專利名稱：：用于核酸分析的高度正交的通用序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—般而言，本發(fā)明涉及產(chǎn)生用于核酸分析的通用序列。更具體而言，本發(fā)明涉及產(chǎn)生用于帶分支DNA("bDNA")和其它核酸分析時具有可忽略不計的交叉反應(yīng)性的高度正交的通用序列(highlyorthogonaluniversalsequences)。麵支A由ChironDiagnostics開發(fā)、現(xiàn)歸BayerDiagnostics所有的bDNA分析使用線性而非指數(shù)信號擴增來提高診斷測試中定量雜交的靈敏度和特異性。Collinsetal,NUCLEICACIDRESEARCH25(15):2979-2984(1997)。bDNA分析用來對多種來源的RNA和DNA靶標(biāo)進(jìn)行定量。該分析的靈敏度和特異性部分來源于對構(gòu)成探針組的寡核苷酸探針的明智的選擇。在一種bDNA分析中，將捕獲探針("CP")附著于固體支持物上，捕獲輔助("CE")探針附著于CP,以介導(dǎo)將DNA或RNA靶標(biāo)捕捉至固體支持物上。使用大量(一般>30個)被稱為標(biāo)記輔助("LE")探針的把特異性寡核苷酸對DNA或RNA把標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，這介導(dǎo)bDNA擴增分子與CE的雜交。靶標(biāo)與固體支持物的雜交一般通過與bDNA的分支結(jié)合的堿性磷酸酶探針來檢測。信號擴增是由于結(jié)合的LE探針、bDNA擴增分子上的分支數(shù)目以及bDNA分子的每個分支上堿性磷酸酶結(jié)令位點的數(shù)目所導(dǎo)致的。這類bDNA分析被稱為"第一代"bDNA分析或"Quantiplex"bDNA分析，可對10,000和10,000,000個分子/mL進(jìn)行定量，并已用于檢測HIV、HBV和HCV。Collinsetal.，同上，2979頁。在"第二代"bDNA分析(也稱為"靈敏度增強，，或"ES"bDNA分析)中，LE探針與擴增前體(preamplifier)結(jié)合，這進(jìn)而會結(jié)合大量bDNA擴增分子。第二代bDNA分析的產(chǎn)生使得擴增信號增強，同時降低了檢測局限性。例如，第二代bDNA分析能對500個分子/mLHIVRNA進(jìn)行定量。參見Kernetal.,JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY34(12):3196-3202(1996)。第一代和笫二代bDNA分析的負(fù)面作用在于擴增序列與非靶標(biāo)分子的非特異性雜交所引起的背景噪音。例如，下述任何非特異性雜交均會導(dǎo)致背景噪音升高bDNA與CE探針(而非LE探針)的雜交以及CE探針與LE探針(而非CE探針與耙標(biāo)以及把標(biāo)與LE探針)的非特異性雜交。為減少bDNA分析中的非特異性雜交，可將非天然堿基異鳥。票呤核苦("iso-G")和異胞嘧，定(isocytidine，"iso-C")(兩者均不與4壬^f可天然DNA或RNA堿基發(fā)生可檢測到的相互作用)摻入擴增序列。Iso-G和iso-C《皮此之間形成標(biāo)準(zhǔn)的Watson和Crick相互作用，^f旦是，由于iso-G和iso-C之間的氫鍵合模式不同于天然堿基之間的氫鍵合模式，因此iso-G和iso-C與天然堿基之間不發(fā)生相互作用。參見美國專利No.5,681,702。具有iso-G/iso-C堿基對的序列較其G/C同源物在低2°C時更穩(wěn)定。將iso-G和iso-C堿基摻入第二代bDNA分析的分析被稱為"第三代，，bDNA分析或"System8"bDNA分析法。參見Collinsetal.(同上)和美國專利No.5,681,702。在第三代bDNA分析中，優(yōu)選地，捕獲探針、擴增前體探針、擴增探針和/或標(biāo)記探針中的每隔兩個或三個核苷酸為iso-G或iso-C，兩者4皮此之間進(jìn)4亍i威基配對，而不與天然堿基配對。將iso-G和iso-C核苷酸摻入bDNA分析時，由于非特異性雜交所致的背景噪音得到降低，同時信號得到增強。由于信號可被增強，同時沒有相當(dāng)?shù)脑胍舴糯?，因此對于iso-G和iso-C的非特異性雜交的控制允許使用較大的LE擴增前體探針、較大的bDNA擴增分子或多層擴增，以增加bDNA分析的靈敏度。例如，Collins等人記載用堿性磷酸酶探針檢測5attomol寡核苷酸耙標(biāo)的信噪("S/N")比為5.5，而兩層擴增的S/N比為19.6，三層擴增的S/N比為154.3。使用第三代bDNA分析，Collins等人能對60個分子/mLHIVRNA進(jìn)行定量。Collinsetal.,同上，1982頁。第二代和第三代bDNA分析以多重形式使用。參見Collinsetal.,同上，2983頁。多重分析中，同時對多個靶標(biāo)進(jìn)行分析。多重分析已被用來對單核苷酸多態(tài)性("SNP")即基因組DNA中的單點變異進(jìn)行基因分型，并用來篩選樣本中的多種細(xì)胞因子。參見Iannoneetal.,Cytometry39:131-140(2000);Collinsetal.,supraat2983;anddeJageretal.,ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology10(1):133-139(2003)。SNP代表著形式最為豐富的遺傳變異，在人類基因組中平均每1-2kb就出現(xiàn)一次。已經(jīng)鑒定了四百萬個以上的SNP(參見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP),并且這些SNP中有一百二十萬個以上已在人類基因組中定位(參見http:〃s叩.cshl.org)。由于人類基因組中的豐富重復(fù)序列，數(shù)據(jù)庫中含有的全部SNP并不一定真的是多態(tài)性，或者它們在所研究特性群體中并不是多態(tài)性。對SNP的鑒定除了可用于對人的診斷分析外，還有多種用途。例如，對SNP的鑒定可用于在包括植物、哺乳動物和微生物在內(nèi)的多種物種中制作遺傳圖譜，進(jìn)行遺傳變異分析和標(biāo)記輔助育種。因此，準(zhǔn)確有效的基因分型是鑒定SNP的先決條件。參見See,Lind訓(xùn)setal.,NucleicAcidResearch30(14):l畫9(2002).細(xì)胞因子是由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞分泌的可溶蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可改變不同細(xì)胞類型的表現(xiàn)和性質(zhì)。不同的細(xì)胞因子在生物學(xué)上具有重疊功能，因此具有調(diào)節(jié)其它細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。因此，對微環(huán)境即發(fā)炎位點內(nèi)的一整套細(xì)胞因子的功能進(jìn)行分析通常比對一種單獨的細(xì)胞因子進(jìn)行分析更有價值?？稍诓煌綄?xì)胞因子進(jìn)行定量。在信使RNA("mRNA")水平和細(xì)胞水平上檢測細(xì)胞因子的多重分析有一定的局限性，如需要較大體積的樣本或者檢測前體蛋白質(zhì)而非天然蛋白質(zhì)。參見deJageretal.,同上。為了以多重(multiplex)形式使用bDNA分析，必須使用多個CP和CE序列，目的在于將多個靶標(biāo)附著于固體支持物上。