專利名稱：一種磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及利用磁性納米粒子進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)80年代起，造血干細(xì)胞移植成為惡性腫瘤(如一些惡性血液病和非血液系統(tǒng)的實(shí)體瘤等)大劑量放療、化療后造血支持治療的主要措施。有了造血干細(xì)胞移植的支持，臨床醫(yī)生就可以使用超大劑量的放療、化療，最大限度地消除患者體內(nèi)的癌細(xì)胞，然后植入造血干細(xì)胞，重建被破壞的造血和免疫系統(tǒng)，提高了惡性腫瘤的治療效果和病人的生存期。由于成人體內(nèi)造血干細(xì)胞主要存在于骨髓中，因此最初最多采用骨髓來源的造血干細(xì)胞進(jìn)行移植。后來動(dòng)員的外周血成為造血干細(xì)胞移植的另一來源。與骨髓移植相比，外周血干細(xì)胞移植具有幾個(gè)顯著的有點(diǎn)，如采集方便、造血功能重建快、免疫功能恢復(fù)早、并發(fā)癥輕等。1988年，第一例應(yīng)用人類臍帶血移植治療凡科尼貧血癥的成功開創(chuàng)了人類臍帶血移植的先河。臍帶血含有豐富的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞，并且其免疫細(xì)胞的抗原性較弱，移植相關(guān)的移植物抗宿主病(GVHD)相對(duì)骨髓和外周血發(fā)生較低、嚴(yán)重程度較弱，因此被認(rèn)為是極具潛力的繼骨髓和外周血后的第三種造血干細(xì)胞的來源。隨著同胞間臍帶血移植的發(fā)展，人們又把目光轉(zhuǎn)移到非血緣臍帶血移植上來。其前提是建立臍帶血庫(kù)。2005年6月4日青年報(bào)報(bào)導(dǎo)了上海市臍帶血采集重新啟動(dòng)。臍帶血造血干細(xì)胞是用來根治白血病的有效手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)白血病患者以每年十萬分之四的速度增長(zhǎng)，每年新發(fā)病的患者就達(dá)4萬-5萬人，其中少年兒童占50％。雖然造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)的入庫(kù)人數(shù)已經(jīng)達(dá)到了26萬人，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了白血病患者移植的需求。
進(jìn)行造血干細(xì)胞移植前首先必須對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分離純化，其目的在于在異體PBSCT中它可去除T細(xì)胞、減少和減輕GVHD發(fā)生、尤其是提高了供受者2-3個(gè)HLA位點(diǎn)不合間移植的安全性；在自體PBSCT中它可凈化殘留腫瘤細(xì)胞而減少移植后的復(fù)發(fā)；對(duì)難治性自身免疫性疾病可經(jīng)干細(xì)胞純化除去異常免疫細(xì)胞；同時(shí)經(jīng)純化后可以提高干細(xì)胞體外擴(kuò)增及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率等。最初分離富集造血干細(xì)胞的方法是依據(jù)造血干細(xì)胞具有細(xì)胞體積小，浮力密度低等物理學(xué)特性。采用包括速度離心沉淀，密度梯度離心以及后來的逆流離心淘洗等技術(shù)進(jìn)行分離。七十年代中后期流式細(xì)胞分析及分選技術(shù)和單克隆抗體的出現(xiàn)和發(fā)展，使細(xì)胞分離技術(shù)出現(xiàn)了質(zhì)的飛躍。應(yīng)用單克隆抗體熒光染色與流式細(xì)胞分選相結(jié)合的熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)極大地提高了細(xì)胞分離純化的效率，使得高效快速分離純化一些含量極少的細(xì)胞群成為可能。近年出現(xiàn)的免疫磁珠細(xì)胞分離技術(shù)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了分離的程序并提高了分離效率。在此基礎(chǔ)上，我們研發(fā)了一種利用磁性納米粒子進(jìn)行造血干細(xì)胞自動(dòng)分選的裝置，可以在密閉系統(tǒng)內(nèi)無菌地分選大量細(xì)胞。其主要特性是自動(dòng)、省時(shí)、安全、高效。可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置及其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有分選系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和大量細(xì)胞的分選。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，至少由磁性分選系統(tǒng)、樣品傳輸系統(tǒng)和電腦控制系統(tǒng)組成，其特征在于，所說的磁性分選系統(tǒng)中至少包括磁分選溶液、分選柱和可移動(dòng)磁場(chǎng)，所說的磁分選溶液含有殼聚糖包裹的γ-Fe2O3磁性納米粒子。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之一為，所說的可移動(dòng)磁場(chǎng)強(qiáng)度為4000-6000高斯。