專利名稱：一種真菌共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)用酶制劑的制備方法，特別涉及工業(yè)用漆酶的制備方法，確切地說是一種真菌共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物的氧化，同時(shí)伴隨著氧還原成水。漆酶廣泛存在于高等植物和高等真菌(特別是擔(dān)子菌)中。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿和漂白、食品風(fēng)味的改良、飼料營(yíng)養(yǎng)的改善、紡織染料的降解和轉(zhuǎn)化、紡織纖維的軟化細(xì)化、新型藥物開發(fā)、新型生物傳感器的研制及新型能源開發(fā)等領(lǐng)域具有潛在重要應(yīng)用價(jià)值[洪宇植，肖亞中，房偉等(2005)Trametes sp.AH28-2漆酶A的誘導(dǎo)合成及其基因5′-端調(diào)控區(qū)的克隆與分析。生物工程學(xué)報(bào)21547-552；Xiao YZ，Hong YZ，Li JF et al(2006)Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp.AH28-2 andanalyses of their differential expression.Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-005-0188-2]，近年來成為國(guó)際酶工程學(xué)和環(huán)境科學(xué)交叉領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
目前，真菌漆酶大多采用人工合成培養(yǎng)基液態(tài)深層發(fā)酵進(jìn)行制備，該過程需要添加芳香類化合物和/或重金屬離子作為誘導(dǎo)物，增加了成本；并且，毒性誘導(dǎo)物的引入使得發(fā)酵液后處理難度大，易造成環(huán)境污染，難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
微生物共培養(yǎng)是指將有益微生物加入培養(yǎng)基中，以促進(jìn)另一種微生物菌株的生長(zhǎng)或提高其代謝活性，該方法已在多個(gè)領(lǐng)域得以應(yīng)用。利用基于微生物相互控制技術(shù)的共培養(yǎng)法發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，與傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法相比具有兩方面優(yōu)點(diǎn)(1)成本低廉無需昂貴的誘導(dǎo)劑，發(fā)酵液后處理簡(jiǎn)單；(2)安全清潔避免了毒性芳香物和重金屬離子的使用。
國(guó)際上已初步開展了共培養(yǎng)法發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的相關(guān)研究1997年，德國(guó)學(xué)者Lang對(duì)此進(jìn)行了最早的報(bào)道，他們用Pleurotus菌(側(cè)耳屬)等在土壤中培養(yǎng)，兩個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生的酶活力低于7U/g(ABTS法)[Lang E，Eller G and Zadrazil F(1997)Lignocellulose decomposition andproduction of ligninolytic enzymes during interaction of white rot fungi with soil microorganisms.MicrobialEcology 341-10]；2001年丹麥學(xué)者Crowe報(bào)道熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)能夠誘導(dǎo)立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)產(chǎn)生少量漆酶[Crowe JD and Olsson S(2001)Induction oflaccase activity in Rhizoctonia solani by antagonistic Pseudomonas fluorescens strains and a range of chemicaltreatments.Appl Environ Microbiol 672088-2094]；同年，法國(guó)學(xué)者Savoie研究了木霉(Trichoderma)對(duì)7株葉腐擔(dān)子菌、7株木腐擔(dān)子菌漆酶合成的影響，酶活力均有不同程度提高，其中香菇(Lentinula edodes)漆酶的活力由262.6提高到326.6μmol min-1L-1(ABTS法)[Savoie JM，Mata G and Mamoun M(2001)Variability in brown line formation and extracellular laccase production duringinteraction between white-rot basidiomycetes and Trichoderma harzianum biotype Th2.Mycologia93243-248]；2002年，俄國(guó)學(xué)者Koroleva等將漆酶產(chǎn)生菌Cerrena maxima和錳過氧化物酶產(chǎn)生菌Cerrena hirsutus共培養(yǎng)，漆酶活力有所增加[Koroleva OV，Gavrilova VP，Stepanova EV et al(2002)Production of lignin modifying enzymes by co-cultivated white-rot fungi Cerrena maxima andCoriolus hirsutus and characterization of laccase from Cerrena maxima.Enzyme Microb Tech 30573-580]；2004年以色列學(xué)者Baldrian報(bào)道，木霉(Trichoderma sp.)與云芝(Trametes versicolor)共培養(yǎng)產(chǎn)生的酶活比空白提高了40倍，達(dá)44.2U/L[Baldrian P(2004)Increase of laccase activityduring interspecific interactions of white-rot fungi.FEMS Microbiol Ecology 50245-253]；2005年墨西哥人Mata報(bào)道，以咖啡果肉為基質(zhì)共培養(yǎng)平菇(Pleurotus spp)和木霉(Trichoderma spp)，酶活從150U/g上升到180U/g[Mata G，Hernández D and Andreu L(2005)Changes in lignocellulolyticenzyme activites in six Pleurotus spp strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp.World J Microb Biot 21143-150]。