Collinseta1.,同上。以多重形式使用六堿基密碼子的第二代和笫三代bDNA分析的問題在于，在多個靶標(biāo)的天然堿基與捕獲探針、擴增前體探針、擴增探針和標(biāo)記探針的天然堿基之間可能出現(xiàn)3體交叉雜交。更具體而言，如上所述，笫二代和第三代bDNA分析均在捕獲探針、擴增前體探針、擴增探針和/或標(biāo)記探針的每隔三個核苦酸位置具有一個非天然堿基；因此，通過這種設(shè)計，每種探針中四個可能的天然堿基中有三個位于兩個非天然堿基之間。由于每個天然堿基僅有一個成功配對，因此，天然堿基與其三個錯配堿基中的任何一個雜交都會顯著降低多重bDNA分析的有效性。另外，隨著對復(fù)雜的多重分析的開發(fā)，分析物之間不想要的交叉反應(yīng)難以克服和消除。因此，本領(lǐng)域需要設(shè)計和產(chǎn)生用于bDNA單重和多重分析、不會交叉雜交的多個高度特異的序列。本發(fā)明通過設(shè)計和產(chǎn)生高度正交的六密碼子通用序列，滿足本領(lǐng)域的這一需要，所述通用序列可將現(xiàn)有技術(shù)中已知的第二代和第三代bDNA分析中所固有的3體交叉雜交最小化或?qū)⑵滢D(zhuǎn)錄病毒、SNP、細(xì)胞因子以及基因擴增和缺失的精確度得到大大提高。
發(fā)明內(nèi)容為滿足本領(lǐng)域?qū)τ糜赽DNA單重和多重分析、不會交叉雜交的多個高度特異的序列的需要，本發(fā)明一方面提供了包含四個天然堿基和兩個非天然堿基的高度正交的六堿基通用序列，其中以非特定順序排列的一至四個所述天然堿基選自鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺香(A)和胸苷(T)或尿。密啶(U)，并由所述一個或兩個非天然堿基所分隔，由此使得約50%的所述序列含有G/C堿基，并使得所述序列的解鏈溫度(Tm)約為80-85°C。本發(fā)明的另一方面提供了一種制備用于雜交的高度正交的通用序列的方法，包括如下步驟(a)從六個核苷酸堿基制備5，至3，序列，所述六個核苷酸堿基包含兩個非天然堿基和選自鳥苷(G)、胞嗜啶(C)、腺苷(A)和胸苷(T)或尿嘧啶(U)的四個天然堿基，其中所述序列含有以非特定順序排列的一至四個所述天然堿基，并由一個或兩個所述非天然堿基所分隔；(b)篩選所述序列，僅選擇G/C濃度為50%或50%以上的那些序列；(c)測試所述序列的解鏈溫度(Tm),僅選擇Tm約為80-85。C的那些序列；(d)分別用相同序列和互補序列交叉雜交所述序列；(e)僅選擇與所述相同序列最多3體相互作用的那些序列。在本發(fā)明的上述兩個方面，均優(yōu)選以下這樣非天然堿基選自異鳥噪呤核苷和異胞嗜啶，序列長20至25個堿基，Tm約為85。C。本發(fā)明的高度正交的通用序列可用于單重或多重bDNA分析來對樣本中的mRNA進(jìn)行定量，檢測樣本中的病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和SNP并對其進(jìn)行基因分型以及測量樣本中的基因擴增或缺失情況。高度正交的通用序列通常還可用作核酸分析中的通用捕獲探針，此時它可用來以有助于進(jìn)一步分析的方式將分析組分選擇性結(jié)合至基底。本發(fā)明其它方面的優(yōu)點和特點的一部分將在隨后的描述中進(jìn)行闡述，一部分通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員查閱下文后將會變得顯而易見的，或者可通過實施本發(fā)明而獲知。附圖簡述本專利的文件包含至少一幅彩圖。在提出請求并支付必要的費用后，美國專利商標(biāo)局可提供包含彩圖的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏母北?。圖1A示出用作制備本發(fā)明的正交通用序列的起始點的方案。圖IB示出本發(fā)明的正交通用序列的方案；所示序列長20至25個堿基，G/C濃度約為50%,解鏈溫度介于80-85°C，并且交叉反應(yīng)性最小。圖2為示出在使用bDNA的九重細(xì)胞因子mRNA定量分析中使用請求保護的本發(fā)明的正交序列的圖。圖3A為對比圖，示出本發(fā)明的正交序列與Zipcode序列對0.1pmol把標(biāo)的交叉相互作用。圖3B為對比圖，示出本發(fā)明的正交序列與Zipcode序列對1pmol#巴標(biāo)的交叉相互作用。實現(xiàn)發(fā)明的最佳方式定義和術(shù)語在對本發(fā)明的具體實施方案進(jìn)行描述之前，對用來描述本發(fā)明的定義進(jìn)行闡述是有用的。所述定義僅可應(yīng)用于在本專利中所使用的術(shù)語，而不適用于其它地方如科學(xué)文獻(xiàn)或包括這些發(fā)明人或轉(zhuǎn)讓給共有人的其它申請在內(nèi)的其它專利或申請。下文對優(yōu)選的實施方案和實施例的描述以說明和例證方式提供。因此，不應(yīng)將它們看作對權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明范圍的限定。另外，給出實例時，這些實例旨在示例而非限定。例如，某個實例述及"包括"某一特定特征，這旨在表明該實例可具有該特征，而不是將這些實例限定為包含該特征的那些實例。必須注意的是，除非上下文明確指明相反，本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)指代對象。同樣，術(shù)語"任選的"或"任選地"的使用意味著隨后描述的事件或情況出現(xiàn)與否均可，并且意味著說明書包括所述事件或情況出現(xiàn)的情形以及不出現(xiàn)的情形。在對本發(fā)明進(jìn)行描述和要求保護中將使用具有如下定義的術(shù)語。術(shù)語"正交序列"指Watson-Crick相互作用匹配完美的序列。例如，雙螺旋中的序列ATCG與序列TAGC正交。具有高度正交序列的核酸通常具有理想的二級結(jié)構(gòu)。術(shù)語"通用序列，，或"通用探針"在本文中可互換使用，指的是可用來測試多個不同樣本的序列或探針，換言之，通用序列或通用探針獨立于被研究序列。因此，本發(fā)明的"高度正交的通用序列"指這樣的序列，即該序列具有嚴(yán)格的Watson-Cnck相互作用，并不適合于鑒定特定樣本，而可用于在例如多重分析中對多個樣本進(jìn)行篩選。正如本文所述，本發(fā)明的高度正交的通用探針是等溫的(isothermal),動力學(xué)始終如一，并展現(xiàn)出極小的非特異性交叉雜交。術(shù)語"核酸分析物"指用于分析的核酸即DNA或RNA。術(shù)語"靶標(biāo)"指分子、基因或基因組，其含有意欲通過鑒定、定量或擴增來進(jìn)行表征的核酸序列或序列片段。本發(fā)明所述及的靶標(biāo)可來源于任何生物，包括哺乳動物和除哺乳動物外的動物、細(xì)菌、病毒或真菌。反轉(zhuǎn)錄病毒是可在bDNA分析中使用本發(fā)明的高度正交的通用序列鑒定或定量的靶標(biāo)的一個實例。應(yīng)理解的是，如若需要，術(shù)語"核酸分析物"、"靶標(biāo)"和"靶標(biāo)核酸分析物，，可互換使用，以鑒定用于表征的生物內(nèi)的核酸、核酸序列或核酸序列區(qū)段、細(xì)菌或病毒。本文所使用術(shù)語"樣本"指的是獲自生物例如人的流體或組織，其含有有待表征的核酸分析物。這類樣本為本領(lǐng)域所知，包括但不限于血液、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、細(xì)胞裂解物、眼淚、唾液、精液、奶以及皮膚、呼吸道、腸道或胃腸道的分泌物。所研究核酸分析物可為來自宿主或非宿主遺傳物質(zhì)的遺傳物質(zhì)。