示雙HIV NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.8相應于圖5(IIA)，顯示雙HIVNF-kB結合位點。
SEQ ID NO.9-16相應于圖5(IIA)，顯示雙結合位點，其一為HIV NF-kB結合位點，另一為HIV SP1結合位點。
SEQ ID NO.17-18相應于圖5(IIA)，顯示雙HIV SP1結合位點。
SEQ ID NO.19-31相應于圖5(IIIA)，顯示雙HIV NF-kB結合位點和HIV SP1結合位點。
SEQ ID NO.32-33相應于圖5(IVA)，顯示四結合位點，其中兩個位點為HIV NF-kB結合位點，另兩個為HIV SP1結合位點。
SEQ ID NO.34相應于圖(VIA)，顯示5個結合位點，其中兩個為HIVNF-kB結合位點，另三個為HIV-SP1結合位點。
SEQ ID NO.35是1/2 BBR的例子，在此情況下OL1，OL2和OL3元件是λ噬菌體左操縱子，包括插入序列。
SEQ ID NO.36是1/2BBR的例子，在此情況下OR3，OR2，和OR1元件是λ噬菌體右操縱子，包括插入序列。
SEQ ID NO.37是HIV LTR。
SEQ ID NO.38是互補于HIV LTR之PNA的PNA。
SEQ ID NO.39是互補于HIV LTR的不同于SEQ ID NO.38的PNA的PNA。
SEQ ID NO.40是互補于HIV LTR的一部分的PNA，其也含有1/2 BBR和使BNA聚合到PNA上的懸掛序列。
SEQ I D NO.41是互補于SEQ ID NO.401/2 BBR的BNA。SEQ ID NO.42是一個BNA，它將聚合到SEQ ID NO.41 BNA上，并且其和SEQ ID NO.40和41一起產(chǎn)生一個PstI識別位點。
SEQ ID NO.43是一個BNA，其互補于SEQ ID NO.42 BNA，并且其完成一BamHI識別位點。
SEQ ID NO.44是一HNA，其具有BamHI識別位點(它會與另一由SEQ IDNO.42和43產(chǎn)生的識別位點雜交，產(chǎn)生聚合物)。
SEQ ID NO.45是另一PNA，與SEQ ID NO.40相似，互補于HIV LTR的一部分。但不是與SEQ ID NO.40相同的序列。SEQ ID NO.45也編碼一1/2 BBR序列和一突出端，其使得用Sph1識別位點開始BNA的聚合。
SEQ ID NO.46-62是人類乳頭瘤病毒(HPV)特定PNA，一旦與HPV序列雜交，即形成和HPV DNA結合蛋白結合的TBR。
SEQ ID NO.63-71是整合進TBA中的NF-kB DNA識別單位。
SEQ ID NO.72是一核定位序列。
SEQ ID NO.73是一SP1序列識別單位。
SEQ ID NO.74是一TATA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.75-84是乳頭瘤E2 DNA的識別單位。
SEQ ID NO.85-92是不對稱序列。
SEQ ID NO.93是一arabidopsis TATA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.94是一HPV-16-E2-1 DNA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.95是一HPV-16-E2-2 DNA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.96是一HPV-18-E2 DNA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.97是一HPV-33-E2 DNA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.98是一牛乳頭瘤E2 DNA結合蛋白識別單位。
SEQ ID NO.99-102是例證性的接頭序列。
SEQ ID NO.103是一例證性核定位信號序列。
SEQ ID NO.104-108是例證性陪伴序列。
SEQ ID NO.109-116是例證性裝配TBA序列。
SEQ ID NO.117是共有NF-kB結合位點。
SEQ ID NO.118是HIV Tat氨基酸序列。
縮寫 單鏈核酸 雙鏈核酸 核酸上的結合區(qū) 無支持物和指示劑，或固體支持或其它定位方式，包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上和/或指示劑上＝OSA。
BBA輔助結合裝配體BBR輔助結合區(qū)BNA輔助核酸CNA表親核酸1/2 BBR單鏈區(qū)，當其與HNA或BNA的互補序列雜交時，可以結合BBA1/2 TBRPNA之單鏈區(qū)，當其與TNA的互補序列雜交時，可以結合TBAOSA可有可無的支持物或連接PNA探針核酸TBA靶結合裝配體TBR靶結合區(qū)TNA靶核酸
HNA發(fā)夾核酸定義應當理解，在以下所公開的內容中，當提到靶結合裝配體(TBA)、輔助結合裝配體(BBA)、DNA結合蛋白、核酸結合蛋白或RNA結合蛋白這樣一些術語時，意指包含結合到DNA或RNA靶核酸序列(TNA)上的分子的組合體，而不考慮其所來源的結合分子的類別的特殊性。這樣，例如，采用來與人類免疫缺損病毒序列結合的TBA可以最類似于NF-KB轉錄因子，該因子典型地與DNA結合。但是，如本文所用的，人們應該理解可以使TBA最適地用于和特定序列組合體或構象的RNA序列結合。
本發(fā)明公開的檢測方法的真實性在很大程度上取決于TBA和BBA與特定核酸基元的選擇性結合。從本文的公開內容應該理解，TNA的TBA及BBA和相關序列的區(qū)別(表親核酸或CNA)的基礎可以是形成精確核酸探針(PNA)-靶核酸(TNA)雜交體片斷(PNA-TNA雜交體)。然而，區(qū)別的基礎也可以僅僅是特定構象的形成，同時可以不需要PNA-TNA雜交體中錯配堿基對的完全缺失。因此，應該完全理解TBA或BBA操作的基礎完全依靠TNA-PNA雜交體獨有的任何特性，這種特性不同于任何PNA-CNA雜交體顯示的特性，PNA-CNA雜交體可以在和給定的PNA接觸的試驗樣品中形成。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了通過利用摻入特定核酸結合蛋白的靶結合裝配體(TBA)特異性地鑒定樣品中靶核酸(TNA)的方法。通過利用對給定TNA序列特異性的探針核酸(PNAs)和對所說的雙螺旋靶結合區(qū)(TBR)特異性的TBA(靶結合區(qū)是在雜交體TNA-PNA序列形成的基礎上形成的)，形成穩(wěn)定的TBA-TNA-PNA復合體。此外，通過提供PNA中的特異的可擴增序列，除特異性地對由TBA識別的TBR的形成有貢獻的序列外，檢測PNA和TNA的結合并擴增這種檢測。為了這個目的，利用了大量的核酸擴增系統(tǒng)的任何一個，包括聚合酶鏈式反應或利用分枝DNA技術，其每一個分支上都含有可檢測的標記。具體地說，本文描述了新型擴增方法，在這種方法中，PNA的可擴增的部分含有這樣的序列，輔助核酸(BNA)在其上可以發(fā)生聚合。依據(jù)每一個BNA-PNA雜交體的形成，形成了輔助結合區(qū)，其和輔助結合裝配體特異性結合。如果存在可檢測標記，TNA-PNA提供必要的無條件的原始TNA-PNA結合事件的擴增。
按照本發(fā)明，應把TNA理解為含有特定核酸序列。所說的TBA應理解為可特異而緊密地和形成的TNA-PNA雜交體結合的任一分子裝配體。TBA包括一個或多個分子，其序列對結合到TBR上是足夠的。已知的DNA結合區(qū)，既可以直接用作所說的TBA的組分，也可以根據(jù)本文提供的教導進行修飾。最容易得到的分子是DNA結合蛋白的DNA結合區(qū)。已知許多DNA或RNA結合蛋白既可以直接用作已知的未修飾的蛋白，或所說的TBA也可以是根據(jù)本文提供的特殊教導修飾后核酸結合蛋白。在后一種情況下，所需要的特殊修飾應該包括優(yōu)化結合親合力、去除不必要的活性(如核酸酶活性和在其它和TBA組分有親和力的分子存在的情況下所說的TBA的識別力)、優(yōu)化靶序列超過密切相關的序列的選擇性、優(yōu)化穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明可以利用的DNA結合蛋白的例子是轉錄因子NE-kB(p50和p65)的結合蛋白，NF-IL6，NF-AT，rel，TBP，乳頭狀瘤病毒E2蛋白，sp1，噬菌體λ的cro和C1阻遏蛋白和其它已知的蛋白(其DNA結合蛋白已經(jīng)分離、克隆、測序、定性)。此外，任何其它的DNA結合蛋白或作為與TBR雜交體或BBR結合的充要條件的部分蛋白都包括在內。這包括蛋白或具有改變的DNA結合活性的野生型蛋白或蛋白的部分，以及產(chǎn)生的具有改變的DNA結合特異性的蛋白，例如，DNA結合識別螺旋從一個蛋白到另一個蛋白的互相交換。此外，具有核酸結合及其它核酸功能的蛋白，如限制性內切酶，也可以用作所說的核酸結合的功能物。在DNA-RNA雜交體及RNA-RNA雜交體中和靶區(qū)結合的蛋白都包括在內(見，例如Shi 1995，DeStefano 993，Zhu 1995，Gonzalcs 1994，Salazar 1993，Jaishree 1993，Wang 1992，Roberts 1992，Kainz 1992，Salagar 1993(6))。利用陪伴結合裝配體部分的分子可以構建結合裝配體，以便獲得特定組分的組合(combination)和幾何構象。這一分子指定為PILOT。Pilot可以由蛋白質或任何有機或無機材料組合而成，這些有機或無機材料的組合在TBA或BBA成員之間獲得組合選擇和/或誘導特定幾何構象。陪伴分子是一穩(wěn)定構架，TBA或BBA依靠它組建，這樣提供了TBA或BBA的正確構象，同時除去了天然產(chǎn)生的核酸結合蛋白的不需要的特性。此實施方案的具體例子是，以修飾的噬菌體λcro蛋白作為陪伴分子，提供了所說的多效轉錄因子NF-kB的修飾體。每一個NF-kB結合二聚體保留對NF-kB結合位點的微小親合力，同時結合裝配體顯示了有利于制造、穩(wěn)定和特異的特征。
鑒于以上所述，下文詳細地描述了本發(fā)明的各方面和實施方案。
1.探針核酸(PNA)及其制備本發(fā)明的PNA至少包括三個連接在一起的主要部分參見附圖1(I)，所說的PNA的第一部分是一個或多個堿基序列，指定為“1/2 TBR”。參見圖1(I和IIa)，PNA中的1/2TBR與樣品中興趣序列互補，TNA包含一個1/2TBR。參見附圖1(IIIa)，在雜交條件下，當TNA加入到PNA中時，形成了含有一個TBR的PNA-TNA雜交體。參見附圖1(I)，所述PNA的第二部分是一堿基序列，指導為“1/2 BBR”。參見圖1(I，IIb，IIc和IVa)，PNA的1/2BBR與BNA或HNA中的1/2BBR互補。參見附圖1(IIIb，IIIc和Va)，在雜交條件下向PNA中加入BNA或HNA，分別形成含有BBR的PNA-BNA雜交體或PNA-HNA雜交體。參見附圖1(I)，所述PNA的第三部分是OSA，由方框中一個園圈代表。OSA不是支持物和/或指示劑、或者是固體支持物或其它的定位方式和/或指示劑，所述定位方式包括但不限于連接到小珠，聚合物和表面(這些物質共價或非共價地結合到PNA上，但特異性地與PNA相關)上。OSA可以是幫助分離和/或定位的原子或分子，如可通過各種物理手段檢測的固體支持物結合基或標記，這些物理方法包括但不限于釋放的粒子或光子的吸收或成象。將指示劑連在寡聚核苷酸上或用固體支持物固定寡聚核苷酸的方法是本領域公知的(見Keller和Manak，Supra，本文一并參考)。
本發(fā)明所說的PNA可用任何合適的方法制備。通常這種方法包括寡聚核酸的合成和可復制載體的克隆。核酸合成方法在本領域是廣為人知的。在合成或克隆時，有必要進行鏈純化和分離以便該產(chǎn)品用作純化的PNA。制備RNA探針的方法是公知的(參見Blais(1993)，Blais(1994)的例子，該方法使用體外轉錄，采用結合了T7 RNA聚合酶啟動子PCR反應)。
本領域技術人員應理解所說的PNA的長度和特定序列依賴于TNA中被檢測的長度和序列，以及獲得緊密特異結合所使用的特定TBA的結構(參見以下有關TBA的討論)。一般來說，PNA的序列長度在10到300個核苷酸之間是足夠的，對本文所列舉的實施方案，需要具有15-100個核苷酸的長度。
應該理解可以組建這種PNA，目的是使之含有多于一個的1/2 TBR和產(chǎn)生一個或多個TBA、相同或不同的TBR，以及在PNA和TNA雜交體基礎上被新型雙螺旋或多螺旋TBA(參見以下有關這些新TBA的描述)識別的復合體TBR。圖5具體說明了含有一個或多個1/2 TBR的具體PNA。相應于圖5(Ia，IIa，IIIa，IVc和IIa)顯示的1/2 TBR的具體序列見SEQ ID NOS.1-34(見前面描述的序列)。
如圖2a和圖2b所示，包括1/2 TBR的PNA可以和一個或多個BNA雜交(見以下描述)，同時這種聚合BNA可以是任何需要的可能的長度，此鏈用于TNA-PNA雜交事件的擴增。優(yōu)選的是，在這種PNA中存在約0到約10個1/2BBR。
如圖6a和6b所示，所說的PNA可以包含幾個相同或不同的1/2 TBR，其可以與TNA中的幾個1/2 TBR雜交。每次一個PNA中的1/2 TBR與TNA中1/2 TBR配對，即形成一個靶結合區(qū)(TBR)，其可以結合一個TBA。并且，沒有必要所有的TBR都在單鏈的連續(xù)的PNA上。這樣，在本發(fā)明的一個實施方案中，采用兩種不同的PNA來檢測特定的TNA序列。作為本發(fā)明這方面的一個說明，圖7是人體免疫缺陷病毒(HIV)的長末端重復序列(LTR)的代表。本領域已經(jīng)知道，HIV LTR包括兩個非常接近NF-KB結合位點和三個SP1結合位點，其中的NF-KA和SP1已知是DNA結合蛋白。圖7包括兩個PNA，PNA1(SEQ ID NO.38)和PNA2(SEQ ID NO.39)，每個都與所示的TNA(SEQ ID NO.37)的反鏈互補，其包含兩個HIV LTR的NF-kB結合位點和三個SP1結合位點。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，PNA1與圖7所表示的TNA下劃線的用“+”標記的堿基特異雜交，PNA2與圖7所表示的TNA下劃線的用“＝”標記的堿基特異雜交。PNA1或PNA2都包含可以與BNA的1/2 BBR序列(見下文)雜交的序列(序列上用“#”或“*”標記)。此外，PNA1或PNA2都可以用OSA進行不同的標記，比如用熒光素或羅丹明等熒光團，其可以讓兩種探針都與TNA確切地結合。如果只發(fā)現(xiàn)一個標記或兩個標記都沒發(fā)現(xiàn)，則推斷這個TNA在檢測的樣品中不存在。
圖7所示實施方案的另一個方面，顯示了一種改變本測定特異性的方法。通過改變PNA1和PNA2之間缺口的長度，這樣就改變了仍未雜交的TNA區(qū)，實施本發(fā)明，可以改變這種測定的分辨性。
為了更清楚地舉例說明本發(fā)明的這個方面，有必要強調所說的TBR可以具有螺旋結構。這樣，當PNA1在螺旋的一面產(chǎn)生出TBR，PNA2在螺旋的同一側或不同側產(chǎn)生出又一TBR，視兩個TBR(圖7下劃線部分)中間部位的距離而定。如果每個結合位點中間都是相距10.5堿基的完整產(chǎn)物，TBR就會在螺旋的同一側；如果是相距10.5堿基非完整產(chǎn)物，那么TBR就會在螺旋的兩側。在這種方式中，任何由TBA識別PNA1 TBR以及TBA識別PNA2 TBR在結合上的協(xié)調性都是可以控制的(見Hochschild，A.，M.Ptashne細胞44681-687，顯示出噬菌體λ阻遏物和在一個DNA螺旋上彼此定位在不同距離的兩個不同操縱子位點的結合效應)。如Perkinks等(EMBO J.123551-3558)所述，NF-kB和SP1位點的協(xié)調對HIVLTR的激活是必要的。但是，從本發(fā)明的目的來說，可以通過提供能和兩種位點自發(fā)結合的單一、新型結合蛋白，來利用HIV LTR上的兩個NF-kB和三個SP1結合位點標志，但必須在兩個位點的間距幾何學上可行的條件下。這一點受所選擇的TBA和使用的PNA的結構限制。這樣，在圖7所舉的實施例中，可以使用兩個探針，這兩個探針之間有一個足夠大的單鏈DNA區(qū)，即使NF-kB和SP1結合位點在螺旋的兩個不同側面，兩個探針間的這個單鏈區(qū)提供一個足夠靈活的“絞鏈區(qū)(hinge)”，使DNA可以同時彎曲和扭曲以容納幾何構型的TBA。另外，可以通過縮短探針間距離來設計一個更嚴格的檢測方法，這樣DNA只能彎曲，不能扭曲。最后，探針間距可以很近，或使用單一PNA，所以DNA僅能彎曲，無法扭曲。這樣，對任何給定的需要的靶核酸間的分辨程度，此圖舉例說明了并并使得可以產(chǎn)生檢測系統(tǒng)，所述靶核酸具有相似的序列，但這些序列具有不同的并列位置。
作為一種診斷和法醫(yī)學鑒定HIV的試劑盒，本領域的技術人員應該懂得前面所述的關于本發(fā)明的各方面允許選擇診斷和法醫(yī)學鑒定試劑盒的組份以使其在任何時候與當時所知的流行愛滋病病毒菌株或其它病原菌或疾病狀況相匹配。本領域的技術人員還應該意識到，檢測愛滋病的感染不是本發(fā)明的獨有用途；由于愛滋病病毒基因的突變性，對于這樣的診斷，基因的突變是最復雜的實驗環(huán)境因素之一。恰恰是在這種易變的條件中，本發(fā)明方法的靈活性連同其能區(qū)別非常緊密相關的序列的能力是最值得注意的。在突變較少的環(huán)境中，不必實施本發(fā)明的那些復雜方法，這些方法是經(jīng)得起檢驗的。這樣，用于診斷乳頭狀瘤病毒感染的試劑盒中，所有TBA-TBR相互作用的區(qū)別特性都可以得到，其也具有利用BNAs和BBA來擴增信號的能力，但是也可以利用一個單一簡單的PNA，如SEQ ID NO.46-62中任何一個，其鑒別獨有的乳頭狀瘤病毒序列，這種序列和TBA的結合也是公知的，例如乳頭狀瘤病毒E2蛋白或其變形DNA結合蛋白(參見Hegde等自然359505-512；Monini等病毒學雜志652124-2130)。
在使用本方法檢測一個特定TNA以估價是否存在特定核酸，這種核酸與黑素瘤、肝細菌瘤、乳腺癌、子宮頸癌、肺癌、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌或卵巢癌相關，TNA可以從懷疑含有癌細胞的器官和液體的活體組織材料中獲得。為了檢測基因的缺失，TNA可以從含有感染細胞的病人樣品中獲得。為了檢測發(fā)酵中的污染物和在生產(chǎn)食品，化學試劑或生物工程產(chǎn)品或廢物生物處理過程中的產(chǎn)品，TNA樣品可以從發(fā)酵或處理過程中不同階段獲得。為了檢測食品和藥品的病原體或污染物，TNA樣品可以從如下方面獲得食品或藥品；清理食物所用的工具或與食物相接觸的表面；與食物接觸的液體；加工材料；與食品、藥物或生物樣品的生產(chǎn)相關或與其接觸的液體或其它物質，這些物質從與食品、藥物或其它產(chǎn)品相接觸的物質中獲得。
2.輔助核酸(BNA)，輔助結合區(qū)(BBR)和它們的制備本發(fā)明的BNA包括至少一個或多個與OSA結合的1/2 BBR。所說的1/2 BBR可以與包含在PNA、其它BNA或HNA中的1/2 BBR雜交。
參考附圖1(I、IIb和IIIb)，最簡單的BNA包括二部分。參見附圖1(IIb)，最簡單BNA的第一部分是一段與所說的PNA中命名為“1/2 BBR”的序列互補的堿基序列。參考附圖1(IIb)，最簡單BNA的第二部分是OSA。OSA不是支持物和/或指示劑、或者是固體支持物或其它的定位方式和/或指示劑，所述定位方式包括但不限于連接到小珠，聚合物和表面(這些物質共價或非共價地結合到PNA上，但特異性地與PNA相關)上。
參考附圖2a(II和III)，所說的BNA可以含有一個以上的1/2 BBR序列。
圖3(II)所示的BNA包括一段與圖3(I)所示的PNA及兩段其它1/2 BBR序列互補的序列。圖3(III)所示的BNA含有兩個1/2BBR序列，它們與圖3(II)所示的BNA上兩個1/2BBR序列互補，加至“n”個額外1/2 BBR用于和額外的BNA聚合。
在雜交的條件下，圖3(II)所示的BNA，當與圖3(I)所示的PNA組合在一起時，產(chǎn)生了一個如圖3(IVa)所示PNA-BNA雜交體，這一雜交體含有一個BBR和具有二額外1/2 BBR或“輔助”序列的非雜交突出端(extension)。通過所說的雜交產(chǎn)生的BBR在序列上可以相同，相似或不同。通過所說的雜交而產(chǎn)生的BBR可以結合相同的、相似或不同的BBA(見下面)。BNA的制備和PNA的制備相似。
在雜交條件下，圖3(IVb)所示的BNA-BNA雜交體，當與圖3(Vb)所示的PNA結合后，產(chǎn)生如圖3(VI)所示的PNA-BNA雜交體，其包含一個BBR，兩個額外的含有BBR的BNA-BNA雜交體，和一個帶有額外1/2 BBR序列的非雜交突出端，一個“輔助”序列。通過所說的雜交產(chǎn)生的BBR可以在序列上相同，相似或不同。通過所說的雜交產(chǎn)生的BBR可以結合相等，相似或不同的BBA(見下面)。BNA可以以類似于制備PNA的方式制備。
3.靶核酸(TNA)和它們的制備按照本方法，檢測和擴增通過檢測特定TNA而產(chǎn)生的信號的第一步是在一個合適的混和液中將PNA與這一靶物質雜交。這種雜交是在本領域公知的合適的條件下完成的。
可能或已知含有預計的TNA的樣品可以由各種來源獲得。它可以是生物樣品、食物或農(nóng)業(yè)樣品、環(huán)境樣品等等。使用本方法檢測用于醫(yī)療診斷或法醫(yī)學檢測的特定TNA時，TNA可以從活體組織樣品，體液或尿液、血液、牛奶、腦脊髓液、唾液、頜下腺液、糞便、肺抽提液、喉或生殖器官樣品等的提取液。另外，檢測可以在體內進行(見例Embtetson 1993，Patterson1993，Adams 1994)。