在國(guó)內(nèi)，關(guān)于共培養(yǎng)影響漆酶表達(dá)量的報(bào)道僅有一篇，即平菇(Pleurotus sp.)與靈芝(Ganoderma sp.)混合培養(yǎng)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，酶活達(dá)到2,165U/g(ABTS法)，比單獨(dú)培養(yǎng)的活力總和提高了近一倍[黃慧艷，張曉昱(2004)白腐菌混合培養(yǎng)在胞外漆酶分泌上的種屬互惠性。中國(guó)食用菌2331-33]。
這些研究說明，通過共培養(yǎng)微生物的相互控制技術(shù)可以提高漆酶的表達(dá)水平。然而，在這些研究中漆酶的產(chǎn)量均不高，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。另一方面，有關(guān)微生物共培養(yǎng)生產(chǎn)真菌漆酶的生產(chǎn)工藝未見有專利保護(hù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在共培養(yǎng)發(fā)酵中使用的兩種真菌菌株系申請(qǐng)人自主選育的栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)和木霉ZH1(Trichoderma sp.ZH1)，其中前者為新型漆酶高產(chǎn)菌株，后者為微生物控制菌。以這兩個(gè)菌株為材料進(jìn)行漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)。
本生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)基配制、種液制備、滅菌、接種、共培養(yǎng)發(fā)酵和酶分離純化，所述的共培養(yǎng)發(fā)酵就是先將栓菌AH28-2的菌懸液(種液)接種在培養(yǎng)基中于22～37℃培養(yǎng)1～4天000，然后加入木霉ZH1的菌懸液(種液)于22～37℃繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，最后分離得到工業(yè)用漆酶制劑。若應(yīng)用于食品、飲料或生物傳感器領(lǐng)域，則漆酶蛋白需進(jìn)一步純化。
所述的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升含10～30g碳源、1.0～4.0g氮源、0.5～1.5g KH2PO4、0.4～0.6g MgSO4·7H2O、0.05～0.15g Na2HPO4·5H2O、0.005～0.015g CaCl2、0.001～0.003gCuSO4·5H2O、0.0005～0.0015g FeSO4·7H2O、0.01～0.04g腺嘌呤、0.03～0.07g維生素B、pH4.0～8.0。
優(yōu)選的培養(yǎng)基每升含20g碳源、2.5g氮源、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1gNa2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤、0.05g維生素B、pH4.5～6.5。
所述的碳源選自木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、果糖和甘油的一種或兩種以上混合碳源，即每升培養(yǎng)基含總碳源量10～30g。優(yōu)選木糖。
所述的氮源選自胰蛋白胨、蛋白胨、天門冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、KNO3、NH4NO3中的一種或兩種以上混合氮源，即每升培養(yǎng)基含總氮源量1.0～4.0g。優(yōu)選胰蛋白胨。
所述的種液制備就是栓菌AH28-2和木霉ZH1各自接種在上述培養(yǎng)基中于28℃、100～200rpm培養(yǎng)1～3天，3000rpm勻漿約10s制成菌懸液。
本發(fā)明在漆酶生產(chǎn)過程中無需芳香化合物和重金屬離子的誘導(dǎo)，發(fā)酵液后處理簡(jiǎn)單，因而生產(chǎn)工藝安全環(huán)保、成本低廉。本發(fā)明發(fā)酵獲得的漆酶活力在6,000U/L以上(愈創(chuàng)木酚法)，與先前用鄰甲苯胺等芳香化合物高效誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活相當(dāng)[Xiao YZ，Tu XM，WangJ et al(2003)Purification，molecular characterization and reactivity with aromatic compounds of a laccasefrom a basidiomycete Trametes sp.strain AH28-2.Appl Microbiol Biotech 60700-707]。與化學(xué)誘導(dǎo)法相比，本發(fā)明發(fā)酵生成的漆酶活力穩(wěn)定。
申請(qǐng)人自主選育的栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)已于2005年11月22日送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNOM205134；木霉ZH1(Trichoderma sp.ZH1)已于2006年1月16日送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNOM206014。
具體實(shí)施例方式
1、栓菌AH28-2和木霉ZH1菌懸液(種液)的制備在土豆培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基20％土豆汁、20g葡萄糖、3g KH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、0.4g維生素B，加1.5％瓊脂制成固體培養(yǎng)基)斜面上4℃保存的栓菌AH28-2和木霉ZH1分別接種于已高溫滅菌的種液培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基15g葡萄糖、2.5g天冬酰胺、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001gFeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤和0.05g維生素B，自然pH)，28℃、100～200rpm培養(yǎng)1～3天，3,000rpm勻漿約10s制成菌懸液。
