專利名稱：從全基因組中富集甲基化dna的方法及其所用層析柱組的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種從全基因組中富集甲基化 DNA的方法及其所用層析柱組。
背景技術：
正常細胞功能的發(fā)揮與細胞本身的遺傳信息、遺傳調控和表觀遺傳調 控相關，隨著人類基因組計劃的實施，國內外對基因組所攜帶的遺傳信息 在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用己有比較深入的研究。相對而言，染色質 所攜帶的表觀遺傳信息在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用才剛開始被認識， 表觀遺傳學基因組正在興起。表觀遺傳學的過程包括DNA甲基化，組蛋白 的修飾和ATP依賴的染色質的修飾，都可以引起基因表達的改變。其中 DNA的甲基化是目前的一個研究熱點。
疾病的發(fā)生、發(fā)展是細胞內遺傳本身、遺傳調控和表觀遺傳調控的紊 亂。大量的臨床和基礎研究結果表明除了遺傳因素，環(huán)境因素在大多數(shù)疾 病發(fā)生、發(fā)展中有巨大的影響，而表觀遺傳調控機制在遺傳因素和環(huán)境因 素的互動關系中起了橋梁的作用，已有的研究結果表明表觀遺傳因素的作 用占百分之七十左右。近年的研究更進一步指出表觀遺傳調控機制在多種 疾病發(fā)生中起主導作用?；虮磉_的表觀遺傳調控是保證細胞內基因的時 空正確表達所必需的。因此，當表觀遺傳調控出現(xiàn)異常時，在胚胎發(fā)育階 段可能引起各種先天性的發(fā)育缺陷，在成體階段可能造成各種疾病的發(fā)
生。后基因組時代表觀遺傳學的興起為解開生命奧秘及征服疾病帶來了希 望。
.在哺乳類動物中，胞嘧啶的甲基化是惟一已知的DNA內源性修飾方 式，即通過DNA甲基轉移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)的催化作 用，將甲基基團加在胞嘧啶的5' C位置處。在哺乳類動物細胞中，大多 數(shù)5，-甲基胞嘧啶(5mC)以雙核苷酸CpG的形式出現(xiàn)。CpG雙核苷酸在 人類基因組中的分布很不均勻，其中密度較高的區(qū)域稱為CpG島(CpG island)。人類50% 60%的基因有CpG島，據(jù)估計整個基因組有45,000 個CpG島，并且?guī)缀蹩偸俏挥诨騿幼雍?或)外顯子周圍。除了印記 基因和女性失活的X染色體的幾個基因外，正常情況下，在CpG島的CpGs 總是非甲基化的，而大多數(shù)CpG島之外的CpGs則是甲基化的。
DNA甲基化的機制及其作用尚未完全清楚，目前認為它與控制基因表 達、DNA修復、外源基因的識別和剔除、以及染色體的穩(wěn)定性等相關。已 證實，CpG島的甲基化可以直接導致相關基因的表觀遺傳學沉默，啟動子 區(qū)域CpG島甲基化是與基因突變和缺失相并列的抑癌基因失活的第3種途 徑，并成為近年來腫瘤研究的熱點之一。
隨著生物技術的進步，DNA甲基化的檢測手段日漸豐富，常用技術 的基本原理主要可以歸納為四個方面:一種是依賴化學物質對甲基化和非 甲基化胞嘧啶的化學活性不同，將甲基修飾基團的差別轉變?yōu)閴A基序列的 不同，從而加以分離；另一種是依賴甲基化和非甲基化胞嘧啶對特定的限 制性內切酶處理的不同反應而實現(xiàn)；第三種是依據(jù)差異性雜交的原理；第 四種則是依靠甲基化CpG結合(methyl-CpG-binding domain, MBD)蛋白
家族對甲基化以及非甲基化的CpG序列的結合能力的不同進行分離。此 外，還有單核苷酸法、甲基化接受力的檢測法等多種技術，這些技術極大 地促進了表觀遺傳學的研究，推動了表觀基因組學研究的開展。目前雖然 已經存在較多的DNA甲基化的檢測技術，但是每種方法都有一定的局限 性，難以達到大規(guī)模和全基因組范圍的分析。例如目前大量使用的基于 亞硫酸氫鈉對DNA的修飾的各項技術，包括甲基化特異性的PCR，即MSP， 以及被視為金標準的亞硫酸鹽測序法，即BSP，均由于亞硫酸氫鈉對DNA 修飾技術本身的瓶頸——改變了原有DNA的二級結構，導致DNA不穩(wěn)定； 難以準確有效的保證亞硫酸氫鹽對DNA的修飾程度;改變了原有DNA的堿 基序列，增加了后續(xù)實驗室操作，包括PCR等的難度，而難以得到大規(guī)模 的應用；同樣的，基于限制性內切酶的檢測技術由于受到酶切位點的限制， 也難以在全基因組的范圍內大規(guī)模應用?，F(xiàn)有的表觀基因組學急需在高通 量、大規(guī)模的研究技術方面得到突破，以滿足全面地了解在疾病的發(fā)生過 程中甲基化譜式的改變的需要。如果能出現(xiàn)一種靈敏而特異的富集甲基化 和/或非甲基化DNA的方法，將有效規(guī)避上述幾種常用實驗技術的弊端， 大大增加大規(guī)模DNA甲基化檢測的發(fā)展和應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種從全基因組中富集甲基化DNA 的方法，能有效提高甲基化DNA富集的特異性和敏感性。為此，本發(fā)明還 要提供該方法所用的層析柱組。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法 包括如下步驟(1) 制備層析柱組，該層析柱組包括甲基化DNA特異的親和層析柱和 非甲基化DNA特異的親和層析柱；