因此，對脊椎動物(包括哺乳動物和人)或者對下列任何一種或所有興趣微生物特異性的PNA可以按照本發(fā)明的方法設想和使用棒桿菌屬白喉棒桿菌芽孢桿菌屬蘇云金芽孢桿菌肺炎球菌屬肺炎雙球菌鏈球菌屬釀膿鏈球菌唾液鏈球菌葡萄球菌屬金黃色葡萄球菌白色葡萄球菌假單胞菌屬Pseudomona sstutzen奈瑟氏球菌屬腦膜炎奈瑟氏球菌淋病奈瑟氏球菌腸桿菌屬大腸桿菌產(chǎn)氣氣桿菌肺炎克雷伯氏菌大腸肝菌狀的細胞傷寒沙門氏菌豬霍亂沙門氏菌沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌痢疾志賀氏菌施氏志賀氏菌阿糖遲酵志賀氏菌弗氏志賀氏菌志賀氏菌鮑氏志賀氏菌索氏志賀氏菌其他腸桿菌普通變形菌奇異變形菌變形桿菌類摩氏變形菌銅綠假單胞菌糞產(chǎn)堿菌霍亂弧菌嗜血桿菌-博德特氏菌屬組流感嗜血菌，杜克雷氏嗜血桿菌Hemophilus hemophilus埃及嗜血菌副流感嗜血菌百日咳博德特氏菌巴斯德氏菌屬鼠疫巴斯德氏菌土拉巴斯德氏菌布魯氏菌屬馬爾他布魯氏菌流產(chǎn)布魯氏菌豬布魯氏菌需氧芽孢形成細菌炭疽芽孢桿菌枯草芽孢桿菌巨大芽孢桿菌蠟狀芽孢桿菌厭氧芽孢形成細菌肉毒梭菌破傷風梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌諾氏梭菌敗毒梭菌溶組織梭菌第三梭菌雙酶菌生孢梭菌分枝桿菌屬結核分枝桿菌牛分枝桿菌鳥分枝桿菌麻瘋分枝桿菌副結核分枝桿菌放線菌屬(類真菌細菌)衣氏放線菌牛型放線菌內氏放線菌星狀諾卡爾菌巴西諾卡氏菌螺旋體蒼白密螺旋體極細密螺旋體斑點病密螺旋體減少螺菌念珠狀鏈桿菌回歸熱疏螺旋體出血黃疸鉤端螺旋體犬鉤端螺旋體錐蟲支原體肺漿支原體其他病原體單核細胞增生利斯特氏菌豬丹毒丹毒絲菌念珠狀鏈桿菌肉芽多諾萬氏菌桿狀巴爾通氏體立克次氏體族(類細菌寄生蟲)普氏立克次氏體莫賽氏立克次氏體立氏立克次氏體康納次氏立克次氏體澳大利亞立克次氏體西伯利亞立克次氏體螨立克次氏體Ricketrsia tsursugamushi伯耐梯氏立克次氏體五日熱立克次氏體衣原體屬(不能歸類的寄生細菌/病毒)衣原體屬病原體(命名不確定)真菌新型隱球酵母皮炎芽生菌莢膜組織胞漿菌粗球孢子菌巴西芽生菌白假絲酵母煙曲霉叢生毛霉(傘枝犁頭霉)米根霉少根根霉藻狀菌綱變黑色根霉申克氏孢子絲菌FlonSecaea pedrosoiFonsecaea compactFonsecacae dermatidis腐肉枝孢疣狀瓶霉構巢曲霉足腫馬杜拉放線菌灰色馬杜拉放線菌波伊德氏霉樣真菌甄氏瓶霉石膏狀小孢子菌須發(fā)蘚菌Keratinomyces ajelloi狗小孢霉深紅色發(fā)癬菌頭癬小孢霉病毒腺病毒皰疹病毒單純皰疹水痘(小雞痘)帶狀皰疹(Shingles)病毒B細胞肥大病毒痘病毒天花(天花)牛痘牛囊尾蚴痘病毒副牛痘觸染性軟疣細小核糖核酸病毒脊髓灰質炎病毒柯薩奇病毒Echoviruses
鼻病毒粘液病毒流感(A，B和C)副流感1流行性腮腺炎病毒紐卡斯爾疾病病毒麻疹病毒牛疫病毒犬瘟熱病毒呼吸合胞體病毒風疹病毒節(jié)肢介體病毒東方馬腦炎病毒西方馬腦炎病毒Sindbis病毒Chikugunyavirus賽姆利基森林病毒Mayora病毒圣路易斯腦炎病毒加利福尼亞腦炎病毒科洛拉多蜱熱病毒黃熱病病毒Dengue病毒呼吸道腸道病毒呼吸道腸道病毒13型逆轉錄病毒人類免疫缺損病毒(HIV)人類T-細胞淋巴營養(yǎng)病毒III(HTLV)肝炎肝炎A病毒肝炎B病毒肝炎非A-非B病毒肝炎C，D，E腫瘤病毒勞舍爾氏白血病病毒Gross病毒馬隆尼氏白血病病毒人類乳頭瘤病毒本領域的技術人員會理解，一般需要以這樣一種方式來處理可能含有特定TNA樣品，即產(chǎn)生和所說的PNA容易雜交的片斷。有必要對實驗樣品進行處理，以便完成用于雜交的TNA的釋放或提取用于雜交的TNA，如通過把血液樣品或其它細胞露置于低滲透壓條件中，或者采取別的更為劇烈的方法破碎樣品。當認為TNA是以雙鏈形式存在時，自然需要通過本領域公知的方法分開雙鏈，使TNA能以單鏈形式進行雜交，這些方法包括但不僅限于加熱或有限度地露置在堿環(huán)境中，可以通過另外加入單鏈PNA而中和堿并使得可以發(fā)生雜交。制備RNA靶的方法是公知的(參見Waterhouse 1993和Mitche 111992)。
含有TNA的核酸片段通常需要降低樣品的粘度并增加TNA和PNA的可接觸性。通過本領域任意的和特定的方法得到這種片斷。這樣，例如，已知以特定的頻率在分析的特異基因組中切割的核酸酶，可以用來產(chǎn)生一種已知平均分子量的片段。此外，其它的核酸酶，磷酸二酯酶，核酸外切酶和內切酶，物理切碎或超聲波處理均是用于此目的的可行方法。這些方法是本領域公知的。為了獲得DNA片段，一般優(yōu)選使用限制性內切酶。然而也可以通過各種化學方法獲得DNA片斷，例如使用下列類型的試劑EBTA-FE(II)(見Stroebel等(1988)，美國化學會雜志，1107921，或Dervan(1986)科學，232464)；CU(II)-菲咯啉(見Chen和Sigman(1987)，科學，2371197)；IIS級限制性內切酶(見Kim等(1988)，科學，240504)；雜交DNA酶(見Corey等.(1989)，生物化學，288277)；爭光霉素(見Umezawa等，(1986)，抗生素雜志，(Tokyo)Ser.A.19200)；neocarzinotatin(見Goldberg等.(1981)，癌癥研究第二屆Bristol-Myecs會議，學術出版社，紐約，p.163)，以及methidiumpropyl-EDTA-FE(II)(見Hertzberg等.(1982).美國化學會雜志，104313)。一般需要用蛋白酶處理除去蛋白質，有效地除去核酸樣品之中的蛋白又不損傷核酸的方法也是本領域公知的。
本發(fā)明的TNA應該有足夠長度，以便在TBR兩側有足夠數(shù)量的雙鏈雜交體，這樣，TBA能夠免受不連接的片段末端的干擾而進行結合。一般地，大約10到大約100,000個核苷酸范圍內的片斷，優(yōu)選的是大約20到大約1000個核苷酸范圍內的片斷，作為TNA片段的平均大小。能被檢測的特定TNA序列的例子是和本文描述的PNA序列互補的序列，這種PNA序列用于檢測正常細胞的、不正常細胞的(如有激活的致癌基因、整合的外源基因、遺學上具有缺陷的基因)、以及病原特異性的核酸序列，由于這種序列的特異性核酸結合蛋白是已知的，或可根據(jù)本文描述的方法產(chǎn)生。參見圖7，一種和HIV相關的特異TNA示于SEQ ID NO.37中。
4.用于BNA的PNA的突出端及其制備和信號擴增在雜交條件下，可以加入BNA，其與PNA、PNA-BNA雜交體、BNA和/或BNA-BNA雜交體雜交?？梢砸苑敲浇榫酆衔锓绞交蛞悦浇榈姆绞接靡阎樞虻腂NA完成前面所述的加入。
參見圖2a，給出了一個簡單的輔助。通過加入如2a(Ib和Ic)所示的兩種BNA產(chǎn)生了輔助聚合物，BNA在雜交條件下與PNA結合，形成PNA-BNA-BNA雜交體，這種雜交體含有PNA和“輔助”突出端(如圖2a(IIa，IIb，IIc和IId)所示)，留下至少一個未配對的1/2 BBR序列。每個未配對的1/2BBR序列(如圖2a(IIa，IIb，IIc和IId)所示)，可與添加的BNA雜交形成“輔助”突出端。每個未配對的1/2 BBR序列(如圖2a(IIa，IIb，IIc和IId)所示)，又可以與添加的HNA(如圖2a(IIIa和IIIb))雜交。不能與添加的BNA雜交的HNA，其雜交作用覆蓋了BNA加入到PNA上，如圖2a(IVa，IVb，IVc和IVd)所示。
參照2b所示，有可能控制和指定PNA突出端的順序和組份。如果需要單一的BBR，可把包含一個與PNA中的1/2 BBR互補的序列的HNA加入到PNA中，這樣就可產(chǎn)生一個單獨的BBR并“覆蓋”任何PNA“輔助”突出端。如果把添加的BBR加入到PNA中，就可以形成PNA的受控制的突出端。
參照2b所示，給出了一個簡單的輔助。媒介(vectorial)聚合物的突出端可采用加入對PNA(如圖2B(IA和IB)所示)特異性BNA完成，這種BNA可在雜交的條件下與PNA雜交，形成PNA-BNA-BNA雜交體，由PNA和“輔助”突出端組成。如果用OSA標記，這種突出端可提供用于極大地擴增任一信號的方法，這種信號是基于樣品中PNA和TNA結合而產(chǎn)生的。并且，通過聚合物中的標記的BBA與BBR結合，還可完成附加擴增。
可以用許多方法制備BNA，包括，如通過化學合成方法或重組DNA產(chǎn)生方法。后一種方法可以簡單廉價地產(chǎn)生無限量的BNA，如通過原核生物(如大腸桿菌)中的質粒DNA產(chǎn)生，這種質粒DNA含有多重復的特定BNA序列，其兩側是具有懸突末端的限制性酶切位點。通過這種方式，例如，可以以實質上無限量的拷貝產(chǎn)生噬菌體λ左側或右側的操縱位點、其它DNA、其它已知和特定BBA特異且緊密結合的核酸序列，如DNA或RNA結合蛋白序列，每一個拷貝的兩側是EcoRI，PstI，BamHI或其它許多常見的限制性內切酶位點的任何一個。此外，重復位點的聚合物可由不存在于聚合物內部的獨有內切酶位點切除?？梢酝ㄟ^本領域公知的方法產(chǎn)生大量的pBR322、pUC質粒，或其它帶有這些序列多拷貝的質粒，在聚合位點兩側用限制性內切酶切開質粒，通過層析方法或本領域其它任何方便易行的方法分離自由的多拷貝操縱子。BNA在使用之前，分離成單鏈，然后聚合在一個編碼操縱子的單鏈互補拷貝的PNA上(即1/2 BBR)。通過利用質粒上的每個重復聚合物兩側的不同的限制性內切酶，把BNA媒介聚合在PNA上，以產(chǎn)生多拷貝的BNA。此外，可以通過BNA聚合物一端或兩端的懸突端雜交BNA聚合物和所說的PNA，這樣就不需要分離雙鏈和對BNA片段進行退火處理。以上提到的特異BNA序列的例子見序列描述部分，為SEQ ID NO.35-36。為了穩(wěn)定BNA聚合物，可用DNA連接酶共價連接雜交的BNA。
5.發(fā)夾核酸(HNA)及其制備本發(fā)明的HNA至少包括兩個主要的組成部分一個單鏈的序列，其與1/2BBR互補；和一個雙鏈的核酸區(qū)，其在雜交條件下通過HNA內部的自我互補序列的自我連接而形成。參見附圖1(IIc)，可以構建HNA中的1/2 BBR以使其與PNA中的1/2 BBR序列互補。參見附圖1(I，IIc和IIIc)，在雜交條件下，把前述的HNA加入到PNA中，其則形成含有BBR的PNA-HNA雜交體。參見附圖1(IIIc，IVc和Vc)，在雜交條件下，PNA-HNA雜交體在加入TNA之后，可形成含有一個TBR和BBR的TNA-PNA-HNA雜交體。
如圖2a和2b所示，可以用HNA“覆蓋”或終止加入的相對于PNA的BNA的突出端。圖2a(Ib和Ic)中所示的兩個BNA分子可締合形成圖3(IVb)所示的雜交體，或者直接單獨與PNA雜交(如圖2a(Ia-c，IIa-d)所示)。兩個HNA分子(圖2a(IIIa和IIIb所示)可以終止BNA與其它BNA的雜交，這些BNA從PNA延伸(圖2a(IVa-d))。圖2a(IIa)所示的HNA可終止圖2a(IIb和IId)所示的PNA-BNA雜交體的形式和任何一種帶有一條單鏈1/2 BBR的PNA-BNA雜交體，這種單鏈1/2 BBR與圖2a(IIIa)所示的HNA中1/2 BBR序列互補。同樣地，圖2a(IIb)所示的HNA可終止圖2a(IIa和IIc)所示的PNA-BNA雜交體和任何一種帶有單鏈1/2 BBR的PNA-BNA雜交體，這種1/2BBR與圖2a(IIIb)所示的HNA中1/2 BBR序列互補。
構建HNA，其能終止由連續(xù)加入BNA到PNA中而構建的PNA-BNA雜交體的形成(見圖2b)。圖2b(Ia、IIIa、Va和VIIa)中所示的單鏈1/2 BBR序列(見)與圖2b(Ib、IIIb、Vb和IIIb)中所示的單鏈1/2 BBR序列特異性互補，并可以產(chǎn)生獨有的加帽的PNA-BNA-HNA雜交體(圖2b(Ic、IIIc、Vc和VIIc)。
HNA中的自互補序列和連接自互補發(fā)夾序列的環(huán)狀序列，只要其實質上不由HNA干擾或抑制單鏈1/2 BBR(包含部分HNA)的存在或選擇性地結合BBA或TBA，就可以有任何的組成和任意長度。應該選擇環(huán)狀序列以使環(huán)的形成不阻礙發(fā)夾的形成。在此項應用中，提供的有用的HNA例子是SEQ IDNO.44(見前面的序列描述部分)。
6.靶結合裝配體(TBA)及其制備TBA可以是與由特定TNA和PNA雜交形成的TBR結合的任何一種物質。條件是TBA必須具有至少下列特點(a)TBA必須以以對興趣TBR(s)高度特異性的方式與TBR(s)結合。也就是說，TBA必須區(qū)分存在于TNA-PNA雜交體中的TBR和由PNA-CNA雜交體形成的類似的雙鏈序列。TBA必須與PNA-CNA雜交體有足夠低的親和力，這樣通過洗脫TBA-TNA-PNA復合體，除去PNA-CNA雜交體而不除去PNA-TNA雜交體。
(B)TBA必須與由TNA與PNA雜交形成的TBR極易結合。一般認為結合親和力在10-5到10-12或更高的范圍內是足夠的。在以下的描述中，在某些情況下，需要利用對特定TBR具有非常低的親和力的特異TBA，但是當提供多聚TBR的特并構型時，TBA的親和力則極大地增加，這樣對于每個TBR的TBA親和力的平方則是有關這個特異TBA的親和力。
在TBA形成中有用的DNA結合組份的例子包括但不限于NF-KB、乳頭狀瘤病毒E2蛋白、轉錄因子SP1、無活性的限制性內切酶、抗體等。本領域認為每種這樣的蛋白都含有和特異核酸序列結合的序列，它們之間的親和力是已知的。自然，本發(fā)明的方法不限于這些已知DNA結合蛋白及其片斷的使用。從本公開內容可知，對于本領域一般技術人員很明顯，可以容易地把本發(fā)明的方法施用到新型TBA的使用中，這種TBA至少需要具有上面所說的特性。比如，在WO92/20698中，描述了包含寡聚核苷酸偶聯(lián)物的序列特異性DNA結合分子，這種寡聚核苷酸偶聯(lián)物是由DNA結合藥物和三螺旋體形成的寡聚核苷酸共價連接而形成的。可以用本公開內容的方法產(chǎn)生新型TBA，以便按照本文的方法使用，條件是這樣形成的TBA可以達到以上標準。此外，美國專利5,096,815，5,198,346和WO88/06601中的方法(本文一并參考)也可以用來產(chǎn)生新型TBA，以便按照本文的方法使用(見Blais(1994)的例子)。
不管TBA是一種蛋白質，或是蛋白質復合體，都可用本領域中很多方法路線的任何一種來產(chǎn)生TBA。TBA實際上可以從其自然產(chǎn)生的環(huán)境中分離，或者如這種方法不可行，則可用標準的分子生物學技術產(chǎn)生。這樣，以NF-kB為例子，利用p50或p65亞單位的DNA結合部位，可以按照本領域已知的重組方法產(chǎn)生這個結合裝配體(見Ghosh(1990)，細胞，621019-1029，描述了NF-kB的p50 DNA結合亞單位的克隆及這種蛋白對rel和dorsal的同源性)。
按照本發(fā)明，已知許多DNA和其它核酸的結合蛋白都可用作或用于TBA。一旦任何DNA、RNADNA、RNA或其它核酸結合蛋白的氨基酸序列已知，就可通過合成的方法制備編碼這段蛋白的合適的DNA序列，或可以利用來源于合適組織的編碼這種蛋白的mRNA的cDNA拷貝。并且可以獲得編碼這種蛋白的基因組拷貝，同時用本領域已知的方法切除內含子。另外，也可化學合成TBA。
一旦得到了編碼序列，就可利用點直接突變改變氨基酸序列而產(chǎn)生突變的核酸結合蛋白，這種蛋白比原核酸結合蛋白質具有更需要的結合特性。例如，可以改變NF-kB的DNA結合部分的氨基酸順序，使之成為NF-kB′分子，該分子能更緊密地結合在NF-kB的結合位點上(見下面HIV-檢測和HIV-鎖定(Lick)的例子)。
為了進一步了解本發(fā)明的這個方面，考慮到了以下幾點。以NF-kB為例子，TBA可以利用自然產(chǎn)生的NF-kB分子制備。但是，由于該分子在細胞中的存在量極微，并且已克隆了這種DNA結合蛋白的亞單位，所以通過重組DNA的方法制備大量的復合體是可行的，并且在這種蛋白上已經(jīng)完成了復合體的制備(見Ghosh(1990)，細胞，621019-1029)。NF-kB是一種和免疫、炎癥和生長調節(jié)反應相關的基因多效性誘導物，這種反應是對原初病原(病毒、細菌或逆境)競爭或次生病原(炎癥狀細胞素)競爭的反應。NF-kB是一種二聚體DNA結合蛋白，包括p50和p65兩個亞單位，兩者都可以與特定DNA序列接觸并結合。在非活躍時，NF-kB存在于細胞質中，與一個特定抑制物(I-KB)形成一個細胞質的異源三聚體。在活化時，抑制物解離，p50-p65二聚體通過一個特定細胞核定位信號(NLS)重新定位于細胞核中，在此與DNA結合，作為大量基因的轉錄激活體(見Grimm和baeuerle(1993)生物化學雜志，290297-308，本文是有關NF-kB的綜述文章)。
p50-p65二聚體與共有序列GGGAMTNYCC(SEQ ID NO.117)的配對序列以微微摩爾級親和力結合，其精確序列的不同親和力稍有不同。值得注意的是也觀察到了p50和p65的同源二聚體的發(fā)生。這些同源二聚體具有不同的生化特性以及和結合序列不同的親和力，結合序列存在于上面的共有序列中或和其相似。這樣，根據(jù)TBA需要的結合特性，p50-p65異源二聚體，p50-p50同源二聚體，或p65-p65同源二聚體都可以利用。
圖9以圖解的形式說明了一種方法，利用這種方法可以產(chǎn)生各種各樣的新型TBA，以便根據(jù)本發(fā)明的方法進行使用。TBA的核酸識別單位可以通過“陪伴”與類似的或不同的TBA核酸識別單位組裝并締合起來。所說的陪伴是一種結構，在這種結構上，可組裝各種TBA識別因素，同時其能在核酸識別位點上提供各種需要的特性。所說的陪伴由能提供裝配序列的序列組成。以便將同樣或不同的核酸識別部分拉近并彼此穩(wěn)定地連接。這樣，例如，在指定的一種TBA與NF-kB TBR緊密結合的情況下，通過提供噬菌體λcro序列做為組裝序列而裝配TBA，這種序列和NF-kB p50或p65的核酸結合序列連接。p50或p65的核酸結合序列與cro序列連接，其連接位點在cro的羧基端或氨基端，或者在p50或p65的核酸識別位點的羧基端或氨基端。可以提供也可以不提供連接序列，以便在核酸結合位點上存在用于合適TBR結合的適當間距。
裝配序列，例如上面所舉的cro和CI序列(SEQ ID NO.104-108)，包含任何能夠自然而牢固地與其它序列結合的寡聚小肽。對于cro，公知cro二聚體可與噬菌體λ的操縱子位點結合(Anderson等(1981)，自然，290754-758；Harrison和asgarwal(1990)，生物化學年評，59933-969)。cro的單體彼此緊密且特異地結合。這樣，通過cro序列和DNA識別單位序列連接，即可產(chǎn)生牢固而緊密的締合。
可有可無的接頭序列包含任何氨基酸序列，這種氨基酸序列不干擾TBA的裝配或核酸的結合，并且不易發(fā)生變化以便從完整的TBA中釋放出核酸識別單位。接頭序列與其它結合裝配組份應共價聯(lián)接，這一點是需要的但不是必要的。這種締合應該是特異性的，這樣有利于結合裝配體的裝配和制造。這種序列的例子包括但不限于那些在結構蛋白中發(fā)現(xiàn)的連接各種區(qū)域的公知的序列。比如，在噬菌體λ阻抑蛋白中，在DNA結合區(qū)和二聚體區(qū)之間就有一個連接序列用于此目的。已知還有很多其它的這樣序列，其精確的順序不限于此發(fā)明，只要常規(guī)實驗能保證其穩(wěn)定性和對靶核酸結合的不干擾性。本文提供了這些序列的例子，為Met Ser和SEQ ID NO.99-102。在這些接頭中插入特異性的已知的蛋白酶解位點也是本發(fā)明的組成部分。在接頭序列中存在這類位點有助于進行制造，并且允許在陪伴框架上裝配不同的分子。
除核酸識別單位，可有可無的接頭序列，裝配序列外，本發(fā)明的新TBA還可有或可無不對稱或PILOT TNA序列以及一個或多個OSA單位。這些不對稱序列用于促進或阻止某種需要或不需要的締合。例如，當需要帶有同源二聚體的p50 DNA識別單位TBA時，需要不對稱序列打斷自然條件下較牢固的NF-kB的p50亞單位與p65亞單位的締合，但又不干擾裝配序列使p50亞單位聚合。本文的例子是SEQ ID NO.85-92和SEQID NO.105和106。
在不同的構型中，NF-kBp50亞單位可和轉錄因子SP1 DNA識別單位緊密締合。在某些情況下希望這種結合，即NF-kB/SP1結合基元是很有價值的時候，如在HIN LTR中，至少六個DNA結合蛋白識別位點，兩個NF-kB，三個SP1，和一個TATA位點的結合部分已經(jīng)證明是存在的。已知第二個NF-kB和第一個SP1位點對HIV轉錄調節(jié)是非常重要的(Perkins等.(1993)Embo J.123551-3558)，這種特定TBA構型不僅用于HIV的診斷，而且可用作HIV感染的治療劑或預防劑(見下文)。同樣地，按照本發(fā)明也可有用人類乳頭狀瘤病毒的長控制區(qū)(LCR)作為探針探測的主控制區(qū)。
由于能夠締合的不同組份和彈夾方式，按照本發(fā)明的TBA制備方法，實質上可以不受限制地產(chǎn)生各種TBA。圖10中，列舉了一系列不同的分子，即是“HIV-診斷I-IV”，其中的“ CHAP”代表陪伴、“NFKB”代表NF-kB亞單位、“SP1”代表SP1轉錄因子的DNA識別單位、“TATA”代表TATA序列DNA結合蛋白(TBP)的DNA識別單位的二聚體，也稱為TATA結合蛋白，或TBP。下文進一步列舉了這些構型，其也是本發(fā)明的組成部分。
在另一種構型中，圖9所示的模型結構是用于監(jiān)測，處理和預防一種完全不同的病原。圖11中，與上面描述的“HIV-診斷I-IV”分子的方式相似，產(chǎn)生了一系列“HPV-診斷I-IV”分子。在這種產(chǎn)品中，利用了人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的E2蛋白的DNA結合的有利特性。此外，通過提供特異DNA識別單位來利用SP1和TBP，用這種特異DNA識別單位結合HPV基因組中的這些序列。在用于監(jiān)測HPV感染的E2特定TBA的形成過程中，希望利用SEQ ID NO.75-84或93-98中的任何一種作為E2 DNA識別單位。含有牛E2二聚體和人E2二聚體的DNA結合區(qū)也許是特別有用的。