因此，例如獲自人類個體的樣本可含有人的遺傳物質(zhì)和/或感染病原體(如細(xì)菌、病毒或真菌等)的遺傳物質(zhì)?？赏ㄟ^使用常規(guī)技術(shù)，例如針吸活組織檢查或擦拭等，自生物組織或流體樣本獲得本文所述的這些樣本。本文所使用術(shù)語"病毒"通常用來指DNA病毒和RNA病毒，后者被稱為"反轉(zhuǎn)錄病毒"。本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，DNA病毒通過將DNA整合至宿主基因組進(jìn)行復(fù)制，而反轉(zhuǎn)錄病毒通過將RNA整合至宿主基因組進(jìn)行復(fù)制。對DNA病毒進(jìn)行篩選時，雙鏈病毒DNA必須從蛋白外殼釋放并變性，目的是將兩條鏈分開。然后將單鏈病毒DNA與結(jié)合基底的捕獲探針雜交，并用bDNA分子來擴增單鏈DNA。對RNA反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行篩選時，病毒RNA自病毒蛋白外殼釋放并與所結(jié)合的捕獲探針雜交。由于病毒RNA并非雙鏈，因此無需變性步驟。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可用bDNA分析篩選DNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒。術(shù)語"基因"指的是DNA分子內(nèi)的特定核酸序列，其位于染色體上的精確的基因座上，并且能通過編碼特定多肽鏈進(jìn)行自我復(fù)制。術(shù)語"基因組"指的是特定生物體的每個細(xì)胞的染色體中的整套基因。術(shù)語"基因擴增"指的是生物體的基因組中特定基因的拷貝數(shù)的增加。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，基因組內(nèi)存在某個基因的多個拷貝可產(chǎn)生水平升高的相應(yīng)蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用術(shù)語"核苷酸"和"核苷"指的是這樣的核苷和核苷酸它們不僅含有四個天然的DNA核苷酸;威基，即嘌呤石成基鳥噤呤(G)和腺。票呤(A)以及嘧啶堿基胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，還含有RNA噤呤堿基尿嘧啶(U)、非天然核苷酸堿基iso-G和iso-C、通用堿基、簡并堿基(degeneratebase)以及其它經(jīng)修飾的核香酸和核香。通用石威基為這樣一類堿基，即所述堿基具有替換四個正常堿基中的任何一個堿基、并且不會顯著影響雙鏈體的解鏈行為或寡核苷酸的生化功用的能力。通用堿基的實例包括3-硝基吡咯和4-、5-和6-硝基吲哚以及2-脫氧肌苷(dl),后者被認(rèn)為是唯一的"天然"通用堿基。盡管在理論上dl可結(jié)合所有的天然堿基，但是它主要作為G編碼。簡并堿基由嘧啶衍生物6H,8H-3,4-二氫嗜咬并[4,5-c][1,2]嗪-7-酮(P)(在其被引入具有G或A的寡核苷酸堿基對時)和嘌呤衍生物N6-曱氧基-2,6,-二氨基嘌呤(K)(在其被引入具有C或T的寡核苷酸堿基對時)組成。P和K堿基對的實例包括P-亞氨基、P-氨基、K-亞氨基和K-氨基。對核苷酸和核苷的修飾包括但不限于嘌呤或嘧啶部分的曱基化或酰化、不同雜環(huán)結(jié)構(gòu)對嘧咬環(huán)或噤呤環(huán)系統(tǒng)中的一個或兩個環(huán)的取代以及對一個或多個官能團的保護，例如使用保護基團如乙?；?、二氟乙?；?、三氟乙酰基、異丁?；⒈綍貂；取＝?jīng)修飾的核苷和核苷酸還包括對糖部分的修飾，例如，其中一個或多個羥基被卣素和/或烴基取代基(在后一種情況下，通常為脂肪族基團)取代，或者被官能化為醚、胺等。經(jīng)修飾核苷酸和核苷的實例包括但不限于1-曱基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-曱基腺噤呤、N、異戊基-腺。票呤、2-曱硫基-N、異戊基腺噤呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺噪呤、2-硫胞嘧啶、3-曱基胞嘧啶、5-曱基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、1-曱基鳥嘌呤、2-曱基鳥嘌呤、7-曱基鳥嘌呤、2,2-二曱基鳥嘌呤、8-溴-鳥。票呤、8-氯鳥。票呤、8-氨基鳥噤呤、8-曱基鳥噤呤、8-硫鳥嘌呤、5-氟-尿嘧咬、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘代尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-曱氧基尿嘧啶、5-羥曱基尿嘧啶、5-(羧基羥基曱基)尿嘧啶、5-(曱基-氨曱基)尿嘧啶、5-(羧曱基氨曱基)-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-曱基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸(oxyaceticacid),尿口密口定-5隱氧乙酸甲酉旨(oxyaceticacidmethylester)、假尿嘧啶、1-甲基尿嘧啶、Q核苷(queosine)、肌肝、l-曱基肌肝、次黃噤呤、黃噤呤、2-氨基噪呤、6-幾基氨曱基噤呤、6-硫代嘌呤和2,6-二氨基噤呤。本文所使用的術(shù)語"寡核苷酸"包括多脫氧核糖核普酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核香酸(含D-核糖)，為噤呤或嘧啶堿基的N-糖苷的任何其它類型的多核苷酸以及含有非核苷酸骨架(如購自Anti-GeneDevelopmentGroup,Corvallis,Oregon的蛋白#亥酸和合成型序列特異'l"生^亥酸聚合物，為NeugeneTM聚合物形式)或非標(biāo)準(zhǔn)鍵的其它聚合物，前提是聚合物含有構(gòu)象為可進(jìn)行諸如DNA和RNA中的堿基配對和堿基堆集(stacking)的核酸堿基(necleobase)。因此，本文的"寡核苷酸"包括雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA和DNA:RNA雜合體，并且還包括已知類型的經(jīng)修飾寡核苷酸，例如其中一個或多個天然存在的核苷酸被類似物取代的寡核苷酸；含有核苷酸間修飾的寡核苷酸，所述核苷酸間修飾為例如具有不帶電的鍵的核苷酸間修飾(如曱基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基曱酸酯等)、帶負(fù)電的鍵的核普酸間修飾(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)以及帶正電的鍵的核苷酸間修飾(如氨烷基亞磷酰胺、氨烷基磷酸三酯)；含有懸掛(pedant)部分的核苷酸間修飾，例如蛋白質(zhì)(包括核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)，具有插入物的核苷酸間修飾(如吖啶、補骨脂素等)，含有螯合劑的核苷酸間修飾(如金屬、放射性金屬、硼、金屬氧化物等)以及含有烷化劑(alkylator)的核苷酸間修飾。術(shù)語"多核苷酸"和"寡核苷酸"之間在長度上沒有預(yù)定的差異，這些術(shù)語將互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。