(2) 抽提待測樣品DNA;
(3) 將待測樣品DNA與步驟(1)制備的非甲基化DNA特異的親和層 析柱進行結合反應，以去除待測樣品DNA中的非甲基化DNA;
(4) 把經步驟(3)所得的濾過液與甲基化DNA特異的親和層析柱進行 結合反應，以富集甲基化DNA。
一種適用于上述方法的層析柱組，包括甲基化DNA特異的親和層析柱 和非甲基化DNA特異的親和層析柱。
本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法，顯著提高從全基因組范 圍內富集甲基化DNA的效率，且能明顯增加甲基化DNA富集的特異性和敏 感性。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明。 附圖是本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法的流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法，利用特異性非甲基化 CpG結合蛋白和甲基化CpG結合蛋白制成DNA親和層析柱組，對基因組DNA 進行初步篩選，對甲基化的DNA進行富集，具體實驗步驟如下(見附圖) l.制備DNA層析柱組
包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析 柱，其中
1) 構建CGBP蛋白(麗—014593 ， Homo sapiens CpG binding protein) 的質粒表達載體，在原核表達系統(tǒng)內進行表達，得到的蛋白經純化后結合 于固體基質制成非甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4°C備用。
2) 構建MBD2b (NM_015832， Homo sapiens methyl-CpG binding domain protein 2， isoform 2)蛋白的質粒表達載體，在原核表達系統(tǒng)內進行表 達，得到的蛋白純化后結合于固體基質制成甲基化DNA特異的親和層析 柱，置于4。C備用；構建MBD3L1 (AY038022, Homo sapiens methyl_CpG binding domain protein 3-like)蛋白的質粒表達載體，在原核表達系 統(tǒng)內進行表達，得到的蛋白純化后，于實驗時在加入待測DNA之前，與甲 基化DNA特異的親和層析柱進行預孵育，加強甲基化DNA特異的親和層析 柱上MBD2b與甲基化的DNA的結合力。構建kaiso (NM—006777， Homo sapiens zinc finger and BTB domain containing 33， ZBTB33)蛋白的 質粒表達載體，在原核表達系統(tǒng)內進行表達，得到的蛋白純化后結合于固 體基質制成甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4。C備用。其中，所述固 體基質包括溴化氰活化的S印herose 4B、 Agarose和磁珠。
2. 抽提待測樣品DNA
3. 利用親和層析柱組對待測樣品中甲基化和非甲基化的DNA成分進 行分離和富集
1) 將待測樣品DNA與上述非甲基化DNA特異的親和層析柱進行結合， 除去其中的非甲基化修飾的DNA成分;也可對通過對洗脫液中非甲基化的 DNA成分進行富集，以備非甲基化DNA的后續(xù)檢測。
2) 將上述非甲基化DNA特異的親和層析柱的濾過液與甲基化DNA特異
的親和層析柱進行結合反應。
3)將結合在甲基化DNA特異的親和層析柱上的DNA洗脫、純化。以實 現(xiàn)對甲基化修飾的DNA的富集。如果該部分DNA量較少，可通過PCR等方 法進行放大。
為了保證本發(fā)明方法的特異性和靈敏度，每次實驗，均嚴格設置陰性 對照和陽性對照。其中，陰性對照為全基因組DNA經全基因組PCR放大， 而后取其產物，稀釋500倍后作為模板，再次進行全基因組放大，取第二 次全基因組放大的產物作為非甲基化狀態(tài)的陰性對照(由于PCR體系中的 dNTP未經甲基修飾，無論原始模板的甲基化修飾狀態(tài)怎樣，經兩次PCR 放大后，PCR產物中的剩余甲基可以忽略不計)；陽性對照為取全基因 組DNA作為模板(無論其甲基化狀態(tài)如何)，經Sss-I甲基化酶進行處理， 在其全部CpG結構上加以甲基修飾，取其修飾產物作為甲基化DNA的陽性 對照。
實施例 1
應用本發(fā)明的富集甲基化DNA的方法，對臨床肝癌樣本進行DNA甲基 化異化譜的研究，具體步驟為 1.親和層析柱組的制備
包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析
柱，其中
1)構建CGBP蛋白(麗—014593 ， Homo sapiens CpG binding protein, 人CpG結合蛋白)的質粒表達載體，在原核表達系統(tǒng)內進行表達，得到的 蛋白經純化后結合于固體基質制成非甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4"C備用。