以上提到的各種序列可以通過使用純寡聚核苷酸起動材料進行化學連接，或者通過提供重組核酸進行連接，這些重組核酸通過各種遺傳密碼編碼各種亞單位。在重組產(chǎn)生過程中，把cro編碼序列和核酸識別單位序列連在一起形成TBA是非常有利的，因為cro不僅在陪伴中充當裝配序列，而且可以引導核酸識別單位進行適當?shù)恼郫B。本文列舉的陪伴序列見SEQ IDNO.104-108。并且，在希望得到含有多個結合位點的高級結構的過程中，如NF-kB/NF-kB/SP1/SP1/SP1TBA的五聚體，正確地設計不對稱序列使得能夠制造這種結構。
以前面所述的方法，制備以高親和力和其同類結合位點結合的TBA。比如圖10中TBA的NF-kB的DNA結合組份是計劃以10-8和10-12摩爾的親和力結合HIV-LTR的。DNA結合位點有用的序列見SEQ ID NO.63-71，73-84，93-98和104-108，下文還要引用。
由于前面使用裝配序列或不對稱序列的直接裝配核酸結合蛋白的描述，本領域的技術人員會認識到本發(fā)明提供了裝配蛋白結構的一般實用的方法。通過進一步的闡述和舉例的方式、利用需要的結構的裝配體中的抗體-抗原表位的相互作用的方式，進一步驗證本了方法施用的普遍性。更詳細地說，通過把NF-kB p50亞單位連到一個抗原上，如環(huán)形的(酶二硫鍵)黑色素細胞刺激激素(MSH)，抗原裝配DNA結合蛋白結構。這種原-MSH分子可以通過抗MSH的抗體結合，形成一個新型核酸結合裝配體，這個過程中抗原和抗體充當裝配序列。
圖9的模式結構表明可以用各種組份的不同結合體來裝配大量不同的TBA。這樣，一般結構的代表實例見SEQ ID NO.119-116。
7.輔助結合裝配體(BBA)及其制備BBA可以是和特定的BBR結合的任何物質，這種BBR是通過特定的PNA與BNA雜交而形成的，包括多個BNA(上至“n”且包括“n”的BNA，即BNAn，其中的“n”在理論上從0到無窮大，一般是在0到100之間)聚合在PNA上以用于信號擴增，條件是BBA必須具有至少以下兩個特征(a)BBA必須以某種方式與BBR結合，其對興趣BBR是高度特異性。也就是說，BBA必須區(qū)分存在于PNA-BNA雜交體中的BBR和BNA-CNA雜交體中類似的雙鏈序列或其它的CNA。因此，在PNA-BNAn或PNA-BNAn-HNA雜交體的產(chǎn)生過程中，當甚至只有一個堿基錯配，或構象差異(有或無堿基誤配)，這種BBA必須以足夠低的親和力和雜交體聚合，以便在洗脫TBA-TNA-PNA-BNA復合體時，從CNA序列中除去了BBA而不是BBR序列。
(b)BBA必須極易結合BBR。在10-5到10-9或更高范圍內的結合力一般認為是足夠的。
BBA的例子包含但不限于cro和噬菌體λ阻抑蛋白CI。此外美國專利4,556,643，本文一并參考，其介紹了其它的DNA序列和特異結合蛋白，如阻遏子，組蛋白，DNA修飾酶類，及分解代謝產(chǎn)物基因的激活蛋白。也見EP0453301，本文一并參考，其提議了一大群核苷酸序列特異結合蛋白(NSSBPs)，例如四環(huán)素阻遏物，乳糖阻遏物以及色氨酸阻遏物。本領域已經(jīng)認識到這些BBA的每一個都和特定的、已知的核酸序列結合，它們之間的親和力也是已知的。當然，本發(fā)明的方法不限于使用這些已知的BBA從本發(fā)明的公開內容可知，普通技術人員可以容易地施用新型至少具有本方法以上提到的所需特性的BBA的用途。
按照本發(fā)明的這方面，有用的新型BBA的例子包括基于已知的DNA或RNA或DNA:RNA結合蛋白基元的新型蛋白質，例如cro或入CI阻抑蛋白。優(yōu)選的是對這些蛋白進行一些修飾，以提高本發(fā)明這些組分的操作性。這樣，對一個分析來說，以希望加入高濃度的cro。cro的一個缺點是在高濃度時，cro與其靶DNA的結合將與cro-cro間的相互作用競爭。這樣，例如，可以產(chǎn)生一種沒有這種缺點的陪伴的或突變的cro。這種改變了的陪伴的例子見SEQ ID NO.105-106和108。本領域已知的方法，例如用多樣的核酸群體產(chǎn)生新型靶結合蛋白及選擇噬菌體和特定的、預先靶結合(例如，所謂的噬菌斑展示技術，參見上面有關新型TBA產(chǎn)生的討論)的方法，都可以用來產(chǎn)生這種新型BBA以及前面提到的新型TBA。
無論BBA是一個蛋白質或蛋白質復合體，應該認識到可以利用本領域許多常規(guī)方法的任何一種來制備這種BBA。BBA事實上可從其自然產(chǎn)生的條件中分離，或者，如果這樣不可行，可用標準的分子生物學技術來制備。例如，cro蛋白序列是已知的，噬菌體λ的任何分子克隆可用于獲得編碼cro的適當?shù)暮怂嵋杂糜谥亟M體產(chǎn)生。此外，如果利用不同的TBA和TBR及BBR結合，本文描述的TBA也可用作BBA。
8.BBA和BBR用來定位和擴增PNA-TNA-TBA復合體定域的用途(見圖8)在本發(fā)明的一個實施方案中，使用了高度特異和極緊密結合的包含核酸結合組份的TBA，來產(chǎn)生可擴增的核酸夾層分析。按照本實施方案的一個方面，用第一個TBA包裹一個固體支持物以產(chǎn)生固定化的TBA。在溶液中，PNA和TNA在雜交條件下接觸，然后與固定化的TBA接觸。只有那些能夠形成由固定化TBA識別的特異TBR的PNA-TNA相互作用才能在洗脫后保留下來，該固體表面結合了TBA-TBR復合體。
結合的TBR的檢測通過在雜交條件下輔助核酸、BNA和存在于PNA上的1/2 BBR結合來完成。以這種方式，既使只有單一的TBA-TBR復合體結合在固定化TBA上，也可以通過聚合眾多的BNA在固定化TNA上來產(chǎn)生一個擴增的信號。每一個和TNA結合的BNA產(chǎn)生一個BBR，它可和BBA結合，就象TBA固定在固體表面一樣，可以選擇BBA使它們能非常緊密且特異性地和特定核酸結構結合。這樣，按照這一實施方案，固定化的TBA可以包含NF-kB的DNA結合蛋白，它非常特異地且緊密地與NF-kB結合位點結合，這一結合位點是基于TNA與PNA雜交而形成的。
因為，公知在正常人的基因組與人類免疫缺陷病毒(HIV)的長末端重復序列中都存在NF-kB結合位點，本發(fā)明提供了一種能區(qū)別“正常”人類的結合位點和由于HIV感染而在細胞中出現(xiàn)的結合位點的方法。因此，在一個設計來確定人DNA樣品中是否存在HIV DNA的測試中，可以把HIV NF-kB結合位點看成TNA，正常人的NF-kB結合位點看成CNA。按照本發(fā)明的方法，區(qū)別TNA和CNA可以通過利用如下事實來完成，即在HIV LTR中，有兩個NF-kB結合位點，后面緊接著三個SP1位點(見Koken等.病毒學191968-972)，而發(fā)現(xiàn)具有同樣序列的細胞NF-kB結合位點不是一前一后的。
在TNA包含不只一個1/2 TBR時，希望實施TBA的診斷和預防應用時，可以使用不只一個的TBA，每個TBA都具有與TNA-PNA復合體中的TBR結合的能力。在這種情況下，選擇對TBR親和力小于野生型DNA或RNA結合區(qū)的DNA或RNA結合區(qū)是有利的，這種結合區(qū)作為所說的TBA的組分。假設那些與眾多TBR結合的TBA既可以在與它們的TBR結合之前聚合在一起，也可以在與它們的TBR結合之后聚集在一起，在其它非靶基因組中，除非TBR具有空間上結合已裝配的TBA復合體的能力，單個的TBA將不會阻礙相應的TBR。在這兒特別聲明的作為本發(fā)明一個部分的多聚TBA復合體的一個特征是預計這種多聚復合體與TNA內單個位點的親和力極大地減小。然而，由于其結合能力相對于單個的TBA極大地增加，預計這種TBA復合體不和任何單個的TBR與活體內相應蛋白質之間的結合發(fā)生競爭，但卻和含有TBR的PNA-TNA雜交體的序列緊密結合，這種TBR用于TBA中每個裝配的核酸結合組份。裝配TBA復合體并調整單個TBA中的接頭以便包含在TBA復合體中的核酸結合區(qū)到達這些靶并與之結合。
一旦TNA-PNA雜交體形成并與固定化TBA接觸，未結合上的核酸則可從固定化表面洗脫掉并可檢測固定化的雜交體?？梢杂脦追N方法中的任何一個來完成這個過程。本發(fā)明的一個方面是，PNA用一種OSA標記，如放射性核素，有色顆粒，或有能力產(chǎn)生帶色反應產(chǎn)物的酶。并且，這種PNA除了具有一個或多個1/2 TBR外，也可以含有至少一個1/2 BBR。對這種1/2BBR序列進行選擇以便其與BNA中獨有的1/2 BBR序列互補。在上面描述的實施例中，例如，其中的TBA是NF-kB以及在TNA-PNA雜交體上形成的TBR是一個或多個NF-kB的結合位點時，1/2 BBR可提供噬菌體λ操縱子左端或右端的可雜交(即是單鏈的，互補的)的序列(見，例如，Ptashne，科學的美國(Scientific American)247128-140，以及該文關于這些操縱子序列所引用的參考文獻)。這些序列可以以載體的形式聚合在PNA1/2BBR上(見圖2和3)，提供“n”個BBR，每個BBR形成一個cro結合位點。以酶法、放射性或其它方法標記的cro與TBA-TNA-PNA-(BNA)n復合體接觸。以這種方式，可產(chǎn)生一個高度選擇性的和擴增的信號。用含有單個1/2 TBR的PNA產(chǎn)生的信號表明分析的成功，完成了TBA-TBR的結合及BNA的聚合結果從細胞位點產(chǎn)生信號(例如，從CNA)。當使用雙聚TBA時，信號的缺乏表明在TNA中沒有HIV LTRs，因為不存在雙NF-kB結合位點。另一方面，使用雙聚NF-kB時信號的出現(xiàn)表明有HIV感染。本發(fā)明此實施例前面所述的一個具體例子，見例6所描述的HIV檢測試劑盒。
自然，本領域的技術人員應該認識到前面所述的描述可以在選擇PNA，TNA，TBA，BNA和BBA有幾種修改。并且，在非HIV的其它系統(tǒng)中，本領域的技術人員應意識到以上描述的一般方法可同樣使用。然而，其它的使用可以比以上描述的方法更簡單，因為使用的TBA可以不識別任何正常細胞位點因而采取雙聚合法，或其它能區(qū)別TNA和CNA方法都可以。在設計用于其它系統(tǒng)的探針和結合裝配體時，本領域技術人員應遵守下面的原則和注意事項。
在以上所述的實施方案中，要求用NF-kB蛋白的DNA-結合部分作為TBA和用NF-kB識別結合組份作為TBR，是因為這些組份形成一個重要的HIV復制的“控制點”。也就是說，已知HIV需要在其復制生命周期中用NF-kB作為一個關鍵組份。按照本文描述的方法，可以選擇其它病原體的類似控制點并作為檢測的基礎。
從以上描述的本發(fā)明的一般特性和操作方式，本領域的技術人員應認識到有很多實踐本發(fā)明的具體方式。例如，本發(fā)明的方法適用于美國專利4690691和5310650(′691和′650專利)描述的使用層析測試盒的方法和裝置。在那些專利中，利用孔狀培養(yǎng)基固定TNA或捕獲探針，利用一種溶液傳輸流動相到“捕獲區(qū)”，如果固定的是TNA，流動相中則含有標記的PNA；如果固定的是捕獲探針，流動相則含有TNA。通過直接固定或捕獲，一旦TNA結合到捕獲區(qū)，在捕獲區(qū)內色譜分析標記的PNA同時檢測任何結合的標記。
本發(fā)明采用這種系統(tǒng)，改進了捕獲區(qū)的子結合裝配體的利用，因而，捕獲的只是完美相配的TBR序列或其它代表核酸構型的TBR，這種TBR和TNA-PNA雙螺旋體中的TBA特異結合，其中TNA與CNA的區(qū)別依靠前面描述的TBA靈敏區(qū)別TNA與CNA的方法。
一旦TNA-PNA雜交體與固定化的TBA結合，就可以通過加入BNA或捕獲區(qū)層析分析的BNA而擴增信號。最后，可以通過加入BNA或捕獲區(qū)層析分析的BNA而進一步擴增信號。以這種方式，通過提供增加那些專利所述方法的特異性和靈敏性的額外能力(通過擴增)，本發(fā)明提高了專利′691與′650所述分析各步的簡便性。為了顯示該方法的細節(jié)和該文本所述特殊操作條件的教導(該條件下，本發(fā)明的組分和方法也是適用的)，專利′691與′650的公開內容本文一并參考。
本領域的技術人員也會認識到本發(fā)明的方法適合用于微孔滴板或自動分析。因此，并入本發(fā)明方法的儀器的用途自然在本公開內容和有關權利要求范圍內。這樣，例如，本發(fā)明可采用的儀器，如AbbottLaboratories(Cabbott Park，IL)的IMx桌面分析儀。設計IMX目前是來進行熒光極化免疫分析(MEZA，見KierKCLA313-15)和微粒酶聯(lián)免疫分析(MEZA，見實驗醫(yī)學，Vol.20，NO.1，January 1989，PP.47-49)。用本發(fā)明的TBA作為捕獲分子，這種捕獲分子包裹在懸浮于溶液中的亞微粒(平均＜0.5μm)大小的微粒上，可以容易地把MEZA法轉變成核酸檢測的方法。將TBA包裹的微粒轉入反應細胞中。然后IMx將樣品(雜合的PNA-TNA)轉入反應細胞中，與TBA形成一個復合體。經(jīng)過一段適當時間的培養(yǎng)，將溶液轉移到惰性的玻璃纖維基質上，顆粒物與其具有強的親和力因而微粒粘在其上。在通過玻璃纖維基質過濾反應液之前或之后加入BNA和BBA，或依據(jù)TNA-PNA雜交體的特定結構，使用另外的信號擴增和檢測方法。對固定化的復合體進行洗脫，未結合上的物質通過玻璃纖維基質流出來。
用堿性磷酸酶標記BBA或其它形式(放射性的，酶學的，熒光的)標記BBA的方法檢測結合的復合體。在堿性磷酸酶標記BBA的情況下，可以加入熒光底物4-甲基umbelliferyl磷酸鹽或類似的試劑。另外，可以通過直接以這種試劑或類似試劑標記BBA的方法而省去酶。不管哪種情況，熒光或其它信號都與PNA-TNA雜交體的數(shù)量成比例。
用IMx制造商所描述的前表面熒光計的方法來檢測基質表面的熒光。通過一些小的調整，這一方法可以由常規(guī)實驗來完善儀器，例如Imx用于核酸雜交和核酸-TBA相互作用的檢測，本發(fā)明完全適用于TNA樣品的自動分析。
9.本發(fā)明的其它診斷應用雖然，從前面的描述可知能以多種不同的方式利用本發(fā)明，但本發(fā)明另外眾多的應用也是相當有價值的，例如，在移動延遲系統(tǒng)中的應用。
在本發(fā)明的這個實施例中，依下列各項對公知的電泳遷移率變動分析(EMSA)進行了改進(見圖12a和12b)。
通過隨機切割或通過特定的限制性核酸內切酶處理的方法把DNA樣品切成片段。然后將DNA樣品分成相等的兩份，將特定的TNA加入到第一份中但不加入第二份中。然后將兩等分試樣在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上電泳。比較兩份樣品的DNA帶型(通過溴化乙錠結合或通過電泳前放射性標記的方法顯示)。具有TBA特異結合位點的DNA片段在通過電泳介質遷移時受阻。用合適的TBA，任何數(shù)量的DNA或其它核酸都可以以此種方式追蹤。
在以上描述的EMSA的改進中，TNA的片斷與PNA雜交并被分離在第一部分中。分離的DNA與適當?shù)腡BA反應同時注意到DNA片段的遷移率發(fā)生變化。如上文描述，加入BBA可能會增加這種阻滯(見Vijg及其所引用的有關已知的二維核酸電泳技術的文獻，對于這種技術可直接應用本方法)。
10.治療應用由于本文描述的新型TBA具有緊密且選擇性的核酸結合特征，所以考慮到這些化合物除了診斷上的應用外，還可用于治療。這樣，由于在臨近的組合中存在NF-kB p50和SP1 DNA識別單位(見圖10，HIV-檢測II)，具有緊密及特異地與HIV-LTR結合的特性的TBA，可以用來結合到HIV-LTR上而阻止HIV基因組的某些關鍵因素的轉錄。TBA裝配序列獨有的這種特征允許重組載體把編碼TBA的DNA導入細胞并把表達的序列正確地折疊。一旦進入細胞，p50亞單位上的細胞核定位信號將引導TBA進入細胞核并緊密地與任何整合的HIV的LTR結合，結果有效地控制了病原。在預防模式中，對有可能暴露在HIV中的人施用足夠劑量的TBA或一個可以表達TBA的重組載體，這樣阻斷任何可能侵入人體的HIV。在這種模式中，TBA的使用類似于用特異性免疫球蛋白的被動保護。在治療或預防模式，使用NLS序列替代用于診斷模式中的OSA。例舉的NLS序列見SEQ ID NO.72和103(另見Heinzingen 1994和bukinsky 1993，分別描述了HIV Vpr和gag蛋白質的NLS序列)。在任何情況下，以藥學上可接受的載體施用TBA，如無菌鹽溶液，與磷酯體結合或以重組載體的形式，優(yōu)選的方法應該能指導TBA在選擇的細胞類型中表達，或取決于蛋白質的轉遞系統(tǒng)。
II.本發(fā)明的實施方案由于前面的描述和下面的實施例，本領域的技術人員會理解本文描述了并使得可以實施本發(fā)明的各種實施方案，這些實施方案包括1.一種探針核酸(PNA)，該核酸包含(A)單鏈序列1/2 TBR，該序列在雜交條件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2 TBR形成雜交體TBR；(B)單鏈序列1/2 BBR，該序列在雜交條件下可以和輔助核酸(BNA)中的0-10個1/2 BBR形成雜交體BBR；和(C)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；其中所說的TBR可以以高親和力和TBA結合，所說的TBA是一種能夠區(qū)分配對的TBR和具有未配對的核苷酸的TBR的物質，并且，所說的BBR可以以高親和力和BBA結合，所說的BBA是一種能夠區(qū)分配對的BBR和具有未配對的核苷酸的BBR的物質。這一實施方案包括TRR(其是核酸結合蛋白識別位點，例如HIV LTR)在其它病原體中的核酸結合蛋白識別位點，其中某些以上已說明。本發(fā)明的這一實施方案的PNA可以產(chǎn)生TBR，后者是存在于病原體基因組中的核酸結合蛋白識別位點或者是與人基因組中的病理狀態(tài)或發(fā)酵過程中污染物相關的結合位點。
2.一種輔助核酸(BNA)，該核酸包含(A)1/2 BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2 BBR序列互補的序列，并且其在雜交條件下可以和PNA形成雜交體BBR；(B)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；和(C)附加的雜交位點1/2 BBR，用來和附加的BNA雜交；其中所說的BBR可以以高親和力和BBA結合，所說的BBA是一種能夠區(qū)分配對的BBR和具有未配對的核苷酸的BBR的物質。
3.一種發(fā)夾核酸(HNA)，該核酸包含單鏈序列1/2 BBR，該序列在雜交條件下能夠形成發(fā)夾結構，并且同時和BNA結合形成能夠結合BBA的BBR，其中所說的BBR可以以高親和力和BBA結合，所說的BBA是一種能夠區(qū)分完美的BBR和具有未配對的核苷酸的BBR的物質。
4.一種用于檢測特定TNA序列的方法，該方法包括以下步驟(A)使所說的TNA與權利要求1的PNA雜交；(B)使所說的TNA與含有1/2 BBR的BNA雜交，所說1/2 BBR的序列和PNA中的1/2 BBR序列互補；(C)將含有TBR和BBR的步驟(A)和(B)的產(chǎn)物加入到含有TBA的表面、液體或其它介質中；(D)將BBA加入到步驟C的混合物中，其中所說的BBA包含(I)能夠選擇性地結合BBR的分子或分子的一部分；(II)可檢測的指示劑；和(E)檢測連接到BBA上的指示劑所產(chǎn)生的信號。這一方法包括使用蛋白質指示劑包括可以催化反應導致產(chǎn)生有色反應產(chǎn)物的酶，也包括象放射性核素，有色小球之類的指示劑。
5.一種用于檢測樣品中特定靶核酸TNA存在的方法，該方法包括以下步驟(A)使所說的樣品和探針核酸PNA接觸，如果樣品中存在所說的TNA，則PNA與TNA雜交形成靶結合區(qū)TBR，此TBR可以和靶結合裝配體TBA結合；和(B)使已經(jīng)和所說的PNA接觸的樣品和TBA接觸，此TBA可以結合任何由所說的PNA與樣品中所說的TNA雜交形成的TBR。
6.一種具有高靈敏性和特異性的檢測和定位特定核酸序列的方法，該方法包括(A)將含有1/2 BBR和1/2 TBR的PNA加入到含有或懷疑含有包含1/2 TBR序列的TNA樣品中，以形成具有靶結合區(qū)的復合體TBR，此TBR由分別存在于PNA和TNA中的互補1/2 TBR的雜交形成；(B)將步驟A中形成的TBR結合到固定化的TBA上，以形成TBA-TNA-PNA復合體；(C)將包含輔助結合區(qū)1/2 BBR的輔助核酸BNA加入到步驟B中形成的復合體中，以便BNA中的1/2 BBR與存在于PNA中的1/2 BBR序列雜交，或者加入到存在于已經(jīng)和PNA結合的BNA中的1/2 BBR上形成BBR，以便形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n復合體；(D)將含有1/2 BBR序列的發(fā)夾核酸HNA加入到步驟C中形成的復合體中，以便HNA中的1/2 BBR和任何存在于步驟C的復合體的BNA中的可獲得的1/2 BBR序列雜交，由此在步驟C的TBA-TNA-PNA-(BNA)n復合體上加帽使BNA延伸，形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA復合體；(E)將和指示劑部分連接的輔助結合裝配體加入到步驟D中所形成的TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA復合體中，以便形成TBA-TNA-PNA(BNA-BBA)n-HNA復合體；和(F)檢測由連接到步驟(E)中TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)n-HNA復合體中的TBA，PNA，BNA，BBA或HNA上的指示劑所產(chǎn)生的信號；其中所說的TNA包含(i)一個或多個特定1/2 TBR核酸序列，此特定序列在特定樣品中的存在與否有待證實；所說的PNA包含(i)單鏈序列1/2 TBR，該序列在雜交條件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2 TBR形成雜交體TBR；(ii)單鏈序列1/2 BBR，該序列在雜交條件下可以和輔助核酸(BNA)中的0-10個1/2 BBR形成雜交體BBR；和(iii)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；所說的BNA包含(i)1/2 BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2 BBR序列互補的序列，并且其在雜交條件下可以和PNA形成雜交體BBR；(ii)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；和(iii)附加的其它BNA的雜交位點1/2 BBR；(iv)序列1/2 BBR，其可以與已經(jīng)和PNA雜交的BNA雜交；所說的BBA包含(i)能夠選擇性地結合BBR的分子或分子的一部分；和(ii)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；并且所說的TBA包含(i)能夠選擇性地結合TBR的分子或分子的一部分；和(ii)無連接的支持物和/或指示劑，或者連接的支持物或其它定位方式，包括，但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上和/或指示劑上；7.一種用于檢測靶多核苷酸存在的改進的固相雜交方法，所述的固相雜交方法涉及將靶多核苷酸(如果存在于樣品中)直接或經(jīng)媒介俘獲結構固定化在固相的俘獲位點上；在所說的固定化過程之前、之中或之后將一種可檢測的標記連接到所說的靶多核苷酸(如果存在)上，并且在俘獲位點上檢測所說的標記(如果具有任何所說的標記存在)，所述改進包括(A)使用靶結合裝配體TBA作為達到固定化所說的靶多核苷酸的手段，其中所說的TBA只結合到由特定的探針核酸PNA和所說的的靶核酸形成的獨特的雜交體上，以便形成可以被所說的TBA識別的完美的靶結合區(qū)TBR；和(B)在PNA中包含進可以結合輔助核酸BNA的單鏈核酸1/2 BBR，所說輔助核酸含有單鏈互補1/2 BBR，當其和PNA中的1/2 BBR雜交時，形成可以和標記的輔助結合裝配體BBA結合的BBR。