本文所使用的核苷酸和多核苷酸的符號以IUPAC-IUBMB聯(lián)合委員會生物化學(xué)命名為依據(jù)(參見http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iupac/jcbn)?？赏ㄟ^已知方法合成寡核苷酸。通常與合成寡核苷酸的方法相關(guān)的背景參照物包括涉及基于使用P-氰乙基磷酸酯保護基從5，至3'合成的那些背景參照物。參見例如deNapohetal.,GAZZCHIMITAL114:65(1984);Rosenthaletal.,TETRAHEDRONLETT24:1691(1983);BelagajeandBmsh,NUCACIDSRES10:6295(1977);描述了5，至3，的液相合成的參考文獻(xiàn)包括HayatsuandKhorana,JAMCHEMSOC89:3880(1957);GaitandSheppard,NUCACIDSRES4:1135(1977);CramerandKoster,ANGEWCHEMINTEDENGL7:473(1968)和Blackburnetal.,JCHEMSOCPARTC,at2438(1967)。另外，MatteucciandCaruthers,JAMCHEMSOC103:3185-91(1981)描述了使用亞褲酰氯(phosphochloridites)制備寡核香酸，BeaucageandCaruthers,TETRAHEDRONLETT22:1859-62(1981)以及授權(quán)給Caruthers等人的美國專利No.4,415,732描述了使用亞磷酰胺制備寡核香酸。Smith,AMBIOTECHLAB,pp.15-24(December1983)描述了自動固相寡脫氧核糖核苷酸合成，并且T.HornandM.S.Urdea,DNA5:421-25(1986)描述了使用雙(氰基乙氧基)-N,N-二異丙基氨基膦(bis(cyanoethoxy)國N,N畫diisopropylaminophosphine)對固相支持的DNA片)爻進(jìn)4亍磷酸化。還參見Smith(同上)所引用的文獻(xiàn)；Warneretal.,DNA3:401-11(1984);andT.HornandM.S.Urdea,TETRAHEDRONLETT27:4705-08(1986)。術(shù)語"互補"和"基本互補"指核苷酸或核酸之間的堿基配對，例如雙鏈DNA分子的兩條鏈之間或寡核苷酸引物和有待測序或擴展的單鏈核酸上的引物結(jié)合位點之間的堿基配對。通?；パa核苷酸為A和T(或A和U)以及G和C。本文所使用的術(shù)語"探針"指包含多核香酸的結(jié)構(gòu)，由于探針的至少一個序列與靶標(biāo)序列之間的互補性，所述多核苷酸與進(jìn)行分析的樣本中的分子(即"靶標(biāo)分子")中所含有的靶序列形成雜合體結(jié)構(gòu)。任何具體探針的核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或合成型核苷酸類似物。術(shù)語"引物"指的是包含寡核苷酸、在純化的限制性酶切消化補的引物延長產(chǎn)物的條件下，即在合適的緩沖系中，在合適的核苷酸和聚合劑(如DNA聚合酶)存在的情況下，以及適當(dāng)?shù)臏囟认?，該分子能作為合成起點。術(shù)語"雜交條件"旨在表示那些足以使得至少一部分互補序列彼此退火的時間、溫度和pH條件以及必要量和濃度的反應(yīng)物和藥劑。正如本領(lǐng)域所知，完成雜交所需時間、溫度和pH條件取決于待雜交寡核苷酸探針的大小、寡核苷酸探針和靶標(biāo)之間的互補程度以及雜交反應(yīng)混合物中是否存在其它物質(zhì)。本領(lǐng)域已知每步雜交所需的實際條件，即該條件無需過多實驗即可確定。常規(guī)雜交條件包括使用pH被緩沖為約7至約8.5的溶液以及約30。C至約6CTC的溫度(優(yōu)選約37。C至55。C的溫度)進(jìn)行約一秒至約一天(優(yōu)選地，約15分鐘至約16小時，最優(yōu)選地，約15分鐘至約三小時)的一段時間。"雜交條件"還包括有效的緩沖系。可使用與探針和其它組分相容(即不起化學(xué)作用、但卻可使互補堿基對之間進(jìn)行雜交)的緩沖系。一種特別優(yōu)選的緩沖系包含3XSSC、50%曱酰胺、10。/o硫酸葡聚糖(MW500,000)、0.2%酪蛋白、10貼/mLpolyA和100昭/mL變性鮭精DNA，其中IXSSC為0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉。另一種特別優(yōu)選的緩沖系包含5XSSC、0.1至0.3%十二烷基硫酸鈉、10%硫酸葡聚糖、1mMZnCl2和10mMMgCl2,其中1XSSC如上所述。其它合適的緩沖系是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，從樣本分離DNA和RNA靶序列需要不同雜交條件。例如，若樣本起初在堿性緩沖系中遭到破壞，那么就使得雙鏈DNA變性并且破壞了RNA。相反，若在含SDS和蛋白酶K的中性緩沖系中收集樣本，那么DNA依然為雙鏈，不能與探針雜交，并且RNA受到保護，免于降解。術(shù)語"基底"指的是想要的寡核苷酸可錨定的任何固體或半固體表面。合適的基底包括可固定寡核苷酸的任何物質(zhì)，包括例如玻璃，竭酸纖維素，塑料包括聚氯乙烯(如薄片或微量滴定孔形式)、聚苯乙烯乳膠(如小球或微量滴定板形式)、聚偏氟乙烯(如微量滴定板形式)、聚苯乙烯(如小球形式)，金屬、聚合物凝膠等等。術(shù)語"支持物"指的是探針、分析物分子或其它化學(xué)個體可錨定的任何固體表面(包括半固體表面)。合適的支持物材料包括但不限于通常用于固相化學(xué)合成的支持物，如聚合材料(如聚苯乙烯、據(jù)醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚曱基丙烯酸曱酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚偏乙烯、聚碳酸酯、基于苯二乙烯-苯乙烯的聚合物)、瓊脂糖(如Sepharose)、葡聚糖(如Sephadex)、纖維素聚合物和其它多糖、二氧化硅和基于二氧化硅的材料、玻璃(可控多孔玻璃)和官能化玻璃和陶瓷。優(yōu)選的支持物是小球或顆粒形式的固體基底，其包括^鼓粒和納米顆^立。本文所使用術(shù)語"標(biāo)記"指任何原子或分子，所述原子或分子可用來提供檢測(優(yōu)選定量)信號，并可通過共價鍵或非共價相互作用(如通過離子鍵或氫鍵，或通過固定、吸附等)連接核酸或蛋白質(zhì)。標(biāo)記通?？商峁┩ㄟ^熒光法、化學(xué)發(fā)光法、放射法、比色法、質(zhì)譜法、X-射線衍射或吸收法、磁學(xué)法、酶活性法等檢測的信號。合適的標(biāo)記包括具有特定結(jié)合配偶體的熒光團、發(fā)色團、放射性原子(尤其是"P和1251)、電子致密物(electron-densereagent)、酶和配體。酶通常通過其活性4企測。例如，通過其將3,3，,5,5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化為可用分光光度計定量的藍(lán)色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶(HRP)。應(yīng)理解的是，由于一種標(biāo)記可使用兩種或多種不同方法檢測，所以上面的描述無意于將多種標(biāo)記分成不同類別。例如，1251可作為放射性標(biāo)記，也可作為電子致密物。HRP可作為酶或作為單克隆抗體(mAb)的抗原。另外，可就所需作用結(jié)合多種標(biāo)記。