2)構建MBD2b (麗—015832， Homo sapiens methy卜CpG binding domain protein 2， isoform 2，人甲基化CpG結合蛋白異構體2)蛋白的質粒表 達載體，在原核表達系統(tǒng)內進行表達，得到的蛋白純化后結合于固體基質 制成甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4。C備用；構建MBD3L1(AY038022， Homo sapiens methyl-CpG binding domain protein 3-like)蛋白的質 粒表達載體，在原核表達系統(tǒng)內進行表達，得到的蛋白純化后置于4'C備 用。
2. 抽提臨床肝癌樣本DNA
使用傳統(tǒng)的酚-氯仿方法從臨床肝癌樣本(-8(TC保存)中抽提DNA， 將抽提溶解好的DNA移入高壓滅菌過的1. 5ml離心管中，取lul進行電 泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE, EB， 80MV, 1. 5小時電泳)，在FR-200紫 外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker ( Lambda DNA/EcoRI+Hindlll)進行定量。
3. 目的DNA的富集
1) 將待測DNA進行超聲斷裂，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)進行純化后測定濃度。而后，將DNA與上述非甲基化DNA特異的親和層析柱進行結合，除去其中的非甲基化修飾的 DNA成分，收集濾過液；同時收集洗脫液，對非甲基化的DNA成分進行富 集，以備非甲基化DNA的后續(xù)檢測。
2) 在上述甲基化DNA特異的親和層析柱中，加入MBD3L1蛋白進行預 孵育，以加強甲基化DNA特異的親和層析柱中MBD2b蛋白與甲基化DNA
的親和能力。
3)將上述非甲基化DNA特異的親和層析柱的濾過液加入甲基化DNA 特異的親和層析柱進行結合反應。收集洗脫液，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)進行純化。 4.甲基化DNA的進一步檢測 將上述富集的甲基化DNA與人類全基因組CpG島檢測芯片進行雜交， 依據(jù)雜交結果確定甲基化DNA所在的CpG島位置，與正常肝組織的DNA 甲基化譜進行比較，得到肝癌的DNA甲基化異化譜。
權利要求
1. 一種從全基因組中富集甲基化DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備層析柱組，該層析柱組包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析柱；(2)抽提待測樣品DNA；(3)將待測樣品DNA與步驟(1)制備的非甲基化DNA特異的親和層析柱進行結合反應，以去除待測樣品DNA中的非甲基化DNA；(4)把經步驟(3)所得的濾過液與甲基化DNA特異的親和層析柱進行結合反應，以富集甲基化DNA。
2. —種適用于權利要求1所述方法的層析柱組，其特征在于，包括甲 基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析柱。
3. 如權利要求2所述的層析柱組，其特征在于，所述甲基化DNA特異 的親和層析柱通過將特異性結合甲基化DNA的蛋白固定于層析柱的基質 而制得。
4. 如權利要求3所述的層析柱組，其特征在于，所述特異性結合甲基 化DNA的蛋白包括MBD2b蛋白和kaiso蛋白。
5. 如權利要求2所述的層析柱組，其特征在于，所述非甲基化DNA 特異的親和層析柱通過將特異性結合非甲基化DNA的蛋白固定于層析柱 的基質而制得。
6. 如權利要求5所述的層析柱組，其特征在于，所述特異性結合非甲 基化DNA的蛋白包括CGBP蛋白。7.如權利要求3或5所述的層析柱組，其特征在于，所述層析柱的基 質包括溴化氰活化的S印herose 4B、 Agarose禾口磁珠。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，公開了一種從全基因組中富集甲基化DNA的方法，包括制備層析柱組，該層析柱組包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析柱；抽提待測樣品DNA；將待測樣品DNA與非甲基化DNA特異的親和層析柱進行結合反應，以去除待測樣品核酸中的非甲基化DNA；把所得的濾過液再與甲基化DNA特異的親和層析柱進行結合反應，以實現(xiàn)富集甲基化DNA的目的。本發(fā)明還公開了適用于該方法的層析柱組。本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法，能顯著提高從全基因組范圍內富集甲基化DNA的效率，且明顯增加甲基化DNA富集的特異性和敏感性。
文檔編號C12N15/10GK101205536SQ200610147409
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月18日 優(yōu)先權日2006年12月18日
發(fā)明者穎 秦, 肖華勝 申請人:上海生物芯片有限公司