8.一種靶結合裝配體TBA，其包含一個或多個核酸識別單位、接頭序列、裝配序列、不對稱序列、核定位信號序列(NLS)和OSA。所說的核酸識別單位可以是NF-kB結合單位、SP1結合單位、TATA結合單位、人乳頭狀瘤病毒結合單位、HIV LTR結合單位或特定序列(其檢測是所需的，并且其可以通過與TBA特定締合完成)的任何其它片段的結合單位。這樣的核酸識別單位包括但不限于這里作為舉例的這樣一些SEQ ID NO.63、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ IDNO.72和SEQ ID NO.73。接頭序列，例如寡肽，不干擾核酸識別單位的核酸識功能，并且提供核酸識別單位與剩余TBA間隔的穩(wěn)定性和控制。這種接頭序列是本領域已知的，包括但不限于來源于結構蛋白區(qū)域間一級序列的寡肽序列。裝配序列包括寡肽序列，此寡肽序列指導核酸識別單位的折疊和締合。這種序列優(yōu)選的例子是來源于λ噬菌體cro蛋白寡肽。所說的不對稱序列指導核酸識別序列和裝配序列以預定的順序締合。這種不對稱序列的例子是來源于胰島素、松馳素、促性腺激素、FSH、HCG、LH、ACTH的序列，包括但不限于SEQ ID NO.85-92。參照圖14和15，SEQ IDNo.85是“A”序列，SEQ ID No.86是“B”序列；SEQ ID No.87是“A”序列，SEQ ID No.88是“B”序列；SEQ ID No.89是人松弛素“A”序列，SEQ ID No.90是人松弛素“B”序列；SEQ ID No.91是skate“A”序列，SEQ ID No.92是skate“B”序列。此外，所說的TBA可以含有核定位序列NLS，其指導與所說的NLS相關的蛋白質或復合體遷移和攝入到細胞核中。這樣的NLS序列的例子是SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.103。TBA優(yōu)選的具體例子是HIV Detect I-IV或HPV DectectI-IV，和SEQ ID NO.109-116。
9.使用本發(fā)明的新TBA的方法，包括但不限于使用TBA結合靶核酸樣品中特定的核酸序列的方法，該方法包括(A)裂解靶核酸樣品中的核酸；(B)在雜交條件下，使裂解的核酸與和特定的興趣核酸互補的探針核酸接觸，其中在所說的的探針核酸與所說的特定的興趣核酸序列雜交時，形成所說的TBA特異性地結合到其中的靶結合區(qū)。
在這一方法中，所說的探針核酸除了具有和所說的特定的興趣核酸互補的序列外，還具有附加序列，此附加序列可與輔助核酸結合，形成輔助結合位點，標記的輔助結合裝配體可以結合到此結合位點上，提供顯示和擴增探針核酸和興趣靶核酸序列結合的信號。
本發(fā)明不需要裂解靶核酸的另一方面涉及將預防和治療有效量的所說TBA施用給需要此種治療的病人，該方法包括以提純的蛋白復合體的形式或以重組載體(進入病人體內后可以表達TBA)的形式施用TBA，以便TBA和特定的核酸序列結合達到所期望的治療和預防結果。這可以包括提供可由常規(guī)實驗確定的足以阻止病原體活性感染的劑量。當以指導TBA體內表達和折疊的重組表達載體提供時，重組核酸的劑量可以實質上較低，特別是以非病原體病毒載體形式提供時。使用TBA的方法也包括監(jiān)測靶核酸樣品中核酸移動性的改變，以便TBA和樣品中特定的核酸片段結合改變此片段的移動性作為核酸大小的函數(shù)。所述方法的這一方面提供了為特定的畸變(例如可能在與新陳代謝相關的過程中發(fā)現(xiàn)的)分析核酸片段的有用的方法。
10.診斷或法醫(yī)試驗試劑盒，該試劑盒在確定感染的存在、疾病的易感性或包含特定核酸源的樣品。
11.一種用于在體內裝配多聚體TBA方法，該方法包括將組份TBA引入到細胞中，所說的TBA組份每個都應含有核酸識別單位、裝配序列、不對稱序列和核定位信號序列，如果足跡法實驗表明需要接頭序列來獲得多聚體TBA的最適的幾何學，則接頭序列也可以包含在其中。當體內表達各組份TBA和經(jīng)由各組份TBA的DNA識別單位鄰近地結合到在細胞核中或細胞其它區(qū)域遇到的核酸序列上時，組份表達的TBA通過所說的裝配和不對稱序列被裝配成多聚體TBA。如上所述，這樣的多聚體TBA具有以高的親和力特異性地結合到特定靶序列中的TBR上但根本不結合到表親核酸上或者以非常低的親和力結合到表親核酸上的優(yōu)點。
本發(fā)明以上的描述會使本領域技術人員明白本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案和最佳方式。不將發(fā)明主題限制在此后給出的具體例子中，以下實施例提供來指定本領域技術人員實施本發(fā)明的方法。在Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis(1989)分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY中描述了標準的重組DNA技術，沒有描述較近期的內容，因為現(xiàn)在這些已經(jīng)完全在本領域技術人員的知識范圍內。
實施例1-PNA的制備及標記可以通過本領域已知的各種方法制備核酸探針(PNA)。這樣，限定序列的單鏈多核苷酸的PNA可以按照Merrifield的固相化學合成方法進行制備?？梢岳猛ㄟ^商業(yè)途徑可以得到的技術經(jīng)自動合成的方法制備PNA，例如使用Biosystems、ABI和其它制造者生產(chǎn)和銷售的樹脂和儀器。另外，通過已知的重組DNA方法，體內合成特定的PNA序列，例如通過將雙鏈PNA克隆進能在大腸桿菌中復制的載體中，則可以制備大量的雙鏈PNA?？梢园裀NA聚合物克隆進這種載體，這樣對于每摩爾的載體，通過用位于PNA序列兩側的限制片斷消化載體，可以釋放幾摩爾的PNA。繼合成或重組產(chǎn)生之后，通過本領域公知的方法純化PNA，如通過凝膠電泳或高壓液相色譜技術。如果PNA以雙鏈形式產(chǎn)生，在其用于檢測靶核酸序列的雜交分析之前，用加熱或本領域已知的其它方法將PNA的雙鏈分離。
選擇PNA中的特定堿基序列，這些序列反映了TNA中被檢測的序列，但條件是，根據(jù)本發(fā)明，PNA含有一個1/2 TBR序列，此序列是基于PNA和TNA雜交形成TBR的之一。由于本領域中實際上有無限量的這樣的序列，所以對于任何給定的應用，技術人員能夠選擇到合適的PNA序列。HIV LTR序列就是這樣一個序列，其在編碼部分LTR的PNA與編碼HIV LTR的TNA雜交后，形成可以與NF-kB或SP1 DNA結合蛋白結合的TBR。
除了在雜交基礎上形成TBR的序列，PNA還可以含有1/2 BBR。這一序列是指在和輔助核酸BNA雜交后可以形成BBR的序列，BBR序列能結合BBA。優(yōu)選的BBA是對BBR序列有高度親合力的DNA結合蛋白。
在這個具體的例子中，雜交發(fā)生在有一個1/2 TBR的PNA(見SEQ ID NO.4)和該序列3端的1/2 TBR(見SEQ ID NO.35)之間。編碼這些序列的PNA在使用中可以不標記或者用同位素如P32，S35標記或按照本領域已知的方法用類似的同位素標記。另外，PNA也可以和直徑0.01到10微米的膠粒結合，將這些膠粒染色以便于視覺檢測。這種標記形成如說明書所描述的OSA。這種探針與HIV LTR序列雜交形成了結合NF-kB的TBR。此外，PNA與具有互補1/2 BBR的BNA雜交形成噬菌體λ的左操縱子，這種操縱子或者與cro或與λ阻抑蛋白結合。
以上面描述類似的方法，使用PNA，其中所說的1/2 TBR是SEQ ID NO.5或SEQ ID NOS.7-34的任何一個，另外一個1/2 BBR，如SEQ ID NO.35或36，在前一個1/2 TBR的3′端或者5′端。
實施例2-BNA的制備和標記與實施例1中所描述的制備和標記PNA的方法相似，按照本領域已知的方法制備和標記BNA。美國專利4,556,643所描述的方法，本文一并參考(具體參見例1)，可以通過將其克隆到一個可復制的載體中而大量產(chǎn)生編碼特異核酸結合序列的核酸序列。并且，和其所公開的內容相似，以這種方式，可以共線性產(chǎn)生1/2 TBR和1/2 BBR，但不同的是，按照本發(fā)明，1/2 TBR自身形成一個核酸結合組份的識別位點，而1/2 BBR，盡管形成一個核酸結合組份識別位點，但還可以通過把BNA聚合在結合PNA的TNA上，而提供了擴增基于這種1/2 TBR和TNA中的互補序列結合而產(chǎn)生的信號的方法。為了實現(xiàn)這種擴增，給如SEQ ID NO.35的序列(這種序列能夠編碼噬菌體λ左操縱子)裝配額外的序列，這樣在BNA和PNA雜交的基礎上，在BNA的一端或兩端就形成了突出端序列。
BNA媒介聚合在TNA上的具體例子見SEQ ID NO.40-43。在這一例子中，SEQ ID NO.40編碼2個1/2 TBR，這2個1/2 TBR與TNA上的2個1/2 TBR雜交而形成2個NF-kB結合位點，同時還提供了一個噬菌體左操縱子1/2BBR，該序列的3′端是一個限制酶PstI的識別位點。加入BNA(SEQ ID NO.41)及與PNA中的1/2 BBR互補的1/2 BBR(SEQ ID NO.40)，就形成一個完整的BBR同時形成一個完整的PstI識別位點，留下一個4堿基的突出端用于和額外的BNA雜交。因此，加入3′端有一個4堿基序列的SEQ ID NO.42，其與SEQ ID NO.4和41雜交后剩下的4個堿基的突出端互補。此外，給SEQID NO.42在5′端裝配一個5堿基的序列，該序列是BamHI識別位點的組成部分。通過加入SEQ ID NO.43的BNA，可進一步擴展BNA生長聚合體，SEQ ID NO.43的BNA和SEQ ID NO.42互補，形成一個完整的BBR同時形成完整的BamHI識別位點，并且，留下一個還可和具有互補序列的BNA雜交的4堿基的突出端。通過這種方式，可以廣泛的雜交BNA，結果極大地擴增了單一PNA與TNA雜交作用的信號。
和實施例1中所述的PNA一樣，利用BNA可以以不標記形式或按照本領域已知的和實施例1所描述的方法對其進行標記。產(chǎn)生BNA聚合物時，向PNA-TNA復合體直接加入BNA而形成BNA聚合體是值得欣賞的，而不是通過向PNA-TNA復合體中順序添加BNA。形成這種BNA聚合物的一個簡易方法包含重組產(chǎn)生載體，在該載體中給BNA聚合物在其任何一端提供一個獨有的限制酶切位點。把含有多個BBR的多聚體BNA從載體上切下來，并和基于PNA和TNA雜交保留在PNA上的單鏈1/2 BBR雜交。通過在PNA上提供和BNA聚合物上的突出端互補的單鏈序列來完成這一過程，其中突出端是BNA聚合物從產(chǎn)生載體上切割下來時產(chǎn)生的。
實施例3-HNA的產(chǎn)生和它們用于加帽BNA聚合物的用途按照本領域用于產(chǎn)生核苷酸的已知方法，如例1和例2中產(chǎn)生PNA和BNA的方法產(chǎn)生本發(fā)明的HNA。但是，在生產(chǎn)HNA的過程中，特異設計HNA的序列，以便HNA的實質性部分形成一個自我配對的回文序列而形成一個發(fā)夾結構，同時，在剩余的單鏈部分形成足夠的堿基以便能與例2所描述的BNA的生長鏈的單鏈序列雜交。
在這一實施例中，提供HNA(SEQ ID NO.44)以加帽例2中在加入BNA(SEQID NO.43)之后，和PNA雜交的BNA的突出端。因為SEQ ID NO.44除了具有一個形成一個穩(wěn)定發(fā)卡結構的回文序列，還在HNAs的5′端有一段序列，這段序列完善通過SEQ ID NO.42和43的雜交而形成的BamHI序列，所以上述過程能夠完成。自然，在說明本發(fā)明的過程中，只加入3個BNA而終止聚合物是為了簡便說明的目的。如上所述，這一聚合過程實質上可以無限地連續(xù)擴增PNA-TNA雜交過程中的信號。一旦HNA與BNA的生長鏈雜交，則加帽該聚合物，并且失去聚合物的突出端。
實施例4-TBA和BBA的制備、標記和其固定根據(jù)本發(fā)明可以使用的TBA和BBA包括任何特異性地和PNA、TNA和BNA雜交后形成的TBR和BBR結合的物質。使用DNA結合蛋白形成這種物質的一例。
在這個例子中，所說的TBA是DNA結合部分p50的二聚體，所說的BBA是λcro蛋白。這些蛋白可以通過本領域已知的方法生產(chǎn)。已經(jīng)克隆了編碼這些蛋白的基因。這樣，依據(jù)本領域已知的方法能夠重組產(chǎn)生這些蛋白并對其進行純化。并且可按照本領域已知的方法標記這些蛋白，或者通過放射性同位素標記(如放射性碘)，或者用酶標記(如β-半乳糖酶或辣根過氧化物酶)，或者通過螢光染料標記(如螢光素或羅丹明)。另外，可以把TBA和BBA中的任何一個或兩個固定在固相表面，如微量滴定板表面或微粒的表面(直徑介于0.01至10微米的彩色粒子)。TBA和BBA的標記可以相同也可以不同。
在這一例子中，含有二聚p50 DNA結合區(qū)的TBA用羅丹明標記，而BBA，cro蛋白，用螢光素標記。因此，經(jīng)過和本專利公開內容和前面與下面的例子所描述的PNA、TNA、BNA和HNAs的雜交，核酸雜交體(如果形成)，和過量標記的TNA和cro接觸。這些標記的螢光信號通過已知的方法來測量，二種信號的檢測結果都表明TNA上存在1/2 TBR序列。NF-kB和cro的螢光產(chǎn)生的差異信號能夠量度BNA在PNA-TBA雜交體上的聚合引起的信號擴增程度。按照本發(fā)明的方法，預計擴增可從一倍至一千倍。
實施例5-兩個PNA和一個TNA的雜交以及TNA和CAN的區(qū)別所用的PNA，PNA1(SEQ ID NO.40)和PNA2(SEQ ID NO.45)，以十倍于實驗樣品中TNA的摩爾濃度的量使用。在該實施例中，一個分離的雙鏈HIVLTR，其中一條鏈具有圖7所示的SEQ ID NO.37序列，另一條鏈與圖7所示序列互補，用作TNA。在此實施例中也使用了一個分離的雙鏈CNA，其中的一條鏈與SEQ ID NOS.37的序列相同，除了在圖7所示的第一個NF-kB結合位點的中心，即圖7的1位，“A”代替“T”；因此互補鏈在那個位點上和SEQ ID NOS.40的PNA錯配。
把SEQ ID NOS.40和SEQ ID NOS.45的序列都加入到不同的反應中，第一個序列包括上述的TNA，而第二個序列包括上述的CNA。把樣品溶解在合適的雜交緩沖液中，例如10mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA。把樣品加熱到90℃保持大約5分鐘，使樣品中雙鏈的TNA和CAN鏈分離，然后冷卻樣品使PNA，TNA和CNA的鏈退火。
雜交結束后，可以根據(jù)已知的方法檢測雜交，如根據(jù)已知的方法計算基于堿基組份的t1/2和退火溫度，SEQ ID NOS.40的PNA和加入的BNA多聚合(和實施例2一樣)，SEQ ID NOS.45的PNA2探針與始于Sph1識別位點突出端的BNA進行多聚合。在加入BNA并短時間雜交后，不同的樣品分別加入用共價固定的NF-kB包被的顆粒上，允許NF-kB和TNA及CNA樣品中形成的任何TBR結合。大約結合15分鐘后，用大約3倍體積的合適洗脫緩沖液洗脫樣品兩次，所用的緩沖液如10mM Tris(pH7.5)、100mM氯化鈉，或已確定不會影響NF-kB或噬菌體λCI阻抑蛋白結合活性的另外緩沖液。每次洗脫后，顆粒都通過重力或短時間離心而沉降下來。這樣就去除了那些沒有正確地經(jīng)PNA1和TNA雜交而形成的NF-kB結合位點的核酸。
最后一次洗脫后，把標記的噬菌體λ的CI阻抑蛋白加到每一個樣品中，這些噬菌體λCI阻抑蛋白用放射性同位素標記(如放射性碘)、或用酶標記(如辣根過氧化物酶)、或者用帶顏色的顆粒、或者用螢光標記物標記。然后用幾倍體積(約2倍)的合適洗脫緩沖液洗脫樣品幾次(約3次)，緩沖液如10mM Tris，pH7.5、100mM氯化鈉，或已確定不會影響NF-kB或噬菌體λCI阻抑蛋白結合活性的另外緩沖液。每次洗脫后，顆粒都通過重力或短時間離心而沉降下來。最后一次沉降或離心之后，通過檢測結合的放射性量、酶分析中釋放的顏色、結合的顆粒的顏色、或熒光來定量結合的標記物。另外，也可以加入一種抗-CI的抗體并使用一種標準的三明治式酶聯(lián)免疫測試或放射免疫測試來檢測結合的阻抑蛋白。另外，作為陰性對照(背景)，所有的上述操作都在另一種樣品中依次進行，這種樣品中的顆粒不含固定的NF-kB。
前面檢測的結果是，對照和含CNA的樣品具都有相似的低度信號而含TNA的樣品則具有遠遠高于背景的信號。
實施例6-A.檢測HIV的試劑盒A.試劑盒組成1.微量滴定板
2.在tris緩沖液鹽水中重組產(chǎn)生的NF-kB溶液1mg/ml3.含有單鏈HIV PNA的管(預先混合的編碼2個NF-kB1/2結合位點的寡核苷酸混合物，即SEQ.ID.No.7和8的混合物)4.含有單鏈人基因組PNA(SEQ ID NO.1)的管5.含有核酸酶(PstI)的管6.含有蛋白酶的管7.含有預先聚合的BNAs，100個重復單位的噬菌體λOR的管，其被HNA加帽但具有自由的1/2 BBR以便結合PNA-TNA雜交體8.含有結合cro的辣根過氧化物酶(hrp)的管9.含有hrp染色底物的管10.Tris緩沖液鹽水100ml11.小刀12.反應管A、B、C，每個管含有250ml蒸餾水13.醫(yī)用滴管B.檢測方法(a)用在tris緩沖液鹽水中重組產(chǎn)生的NF-kB溶液(項2)1mg/ml，浸沒微量滴定板(項1)，4℃下旋轉過夜。
(b)用小刀(相11)刺破手指取出三滴試驗者的血，在A、B、C反應管(項12)中各懸浮一滴血。
(c)在每個管中用醫(yī)用滴管(項12)懸浮一滴蛋白酶溶液(項6)，振動管，靜置5分鐘。
(d)用醫(yī)用滴管在管A-C的每個管中滴一滴核酸酶溶液(項5)，振動管，然后靜置10分鐘。
(e)把一滴項3的溶液加入管A中(試驗樣品)；一滴項4的溶液滴入管B中(陽性對照)；一滴鹽水(項12)加入管C中(陰性對照)。將管在熱水中加熱至50℃，然后經(jīng)一小時冷卻至室溫。
(f)雜交可在步驟(d)中發(fā)生時，從表面和微量滴定板上除去多余的蛋白(步驟(a)中)，用Tris緩沖液鹽水沖洗盤子(管10)。
(g)從步驟(e)始把管A-C中的樣品轉移到有3個微孔的微量滴定板中，放置1個小時，不斷搖動。
(h)用Tris緩沖液鹽水沖洗含有管A-C內容物的微量滴定板微孔，再倒空。
(i)把一滴項7的溶液加入到每個微孔中，與結合在盤上的任何1/2 BBR雜交，一小時后，再用Tris緩沖液鹽水沖洗三次。
(j)把一滴項8的溶液加入到每個微孔中，使cro可以與任何附著的BNAs結合，10分鐘后，然后再用1毫升Tris緩沖液鹽水洗脫5次。
(k)在每個微孔中加入一滴hrp底物，顏色反應即可發(fā)生。
C.結果如果微孔A和B都顯出顏色反應，而微孔C中無顏色反應，檢驗結果有效，被檢對象感染了愛滋病。如果僅僅微孔A顯示顏色反應，或者微孔C顯出顏色反應，則檢驗的操作不正確，結果無效。如果微孔A和C不顯示顏色反應但是微孔B顯示顏色反應，則該檢驗有效，該個體沒有感染愛滋病。
實施例7-各種新型TBA的產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的新型TNA按如下過程制備(a)NFkB/NF-kB(HIV-Detect I).把編碼任意一種SEQ ID NOS.63-71或一種類似于NF-kB DNA結合蛋白的核酸以讀框形式融入到另一個編碼裝配序列，如cro的核酸序列上，這樣NF-kB DNA識別序列可在cro序列的氨基端或者羧基端編碼。在NF-kB序列和cro序列之間可以提供也可以不提供一個接頭序列。在cro的另一端，可以提供也可以不提供一個核定位序列，例如SEQ ID NOS.72。并且，在cro末端可以提供也可以不提供不被NF-kB識別序列利用的不對稱序列。完整的TNA序列的例子如下所示。
(b)NF-kB/SP1(HIV-Detect II).以上文(a)中描述的相似方式，制備一個編碼一個NF-kB識別區(qū)的重組編碼序列。在另一個構建中，包括編碼SP1 DNA識別部分的編碼序列而不是SEQ ID NOS.63-72。這一序列編碼SEQ ID NOS.73的序列的所有部分或功能部分，這部分是具有DNA結合功能的SP1轉錄因子的組成部分(參見Kadonaga等細胞511079-1090)。把NF-kB編碼載體和SP1-編碼載體共轉染到一個適合的表達系統(tǒng)，這種表達系統(tǒng)是本領域公知的。在SP1和NF-kB識別單位通過陪伴裝配之后，加入單體的NF-kB識別單位以完成NF-kB識別二聚體的聚合。不對稱序列阻止NF-kB或SP1二聚體的形成，相反卻指導NFKB-SP1異源二聚體的形成(即，愛滋病-檢測II)，然后通過本領域已知的方法把這種異源二聚體從表達系統(tǒng)(哺乳動物或細菌細胞)中分離出來。