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之二為，所說的磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物粒徑范圍為50～200nm。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之三為，所說的磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物為磁性納米粒子表面連接CD34單克隆抗體所構(gòu)成的復(fù)合物。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之四為，所說的磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物為γ-Fe2O3磁性納米粒子表面用殼聚糖包裹繼而連接CD34單克隆抗體所構(gòu)成的復(fù)合物。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之五為，所說的磁性分選系統(tǒng)由永磁鐵、分選單元和磁性納米分離液組成，且所說的磁性納米分離液中含有磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之六為，所說的分選單元至少由一個(gè)永久性磁鐵和一個(gè)鐵磁化的基材組成。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之七為，所說的樣品傳輸系統(tǒng)是由蠕動(dòng)泵、閥門及管道組成的細(xì)胞懸液輸送和洗滌系統(tǒng)。
上述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置的優(yōu)選方案之八為，所說的電腦控制系統(tǒng)由主控模塊控制電磁閥、蠕動(dòng)泵和步進(jìn)電機(jī)。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種利用上述裝置進(jìn)行磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選的方法。
本發(fā)明是通過如下方式實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)細(xì)胞納米磁性分選裝置由磁性分選系統(tǒng)、樣品傳送系統(tǒng)、電腦控制系統(tǒng)和外殼組成。
(1)磁性分選系統(tǒng)磁性分選系統(tǒng)由永磁鐵、分選單元和磁性納米分離液組成。特別地，可以有如下部件和性質(zhì)1)分選單元磁性分選單元由一個(gè)特制、高效的永久性磁鐵和一個(gè)鐵磁化的基質(zhì)組成。這種系統(tǒng)可產(chǎn)生強(qiáng)磁性，并且又可快速退磁，當(dāng)分選單元移出磁場(chǎng)后，柱基質(zhì)的快速退磁可使吸附有細(xì)胞的粒子得以解離。
2)磁性納米分離液可以由化學(xué)沉淀法合成具有超順磁性的γ-Fe2O3磁性納米粒子，用殼聚糖包裹磁性納米粒子，形成核殼型超順磁性磁性納米粒子。該磁性納米粒子具有生物相容性和生物降解功能。在核殼型磁性納米粒子上連接生物大分子構(gòu)建納米粒子-生物分子復(fù)合物，以造血干細(xì)胞自動(dòng)磁分選系統(tǒng)為例，生物大分子為CD34單克隆抗體，納米粒子-生物分子復(fù)合物與合適的懸浮溶液配制成磁性納米細(xì)胞分離液。利用免疫反應(yīng)，對(duì)目的造血干細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記，從而在磁場(chǎng)中將造血干細(xì)胞從細(xì)胞混合群體中分離出來。
(2)樣品傳輸系統(tǒng)樣品傳輸部分是由蠕動(dòng)泵、多個(gè)閥門及連接管道組成的血樣懸液輸送和分離洗滌系統(tǒng)。
以上述所說的造血干細(xì)胞自動(dòng)磁分選系統(tǒng)為例，蠕動(dòng)泵及電磁閥可以采用美國(guó)科爾帕默Cole-Parmer公司的產(chǎn)品，Cole-Parmer的Masterflex@系列蠕動(dòng)泵已有50多年的生產(chǎn)歷史，在美國(guó)、歐洲占有市場(chǎng)主導(dǎo)地位，目前在中國(guó)被廣泛應(yīng)用于科研、制藥、監(jiān)測(cè)、生物、環(huán)境保護(hù)、化學(xué)反應(yīng)過程等廣闊領(lǐng)域，全部符合國(guó)際IS9001、CE、UL標(biāo)準(zhǔn)。Masterflex變速數(shù)控蠕動(dòng)泵，無刷免維護(hù)電極，雙向運(yùn)轉(zhuǎn)，液晶顯示轉(zhuǎn)速可調(diào)，是針對(duì)于制藥、血液、組織及細(xì)胞培養(yǎng)的Pharmed TC衛(wèi)生泵，可抵抗臭氧及紫外線輻射，無細(xì)胞毒素及無溶血?jiǎng)?，管道可重?fù)高壓消毒不影響壽命。流速可調(diào)。
(3)電腦控制系統(tǒng)電腦控制系統(tǒng)負(fù)責(zé)整個(gè)儀器的運(yùn)作流程，根據(jù)該儀器用于醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的要求，所以需要根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)的可靠性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和可操作性進(jìn)行硬件選型及功能設(shè)計(jì)。具體而言，電腦控制系統(tǒng)由主控模塊控制電磁閥、蠕動(dòng)泵和步進(jìn)電機(jī)。其模塊結(jié)構(gòu)見附圖1所示。各模塊功能如表1所示。