2、共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1L)10～30g碳源、1.0～4.0g氮源、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤和0.05g維生素B，pH4.0～8.0。
3、接種與發(fā)酵培養(yǎng)將制備的栓菌AH28-2菌懸液按1～20％質(zhì)量份數(shù)接種于已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，100～200rpm、22～37℃培養(yǎng)1～4天，然后按0.1～10％質(zhì)量份數(shù)加入木霉ZH1的菌懸液，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天至產(chǎn)酶高峰。
4、酶分離與純化發(fā)酵達(dá)到漆酶高峰期，發(fā)酵液經(jīng)過濾分離菌體，即得到漆酶粗制劑。濾液可根據(jù)需要超濾濃縮或加水稀釋(可用于紙漿漂白、工業(yè)染料脫色、廢水處理、纖維軟化、飼料加工等領(lǐng)域)。
粗酶制劑依次按下述步驟可獲得純酶，所有操作在4～10℃進(jìn)行①6,000rpm離心10min，上清液超濾濃縮10～50倍；②上清液在10mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH8.0)透析3～6小時(shí)，然后10,000rpm離心10min；③上清液上預(yù)先用透析液平衡的DEAE-Sepharose FF離子交換柱，并用0.3mol/L的硫酸銨進(jìn)行線性洗脫，活性組分脫鹽后用滅菌水(或去離子水)稀釋，即可獲得純酶制劑(純酶制劑除了可用于上述粗酶的應(yīng)用領(lǐng)域外，還能用于食品和飲料工業(yè)、生物傳感器等)。
5、具體操作例
(1)、從栓菌AH28-2和木霉ZH1的保藏斜面分別挑取1cm2的菌絲塊，各自接種到裝有100mL種液培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，150rpm、28℃分別培養(yǎng)3天和1.5天，3,000rpm均漿10s制成菌懸液(臨用現(xiàn)制)。
(2)、1L三角瓶中裝350mL發(fā)酵培養(yǎng)基(1L15g木糖、2.5g胰蛋白胨、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002g CuSO4·5H2O、0.001gFeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤和0.05g維生素B，pH5.0～6.0)，高溫滅菌后接種10mL栓菌AH28-2菌懸液，130rpm、28℃培養(yǎng)2.5天后，加入木霉ZH1菌懸液2.1mL，繼續(xù)培養(yǎng)7天。
(3)、發(fā)酵液用八層紗布過濾去除菌體，濾液即是粗漆酶制劑，酶活在6,000U/L(愈創(chuàng)木酚法)以上。濾液經(jīng)超濾濃縮凍干以便貯存，或加水稀釋直接用于紙漿漂白、染料脫色、污水處理、纖維軟化、飼料加工、酒精生產(chǎn)等。
(4)、若用于食品、飲料或生物傳感器，則進(jìn)一步純化。按“4、酶分離與純化”中所述的純化步驟進(jìn)行處理，得到純漆酶制劑。
權(quán)利要求
1.一種真菌共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，包括培養(yǎng)基配制、種液制備、滅菌、接種、共培養(yǎng)發(fā)酵和酶分離純化，其特征在于所述的共培養(yǎng)發(fā)酵就是先將栓菌AH28-2的菌懸液接種在經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基中于22～37℃培養(yǎng)1～4天，然后加入木霉ZH1的菌懸液于22～37℃繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，每升培養(yǎng)基含10～30g碳源、1.0～4.0g氮源、0.5～1.5g KH2PO4、0.4～0.6g MgSO4·7H2O、0.05～0.15g Na2HPO4·5H2O、0.005～0.015g CaCl2、0.001～0.003gCuSO4·5H2O、0.0005～0.0015g FeSO4·7H2O、0.01～0.04g腺嘌呤、0.03～0.07g維生素B、pH4.0～8.0；所述的碳源選自木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、果糖和甘油的一種或兩種以上混合碳源；所述的氮源選自胰蛋白胨、蛋白胨、天門冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、KNO3、NH4NO3中的一種或兩種以上混合氮源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的每升培養(yǎng)基含20g碳源、2.5g氮源、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2HPO4·5H2O、0.01g CaCl2、0.002gCuSO4·5H2O、0.001g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤、0.05g維生素B、pH4.5～7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于制備種液的菌株為栓菌AH28-2和木霉ZH1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的碳源為木糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的氮源為胰蛋白胨。
全文摘要
一種真菌共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，將栓菌AH28－2(Trametes sp.AH28－2)的菌懸液接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中于22～37℃培養(yǎng)1～4天，然后加入木霉ZH1(Trichoderma sp.ZH1)的菌懸液繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，最后分離得到漆酶制劑，酶活達(dá)6,000U/L(愈創(chuàng)木酚法)。培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，主要含一定量的碳源、氮源、鉀與鈉的磷酸鹽、銅與鐵的硫酸鹽、腺嘌呤和維生素B等。本方法中不用芳香化合物和重金屬離子誘導(dǎo)，安全、環(huán)保，酶活高且活力穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12R1/885GK1958789SQ20061014614
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者肖亞中, 洪宇植, 張赫, 袁璟, 房偉 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)