(c)SP1/SP1 TBA(HIV-DetectIII).如上文(b)所述，制備SP1-編碼的TBA構建體。但是，只有把構建體轉染到表達系統(tǒng)時，才具有允許SP1-SP1二聚體形成的不對稱序列。
(d)SP1-TATA(HIV-Detect IV).如上文(b)所述，產(chǎn)生SP1-編碼的TBA重組體。此外，用和SP1 TBA-編碼的構建體中的序列互補的不對稱序列制備了編碼具有結合序列的TBA的重組序列，SEQ ID NO.74或其它編碼TATA結合位點的序列。通過標準的方法把這些構建體共轉染并把異源二聚體分離出來，這些方法包括在具有適當?shù)腟P1-TATA靶結合區(qū)的DNA柱上的親和純化法。
(e)SP1-E2(HPV-DetectI).按上文(b)所述的方法制備SP1-編碼的構建體，通過利用編碼SEQ ID NO.75-84和94-98任何一個的序列(這些序列是乳頭狀瘤病毒E2 DNA識別位點(見Hegde等)自然，359505-512)或其它識別位點)，制備一種E2 TBA-編碼的構建體并把其和編碼SP1 TBA的構建體共轉化或共轉染。在E2-SP1識別單位通過陪伴裝配之后，加入單體E2識別單位以形成完整的E2識別二聚體。按照已知的方法把異源二聚體分離出來。
(f)E2-E2(HPV-Detect II)如上文(e)所述，制備E2 TBA-編碼的構建體，除了包含不對稱序列，這種序列允許E2二聚體的形成。然后把表達的二聚體用已知的方法分離出來，這些方法包括在DNA親和柱上用于二聚的E2的結合位點的親和純化方法。
(g)E2-TATA(HPV-Detect IV)如上文(e)和(d)所述，分別制備結合TBA的E2和TATA，除了包含不對稱序列，這些序列能促進異源二聚體而不是同源二聚體的形成。然后，使這些構建體共表達并分離異源二聚體。
(h)TATA-TATA(HPV-Detect IV) 如(a)和(d)中所述，通過使用促進同源二聚體形成的不對稱序列制備和TBA-編碼的構建體結合的TATA，同時分離同源二聚體。
(i)其它TBA如上文所述關于HIV和HPV的TBA，任何關于病原體或疾病狀態(tài)的TBA都可通過鑒定特定DNA結合蛋白，以及通過使用合適接頭、裝配體和不對稱序列而形成表達構建體來制備。
實施例8以實施例5所述的類似分析方式，通過使用實施例6中制備的雙鏈NF-kB-SP1結合蛋白而產(chǎn)生一種更嚴格的分析方法。因此，可以加長圖7所示和實施5所使用的探針以縮小探針間距離從而減少TNA中DNA的自由度。
實施例9-“高級”TBA的產(chǎn)生通過恰當使用不對稱序列，產(chǎn)生TBA，這些TBA是特定DNA識別單位的二聚體，三聚體，四聚體，五聚體或六聚體。在這一方式中，產(chǎn)生一個六聚體TBA，先要通過使用能夠促進二聚體形成的不對稱序列產(chǎn)生一個NF-kBp50二聚體TBA。此外，這個不對稱序列可以促使這個p50二聚體與一個SP1-SP1二聚體四聚化。最后，另外加入不對稱序列指導具有核定位序列的二聚體參入而形成一個六聚體。這個過程的完成是通過加入，例如，胰島素的不對稱序列，其實質上形成六聚體。SEQ ID NOS.-85(A)和86(B)、87(A)和88(B)、89(A)和90(B)、以及91(A)和92(B)(參與圖13和14)指導這一六聚體的形成。
因為其對HIV-LTR有非常高的親合力，可以通過使用一個多聚的TBA來產(chǎn)生此六聚體，具有這種結構并用于此目的多聚體化合物本文稱為“HIV-Lock”。
最佳HIV-Lock是通過結合在HIV-LTR的TBR上的TBA的足跡法(按照本領域公知的方法)來定義的，用這種方法來證實對多聚的TBA復合體的形成具有貢獻的每個DNA結合蛋白的結合親合力，參照能衍生出TBA的DNA結合識別單位的任意自然靶序列(如CNA)的親合力而下移。任何對HIV TBA親合力的并發(fā)丟失都可通過下述的聚合物形成而得到極大地補償。
TBA每個組份與其TBR的結合和通過不對稱序列形成二聚體的裝配過程存在競爭。這種競爭可以通過在每個TBA組份中調整陪伴和不對稱序列之間的接頭而解除，這樣就解開了這些競爭過程。所造成的TBA不對稱性和裝配組份在擴散方向上的降低(增加了有效濃度)導致了多聚復合體有效地形成。
在足跡的基礎上，調整接頭的長度和組成以便更好地區(qū)別靶HIV序列和自然序列。在這種方式下，雖然每個TBA組份將對CNA和TBR序列具有低親合性，但聚合的復合體將對現(xiàn)已擴展的多聚復合體識別的TBR具有更高的親合力(是TBA聚合物每個組份識別的TBR的親合力的平方)，同時對CNA仍具有低親合力。以同樣方式，制備除HIV-Lock以外的其它多聚的TBA復合體。
以這種方式產(chǎn)生的TBA包括如下序列，它們可以通過連接蛋白亞單位或編碼這些亞單位的核酸序列而裝配起來，如下所示組合(set)連接的序列組AI+II+IIIBIV+V+IIICIV+III其中I-V組所包括的序列選自組所選自的序列I SEQ ID NO.8 5-92的任何序列IIMet Ser，連接到SEQ ID NO.104-106的任何序列上，其各自連接到SEQ ID NO.99上。
III 連接到SEQ ID NO.75-84或94-98之任一上的SEQ ID NO.100，連接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ ID NO.
101；或連接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ IDNO.102；或者SEQ ID NO.72，103，73，或63-71的任何序列。
IVSEQ ID NO.104-106的任何序列V SEQ ID NO.99。
這樣的TBA的具體例子是SEQ ID NO.109-116，按如下裝配
以這種方式，通過在合適的不對稱序列、裝配序列和DNA的識別單位之間進行選擇，可以形成許多不同的TBA。并且，這些系列，例如SEQ ID NO.114和115，將和非SEQ ID NO.114或115的二聚體的其它序列結合，由于在突變裝配序列中的電性排斥作用不會形成二聚體(SEQ ID NO.104是cro；SEQ ID NO.105是一個新型突變的，負電性的cro，SEQ ID NO.106是一個新型突變的正電性的cro)。
當然，對于給定的這些TBA的氨基酸順序，本領域的一般技術人員可以生產(chǎn)出編碼這些序列的核酸克隆，而這些重組克隆自然是本發(fā)明的組成部分。
實施例10-用“HIV-LOCK”檢測HIV以與實施例6非常相似方法，用實施例9產(chǎn)出的“HIV-LOCK”作為TBA，試劑2，得到類似結果。
實施例11-用“HIV-LOCK”對損獻血樣進行HIV檢測當不限制待測血的質量時，檢驗捐獻的血樣是否有HIV污染，使用類似實施例6的檢驗，但是對A-C的每個管，把約5毫升血樣在桌式離心機上離心沉淀下來。其它試劑用量根據(jù)需要按比例加大以便于處理樣品中大量的TNA。
實施例12-作為抗HIV治療劑的“HIV-LOCK”把按照實施例9產(chǎn)生的“HIV-LOCK”在脂質體中制成1mg/ml的溶液，然后將其靜脈注射到通過檢測已確認感染HIV的個體中。注射劑量為每千克體重約0.1mg至100mg的“HIV-LOCK”，24小時后，監(jiān)測病人血清中的HIVp24的濃度。有必要經(jīng)常重復這種治療，如血清中p24水平上升時。
實施例13-HIV-TBA構建體作為治療劑的使用使用重組逆轉錄病毒或類似載體把一個編碼結合TBA的HIV-LTR的構建體傳送到感染的病人身上。載體編碼陪伴，如cro，和用于p50結合部分的DNA序列。同樣的載體還編碼一個陪伴，SP1 TBA在其上折疊。提供不對稱序列，以便當p50-TBA和SP1-TBA共同在一個HIV感染的細胞中進行體內表達后，這些TBA之間立即進行結合，同時防止任何在p50 DNA結合區(qū)與體內p50或p65單體之間的結合。在TBA中也提供了NLS，以便一旦形成二聚體，TBA快速定位至細胞核中并與整合的HIV序列特異性結合，于是防止了任何從那個位點的轉錄。
為了此目的，需要選擇編碼DNA結合區(qū)的序列以便把表達的單體裝配在不結合到人體自然序列的TBA上。這樣，只有當TBA的組分和其靶序列結合后，TBA的所有組分間才能結合，形成一個能夠緊密地特異性地結合HIV-LTR的復合體。
實施例14-用于人類乳頭狀瘤病毒的診斷試劑盒用于人類乳頭狀瘤病毒的這種診斷劑利用了已知的有差異的良性和惡性HPV，提供了一個能表明病人體內惡性腫瘤的敏感性的檢測手段。人類乳頭狀瘤病毒是一組與高等脊髓動物良性扁形上皮細胞腫痛相關的小DNA病毒。至少已發(fā)現(xiàn)了27種不同類型的HPV；其中許多和特定的醫(yī)療損害相關。其中有5種，HPV-6，HPV-11，HPV-16，HPV-18和HPV-33和人生殖道的損傷相關?？偟膩碚f，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HPV-6和HPV-11的DNA與生殖道的良性損傷相關。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HPV-16，HPV-18和HPV-33與預惡性和惡性損傷相關，并且能在大多數(shù)由子宮頸腫瘤細胞系產(chǎn)生的細胞中轉錄。HPV-16，HPV-18和HPV-33可能僅是一大系列與惡性人子宮頸腫瘤相關的HPV DNAs的2個成員。
動物模型表明良性乳頭狀瘤病毒損傷可以在一個輔致癌物質存在的情況下發(fā)展成為惡性損傷。已經(jīng)在子宮頸腫瘤的轉移瘤中發(fā)現(xiàn)了HPV DNA。在惡性子宮頸腫瘤損傷中，HPV DNA一般整合在人基因組上，但也有一些染色體外的HP VDNA存在。HPV的整合形成原病毒，一般導致病毒E2開放閱讀框架(ORF)的破裂。盡管使E2開放閱讀框架破裂，對幾個子宮頸癌細胞系的檢查顯示了其的轉錄活性并整合了HPV-16和HPV-18。檢測存在于人子宮頸癌細胞系SiHa和CaSKi中的HPV-16基因組時，發(fā)現(xiàn)HIV-16的整合存在差異。在SiHa細胞系中，單一HPV-16基因組的整合發(fā)生在堿基3132和3384之上，E1和E2 ORFs的破壞是缺失了0.3KB的序列。另外50個堿基在HPV-16DNA上的缺失，造成了E2和E4 ORFs的融合。HPV-16DNA的5′部分，包括損壞了的E2 ORF，連接到連續(xù)的人右端序列上。另外，在E1 ORFs中間的1138位上檢測到了單一添加的鳥嘌呤。堿基的添加使E1a和E1b ORFs融合成一個單一E1 ORFs。
可以在基因庫中得到HPV-16的完整基因組，保藏號為K02118；可以在基因庫中得到HPV-33的完整基因組，保藏號為M12732；可以在基因庫中得到HPV-18的完整基因組，保藏號為X05015。
作為初始篩選，對于一個給定的子宮頸活體檢查樣品的HPV感染事實的確定是通過使用，例如PNA SEQ ID NO.46-53的任何一個或全部和一個上述的E2TBA的簡單“是/不是”的分析類型建立起來。(即片斷DNA，結合PNA，用TBA固定，和用BNA和BBA進行檢測)。
一旦發(fā)現(xiàn)活組織檢查的樣品呈現(xiàn)HPV陽性反應，通過分析病毒在人基因組的整合狀態(tài)來獲得關于HPV惡化可能的額外信息。
1.把宮頸活組織檢查樣品的DNA切成片斷，雜交到具有SEQ ID NO.60序列的阻斷探針上。這一探針和未切出0.3kb片段的所有DNA片段結合。
2.將活組織檢查樣品中的DNA暴露給具有SEQ ID NO.61序列的PNA。該探針只和缺失0.3kb片段的DNA片段結合(如果存在大的缺失片段，阻礙探針將阻礙其環(huán)出)。
3.具有SEQ ID NO.62序列的PNA與SEQ ID NO.41序列雜交形成一個BBR，這種BBR再與作為BBA的cro或λCI阻抑蛋白結合，留下一條能與SEQID NO.61序列上TATA位點雜交的單鏈段。這有助于在缺失的大段序列5′端形成TBR。
4.用具有TATA結合蛋白DNA識別單位的TBA固定TBR。
5.通過加入上述的BNA和BBA來檢測結合的片斷。
該分析的檢測信號表明存在于TNA的HPV上有大片段DNA缺失。既然這種缺失與惡性化有關，此分析方法使得能深入了解HPV感染惡化的可能。通過進行基于這52-堿基片段缺失的類似分析可以證實這一結論，這段堿基片斷和HPV-誘導的惡性化有關。
可以選擇用于TBA的TBP識別單位來用于此分析，如，從SEQ ID NO.70和SEQID NO.93中進行選擇。
實施例15-重組HIV-LOCKTM的產(chǎn)生第一階段制備用以產(chǎn)生HIV-LOCKTM的DNA.通過使用MutaGene的噬菌粒試劑盒來完成自然發(fā)生并已克隆的需要修飾的HIV-LOCKTM的組份。修改流程包括使用一個含有HIV-LockTM的每一個結合組份的Blue-script質粒。把這些質粒轉化到感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)含有尿嘧啶的噬菌粒。提取單鏈DNA并作為突變鏈的模板。合成包括所需突變(突變中包含并入一個新的限制酶切位點)的寡聚核苷酸，然后再用多聚核酸激酶和ATP處理。激酶處理過的寡聚核酸退火后和單鏈模板結合，按照MutaGene的程序(只是測序酶2.0作為聚合酶)合成和連接一條突變鏈。使用32P末端標記的與所導入的突變互補的核酸和通過分離這種質粒DNA及用導入的限制酶切位點鑒別突變體來篩選文庫。也可以通過測序酶試劑盒進行測序來證實突變。用多面體啟動子把HIV-LockTMDNA克隆到桿狀病毒的表達系統(tǒng)中。
第二階段使用桿狀病毒產(chǎn)生HIV-LockTM蛋白.把Sf-9細胞培養(yǎng)至預定的密度(約1×106細胞/ml，Log指數(shù)期)，用含有HIV-LockTM構件的桿狀病毒感染培養(yǎng)的細胞，然后收集含有HIV-LockTM的重組蛋白。在大規(guī)模產(chǎn)生中，細胞培養(yǎng)從燒瓶擴大到旋轉器而后到生物反應器。感染后的第12，24，36和48小時時收集細胞以便提取蛋白。在整個過程中監(jiān)測細胞存活指數(shù)。
第三階段--純化HIV-LockTM蛋白.為了方便下面的純化，首先通過最大限度超速沉降離心把要收集的蛋白從微粒中分離出來。然后離心的產(chǎn)物經(jīng)過濾消毒。提取物在4℃下以40,000rpm的速度離心約30分鐘，等分試樣再通過抗一種HIV-LockTM組份的多克隆兔抗體進行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白在10％SDS PAGE凝膠上電泳。
第四階-針對于HIV DNA的HIV-LockTM蛋白的檢測。通過使用含有HIV長末端重復序列組份的寡聚核苷酸探針和含有和Kappa輕鏈和微球蛋白調節(jié)相關的NFKB結合的DNA的片段，進行遷移率變動分析。寡聚核苷酸退火后和其互補鏈結合并且末端用32P-ATP標記。
室溫下通過在緩沖液混合少量(10-15M)放射性標記的HIV LTR DNA和稍大量的HIV-LockTM，10分鐘進行足跡法檢測。在加入蛋白之前加入二疏基乙醇。加入EDTA鐵(二價)、過氧化氫和抗壞血酸鈉然后培養(yǎng)反應混合物。加入熄滅劑，產(chǎn)物用變性膠電泳方法分析。這是依據(jù)不同蛋白濃度而操作的。把得到的凝膠用磷酸圖像掃描儀作圖，分析得到的高分辨度圖象資料，提煉出與細胞DNA相關的HIV-LockTM與HIV DNA的結合親合力。
可以使用多種設計和檢測重復以發(fā)現(xiàn)HIVLockTM和其它用于HIV及其它生物體的TBA的結合。這一過程使設計結合裝配體成為可能，這種結合裝配體不和野生型蛋白競爭基因組樣品中的單一結合位點。用于其它生物體的TBA以及用于這些生物體體內序列的TNA可以通過使用前面所述的方法來產(chǎn)生。當要產(chǎn)生所有核酸的TBR時(包括DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜交體以及這些雜交體的組合)，這種方法是有效的。
實施例16-為了產(chǎn)生本發(fā)明的TBA和BBA，鑒別核酸結合分子的方法在本發(fā)明的方法中，靶結合裝配體和輔助結合裝配體的裝配是通過鑒別核酸結合分子，和以一種能得到區(qū)別特定靶序列和非常相關序列的TBA的方式連接該分子的核酸結合部分。一種鑒定核酸結合分子的方法包括如下步驟1.獲得含有靶核酸的生物樣品。這種樣品可以是，例如，感染病原體的一種生物體或組織提取物。
2.破碎樣品以使核酸暴露出來，同時降低樣品中核酸大小的復雜程度。
3.把第一等分切成片斷的核酸加入到對照緩沖液介質中，再把第二等分的樣品加入到含有已知分布型的核酸結合分子的對照緩沖液介質中。
4.分析兩個等分試樣以鑒定含有靶結合分子的試樣相對于對照試樣，行為發(fā)生改變的片斷。這個過程可以通過單相凝膠電泳，雙相凝膠電泳，高壓液相色譜，紙色譜或任何可以揭示和核酸結合分子結合的核酸片斷(相對于沒有結合的核酸片斷)的不同行為的方法來完成。
5.鑒定和分離那些當和核酸結合分子相接時行為的確發(fā)生改變的核酸片斷和，或對核酸結合片斷進行測序以確定是否存在已知的核酸結合分子基元，或直接鑒定結合在核酸片斷上的核酸結合分子。后者可以通過，例如，把電泳核酸的雙相框架和能夠結合不同核酸結合分子的不同標記的抗體接觸來完成。
在此方法中，優(yōu)選使用核酸基元作為診斷或治療的目的，其中的靶核酸有不止一個可利用的核酸結合分子靶。以這種方式，可以產(chǎn)生復雜的靶結合裝配體，利用鄰近的不同核酸結合分子類型以增強由該個體鑒定的核酸結合組份裝配的TBA的特異性。然后把核酸結合分子的各個核酸結合部分裝配成一個上述的完整的TBA，例如HIV-LockTM。
實施例17-鑒定樣品中特定RNA序列的方法按照本發(fā)明的方法和組合體可以特異性地鑒定任何核酸序列。樣品中靶HIV RNA的鑒定是通過獲得含有HIV RNA的病人血樣或其它生物液體或提抽物樣品，然后檢測TAR的結合位點來完成的。Tat是一個HIV復制的正調節(jié)因子，其和HIV RNA的TAR區(qū)結合。以最小的自然生成機率，完全具有活性的HIV-Tat形式含有72個氨基酸，本文的SEQ Id NO.118。Tat至少具有2個功能區(qū)，和反式激活來源于HIV長末端重復序列(HIV LTR)的基因表達。Tat和TAR中的自雜交序列形成的RNA莖環(huán)結構結合，莖環(huán)結構恰在HIV LTR的5′端。HIV TAR RNA形成一個兩核苷酸突起和兩個莖環(huán)結構(Rhim等1994病毒學202，202-211)。Tat(SEQ Id.118)結合在比Tat突變體具有更低的親合力的結構上，Tat的這種突變體，其中58位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸或65位組氨酸突變?yōu)樘於彼帷?Derse等1993，病毒學194，530-536)。本發(fā)明中這些過程的使用如下1.切斷生物樣品使核酸暴露出來，同時降低核酸大小復雜性。
2.將TBA與鑒定TAR結合蛋白序列的雜交體和HIV基團組中鄰近端的側面序列的樣品接觸。用于此目的TBA是裝配到利用Tat作為HIV RNA特異性結合分子的cro陪伴上。為了提供特異性，例如HIV TAR位點和與其緊密相關的由于其它病原體如巨細胞病毒的存在而出現(xiàn)的TAR位點間的交叉作用，TBA還具有一個識別DNA-RNA雜交體此靶的抗體組份，這種靶結合區(qū)是在探針核酸和HIV LTR RNA結合后產(chǎn)生的。
3.通過用過量的具有更高親合力的Tat異變體(58位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸或65位組氨酸突變?yōu)樘於彼?和反應物接觸，消除由于Tat結合到由污染物(表親RNAs)如CMV TAR序列而形成的HIV RNA的TAR區(qū)所引起的交叉作用。通過這種方法，由于TBA結合到一個表親RNA而形成的單一結合過程就會被來自Tat異變體的核酸樣品競爭下來。另一方面，通過恰當選擇由抗體和Tat引起的雙重結合的親合力，不會從真正的靶序列上把TBA置換下來。圖16具體說明了此過程。同樣方法的另一方面，TBA可以是這樣一種物質，其上可以使用能夠識別核酸片斷的抗體，而不是使用Tat的突變體，并且使用的TBA可以是雙抗體TBA。
本方法的另一種形式，可以使用和HIV LTR RNA雜交的核酸探針。因此，可以產(chǎn)生LTR sp1位點的雙鏈片斷，用作靶結合區(qū)的一部分。HIV RNA區(qū)在位于LTR5′端但和其更靠近的TAR區(qū)的側面。把含有Tat和2個Sp1結合位點的TBA裝配以提供Tat結合TAR以及Sp1結合Sp1的結合位點。然后通過加入適當?shù)腂NA、BBA和HNAs而進行擴增和檢測。在另外一種情況下，可以使用Seq.ID.38和Seq.ID.39(見圖7)的PNA。使用一個含有一個或多個Sp1結合單位和一個抗體單位的TBA，用來結合由樣品RNA和Seq.ID.38 PNA而產(chǎn)生的DNA-RNA雜交體。然后加入適當?shù)腂NA、BBA和HNAs以便擴增信號。
自然，本領域的技術人員會認識到可以使用其它TBA和TNA的組合來優(yōu)化本文所例舉的方法。
應該理解，本文所描述的實施例和實施方案只是為了具體說明本發(fā)明，本領域的技術人員可以根據(jù)其進行修改和變化，并且這些修改和變化包含在本申請的精神和范圍內以及所附的權利要求書的范圍內。應該理解本文所提供的序列只是作為示范，并且其它受到這些序列提示的類似序列也可以在本發(fā)明的方法中使用。應該理解盡管本文提供的序列可以設計成線性，但可以以環(huán)狀或其它替換性形式使用，同時，盡管這些序列不是作為反義鏈而設計的，但是可以以編碼或非編碼形式或者和編碼或非編碼互補序列結合的形式使用。
序列表(1)一般信息(i)申請人申請人名稱THE GENE POOL，INC.