表1電腦控制系統(tǒng)各模塊功能

(4)自動(dòng)細(xì)胞納米磁性分選裝置還可以配置便于操作各項(xiàng)功能和帶有調(diào)節(jié)樣品流速、磁場(chǎng)強(qiáng)度和管道/樣品清洗過程的儀器控制表盤的外殼。
有益效果本發(fā)明設(shè)計(jì)開發(fā)的大量細(xì)胞自動(dòng)分選儀采用微型計(jì)算機(jī)和現(xiàn)代控制技術(shù)，對(duì)分離過程和管道清洗進(jìn)行全程自動(dòng)控制，可以批量、安全、精確、快速地對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分離，采用該分離系統(tǒng)后，可以使造血干細(xì)胞分離成本成倍地降低。用于臨床后可為眾多的腫瘤和免疫疾病的患者帶來治療和治愈的機(jī)會(huì)，用該分選系統(tǒng)分選后，在異體PBSCT中它可去除T細(xì)胞、減少和減輕GVHD發(fā)生、尤其是提高了供受者2-3個(gè)HLA位點(diǎn)不合間移植的安全性；在自體PBSCT中它可凈化殘留腫瘤細(xì)胞而減少移植后的復(fù)發(fā)；對(duì)難治性自身免疫性疾病可經(jīng)干細(xì)胞純化除去異常免疫細(xì)胞后行自體移植；還可提高干細(xì)胞體外擴(kuò)增及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率等。
用該分選系統(tǒng)分選后，由于采用的納米粒子具有巨大的表面積，所以對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合速度和結(jié)合效率大大提高。分離采用的磁場(chǎng)強(qiáng)度為4000-6000高斯，使磁性納米粒子的磁聚集效果更佳。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無論外周血還是骨髓有核細(xì)胞分離產(chǎn)物CD34+細(xì)胞的純度和回收率皆分別在90％和60％以上，T細(xì)胞去除率在90％以上，分離產(chǎn)物CD34+細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)證明有很強(qiáng)的增殖能力。磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物在分選后的細(xì)胞溶液中殘留極低，特別是由于采用殼聚糖包裹在γ-Fe2O3磁性納米粒子表面，所以具有生物相容性和生物降解功能，對(duì)分選細(xì)胞和移植受體安全無毒性。臨床移植后所有移植物皆較快植活，且在未給預(yù)防GVHD的情況下移植也是安全的。利用大量細(xì)胞自動(dòng)分選儀分離CD34+細(xì)胞，并進(jìn)行體外擴(kuò)增，在前期擴(kuò)增造血干細(xì)胞的基礎(chǔ)上中藥蛋白質(zhì)，加入以人骨髓基質(zhì)細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外擴(kuò)增體系中，研究骨髓基質(zhì)層和中藥蛋白質(zhì)對(duì)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量的影響，并不斷調(diào)整體系中的各種成分的比例，篩選出一種新的培養(yǎng)體系，擴(kuò)增出能夠滿足臨床移植要求的造血干細(xì)胞。


圖1為電腦控制系統(tǒng)各模塊示意圖。
圖2是帶有磁性納米粒子的CD34+細(xì)胞SEM照片。借助SEM可以看到，分離后的CD34+細(xì)胞仍保持正常形態(tài)，而且同時(shí)我們還可以看到細(xì)胞表面連接的磁性納米粒子。
圖3是在顯微鏡下觀察經(jīng)過體外液體培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如操作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1磁性納米粒子的合成FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液采用共沉淀法形成γ-Fe2O3納米粒子，然后采用反向微乳液法使正硅酸乙酯水解的同時(shí)將殼聚糖包裹在γ-Fe2O3外面，以形成核殼型的磁性納米粒子，并通過TEM和穆斯堡爾譜儀表征。
實(shí)施例2磁性納米粒子上連接抗CD34單克隆抗體將一定量上述連接氨基的磁性納米粒子分散在磷酸緩沖液(Phosphatebuffered saline，PBS，0.1M，pH7.4)中，加入一定量的戊二醛，反應(yīng)4-5個(gè)小時(shí)后，將多余的戊二醛洗去，重新分散在PBS中，然后加入一定量的抗CD34單克隆抗體，反應(yīng)1.5-2.5小時(shí)，再將多余的抗體用PBS充分洗去，同時(shí)收集殘液(抗體與磁性納米粒子反應(yīng)后殘余的液體)、兩次的漂洗液(分別稱為一洗、二洗)。