例如，mAb和親和素(avidin)在實施本發(fā)明中也需要標(biāo)記；因此，可用生物素標(biāo)記探針，并用1251標(biāo)記的親和素或HRP標(biāo)記的抗生物素mAb或者綴合親和素或鏈霉親和素的HRP分子檢測其是否存在。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，其它排列和可能性是顯而易見的，并且被認(rèn)為是等價方案。術(shù)語"靶標(biāo)擴增"指的是擴增基因或一部分基因的過程，例如PCR或線性擴增(參見PhillipsandEberwine,METHODS10(3):283-288(1996》。術(shù)語"PCR"指的是授權(quán)給Mullis等人的美國專利No.4,683,195和授權(quán)于Mullis的美國專利No.4,683,202中公開的多聚酶鏈反應(yīng)("PCR")技術(shù)，兩份專利均通過引用納入本文。簡而言之，在PCR技術(shù)中，將溶液的DNA樣本與摩爾過量的每個均為10-30個石威基對的兩個寡核苷酸引物(被制備成與DNA雙螺旋的每條鏈的3，末端互補)、摩爾過量的未連接的核苷酸堿基(dNTP)和DNA聚合酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定的Taq聚合酶，它催化由寡核苷酸引物和dNTP形成DNA)混合。兩個引物中，一個為沿5，-3，方向結(jié)合變性DNA分析物的一條鏈的3'端的正向引物，另一個為沿3'-5'方向結(jié)合變性DNA分析物的另一條鏈的3'端的反向引物。將溶液加熱至94-96°C,以使雙鏈DNA變性成為單鏈DNA。溶液冷卻時，引物與分開的鏈結(jié)合，DNA聚合酶通過使dNTP與引物相連來催化合成分析物的一條新鏈。重復(fù)該過程，在由引物合成的延伸產(chǎn)物與其互補物分開時，每個延伸產(chǎn)物可作為由另一引物合成的互補延伸產(chǎn)物的模板。換言之，由正向引物合成的延伸產(chǎn)物一旦分開，即可作為由反向引物合成的互補延伸產(chǎn)物的模板。同樣，由反向引物合成的延伸產(chǎn)物一旦分開，即可作為由正向引物合成的互補延伸產(chǎn)物的模板。通過這種方式，引物之間的DNA區(qū)域可通過該過程的每次重復(fù)選擇性復(fù)制。由于被擴增的序列在每個循環(huán)之后倍增，因此理論上擴增十億個拷貝可在重復(fù)該過程幾小時后實現(xiàn)；因此，使用PCR可在相對4交短的時間里對極少量的DNA加以擴增。若用于PCR反應(yīng)的起始材料為RNA,那么可通過反轉(zhuǎn)錄自RNA制備得到互補DNA("cDNA")。然后使用上述PCR方案對所得到的cDNA進(jìn)行擴增。反轉(zhuǎn)錄酶作為在反轉(zhuǎn)錄病毒中發(fā)現(xiàn)的酶被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，其可從作為模板的mRNA序列來合成DNA的互補單鏈。該酶可用于遺傳工程中，以自純化制備的mRNA產(chǎn)生特異的cDNA分子。用來擴增RNA產(chǎn)物的PCR被稱為反轉(zhuǎn)錄酶PCR或者"RT-PCR，，。術(shù)語"單重"指的是并不同時進(jìn)行其它分析的一個分析。單重分析包括連續(xù)進(jìn)行的各個分析。通常該分析為雜交分析。術(shù)語"多重"指的是同時進(jìn)行的多個分析，其中檢測和分析步驟通常平行進(jìn)行。本文所使用的多重分析還可根據(jù)分析旨在鑒定的靶分子的數(shù)目命名。例如，被設(shè)計來鑒定六種細(xì)胞因子的多重分析可被稱為"六重"分析，被設(shè)計來鑒定十一種細(xì)胞因子的多重分析可被稱為"十一重"分析。與單重分析一樣，多重分析通常為雜交分析。若無相反指明，本文所使用術(shù)語"bDNA分析"指單重和多重bDNA分析。盡管任何相似或等價的方法和物質(zhì)可用來實施或測試本發(fā)明，但是下面還是要對優(yōu)選的方法和物質(zhì)進(jìn)行描述。正交序列本發(fā)明的一個實施方案中提供了含有四個天然堿基和兩個非天然堿基的高度正交的六堿基通用序列，其中以非特定順序排列的一至四個所述天然堿基選自鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺苦(A)和胸普(T)或尿嘧啶(U)，并由所述一個或兩個非天然堿基所分隔，由此使得約50%的所述序列含有G/C堿基，并使得所述序列的解鏈溫度(Tm)約為80-85。C。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述兩個非天然堿基為異鳥嘌呤或異胞嘧啶。如實施例2所示，還優(yōu)選序列的Tm約為85°C。雖然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，序列的長度根據(jù)其預(yù)定用途將有所變化，但是理想的是，序列長20至25個堿基。例如，在某些情況下，序列不到20體或長于25體可能是優(yōu)選的。在這方面，長10-50個堿基的序列包括在本發(fā)明中，優(yōu)選序列長15-30個堿基，最優(yōu)選序列長20-25個堿基。如上所述，要求保護的正交通用序列的四個天然堿基選自下列核苷酸DNA被雜交的情況下，鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺苷(A)和胸苷(T);和RNA被雜交的情況下，鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺苷(A)和尿嘧啶(U)。鳥苷和腺苷為噤呤，由六元和五元含氮稠環(huán)組成，而胞嘧啶、胸苷和尿嘧咬為噤呤，由六元含氮環(huán)組成。天然堿基核苷酸形成了噤呤-嗜啶堿基對G/C和A7T(U)。G/C堿基對的結(jié)合能大于A/T堿基對的結(jié)合能，原因在于與后者中的兩個石威基相比較，前者存在三個氬鍵合部位，如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>由于G/C堿基對的較高的結(jié)合能，冨含G/C的序列的解鏈溫度(Tm,即50%的序列與其互補序列退火的溫度)較A/T含量豐富的序列的高。序列的Tm可通過任一如下方法提高增加序列的G/C含量；增加<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>分子的長度，即較長的DNA比較短的DNATm更高；增加序列的離子強度(以增加陽離子，減少DNA骨架的排斥力)；調(diào)節(jié)序列的pH(因為極端pH值會使堿基離子化并破壞H鍵，超過pH5-9，Tm會急劇下降)；并仔細(xì)選擇溶劑(已知有機溶劑可降低Tm)。確定適用于大約為中性pH的水溶液的Tm的公式為"。/oG/C-法"Tm(。C)=81.5。C+16.6(log[Na+〗)+0.41(%GC)-675/n,其中n為序列中核苷酸的數(shù)目。通過用該公式計算Tm,可確定序列的退火溫度，無需使用物理方式用UV分光光度計測量序列。必須對序列的退火溫度進(jìn)行預(yù)測來設(shè)定PCR實驗設(shè)計時，使用這個公式是有用的。廣泛用來確定序列的退火溫度的另一個公式為如下較短的公式。Td(。C)=2[A+T]+4[C+G]該公式可確定解離溫度(Td)(即50%的序列與其膜結(jié)合互補序列退火的溫度)而非Tm，已發(fā)現(xiàn)對于長14-20個堿基對的序列而言該公式是準(zhǔn)確的。使用該公式時，用于PCR目的的序列的退火溫度通常被計算為Td-5。因此，例如，若表1的寡核苷酸CP1或CE1用作PCR引物，那么引物的退火溫度為69.7°C(Td)減去5即64.7°C。