街道地址300 Queen Anne Ave.N.，Suite 392城市Seattle州/省華盛頓國家美國郵編98109-4599電話號碼(206)526-8617傳真號(ii)發(fā)明名稱用特異性序列組合物檢測核酸的方法(iii)序列數(shù)118(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Saliwanchik&Saliwanchik(B)街道2421N.W.41st St.，SuiteA-1(C)城市Gainesville(D)州弗羅里達(E)國家美國(F)郵編32606(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25
(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Bencen，Gerard H(B)登記號35,746(C)參考/證書號GP-100.C1(ix)電訊信息(A)電話(904)375-8100(B)傳真(904)372-5800(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度13個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO1TGGGGATTCC CCA 13(2)SEQ ID NO2信息
(i)序列特征(A)長度13個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO2AAGGGACTTT CCC 13(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度13個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO3AGGGGACTTT CCG 13(2)SEQ ID NO4信息
(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO4GCTGGGGACT TTCCA15(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO5ACAAGGGACT TTCCG15(2)SEQ ID NO6信息
(i)序列特征(A)長度13個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO6CCGGGTTTTC CCC13(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO7AAGGGACTTT CCGCTGGGGA CTTTCCA27(2)SEQ ID NO8信息
(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO8AAGGGACTTT CCGCTGGGGA CTTTCCG 27(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO9GCTGGGGACT TTCCAGGGAG GCGTGG26(2)SEQ ID NO10信息
(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO10GCTGGGGACT TTCCAGGGGA GGTGTG26(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO11GCTGGGGACT TTCCGGGGAG CGTGGC26(2)SEQ ID NO12信息
(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO12GCTGGGGACT TTCCGGGGAG GCGCGG26(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO13GCTGGGGACT TTCCAGAGAG GCGTGG26(2)SEQ ID NO14信息
(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO14GCTGGGGACT TTCCAGGGGA GGCGTG26(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO15GCTGGGGACT TTCCAGGGAG GCGTGG26(2)SEQ ID NO16信息
(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO16GCTGGGGACT TTCCAGGGAG GCTGCC 26(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO17TTTCCAGGGA GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGG 33(2)SEQ ID NO18信息
(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO18CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGT CCC33(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO19CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCT(2)SEQ ID NO20信息
(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO20CAGCAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGTG TGGCCT46(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO21CATCAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGTG TGGCCT46(2)SEQ ID NO22信息
(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO22CAACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGTG TGGCCT46(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO23CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCAT(2)SEQ ID NO24信息45
(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO24CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC GGGGAGCGTG GCCT44(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO25CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC GGGGAGGCGC GGCT44(2)SEQ ID NO26信息
(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO26CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGAGAGGCGT GGACT45(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO27CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGGAGGCG TGGACT46(2)SEQ ID NO28信息
(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO28CTACAGGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGGGAG46(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO29CTACAGGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCTG CCT43(2)SEQ ID NO30信息
(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO30CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGG48(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO31TTTCCAGGGA GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGGGAGTGGC GTCCC45(2)SEQ ID NO32信息
(i)序列特征(A)長度59個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO32CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGGG59(2)SEQ ID NO33信息(i)序列特征(A)長度59個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO33TTTCCGCTGG GGACTTTCCA GGGAGGCGTG GCCTGGGCGG GACTGGGGAG TGGCGTCCC59(2)SEQ ID NO34信息
(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO34CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGGGA60GTGGCGTCCC 70(2)SEQ ID NO35信息(i)序列特征(A)長度61個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO35
TATCACCGCC AGTGGTATTT ATGTCAACAC CGCCAGAGAT AATTTATCAC CGCAGATGGT60T61(2)SEQ ID NO36信息(i)序列特征(A)長度64個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO36TATCACCGCA AGGGATAAAT ATCTAACACC GTGCGTGTTG ACTATTTTAC CTCTGGCGGT60GATA64(2)SEQ ID NO37信息(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA
(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO37CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGCGT GGCCTGGGCG GGACTGGGGA60GTGGCGTCCC 70(2)SEQ ID NO38信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO38CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGG37(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO39CGGGACTGGG GAGTGGCGTC CC22(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特征(A)長度103個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO40CTACAAGGGA CTTTCCGCTG GGGACTTTCC AGGGAGGTAT CACCGCCAGT GGTATTTATG60TCAACACCGC CAGAGATAAT TTATCACCGC AGATGGTTCT GCA 103(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特征(A)長度62個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓撲學線性(ii)M_(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO41GAACCATCTG CGGTGATAAA TTATCTCTGG CGGTGTTGAC ATAAATACCA CTGGCGGTGA60TA 62(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO42GATCCAACCA TCTGCGGTGA TAAATTATCT CTGGCGGTGT TGACATAAAT ACCACTGGCG60GTGATACTGC A 71(2)SEQ ID NO43信息
(i)序列特征(A)長度63個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO43GTATCACCGC CAGTGGTATT TATGTCAACA CCGCCAGAGA TAATTTATCA CCGCAGATGG60TTG 63(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO44GATCCGGGGG GATACCCCCC G 21
(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特征(A)長度91個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO45CGGGACTGGG GAGTGGCGTC CCTATCACCG CAAGGGATAA ATATCTAACA CCGTGCGTGT60TGACTATTTT ACCTCTGGCG GTGATAGCAT G91(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否
(xi)序列描述SEQ ID NO46CTAAGGGCGT AACCGAAATC GGTTGAACCG AAACCGGTTA GTATAAAAGC AGA53(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特征(A)長度54個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO47AAAAGGGAGT AACCGAAAAC GGTCGGGACC GAAAACGGTG TATATAAAAG ATGT54(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特征(A)長度54個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否
(xi)序列描述SEQ ID NO48AGTAGGGTGT AACCGAAAGC GGTTCAACCG AAAACGGTGC ATATATAAAG CAAA54(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO49GCTTCAACCG AATTCGGTTG CATG24(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否
(xi)序列描述SEQ ID NO50TGTGCAACCG ATTTCGGTTG CCTT 24(2)SEQ ID NO51信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO51TATGCAACCG AAATAGGTTG GGCA24(2)SEQ ID NO52信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否
(xi)序列描述SEQ ID NO52TGCCTAACCG TTTTCGGTTA CTTG(2)SEQ ID NO53信息 24(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO53GGACTAACCG TTTTAGGTCA TATT 24(2)SEQ ID NO54信息(i)序列特征(A)長度52個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否
(xi)序列描述SEQ ID NO54GACGACTATC CAGCGACCAA GATCAGAGCC AGACACCGGA AACCCCTGCC AC 52(2)SEQ ID NO55信息(i)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO55GACGACACGG TATCCGCTAC TCAGCTTGTT AAACAGCTAC AGCACACCCC CTC 53(2)SEQ ID NO56信息(i)序列特征(A)長度60個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否
(xi)序列描述SEQ ID NO56GACGACGACC TGCAGACACC ACAGACACCG CCCAGCCCCT TACAAAGCTG TTCTGTGCAG60(2)SEQ ID NO57信息(i)序列特征(A)長度68個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO57CATACCAAAG CCGTCGCCTT GGGCACCGAA GAAACACAAC CACTAAGTTG TTGCACAGAG60ACTCAGTG 68(2)SEQ ID NO58信息(i)序列特征(A)長度77個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無
(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO58TAATGTAATT GATTGTAATG ACTCTATGTG CAGTACCAGT ACCGTATTCC AGCACCGTGT60CCGTGGGCAC CGCAAAG 77(2)SEQ ID NO59信息(i)序列特征(A)長度80個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO59ACAGACAACG ATAACCGACC ACCACAAGCA GCGGCCAAAC ACCCCGCCTT GGACAATAGA60ACAGCACGTA CTGCAACTAA80(2)SEQ ID NO60信息(i)序列特征(A)長度266個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性
(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO60CATATGCAAT ACAATGCATT ATACAAACTG GACACATATA TATATTTGTG AAGAAGCATC 60AGTAACTGTG GTAGAGGGTC AAGTTGACTA TTATGGTTTA TATTATGTTC ATGAAGGAAT120ACGAACATAT TTTGTGCAGT TTAAAGATGA TGCAGAAAAA TATAGTAAAA ATAAAGTATG180GGAAGTTCAT GCGGGTGGTC AGGTAATATT ATGTCCTACA TCTGTGTTTA GCAGCAACGA240AGTATCCTCT CCTGAAATTA TTAGGC 266(2)SEQ ID NO61信息(i)序列特征(A)長度95個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO61AGGATGTATA AAAAAACATG GATATACAGT GGAAGTGCAG TTTGATGGAG ACATATGCTA 60TTAGGCAGCA CTTGGCCAAC CACCCCGCCG CGACC 95
(2)SEQ ID NO62信息(i)序列特征(A)長度81個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO62CATGTTTTTT TATACATCCA TATCACCGCC AGTGGTATTT ATGTCAACAC CGCCAGAGAT60AATTTATCAC CGCAGATGGT T 81(2)SEQ ID NO63信息(i)序列特征(A)長度322個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部
(xi)序列描述SEQ ID NO63Met Ala Asp Asp Asp Pro Tyr Gly Thr Gly Gln Met Phe His Leu Asn1 5 10 15Thr Ala Leu Thr His Ser Ile Phe Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Pro Glu20 25 30Ile Pro Leu Ser Thr Asp Gly Pro Tyr Leu Gln Ile Leu Glu Gln Pro35 40 45Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys Glu Gly Pro Ser His50 55 60Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys Ser Tyr Pro65 70 75 80Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala Lys Val Ile Val Gln85 90 95Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His Ala His Ser Leu Val100 105 110Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Val Cys Thr Val Thr Ala Gly Pro Lys115 120 125Asp Met Val Val Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His Val Thr Lys130 135 140Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu Ala Cys Ile145 150 155 160Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Ser Asp Leu Ala Tyr Leu165 170 175Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Thr Asp Arg Glu Lys Glu180 185 190Ile Ile Arg Gln Ala Ala Val Gln Gln Thr Lys Glu Met Asp Leu Ser195 200 205Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser Thr Gly Ser210 215 220Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile Tyr Asp Ser225 230 235 240Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met Asp Arg Thr245 250 255Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu Cys Asp Lys260 265 270Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu Glu Glu Asn275 280 285
Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr AsP Val His290 295 300Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Asp Val Asn305 310 315 320Ile Thr(2)SEQ ID NO64信息(i)序列特征(A)長度325個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO64
Met Ala Glu Asp Asp Pro Tyr Leu Gly Arg Pro Glu Gln Met Phe His1 5 10 15Leu Asp Pro Ser Leu Thr His Thr Ile Phe Asn Pro Glu Val Phe Gln20 25 30Pro Gln Met Ala Leu Pro Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Gln Ile Leu35 40 45Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys Glu Gly50 55 60Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys65 70 75 80Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala Lys Val85 90 95Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His Ala His100 105 110Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Ile Cys Thr Val Thr Ala115 120 125Gly Pro Glu Asp Cys Val His Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His130 135 140Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu145 150 155 160Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro Asp Leu165 170 175Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly Asp Arg180 185 190Glu Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys Glu Met195 200 205Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser210 215 220Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile225 230 235 240Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met245 250 255Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu260 265 270Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu275 280 285
Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr290 295 300Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys305 310 315 320Asp Ile Asn Ile Thr325(2)SEQ ID NO65信息(i)序列特征(A)長度268個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO65Met Glu Pro Ala Asp Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Gln Pro Glu Trp Gly1 5 10 15Glu Gln Glu Pro Gly Gly Ala Thr Pro Phe Val Glu Ile Leu Glu Gln20 25 30Pro Lys Gln Arg Gly Met Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser35 40 45Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu His Ser Thr Asp Ser Ala Arg Thr His50 55 60Pro Thr Ile Arg Val Asn His Tyr Arg Gly Pro Gly Arg Val Arg Val65 70 75 80
Ser Leu Val Thr Lys Asp Pro Pro His Gly Pro His Pro His Glu Leu85 90 95Val Gly Arg His Cys Gln His Gly Tyr Tyr Glu Ala Glu Leu Ser Pro100 105 110Asp Arg Ser Ile His Ser Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys115 120 125Lys Arg Glu Leu Glu Ala Ala Val Ala Glu Arg Ile Arg Thr Asn Asn130 135 140Asn Pro Phe Asn Val Pro Met Glu Glu Arg Gly Ala Glu Tyr Asp Leu145 150 155 160Ser Ala Val Arg Leu Cys Phe Gln Val Trp Val Asn Gly Pro Gly Gly165 170 175Leu Cys Pro Leu Pro Pro Val Leu Ser Gln Pro Ile Tyr Asp Asn Arg180 185 190Ala Pro Ser Thr Ala Glu Leu Arg Ile Leu Pro Gly Asp Arg Asn Ser195 200 205Gly Ser Cys Gln Gly Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val210 215 220Gln Lys Glu Asp Ile Glu Val Arg Phe Trp Ala Glu Gly Trp Glu Ala225 230 235 240Lys Gly Ser phe Ala Ala Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val245 250 255Phe Arg Thr Pro Pro Phe Arg Glu Arg Ser Leu Arg260 265(2)SEQ ID NO66信息(i)序列特征(A)長度263個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO66Met Asp Asp Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ser Glu Pro Ala Gln Ala1 5 10 15Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met20 25 30Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly35 40 45Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr Ile Lys Ile Asn50 55 60Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys Asp65 70 75 80Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys Arg85 90 95Asp Gly Tyr Tyr Glu Ala Asp Leu Cys Pro Asp Arg Ser Ile His Ser100 105 110Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Arg Asp Leu Glu Gln115 120 125Ala Ile Ser Gln Arg Ile Gln Thr Asn Asn Asn Pro Phe His Val Pro130 135 140Ile Glu Glu Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Asn Ala Val Arg Leu Cys145 150 155 160Phe Gln Val Thr Val Arg Asp Pro Ala Gly Arg Pro Leu Leu Leu Thr165 170 175Pro Val Leu Ser His Pro Ile Phe Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala180 185 190Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn Arg Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly195 200 205
Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile210 215 220Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser Phe Ser225 230 235 240Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro245 250 255Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln260(2)SEQ ID NO67信息(i)序列特征(A)長度263個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO67
Met Asp Glu Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ala Glu Pro Ala Gln Ala1 5 10 15Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met20 25 30Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly35 40 45Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr Ile Lys Ile Asn50 55 60Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys Asp65 70 75 80Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys Arg85 90 95Asp Gly Phe Tyr Glu Ala Glu Leu Cys Pro Asp Arg Cys Ile His Ser100 105 110Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Arg Asp Leu Glu Gln115 120 125Ala Ile Ser Gln Arg Ile Gln Thr Asn Asn Asn Pro Phe Gln Val Pro130 135 140Ile Glu Glu Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Asn Ala Val Arg Leu Cys145 150 155 160Phe Gln Val Thr Val Arg Asp Pro Ser Gly Arg Pro Leu Arg Leu Pro165 170 175Pro Val Leu Pro His Pro Ile Phe Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala180 185 190Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn Arg Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly195 200 205Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile210 215 220Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser Phe Ser225 230 235 240Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro245 250 255Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln260
(2)SEQ ID NO68信息(i)序列特征(A)長度299個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO68Met Phe Pro Asn Gln Asn Asn Gly Ala Ala Pro Gly Gln Gly Pro Ala1 5 10 15Val Asp Gly Gln Gln Ser Leu Asn Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Gln Gln20 25 30Gln Gln Gln Leu Ala Gln Ser Thr Lys Asn Val Arg Lys Lys Pro Tyr35 40 45Val Lys Ile Thr Glu Gln Pro Ala Gly Lys Ala Leu Arg Phe Arg Tyr50 55 60Glu Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Val Asn Ser Thr65 70 75 80Pro Glu Asn Lys Thr Tyr Pro Thr Ile Glu Ile Val Gly Tyr Lys Gly85 90 95Arg Ala Val Val Val Val ser Cys Val Thr Lys Asp Thr Pro Tyr Arg100 105 110
Pro His Pro His Asn Leu Val Gly Lys Glu Gly Cys Lys Lys Gly Val115 120 125Cys Thr Leu Glu Ile Asn Ser Glu Thr Met Arg Ala Val Phe Ser Asn130 135 140Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Lys Asp Ile Glu Ala Ala Leu Lys145 150 155 160Ala Arg Glu Glu Ile Arg Val Asp Pro Phe Lys Thr Gly Phe Ser His165 170 175Arg Phe Gln pro Ser Ser Ile Asp Leu Asn Ser Val Arg Leu Cys Phe180 185 190Gln Val Phe Met Glu Ser Glu Gln Lys Gly Arg Phe Thr Ser Pro Leu195 200 205Pro Pro Val Val Ser Glu Pro Ile Phe Asp Lys Lys Ala Met Ser Asp210 215 220Leu Val Ile Cys Arg Leu Cys Ser Cys Ser Ala Thr Val Phe Gly Asn225 230 235 240Thr Gln Ile Ile Leu Leu Cys Glu Lys Val Ala Lys Glu Asp Ile Ser245 250 255Val Arg Phe Phe Glu Glu Lys Asn Gly Gln Ser Val Trp Glu Ala Phe260 265 270Gly Asp Phe Gln His Thr Asp Val His Lys Gln Thr Ala Ile Thr phe275 280 285Lys Thr Pro Arg Tyr His Thr Leu Asp Ile Thr290 295(2)SEQ ID NO69信息(i)序列特征
(A)長度261個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO69Met Asp Phe Leu Thr Asn Leu Arg Phe Thr Glu Gly Ile Ser Glu Pro1 5 10 15Tyr Ile Glu Ile Phe Glu Gln Pro Arg Gln Arg Gly Thr Arg Phe Arg20 25 30Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu His Ser35 40 45Thr Asp Asn Asn Lys Thr Phe Pro Ser Ile Gln Ile Leu Asn Tyr Phe50 55 60Gly Lys Val Lys Ile Arg Thr Thr Leu Val Thr Lys Asn Glu Pro Tyr65 70 75 80Lys Pro His Pro His Asp Leu Val Gly Lys Gly Cys Arg Asp Gly Tyr85 90 95Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Pro Glu Arg Gln Val Leu Ser Phe Gln Asn100 105 110Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Lys Asp Leu Lys Glu Ser Ile Ser115 120 125Leu Arg Ile Ser Lys Lys Asn Pro Phe Asn Val Pro Glu Glu Gln Leu130 135 140