實(shí)施例3分離出的CD34+細(xì)胞形態(tài)圖2是帶有磁性納米粒子的CD34+細(xì)胞SEM照片。借助SEM可以看到分離后的CD34+細(xì)胞仍保持正常形態(tài)，而且同時(shí)我們還可以看到細(xì)胞表面連接的磁性納米粒子。從圖中我們還可以看出磁性納米粒子相對(duì)于細(xì)胞粒徑很小，在復(fù)雜的生物體系中磁性納米粒子雖有一定團(tuán)聚現(xiàn)象存在，但不影響細(xì)胞的分離效果和對(duì)細(xì)胞的形態(tài)沒有太大的影響。因此，采用磁性納米粒子分離CD34+細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)幾乎沒有影響。
實(shí)施例4分選裝置的工作流程將磁珠的粒徑由微米級(jí)縮小至納米級(jí)，制備出磁性納米粒子用于細(xì)胞分離。其分離原理是在磁性納米粒子表面修飾著能識(shí)別、結(jié)合細(xì)胞的生物分子。構(gòu)成磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物。用該復(fù)合物去捕獲目標(biāo)細(xì)胞，再通過磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置中的可移動(dòng)磁場(chǎng)將目標(biāo)細(xì)胞吸附、洗脫分離出來。
實(shí)施例5CD34+細(xì)胞的液體培養(yǎng)2mL RPMI1640體系中含20％胎牛血清(FBS，Gibco)，干細(xì)胞因子(SCF)40ng/mL，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)30ng/mL，白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、血小板生成素(TPO)各20ng/mL，促紅細(xì)胞生成素(EPO)5U/mL，5％牛血清白蛋白(BSA)，細(xì)胞2×105/mL，將上述體系接種于培養(yǎng)瓶中。置37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)一周，倒置顯微鏡下觀察。經(jīng)過液體培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞，經(jīng)過五天，在液體培養(yǎng)基中有核細(xì)胞總數(shù)可擴(kuò)增20多倍，如圖3。表明經(jīng)過磁性納米粒子分離的CD34+細(xì)胞保持高度增殖能力和自我更新能力。
權(quán)利要求
1.一種磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，至少由磁性分選系統(tǒng)、樣品傳輸系統(tǒng)和電腦控制系統(tǒng)組成，其特征在于，所說的磁性分選系統(tǒng)中至少包括磁分選溶液、分選柱和可移動(dòng)磁場(chǎng)，所說的磁分選溶液含有殼聚糖包裹的γ-Fe2O3磁性納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的可移動(dòng)磁場(chǎng)強(qiáng)度為4000-6000高斯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的磁分選溶液中的磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物粒徑范圍為50～200nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物為磁性納米粒子表面連接CD34單克隆抗體所構(gòu)成的復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物為γ-Fe2O3磁性納米粒子表面用殼聚糖包裹繼而連接CD34單克隆抗體所構(gòu)成的復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的磁性分選系統(tǒng)由永磁鐵、分選單元和磁性納米分離液組成，且所說的磁性納米分離液中含有磁性納米粒子-生物分子復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的分選單元至少由一個(gè)永久性磁鐵和一個(gè)鐵磁化的基材組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的樣品傳輸系統(tǒng)是由蠕動(dòng)泵、閥門及管道組成的細(xì)胞懸液輸送和洗滌系統(tǒng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置，其特征在于，所說的電腦控制系統(tǒng)由主控模塊控制電磁閥、蠕動(dòng)泵和步進(jìn)電機(jī)。
10.一種利用權(quán)利要求1所述裝置進(jìn)行自動(dòng)細(xì)胞分選的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磁性納米細(xì)胞自動(dòng)分選裝置及其應(yīng)用，該裝置至少由磁性分選系統(tǒng)、樣品傳輸系統(tǒng)和電腦控制系統(tǒng)組成，磁性分選系統(tǒng)至少包括磁分選溶液、分選柱和可移動(dòng)磁場(chǎng)，所說的磁分選溶液含有殼聚糖包裹的γ－Fe
文檔編號(hào)C12N5/08GK101041814SQ20061014831
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者沈鶴柏, 潘建國(guó), 董亞明, 朱龍章, 韓林峰 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)