預(yù)測核苷酸序列的Tm的其它公式為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，包括例如"最近毗鄰"法，這種方法在http:〃micx>,nwfsc,noaa,goy/protocQls/methQds/DNA-PCRMethQdsDocs/10-2002/10.8.02.2167.html中解釋—對預(yù)測核苷酸序列的Tm的可選公式的討論示于Ahsenetal.,CLINICALCHEMISTRY47(11):1956醫(yī)1961(2001)中。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選高度正交的序列的Tm約為80°C，更優(yōu)選地，85°C。應(yīng)當(dāng)理解，Tm為80-85。C的范圍是高度正交的通用序列的優(yōu)選范圍，但在某些情況下，低于80。C或高于85。C的Tm可能是優(yōu)選的。因此，在某些情況下，約75。C或90°C的Tm可能是序列優(yōu)選的Tm。如上所述，正交通用序列中的G/C含量會影響序列的Tm。因此，盡管最優(yōu)選正交通用序列的G/C含量約為50%,但是應(yīng)當(dāng)理解，G/C濃度大于50%的序列也在本發(fā)明考慮范圍內(nèi)；因此，在某些情況下，優(yōu)選G/C濃度大于50%的序列，例如G/C濃度范圍為51%至75%或更高的序列。如上所述，iso-G和iso-C之間的氫鍵合模式不同于G和C之間的氫鍵合模式，因此，iso-G和iso-C與天然堿基不發(fā)生相互作用；iso-G和iso-C的鍵合模式如下所示盡管本發(fā)明的優(yōu)選序列長為20至25個堿基，但是應(yīng)理解的是，在某些情況下，少于20體或長于25體的序列可能是優(yōu)選的。本發(fā)明的高度正交的通用序列可通過下述方法制備(a)從六個核苷酸堿基制備5，至3，序列，所述六個核苷酸堿基含有兩個非天然堿基和選自鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺苷(A)和胸苷(T)或尿嘧啶(U)的四個天然堿基，其中所述序列含有以非特定順序排列的一至四個天然堿基，并由兩個非天然堿基的一個或兩個堿基分隔；(b)篩選所述序列，僅選擇G/C濃度為50%或50%以上的那些序列；(c)測試所述序列的解鏈溫度(Tm),僅選4奪Tm約為80-85。C的那些序列；(d)分別用相同序列和互補序列交叉雜交所述序列；并(e)僅選擇與所述相同序列有最多3體相互作用的那些序列。圖1A顯示了要求保護的正交序列的普通結(jié)構(gòu)。圖1B顯示了經(jīng)重排使得具有約50%G/C組合物和解鏈溫度約為80-85。C的正交序列。實施例2描述了圖1B所示探針的產(chǎn)生，并且如實施例2所述，該探針來源于圖1A的普通結(jié)構(gòu)。如上所述，優(yōu)選地，非天然堿基選自異鳥苦和異胞嘧啶，并且序列長約20至25個堿基，Tm約為85。C。信號檢測如上所述，本發(fā)明高度正交的通用序列被用作bDNA分析的CP、CE、LE或擴增探針(參見例如實施例2-4),bDNA分析的信號擴增是由于結(jié)合LE探針、bDNA擴增分子上的分支數(shù)目以及bDNA擴增探針的每個分支上的堿性磷酸酶或其它酶標(biāo)記的結(jié)合位點的數(shù)目所致。任何類型的標(biāo)記均可用來檢測本文所述信號擴增產(chǎn)物，并且對bDNA擴增探針進(jìn)行標(biāo)記可通過本領(lǐng)域已知的任何方法完成；這些方法通常取決于標(biāo)記的性質(zhì)。優(yōu)選的標(biāo)記包含通過光譜法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法或化學(xué)法可檢測的那些部分。這類標(biāo)記包括但不限于熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、染料、生物素、半抗原、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、酶亞基、金屬離子、電子致密物和放射性同位素(如32P)。標(biāo)記部分可直接或間接連接擴增子。優(yōu)選地，若標(biāo)記直接連接引物，則應(yīng)選擇能經(jīng)受住變性條件的標(biāo)記。盡管并不必要，但標(biāo)記還是優(yōu)選為生物素，生物素可通過與偶聯(lián)熒光劑的鏈霉親和素(例如鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物)的結(jié)合來檢測。對于焚光劑，可使用多種熒光計。對于化學(xué)發(fā)光劑，可使用發(fā)光計或薄膜。使用酶可提供熒光產(chǎn)物、化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物或有色產(chǎn)物，可通過焚光法、化學(xué)發(fā)光法、分光光度測量法或通過觀察(優(yōu)選在顯微鏡的幫助下)來測定。例如，通過加入鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物，然后對藻紅蛋白誘導(dǎo)的熒光進(jìn)行檢測可檢測生物素化的標(biāo)記。固體基底所提供的每種信號可通過任何常規(guī)方法檢測。例如，信號可以基底形狀為基礎(chǔ)，其中第一檢測信號和第二檢測信號的不同之處在于相應(yīng)固體基底的形狀不同。但是，優(yōu)選地，每組固體基底，例如，大部分的第一固體基質(zhì)產(chǎn)生所述大部分固體基質(zhì)特有的信號。因此，例如，每種第一固體基質(zhì)具有笫一檢測信號，每種第二固體基質(zhì)具有第二檢測信號。另外，第一和第二檢測信號可由選自下列的部分所提供熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、染料、生物素、半抗原、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、酶亞基、金屬離子、電子致密物和放射性同位素。但是，最優(yōu)選固體基底為小球，其中檢測信號由一種或多種熒光染料提供。適合染色的基底的實例如小球描述于授權(quán)給Chandler等人的美國專利No.6,268,222。如上所述，固體基底包含熒光染料和有色染料的組合。優(yōu)選的染料包括其特征在于發(fā)射波長為550nm至卯0nm的花青(cyamne)染料。一些花青染料具有藍(lán)色至藍(lán)綠色熒光，而另一些具有綠色至黃綠色熒光。另外，其它花青染料具有紅色甚或紅外熒光。花青染料或任何其它常規(guī)染料可通過共價鍵與基底連接或被吸附如"被染色"于其上。另外，基底可連接一群或多群經(jīng)熒光染色的納米顆粒，其中指定群體中的全部納米顆粒具有相同的染料濃度。通過改變針對連接基底的不同群體的納米顆粒的不同染料的數(shù)量和比率，能建立和辨別大量具有獨特發(fā)射光譜的不同類別的基底。這類經(jīng)獨特標(biāo)記的基底可特別用于序列的多重分析，并且可通過使用流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行方便地檢測和分析。這類小球還可自供應(yīng)商例^口LuminexCorporation(Austin,Texas)購買。直徑小于一毫米的基底可用于流式細(xì)胞儀，雖然也可使用其它大小的顆粒。但是，優(yōu)選地，使用球形的基底，例如小球。這類小球的大小為約0.1至1,000pm，優(yōu)選1至100pm，更優(yōu)選2至50,進(jìn)一步優(yōu)選3至25pm，最優(yōu)選直徑為約3至10nm的小球。這個大小的小球適用于流式細(xì)胞儀，由此可提供對復(fù)合物進(jìn)行檢測和計數(shù)的簡單方法。