His Asn Ile Asp Glu Tyr Asp Leu Asn Val Val Arg Leu Cys Phe Gln145 150 155 160Ala Phe Leu Pro Asp Glu His Gly Asn Tyr Thr Leu Ala Leu Pro Pro165 170 175Leu Ile Ser Asn Pro Ile Tyr Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala Glu180 185 190Leu Arg Ile Cys Arg Val Asn Lys Asn Cys Gly Ser Val Lys Gly Gly195 200 205Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Glu210 215 220Val Arg Phe Val Leu Gly Asn Trp Glu Ala Lys Gly Ser Phe Ser Gln225 230 235 240Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro Phe245 250 255Leu Gly Asp Ile Thr260(2)SEQ ID NO70信息(i)序列特征(A)長度262個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO70
Met Asp Phe Leu Thr Asn Leu Arg Phe Thr Glu Gly Ile Ser Glu pro1 5 10 15Tyr Ile Glu Ile Phe Glu Gln Pro Arg Gln Arg Gly Met Arg phe Arg20 25 30Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu His Ser35 40 45Thr Asp Asn Asn Lys Thr Phe Pro Ser Ile Gln Ile Leu Asn Tyr Phe50 55 60Gly Lys Val Lys Ile Arg Thr Thr Leu Val Thr Lys Asn Glu Pro Tyr65 70 75 80Lys Pro His Pro His Asp Leu Val Gly Lys Gly Cys Arg Asp Gly Tyr85 90 95Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Pro Glu Arg Gln Val Leu Ser Phe Gln Asn100 105 110Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Lys Asp Leu Lys Glu Ser Ile Ser115 120 125Leu Arg Ile Ser Lys Lys Ile Asn Pro Phe Asn Val Pro Glu Glu Gln130 135 140Leu His Asn Ile Asp Glu Tyr Asp Leu Asn Val Val Arg Leu Cys Phe145 150 155 160Gln Ala Phe Leu Pro Asp Glu His Gly Asn Tyr Thr Leu Ala Leu Pro165 170 175Pro Leu Ile Ser Asn Pro Ile Tyr Asp Asn Arg Ala Pro ASn Thr Ala180 185 190Glu Leu Arg Ile Cys Arg Val Asn Lys Asn Cys Gly Ser Val Lys Gly195 200 205Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile210 215 220Glu Val Arg Phe Val Leu Gly Asn Trp Glu Ala Lys Gly Ser Phe Ser225 230 235 240Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro245 250 255Phe Leu Gly Asp Ile Thr260
(2)SEQ ID NO71信息(i)序列特征(A)長度314個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO71Met Ser Asn Lys Lys Gln ser Asn Arg Leu Thr Glu Gln His Lys Leu1 5 10 15
Ser Gln Gly Val Ile Gly Ile Phe Gly Asp Tyr Ala Lys Ala His Asp20 25 30Leu Ala Val Gly Glu Val Ser Lys Leu Val Lys Lys Ala Leu Ser Asn35 40 45Glu Tyr Pro Gln Leu Ser Phe Arg Tyr Arg Asp Ser Ile Lys Lys Thr50 55 60Glu Ile Asn Glu Ala Leu Lys Lys Ile Asp Pro Asp Leu Gly Gly Thr65 70 75 80Leu Phe Val Ser Asn Ser Ser Ile Lys Pro Asp Gly GIy Ile Val Glu85 90 95Val Lys Asp Asp Tyr Gly Glu Trp Arg Val Val Leu Val Ala Glu Ala100 105 110Lys His Gln Gly Lys Asp Ile Ile Asn Ile Arg Asn Gly Leu Leu Val115 120 125Gly Lys Arg Gly Asp Gln Asp Leu Met Ala Ala Gly Asn Ala Ile Glu130 135 140Arg Ser His Asn Ile Ser Glu Ile Ala Asn Phe Met Leu Ser Glu Ser145 150 155 160His Phe Pro Tyr Val Leu Phe Leu Glu Gly Ser Asn Phe Leu Thr Glu165 170 175Asn Ile Ser Ile Thr Arg Pro Asp Gly Arg Val Val Asn Leu Glu Tyr180 185 190Asn Ser Gly Ser Glu Ser His Phe Pro Tyr Val Leu Phe Leu Glu Gly195 200 205Ser Asn Phe Leu Thr Glu Asn Ile Ser Ile Thr Arg Pro Asp Gly Arg210 215 220Val Val Asn Leu Glu Tyr Asn Ser Gly Ile Leu Asn Arg Leu Asp Arg225 230 235 240Leu Thr Ala Ala Asn Tyr Gly Met Pro Ile Asn Ser Asn Leu Cys Ile245 250 255Asn Lys Phe Val Asn His Lys Asp Lys Ser Ile Met Leu Gln Ala Ala260 265 270Ser Ile Tyr Thr Gln Gly Asp Gly Arg Glu Trp Asp Ser Lys Ile Met275 280 285Phe Glu Ile Met Phe Asp Ile Ser Thr Thr Ser Leu Arg Val Leu Gly290 295 300Arg Asp Leu Phe Glu Gln Leu Thr Ser Lys305 310
(2)SEQ ID NO72信息(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO72Cys Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Lys1 5 10 15Thr(2)SEQ ID NO73信息(i)序列特征(A)長度168個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部
(xi)序列描述SEQ ID NO73Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys1 5 10 15Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp20 25 30His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys35 40 45Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr50 55 60Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg65 70 75 80Ser Asp His Leu Ser Lys His Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly85 90 95Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly100 105 110Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr115 120 125Thr Asn Met Val Ala Met Glu Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg130 135 140Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln Ser145 150 155 160Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly Phe165(2)SEQ ID NO74信息(i)序列特征(A)長度181個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性
(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO74Ser Gly Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu1 5 10 15Gly Cys Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala20 25 30Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu35 40 45Pro Arg Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr50 55 60Gly Ala Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala65 70 75 80Arg Val Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys85 90 95Ile Gln Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu100 105 110Glu Gly Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu115 120 125Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu130 135 140Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg145 150 155 160Ala Glu Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly165 170 175Phe Arg Lys Thr Thr180
(2)SEQ ID NO75信息(i)序列特征(A)長度85個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO75Ser Cys Phe Ala Leu Ile Ser Gly Thr Ala Asn Gln Val Lys Cys Tyr1 5 10 15Arg Phe Arg Val Lys Lys Asn His Arg His Arg Tyr Glu Asn Cys Thr20 25 30Thr Thr Trp Phe Thr Val Ala Asp Asn Gly Ala Glu Arg Gln Gly Gln35 40 45Ala Gln Ile Leu Ile Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gln Arg Gln Asp Phe50 55 60Leu Lys His Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Asn Ile Ser Gly Phe Thr65 70 75 80Ala Ser Leu Asp Phe85
(2)SEQ ID NO76信息(i)序列特征(A)長度87個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO76Cys Pro Cys Leu Leu Ile Gly Thr Ser Gly Asn Gly Asn Gln Val Lys1 5 10 15Cys Tyr Ser Phe Arg Val Lys Arg Trp His Asp Arg Asp Lys Tyr His20 25 30His Thr Thr Thr Trp Trp Ala Val Gly Gly Gln Gly Ser Glu Arg Pro35 40 45Gly Asp Ala Thr Val Ile Val Thr Phe Lys Asp Gln Ser Gln Arg Ser50 55 60His Phe Leu Gln Gln Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Ser Ala His Gly65 70 75 80Val Thr Met Thr Val Asp Phe85(2)SEQ ID NO77信息(i)序列特征
(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO77Pro Pro Val Ile Cys Leu Lys Gly Gly His Asn Gln Leu Lys Cys Leu1 5 10 15Arg Tyr Arg Leu Lys Ser Lys His Ser Ser Leu Phe Asp Cys Ile Ser20 25 30Thr Thr Trp Ser Trp Val Asp Thr Thr Ser Thr Cys Arg Leu Gly Ser35 40 45Gly Arg Met Leu Ile Lys Phe Ala Asp Ser Glu Gln Arg Asp Lys Phe50 55 60Leu Ser Arg Val Pro Leu Pro Ser Thr Thr Gln Val Phe Leu Gly Asn65 70 75 80Phe Tyr Gly Leu(2)SEQ ID NO78信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽
(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO78Pro Pro Val Ile Leu Val Arg Gly Gly Ala Asn Thr Leu Lys Cys Phe1 5 10 15Arg Asn Arg Ala Arg Val Arg Tyr Arg Gly Leu Phe Lys Tyr Phe Ser20 25 30Thr Thr Trp Ser Trp Val Ala Gly Asp Ser Thr Glu Arg Leu Gly Arg35 40 45Ser Arg Met Leu Ile Leu Phe Thr Ser Ala Cys Gln Arg Glu Lys Pro50 55 60Asp Glu Thr Val Lys Tyr Pro Lys Gly Val Asp Thr Ser Tyr Gly Asn65 70 75 80Leu Asp Ser Leu(2)SEQ ID NO79信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部
(xi)序列描述SEQ ID NO79Pro Pro Val Val Cys Val Lys Gly Gly Ala Asn Gln Leu Lys Cys Leu1 5 10 15Arg Tyr Arg Leu Lys Ala Ser Thr Gln Val Asp Phe Asp Ser Ile Ser20 25 30Thr Thr Trp His Trp Thr Asp Arg Lys Asn Thr Glu Arg Ile Gly Ser35 40 45Ala Arg Met Leu Val Lys Phe Ile Asp Glu Ala Gln Arg Glu Lys Phe50 55 60Leu Glu Arg Val Ala Leu Pro Arg Ser Val Ser Val Phe Leu Gly Gln65 70 75 80Phe Asn Gly Ser(2)SEQ ID NO80信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO80Thr Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Ser Asn Cys Leu Lys Cys Phe1 5 10 15Arg Tyr Arg Leu Asn Asp Lys Tyr Lys His Leu Phe Glu Leu Ala Ser20 25 30
Ser Thr Trp His Trp Ala Ser Pro Glu Ala Pro His Lys Asn Ala Ile35 40 45Val Thr Leu Thr Tyr Ser Ser Glu Glu Gln Arg Gln Gln Phe Leu Asn50 55 60Ser Val Lys Ile Pro Thr Ile Arg His Lys Val Gly Phe Met Ser65 70 75 80Leu His Leu Leu(2)SEQ ID NO81信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO81Thr Pro Ile Val Gln Phe Gln Gly Glu Ser Asn Cys Leu Lys Cys Phe1 5 10 15Arg Tyr Arg Leu Asn Arg Asp His Arg His Leu Phe Asp Leu Ile Ser20 25 30Ser Thr Trp His Trp Ala Ser Ser Lys Ala Pro His Lys His Ala Ile35 40 45Val Thr Val Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Gln Arg Gln Gln Phe Leu Asp50 55 60Val Val Lys Ile Pro Pro Thr Ile Ser His Lys Leu Gly Phe Met Ser65 70 75 80Leu His Leu Leu
(2)SEQ ID NO82信息(i)序列特征(A)長度80個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO82Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser Leu Lys Cys Leu1 5 10 15Arg Tyr Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser20 25 30Thr Trp His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr35 40 45Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val50 55 60Ala Ile Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr ASh Thr Met Tyr65 70 75 80(2)SEQ ID NO83信息(i)序列特征
(A)長度80個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO83Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu1 5 10 15Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser20 25 30Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Tyr Lys His Lys Ser Ala Ile Val35 40 45Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln50 55 60Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile65 70 75 80(2)SEQ ID NO84信息(i)序列特征(A)長度81個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽
(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO84Ala Pro Ile Val His Leu Lys Gly Glu Ser Asn Ser Leu Lys Cys Leu1 5 10 15Arg Tyr Arg Leu Lys Pro Tyr Asn Glu Leu Tyr Ser Ser Met Ser Ser20 25 30Thr Trp His Trp Thr Ser Asp Ash Lys Asn Ser Lys Asn Gly Ile Val35 40 45Thr Val Thr Phe Val Thr Gly Gln Gln Gln Gln Met Phe Leu Gly Thr50 55 60Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Gln Ile Ser Thr Gly Phe Met Thr Leu65 70 75 80(2)SEQ ID NO85信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部
(xi)序列描述SEQ ID NO85Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20(2)SEQ ID NO86信息(i)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO86Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)SEQ ID NO87信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO87Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20(2)SEQ ID NO88信息(i)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO88Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)SEQ ID NO89信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO89Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Ile1 5 10 15Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys20(2)SEQ ID NO90信息(i)序列特征(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽
(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO90Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Ile Cys Gly Arg Glu Leu Val1 5 10 15Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser20 25 30Leu(2)SEQ ID NO91信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO91Glu Glu Lys Met Gly Thr Ala Lys Lys Cys Cys Ala Ile Gly Cys Ser1 5 10 15Thr Glu Asp Phe Arg Met Val Cys20
(2)SEQ ID NO92信息(i)序列特征(A)長度40個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO92Arg Pro Asn Trp Glu Glu Arg Ser Arg Leu Cys Gly Arg Asp Leu Ile1 5 10 15Arg Ala Phe Ile Tyr Leu Cys Gly Gly Thr Arg Trp Thr Arg Leu Pro20 25 30Asn Phe Gly Asn Tyr Pro Ile Met35 40(2)SEQ ID NO93信息(i)序列特征(A)長度182個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽
(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO93Ser Gly Ile Val Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu1 5 10 15Asp Cys Lys Leu Asp Leu Lys Ala Ile Ala Leu Gln Ala Arg Asn Ala20 25 30Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu35 40 45Pro Lys Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly Lys Met Val Cys Thr50 55 60Gly Ala Lys Ser Glu Asp Phe Ser Lys Met Ala Ala Arg Lys Tyr Ala65 70 75 80Arg Ile Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Lys Asp Phe Lys85 90 95Ile Gln Asn Ile Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu100 105 110Glu Gly Leu Ala Tyr Ser His Ala Ala Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu115 120 125Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Lys Val Pro Lys Ile Val Leu130 135 140Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Ile Val Ile Thr Gly Ala Lys Met Arg145 150 155 160Asp Glu Thr Tyr Lys Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Val Leu Ser Glu165 170 175Phe Arg Lys Ile Gln Gln180
(2)SEQ ID NO94信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO94Asn Ser Asn Ser Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr1 5 10 15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr20 25 30Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys35 40 45Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln50 55 60Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly65 70 75 80Phe Met Ser Ile(2)SEQ ID NO95信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO95Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr1 5 10 15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr20 25 30Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys35 40 45Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln50 55 60Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly65 70 75 80Phe Met Ser Ile(2)SEQ ID NO96信息(i)序列特征(A)長度83個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無
(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO96Ser Gly Asn Thr Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser1 5 10 15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg20 25 30Asp Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr35 40 45Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe50 55 60Leu Asn Thr Val Ala Ile Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr65 70 75 80Met Thr Met(2)SEQ ID NO97信息(i)序列特征(A)長度84個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO97
Ser Gly Asn Thr Ala Pro Ile Val His Leu Lys Gly Glu Ser Asn Ser1 5 10 15Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Lys Pro Tyr Lys Glu Leu Tyr Ser20 25 30Ser Met Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser Asp Ash Lys Asn Ser Lys35 40 45Asn Gly Ile Val Thr Val Thr Phe Val Thr Glu Gln Gln Gln Gln Met50 55 60Phe Leu Gly Thr Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Gln Ile Ser Thr Gly65 70 75 80Phe Met Thr Leu(2)SEQ ID NO98信息(i)序列特征(A)長度89個氨基酸(B)類型氮基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO98Ser Gly Asn Thr Ser Cys Phe Ala Leu Ile Ser Gly Thr Ala Agn Gln1 5 10 15Val Lys Cys Tyr Arg Phe Arg Val Lys Lys Asn His Arg His Arg Tyr20 25 30Glu Asn Cys Thr Thr Thr Trp Phe Thr Val Ala Asp Asn Gly Ala Glu35 40 45
Arg Gln Gly Gln Ala Gln Ile Leu Ile Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gln50 55 60Arg Gln Asp Phe Leu Lys His Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Asn Ile65 70 75 80Ser Gly Phe Thr Ala Ser Leu Asp Phe85(2)SEQ ID NO99信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型C-末端(xi)序列描述SEQ ID NO99Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala1 5(2)SEQ ID NO100信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性
(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO100Asn Ser Asn Thr1(2)SEQ ID NO101信息(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO101Ser Gly Asn Thr1(2)SEQ ID NO102信息
(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO102Ser Ser Gly Ser Ser Gly1 5(2)SEQ ID NO103信息(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO103
Cys Tyr Pro Glu Ile Lys Asp Lys Glu Glu Val Gln Arg Lys Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO104信息(i)序列特征(A)長度66個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO104Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1 5 10 15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20 25 30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35 40 45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50 55 60Thr Ala65(2)SEQ ID NO105信息(i)序列特征
(A)長度66個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO105Met Glu Gln Glu Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1 5 10 15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20 25 30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35 40 45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50 55 60Thr Ala65(2)SEQ ID NO106信息(i)序列特征(A)長度66個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質
(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO106Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1 5 10 15Thr rys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20 25 30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35 40 45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50 55 60Thr Ala65(2)SEQ ID NO107信息(i)序列特征(A)長度96個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端
(xi)序列描述SEQ ID NO107Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala Arg1 5 10 15Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu Ser20 25 30Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val Gly35 40 45Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala Leu50 55 60Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser Ile65 70 75 80Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Ser Met Glu Pro Ser85 90 95(2)SEQ ID NO108信息(i)序列特征(A)長度96個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO108
Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asn Ala Arg1 5 10 15Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu Ser20 25 30Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val Gly35 40 45Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala Leu50 55 60Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser Ile65 70 75 80Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Cys Glu Ala Val Ser Met Glu Pro Ser85 90 95(2)SEQ ID NO109信息(i)序列特征(A)長度180個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO109
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn Met Ser Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp20 25 30Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val35 40 45Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe50 55 60Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro65 70 75 80Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala85 90 95Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr100 105 110Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr115 120 125Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys130 135 140Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln145 150 155 160Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly165 170 175Phe Met Ser Ile180(2)SEQ ID NO110信息(i)序列特征(A)長度113個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無