盡管并不必要，但是固體基質(zhì)還是優(yōu)選由聚合材料如聚苯乙烯制備。其它可用的聚合材料包括溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛(polyacrolein)、聚丁二烯、聚己酸內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二曱酸乙酯、聚二曱基硅氧烷、聚異戊二烯、聚氨酯、聚乙烯乙酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯芐基氯、聚曱基苯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯苯、聚曱基丙烯酸曱酯、聚交酯、聚乙醇酸交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈(polyphosphazene)、polyphosophaze、聚諷及其組合。這些聚合物還可摻入選自下列物質(zhì)的i茲性或》茲性應(yīng)答(magneticallyresponsive)金屬IU匕物超順磁金屬氧化物、順磁金屬氧化物、鐵氧性金屬氧化物(ferrimagnetic)、反鐵磁性金屬氧化物(antiferromagnetic)和鐵磁性金屬氧化物(ferromagneticmetaloxides)。實用性要求保護的發(fā)明的高度正交的通用序列在多種應(yīng)用例如診斷分析和遺傳分析等中具有實用性。具體而言，高度正交的通用序列可用于單重或多重bDNA分析，以定量和定性地確定樣本中的mRNA水平；以篩選樣本中少量存在的靶標(biāo)(例如病毒等)并對其進(jìn)行基因分型；以及，以篩選樣本中的SNP并對其進(jìn)行基因分型。高度正交的通用序列還可用作通用捕獲探針，來固定PCR和用于進(jìn)一步分析的其它基因擴增方法產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的高度正交的通用序列可用于單重或多重bDNA分析，以對樣本中的mRNA進(jìn)行定量。實施例3描述了使用高度正交的通用序列對細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量，并在國2示出。在該實施例中，在多重bDNA分析中定量九種細(xì)胞因子的mRNA。實施例3的結(jié)果表明本發(fā)明的高度正交的通用探針可準(zhǔn)確定量mRNA，并特別證實本發(fā)明的高度正交的通用序列用于多重bDNA分析來對靶mRNA進(jìn)行定量時，靶標(biāo)之間的交叉反應(yīng)性的程度可忽略不計。顯然應(yīng)當(dāng)理解，可在單重bDNA細(xì)胞因子分析中對唯——種細(xì)胞因子的mRNA進(jìn)行篩選和定量。將高度正交的通用序列用于bDNA分析對mRNA進(jìn)行定量并不局限于對細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量；高度正交的序列可用于bDNA分析來，以對任何樣本的mRNA進(jìn)行定量。例如，本文所述的bDNA分析可用于樣本例如細(xì)胞、血液、組織等，目的在于對特定基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量。以這種方式使用高度正交的探針的bDNA分析的用途頗為廣泛。例如，對mRNA的定量可用于臨床診斷，以對腫瘤細(xì)胞中的抗藥性標(biāo)記的調(diào)控和表達(dá)進(jìn)行定量，監(jiān)控對化療的反應(yīng)性，測量基因編碼療法的生物分布和轉(zhuǎn)錄，提供腫瘤階段的分子評估，檢測癌癥患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及檢測細(xì)菌性和病毒性病原體。除了在bDNA分析中使用高度正交的序列來對mRNA水平進(jìn)行定量外，高度正交的序列還可用作bDNA分析中的探針來測量例如在基因擴增或缺失時樣本中基因的量的改變。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，高度正交的通用序列可用于單重分析，以對樣本中的一種基因的拷貝的擴增或缺失情況進(jìn)行測量，或者可將其用于多重分析，以對樣本中的多個基因的擴增或缺失情況進(jìn)行測量。待測的一種或多種基因與任何疾病狀況相關(guān)。作為示例，若疾病狀況是癌癥，那么可用高度正交的通用序列進(jìn)行確定若腫瘤樣本中存在額外拷貝的癌基因，則表明該腫瘤是惡性的，或者若之前的癌樣本中存在極少拷貝的基因，則表明癌癥得到減輕。致癌基因為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，其包括但不限于諸如p53癌基因和Her-2/neu基因等測到是由于乳腺癌腫瘤的快速生長所致。致癌基因的數(shù)據(jù)庫由美國國立癌癥研究所的癌癥基因組辦公室公布于因4爭網(wǎng)上，網(wǎng)址是http:〃www3.cancer.gov/ocg/—在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的高度正交的六堿基通用序列可用于bDNA分析，以檢測具有低病毒載量的DNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒。這類DNA基因包括但不限于牛和人乳頭瘤病毒(分別為"BPV"和"HPV");多瘤病毒例如猿猴病毒40("SV40")和人多瘤病毒；腺病毒；皰滲病毒例如愛潑斯坦-巴爾病毒("EBV")、人巨細(xì)胞病毒和(CMV")、單純皰滲病毒("HSV");和曱型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒("HAV"、"HBV"、"HCV"和"HDV")。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，盡管HBV為DNA病毒，但是其表現(xiàn)與反轉(zhuǎn)錄病毒更相似，原因在于它可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。因此，就HBV而言，病毒DNA被轉(zhuǎn)錄成為RNA,以制備病毒蛋白質(zhì)并進(jìn)行基因組復(fù)制，隨后，基因組RNA被反轉(zhuǎn)錄為基因組DNA。通過使用本發(fā)明的高度正交的通用序列可在bDNA分析中鑒定的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于腫瘤病毒例如鼠白血病病毒("MLV")、牛白血病病毒("BLV，，)和人T-細(xì)胞親淋巴病毒("HTLV)以及慢病毒，如人類免疫缺陷病毒("HIV")。作為一個實例，使用高度正交的序列的bDNA分析可檢測HIVRNA的不到50個分子/mL的fflV病毒載量。如上所述，通過將現(xiàn)有分析中普遍存在的分析物交叉反應(yīng)性最小化，本文所述高度正交的通用序列顯著提高了病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒定量分析的靈敏度(參見實施例4以及圖3A和3B)。在本發(fā)明的又一實施方案中，本發(fā)明的高度正交的通用序列用于單重或多重形式的bDNA分析，來對樣本中的SNP進(jìn)行篩選，并對其進(jìn)行基因分型。多重SNP基因分型的實例描述于Iannoneetal.,同上，132頁。Iannone等人使用寡核苷酸連接分析法("OLA")來鑒定基因組樣本中的SNP。在OLA中，將兩個寡核苦酸探針與耙DNA雜交，由此使得一個寡核苷酸(探針)的3'端與第二個探針的5'端緊密相鄰。