(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO110Gly Ile Val Glu Gln Cya Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Ash Met Ser Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp20 25 30Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val35 40 45Tyr Gln Ser Ala Ile Ash Lys Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe50 55 60Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro65 70 75 80Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala85 90 95Cys Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Lys100 105 110Thr(2)SEQ ID NO111信息(i)序列特征(A)長度292個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無
(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO111Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Met Ser20 25 30Met Glu Gln Glu Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln35 40 45Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys50 55 60Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly65 70 75 80Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr85 90 95Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser100 105 110Gly Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly115 120 125Cys Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu130 135 140Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro145 150 155 160Arg Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly165 170 175Ala Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg180 185 190Val Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys Ile195 200 205Gln Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu210 215 220Gly Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu225 230 235 240Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu Leu245 250 255
Ile Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Ala260 265 270Glu Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe275 280 285Arg Lys Thr Thr290(2)SEQ ID NO112信息(i)序列特征(A)長度273個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO112
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Met Ser20 25 30Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln35 40 45Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys50 55 60Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly65 70 75 80Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr85 90 95Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys100 105 110Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr115 120 125Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe130 135 140Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu145 150 155 160Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys165 170 175Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu Ser Lys His180 185 190Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser195 200 205Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly210 215 220Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr Thr Asn Met Val Ala Met Glu225 230 235 240Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn245 250 255Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln Ser Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly260 265 270Phe
(2)SEQ ID NO113信息(i)序列特征(A)長度421個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO113Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Ile1 5 10 15Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Met Ser Met Arg Gln Arg Ile Thr20 25 30Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln Thr Lys Thr Ala Lys Asp35 40 45Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys Ala Ile His Ala Gly Arg50 55 60Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Val Tyr Ala Glu Glu65 70 75 80Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Ser Asn Lys Lys85 90 95Thr Thr Ala Met Ala Asp Asp Asp Pro Tyr Gly Thr Gly Gln Met phe100 105 110
His Leu Asn Thr Ala Leu Thr His Ser Ile Phe Asn Ala Glu Leu Tyr115 120 125Ser Pro Glu Ile Pro Leu Ser Thr Asp Gly Pro Tyr Leu Gln Ile Leu130 135 140Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys Glu Gly145 150 155 160Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys165 170 175Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala Lys Val180 185 190Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His Ala His195 200 205Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Val Cys Thr Val Thr Ala210 215 220Gly Pro Lys Asp Met Val Val Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His225 230 235 240Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu245 250 255Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Ser Asp Leu260 265 270Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Thr Asp Arg275 280 285Glu Lys Glu Ile Ile Arg Gln Ala Ala Val Gln Gln Thr Lys Glu Met290 295 300Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser305 310 315 320Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile325 330 335Tyr Asp ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met340 345 350Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu355 360 365Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu370 375 380Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr385 390 395 400Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys405 410 415
Asp Val Asn Ile Thr420(2)SEQ ID NO114信息(i)序列特征(A)長度391個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO114
Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1 5 10 15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20 25 30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35 40 45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50 55 60Thr Ala Met Ala Glu Asp Asp Pro Tyr Leu Gly Arg Pro Glu Gln Met65 70 75 80Phe His Leu Asp Pro Ser Leu Thr His Thr Ile Phe Asn Pro Glu Val85 90 95Phe Gln Pro Gln Met Ala Leu Pro Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Gln100 105 110Ile Leu Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys115 120 125Glu Gly Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn130 135 140Lys Lys Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala145 150 155 160Lys Val Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His165 170 175Ala His Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Ile Cys Thr Val180 185 l90Thr Ala Gly Pro Glu Asp Cys Val His Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile195 200 205Leu His Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met210 215 220Thr Glu Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro225 230 235 240Asp Leu Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly245 250 255Asp Arg Glu Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys260 265 270Glu Met Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro275 280 285
Asp Ser Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp290 295 300Ala Ile Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val305 310 315 320Arg Met Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr325 330 335Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr340 345 350Glu Glu Glu Glu Ash Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser355 360 365Pro Thr Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys370 375 380Tyr Lys Asp Ile Asn Ile Thr385 390(2)SEQ ID NO115信息(i)序列特征(A)長度391個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO115
Met Glu Gln Glu Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1 5 10 15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20 25 30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35 40 45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50 55 60Thr Ala Met Ala Glu Asp Asp Pro Tyr Leu Gly Arg Pro Glu Gln Met65 70 75 80Phe His Leu Asp Pro Ser Leu Thr His Thr Ile Phe Asn Pro Glu Val85 90 95Phe Gln Pro Gln Met Ala Leu Pro Thr Ala Asp Gly Pro Tyr Leu Gln100 105 110Ile Leu Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Val Cys115 120 125Glu Gly Pro Ser His Gly Gly Leu Pro Gly Ala Ser Ser Glu Lys Asn130 135 140Lys Lys Ser Tyr Pro Gln Val Lys Ile Cys Asn Tyr Val Gly Pro Ala145 150 155 160Lys Val Ile Val Gln Leu Val Thr Asn Gly Lys Asn Ile His Leu His165 170 175Ala His Ser Leu Val Gly Lys His Cys Glu Asp Gly Ile Cys Thr Val180 185 190Thr Ala Gly Pro Glu Asp Cys Val His Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile195 200 205Leu His Val Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met210 215 220Thr Glu Ala Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro225 230 235 240Asp Leu Ala Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly245 250 255Asp Arg Glu Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys260 265 270Glu Met Asp Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro275 280 285
Asp Ser Thr Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp290 295 300Ala Ile Tyr Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val305 310 315 320Arg Met Asp Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr325 330 335Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr340 345 350Glu Glu Glu Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser355 360 365Pro Thr Asp Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys370 375 380Tyr Lys Asp Ile Asn Ile Thr385 390(2)SEQ ID NO116信息(i)序列特征(A)長度241個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無
(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO116Met Arg Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln1 5 10 15Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys20 25 30Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly35 40 45Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr50 55 60Thr Ala Ser Asn Lys Lys Thr Thr Ala Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys65 70 75 80Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr85 90 95Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe100 105 110Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu115 120 125Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys130 135 140Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu Ser Lys His145 150 155 160Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser165 170 175Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly180 185 190Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr Thr Asn Met Val Ala Met Glu195 200 205Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn210 215 220Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln ser Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly225 230 235 240Phe
(2)SEQ ID NO117信息(i)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO117(2)SEQ ID NO118信息(i)序列特征(A)長度72個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無
(iv)反義否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO118Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln65 70
權利要求
1.一種探針核酸(PNA)，該核酸包含(A)單鏈序列1/2TBR，該序列在雜交條件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2TBR形成雜交體TBR；(B)單鏈序列1/2BBR，該序列在雜交條件下可以和輔助核酸(BNA)中的約0-10個1/2BBR形成雜交體BBR；和(C)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；其中所說的TBR可以以高親和力和TBA結合，所說的TBA是一種能夠區(qū)分配對的TBR和具有未配對的核苷酸的TBR的物質，并且，所說的BBR可以以高親和力和BBA結合，所說的BBA是一種能夠區(qū)分配對的BBR和具有未配對的核苷酸的BBR的物質。
2.一種輔助核酸(BNA)，該核酸包含(A)1/2BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2BBR序列互補的序列，并且其在雜交條件下可以和PNA形成雜交體BBR；(B)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；和(C)附加的雜交位點1/2BBR，用來和附加的BNA雜交；其中所說的BBR可以以高親和力和BBA結合，所說的BBA是一種能夠區(qū)分配對的BBR和具有未配對的核苷酸的BBR的物質。
3.一種發(fā)夾核酸(HNA)，該核酸包含單鏈序列1/2BBR，該序列在雜交條件下能夠形成發(fā)夾結構，并且同時和BNA結合形成能夠結合BBA的BBR，其中所說的BBR可以以高親和力和BBA結合，所說的BBA是一種能夠區(qū)分完美的BBR和具有未配對的核苷酸的BBR的物質。
4.權利要求1的PNA，其中所說的TBR由一個或多個核酸結合蛋白、DNA結合蛋白、DNA-RNA雜交結合蛋白或RNA結合蛋白的識別位點組成。
5.權利要求4的PNA，其中所說的TBR是存在于病原體基因組中的核酸結合蛋白識別位點，或者是和脊椎動物基因組病理狀態(tài)相關的結合位點，或者是存在于污染發(fā)酵過程的生物體基因組中的核酸結合蛋白識別位點。
6.權利要求4的PNA，其中所說的TBR是HIV-LTR或其一部分。
7.一種用于檢測和定位特定TNA序列的方法，該方法包括以下步驟(A)使所說的TNA與權利要求1的PNA雜交；(B)使所說的TNA與含有1/2BBR的BNA雜交，所說1/2BBR的序列和PNA中的1/2BBR序列互補；(C)將含有TBR和BBR的步驟(A)和(B)的產(chǎn)物加入到含有TBA的表面、液體或其它介質中；(D)將BBA加入到步驟C的混合物中，其中所說的BBA包含(I)能夠選擇性地結合BBR的分子或分子的一部分；(II)可檢測的指示劑；和(E)檢測連接到BBA上的指示劑所產(chǎn)生的信號。
8.權利要求7的方法，其中所說的指示劑是蛋白質，包括可以催化反應導致產(chǎn)生有色反應產(chǎn)物的酶，放射性核素，有色小球。
9.一種檢測樣品中特定靶核酸TNA存在的方法，該方法包括以下步驟(A)使所說的樣品和探針核酸PNA接觸，如果樣品中存在所說的TNA，則PNA與TNA雜交形成靶結合區(qū)TBR，此TBR可以和靶結合裝配體TBA結合；和(B)使已經(jīng)和所說的PNA接觸的樣品和TBA接觸，此TBA可以結合任何由所說的PNA與樣品中所說的TNA雜交形成的TBR。
10.一種具有高靈敏性和特異性的檢測和定位特定核酸序列的方法，該方法包括(A)將含有1/2BBR和1/2TBR的PNA加入到含有或懷疑含有包含1/2TBR序列的TNA樣品中，以形成具有靶結合區(qū)TBR的復合體，此TBR由分別存在于PNA和TNA中的互補1/2TBR的雜交形成；(B)將步驟A中形成的TBR結合到固定化的TBA上，以形成TBA-TNA-PNA復合體；(C)將包含輔助結合區(qū)1/2BBR的輔助核酸BNA加入到步驟B中形成的復合體中，以便BNA中的1/2BBR與存在于PNA中的1/2BBR序列雜交，或者加入到存在于已經(jīng)和PNA結合的BNA中的1/2BBR上形成BBR，以便形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n復合體；(D)將含有1/2BBR序列的發(fā)夾核酸HNA加入到步驟C中形成的復合體中，以便HNA中的1/2BBR和任何存在于步驟C的復合體的BNA中的可用的1/2BBR序列雜交，由此在步驟C的TBA-TNA-PNA-(BNA)n復合體上加帽使BNA延伸，形成TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA復合體；(E)將和指示劑部分連接的輔助結合裝配體加入到步驟D中所形成的TBA-TNA-PNA-(BNA)n-HNA復合體中，以便形成TBA-TNA-PNA(BNA-BBA)n-HNA復合體；和(F)檢測由連接到步驟(E)中TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)n-HNA復合體中的TBA，PNA，BNA，BBA或HNA上的指示劑所產(chǎn)生的信號；其中所說的TNA包含(i)一個或多個特定1/2TBR核酸序列，此特定序列在特定樣品中的存在與否有待證實；所說的PNA包含(i)單鏈序列1/2TBR，該序列在雜交條件下可以和存在于靶核酸(TNA)中的1/2TBR形成雜交體TBR；(ii)單鏈序列1/2BBR，該序列在雜交條件下可以和輔助核酸(BNA)中的0-10個1/2BBR形成雜交體BBR；和(iii)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；所說的BNA包含(i)1/2BBR，其具有和PNA或另外的BNA中1/2BBR序列互補的序列，并且其在雜交條件下可以和PNA形成雜交體BBR；(ii)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；和(iii)附加的其它BNA的雜交位點1/2BBR；(iv)序列1/2BBR，其可以與已經(jīng)和PNA雜交的BNA雜交；所說的BBA包含(i)能夠選擇性地結合BBR的分子或分子的一部分；和(ii)OSA，其不是連接的支持物和/或指示劑，或者是連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所述的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上；并且所說的TBA包含(i)能夠選擇性地結合TBR的分子或分子的一部分；和(ii)非連接的支持物和/或指示劑，或者連接的支持物或其它定位方式和/或指示劑，所說的定位方式包括但不限于連接到小珠上，聚合物上和表面上。
11.用于在固相中檢測靶多核苷酸存在的雜交方法，該方法涉及將靶多核苷酸(如果存在于樣品中)直接或經(jīng)媒介俘獲結構固定化在固相的俘獲位點上；在所說的固定化過程之前、之中或之后將一種可檢測的標記連接到所說的靶多核苷酸(如果存在)上，并且在俘獲位點上檢測所說的標記(如果具有任何所說的標記存在)，改進包括(A)使用靶結合裝配體TBA作為達到固定化所說的靶多核苷酸的手段，其中所說的TBA只結合到由特定的探針核酸PNA和所說的的靶核酸形成的獨特的雜交體上，以便形成可以被所說的TBA識別的完美的靶結合區(qū)TBR；和(B)在PNA中包含進可以結合輔助核酸BNA的單鏈核酸1/2BBR，所說輔助核酸含有單鏈互補1/2BBR，當其和PNA中的1/2BBR雜交時，形成可以和標記的輔助結合裝配體BBA結合的BBR。
12.一種靶結合裝配體TBA或者輔助結合裝配體BBA，其包含至少一個核酸識別單位，其中可以也可以不包含選自下組的一個或所有序列接頭序列、裝配序列、不對稱序列、核定位信號序列(NLS)和OSA。
13.權利要求12的TBA，其中所說的核酸識別單位選自下組NF-kB結合單位、SP1結合單位、TATA結合單位、人乳頭狀瘤病毒E2結合單位、HPV LTR結合單位、HIV LTR結合單位和Tat。
14.權利要求13的TBA，其中所說的核酸識別單位具有選自下組的序列SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77、SFQ ID NO.78、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.118。
15.權利要求12的TBA，其中所說的接頭序列是寡肽,此寡肽不干擾核酸識別單位的核酸識別功能，并且提供核酸識別單位與剩余TBA間隔的穩(wěn)定性和控制。
16.權利要求15的TBA，其中所說的接頭序列是來源于結構蛋白區(qū)域間一級序列的寡肽序列。
17.權利要求12的TBA，其中所說的裝配序列是一種寡肽序列，此寡肽序列指導核酸識別單位的折疊和締合。
18.權利要求17的TBA，其中所說的裝配序列來源于λ噬菌體cro蛋白或CI蛋白，并且選自下組SFQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQID NO.106、SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108。
19.權利要求12的TBA，其中所說的不對稱序列指導核酸識別序列和裝配序列以預定的順序締合。
20.權利要求17的TBA，其中所說的不對稱序列來源于胰島素、促性腺激素、FSH、HCG、LH、ACTH或松馳素。
21.權利要求20的TBA、其中所說的不對稱序列選自下組SEQ IDNO.85、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ IDNO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92。
22.權利要求12的TBA，其中所說的NLS是一種寡肽，此寡肽指導與所說的NLS相關的蛋白質或復合體遷移和攝入到細胞核中。
23.權利要求22的TBA，其中所說的NLS選自下組SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.103。
24.權利要求12的TBA，其是HIV Detect I-IV或HPV Dectect I-IV。
25.權利要求12的TBA，其具有選自下組的序列SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116。
26.一種使用權利要求12的TBA結合靶核酸樣品中特定的核酸序列的方法，該方法包括(A)裂解靶核酸樣品中的核酸；(B)在雜交條件下，使裂解的核酸與和特定的興趣核酸互補的探針核酸接觸，其中在所說的的探針核酸與所說的特定的興趣核酸序列雜交時，形成所說的TBA特異性地結合到其中的靶結合區(qū)。
27.權利要求26的方法，其中所說的探針核酸除了具有和所說的特定的興趣核酸互補的序列外，還具有附加序列，此附加序列可與輔助核酸結合，形成輔助結合位點，標記的輔助結合裝配體可以結合到此結合位點上，提供顯示和擴增探針核酸和興趣靶核酸序列結合的信號。
28.一種使用權利要求12的TBA的方法，其中將預防和治療有效量的所說TBA施用給需要此種治療的病人，該方法包括以提純的蛋白復合體的形式或以重組載體(進入病人體內后可以表達TBA)的形式施用TBA，以便TBA和特定的核酸序列結合達到所期望的治療和預防結果。
29.權利要求28方法，其中所說的TBA選自下組SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116，并且所說的病人是由HIV和HPV感染的病人。
30.權利要求26的方法，該方法還包括以下步驟(C)監(jiān)測靶核酸樣品中核酸移動性的改變，以便TBA和樣品中特定的核酸片段結合改變此片段的移動性作為核酸大小的函數(shù)。
31.一種用于檢測樣品中具有特定序列組成的核酸的診斷或法醫(yī)試驗試劑盒，該試劑盒包含(A)第一個核酸探針，其互補于具有特定序列組成的核酸，此核酸在試驗樣品中的存在與否是所要確定的，其中所說的第一核酸探針和所說的具有特定序列組成的核酸雜交時，形成第一個核酸結合蛋白的結合位點，其中所說的第一核酸探針還含有和第二核酸探針互補的附加序列；(B)第一核酸結合蛋白，其對由所說的第一核酸探針和所說的具有特定序列組成的核酸雜交形成的雙鏈體是特異性的；(C)第二核酸探針，其互補于所說的第一核酸探針中所說附加序列，當所說的第一和第二核酸探針雜交時，形成第二個核酸結合蛋白的結合位點。(D)第二個核酸結合蛋白，其特異性地結合由所說第一核酸探針和所說第二核酸探針雜交形成的雙鏈體，其中所說的第二核酸結合蛋白由可檢測的標記標記。
32.權利要求31的診斷和法醫(yī)試驗試劑盒，其中所說的第一核酸探針與HIV LTR互補，由此當所說第一核酸探針和HIV LTR雜交時，形成NF-KB或其亞單位SP1、TATA結合蛋白、HIV-DetectI，II，III或IV、或者HIV-Lock的結合位點。
33.權利要求32的診斷或法醫(yī)試驗試劑盒，其中所說的第一核酸結合蛋白是NF-KB或其亞單位SP1、TATA結合蛋白、HIV-Detect I，II，III或IV、或者HIV-Lock。
34.權利要求33的診斷或法醫(yī)試驗試劑盒，其中所說的第一核酸探針除了和HIV LTR互補外還包含噬菌體λ左和右操縱子的編碼序列，所說的第二核酸探針包含和所說的第一核酸探針中噬菌體λ左或右操縱子序列互補的序列，由此當所說的第一和所說的第二核酸探針雜交時，噬菌體λCI抑制子蛋白，噬菌體λcro蛋白或它們的衍生物或類似物的結合位點。
35.權利要求34的診斷或法醫(yī)試驗試劑盒，其中所說的第二核酸結合蛋白是噬菌體λCI抑制子蛋白，噬菌體λcro蛋白或它們的衍生物或類似物。
36.一種組合物，該組合物包含HIV-Lock或編碼HIV-Lock的重組載體和藥物上可接受的載體。
37.一種特異性地將核酸結合蛋白結合到與病理狀態(tài)相關的核酸上的方法，該方法包括(A)選擇存在于病理狀態(tài)相關核酸序列中的特定構型的核酸結合蛋白序列作為靶序列，用以設計將與樣品中那些特定構型的核酸序列(如果存在)雜交的核酸探針，并且保證在所說的核酸探針和選為靶的所說特定構型的核酸序列雜交時，形成可獲得的核酸結合蛋白的結合位點；(B)選擇核酸結合蛋白，此蛋白特異性地和與病理狀況相關的選擇的特定構型的核酸結合蛋白序列結合，但此蛋白不和與所說病理狀況不相關的序列結合。(C)將所說的的核酸探針與懷疑含有存在于病理狀態(tài)相關核酸序列中的所說特定構型的核酸結合蛋白序列的試驗樣品雜交；(D)使所說的核酸結合蛋白和(B)中形成的任何一個雜交體接觸。(E)檢測所說核酸結合蛋白和所說雜交體的任何結合。
38.權利要求37的方法，其中所說的特定構型的核酸結合蛋白序列選自病理狀態(tài)發(fā)展的關鍵步驟或控制點。
39.權利要求9的方法，其中所說的方法以自動方式進行。
40.權利要求39的方法，其中所說的方法是在Abbott Laboratories IMx儀器上進行的。
41.權利要求9的方法，其是在微量滴定板上進行的。
42.一種用于擴增經(jīng)將權利要求1的PNA和TNA結合產(chǎn)生的信號的方法，該方法包括將BNA結合到PNA-TNA雜交體上和將標記的BBA結合到BNA上。
43.一種用于裝配核酸結合復合體的方法，該方法包括用不對稱序列指導核酸結合復合體組份的締合或者非締合。
44.一種用于裝配核酸結合復合體的方法，該方法包括使用來源于噬菌體λcro或CI的裝配序列來裝配核酸結合復合體的締合組份。
45.一種使用裝配，不對稱，或先導序列來裝配多聚體蛋白復合體的方法，該方法包括將待摻入到多聚體蛋白復合體中的亞單位連接到所說的裝配，不對稱或先導序列上，以及回收所說的多聚體復合體。
46.一種組合物，該組合物包含SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106或SEQ ID NO.108。
47.一種編碼權利要求12的TBA或BBA的核酸。
48.權利要求12的TBA或者編碼所說的TBA的核酸，其中所說的TBA的氨基酸序列選自下組組合A、組合B和組合C，所說的各組合如以下所示組合連接的序列組A I+II+IIIB IV+V+IIIC IV+III其中I-V組所包括的序列選自組 所選自的序列I SEQ ID NO.85-92的任何序列II Met Ser，連接到SEQ ID NO.104-106的任何序列上，其各自連接到SEQ ID NO.99上。III 連接到SEQ ID NO.75-84或94-98之任一上的SEQ ID NO.100，連接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ ID NO.101；或連接到SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.93上的SEQ IDNO.102；或者SEQ ID NO.72，103，73，或63-71的任何序列。IV SEQ ID NO.104-108的任何序列V SEQID NO.99。
49.一種用于在體內或原位裝配多聚體TBA方法，該方法包括使用共價或非共價連接的蛋白或雙層載體將組份TBA引入到細胞中，或者通過將編碼TBA組份的核酸引入到細胞中來將組份TBA引入到細胞中，所說的TBA組份每個都含有DNA識別單位，裝配序列，不對稱序列，核定位信號序列和可有可無的接頭序列，由此當經(jīng)由各組份TBA的DNA識別單位鄰近地結合到在細胞核中或細胞其它區(qū)域遇到的核酸序列上時，組份表達的TBA通過所說的裝配和不對稱序列裝配成多聚體TBA。
50.一種用于鑒別核酸結合分子以便制備靶結合裝配體或輔助結合裝配體的方法，該方法包括(A)獲得含有靶核酸的樣品；(B)破碎此樣品以便在樣品中暴露核酸并減少所說核酸大小的復雜性；(C)使第一小份破碎的核酸和對照緩沖介質接觸；使第二小份破碎的核酸和含有已知組成的核酸結合分子的對照緩沖介質接觸；(D)分析所說的兩個小份，以鑒別和與對照緩沖介質接觸的小份相比在與靶結合分子接觸的小份中已改變行為的片段；(E)鑒別和分離在和核酸結合分子接觸時確實顯示出改變的行為的，測定所說核酸片段的序列以確定是否存在已知的核酸結合分子基序或者直接鑒別結合到核酸上的核酸結合分子；和(F)用裝配、不對稱核定位以及可有可無的接頭序列合成含有產(chǎn)生改變的行為的核酸結合分子的TBA。
51.一種用于鑒別樣品中特定核酸序列方法，該方法包括(A)破碎所說樣品中的核酸以暴露核酸和陣低核酸大小的復雜性；(B)使TBA和樣品接觸，所說的TBA含有兩個或多個核酸結合組份，每個組份具有相對弱的對TBR中的核酸識別單位的結合性，但是在組合時其提供對完整的TBR的強的結合性；和(C)排除任何由TBA和含有單獨識別單位的表親核酸結合產(chǎn)生的“交叉對話”，其包括將所說樣品和過量的核酸結合組份接觸，該組份對含有單個識別單位的表親核酸具有相對強的親和力，但對于含有兩個或多個核酸結合組份的完整TBR的結合而言，具有較TBA親和力相對弱的結合力。
全文摘要
本發(fā)明是一種具有高度靈敏性和特異性的檢測和定位樣品中特定核酸序列的新方法。該方法和該方法中使用的新組合體涉及使用探針核酸、產(chǎn)生核酸結合區(qū)和使用靶核酸結合裝配體來檢測和定位靶核酸。即使存在具有類似序列的核酸，該方法也可以完成所說靶核酸的檢測和定位。該方法使得各個特定結合事件所產(chǎn)生的信號高度擴增。具體地說，所說方法和組合體提供來用于檢測樣品中HIV和HPV核酸。這些方法和組合體可以用于疾病診斷、遺傳監(jiān)測、法醫(yī)偵探以及核酸混合物分析。用于所說檢測方法中的某些新組合體在預防或治療病原性疾病上有用。
文檔編號C12NGK1936020SQ20061007154
公開日2007年3月28日 申請日期1995年12月7日 優(yōu)先權日1994年12月9日
發(fā)明者蘇珊·威恩英格, 阿瑟·M·威恩英格 申請人:基因庫公司