若兩個寡核苷酸探針與靶DNA完美地進(jìn)行堿基配對，那么DNA連接酶就能以共價方式將兩個探針連接起來。本發(fā)明的正交序列可用于對SNP進(jìn)行基因分型，原因在于它們可用來設(shè)計捕獲探針，所述捕獲探針可用來與通過PCR擴增得到的基因組靶標(biāo)雜交以及與偶聯(lián)孩i球的互補DNA序列雜交。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明高度正交的通用序列可用于單重SNP基因分型分析以及多重SNP基因組分析。在本發(fā)明的再又一個實施方案中，本發(fā)明的高度正交序列若高度正交的通用序列在操作期間可以以有助于進(jìn)一步分析的方式用來將分析組分選擇性結(jié)合至基底，那么它通常還可用作核酸分析中的通用捕獲探針。在使用PCR的靶標(biāo)擴增的上下文中，所研究的核酸分析物分離自樣本，并使用上述PCR方法對其進(jìn)行擴增。高度正交的通用序列可用于選擇性捕捉互補序列，并將擴增子固定至單獨獨特的固相結(jié)合表面。合成每個PCR引物對的一員，使得在其5'端含有正交捕獲序列?？蓪⒂纱水a(chǎn)生的擴增子捕捉至不同的固相，每一種固相均由合適的互補序列衍生化得到。PCR擴增步驟之后，通過通用正交序列對的雜交，所產(chǎn)生的擴增子被捕捉至獨特的固相；擴增子的捕獲可出現(xiàn)在溫度為37至55。C時。由于要求保護的通用序列的高度正交性，通用核苷酸序列和靶標(biāo)擴增產(chǎn)物所固有的一級或二級結(jié)構(gòu)之間的交叉反應(yīng)性最小化。應(yīng)該理解的是，盡管結(jié)合本文所闡述的優(yōu)選具體實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是上文的描述以及下列的實施例旨在示例，無意于限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的是，在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，可作很多改變并用等價方案替換，另外在其它方面，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，與本發(fā)明相關(guān)的優(yōu)點和改進(jìn)是顯而易見的。上文和下文提及或參考的所有專利、公開出版物和其它公開的文獻(xiàn)可通過援引全文納入本文。實施例1除非有相反指明，實施本發(fā)明可使用本領(lǐng)域已知的合成有機化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分說明，參見Sambrook,etal.,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,2ndedition(1989);OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(M.J.Gait,ed.,1984);THEPRACTICEOFPEPTIDESYNTHESIS(M.BodanszkyandA.Bodanszky,2nded.,Springer陽Verlag,NewYork,NY,1994);NUCLEICACIDHYBRIDIZATION(B.D.Haines&S.J.Higgins,eds.,1984);和METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.)。在下面的實施例中，應(yīng)理解的是，盡管已努力確保實驗參數(shù)(如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是在重復(fù)下述實驗時，應(yīng)考慮到存在一些實驗誤差和偏差。除非有相反指明，溫度數(shù)值表示為攝氏度，壓力數(shù)值表示為大氣壓或接近大氣壓。另外，除非有相反指明，所有試劑均為商購，所有溶劑均為HPLC級，并且所有反應(yīng)均在惰性氬氣中進(jìn)行。隨后的實施例中所使用的寡核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法合成。下列實施例中的解鏈溫度是使用UV分光光度計中的恒溫室確定的。對溫度和吸光度進(jìn)行作圖，可觀察到具有兩個平臺的S形曲線。平臺中間的吸光度讀數(shù)對應(yīng)Tm。實施例1產(chǎn)生具有六堿基密碼子和少于3體相互作用的正交通用序列下面的方法用來產(chǎn)生具有六堿基密碼子、包括所有互補序列在內(nèi)的正交序列之間具有少于3體相互作用的八個正交序列。由在笫四位具有iso-G和iso-C的128種四聚體的庫產(chǎn)生一百個隨機20-體System8序列。在這一百個序列中，基于65%至70%G/C含量(包括iso-G和iso-C)選出36個序列。通過除去具有偏好堿基(biasedbase)組合物(某些堿基4交多、另一些堿基較少的組合物)的序列，這36個序列被進(jìn)一步減少到16個序列。然后將另一些異堿基(isobase)(具體序列中試圖平衡兩個堿基的iso-G或iso-C)添加至所述16個序列的每個序列的5，端("正交序列，，)。使用bDNAP程序的單探針比較(SingleProbeComparison)功能來就交叉雜交進(jìn)行篩選前，將這十六個正交序列轉(zhuǎn)變成為其天然形式(iso-G轉(zhuǎn)化為G,iso-C轉(zhuǎn)化為C)。參見S.Bushnelletal.,BIOINFORMATICS15(5):348-355(1999)。在這個程序中，G/C和A/T的加權(quán)因子設(shè)定為一，以指示X體相互作用的總數(shù)。通過比較下列序列，可人工計算出這16個正交序列的X體相互作用數(shù)(a)具有八個System8序列及其互補序列的16個正交序列；(b)16個正交序列自身以及(c)具有這16個正交序列的互補序列的16個正交序列。由于3體和4體短串聯(lián)重復(fù)(tamdem)中大量的相互作用，選擇5體相互作用來對這些序列進(jìn)4亍人工才企查。對在16個正交序列和八個System8序列之間的總共六十八種5體相互作用進(jìn)行人工比對。由于不能消除的強的相互作用，這16個正交序列中有四個從其中除去。通過分別用iso-G和iso-C交換G和C,對剩下的正交序列中的八個序列的原型進(jìn)行了^f'爹飾，目的在于將(a)、(b)和(c)的相互作用減少至最多3體，而不形成超過五個天然石威基的一段序列。由于對天然Watson-Crick石威基配對的相互作用進(jìn)行了預(yù)測，因此將異堿基重新放回序列計算得到的X體相互作用是沒有意義的。隨后幾輪比對、消除和修飾對上述(b)和(c)相互作用進(jìn)行了重復(fù)。用來獲得不超過3體相互作用的其它序列修飾包括如下修飾(i)通過將一些G/C轉(zhuǎn)化為iso-G和iso-C來提高異堿基含量以及(ii)通過使末端異堿基之一缺失將大小減少至20體?？偣策M(jìn)行了五個重復(fù)，得到其間最多3體相互作用并且具有包含所有組分的System8序列的八個新的通用正交序列。實施例2最佳正交通用序列的產(chǎn)生由含有六堿基密碼子的20體序列設(shè)計得到多個最佳CP,所述六堿基密碼子由四個天然堿基和兩個非天然堿基iso-G和iso-C組成。圖1A示出本發(fā)明的起始20體序列的普通結(jié)構(gòu)，該序列由被一個iso-G或iso-C堿基分隔的、以非特定順序排列的四個天然堿基組成。為由起始20體序列產(chǎn)生探針，通過在實施例1所闡述的方法對起始序列進(jìn)行篩選，目的在于產(chǎn)生具有約50%G/C組成且解鏈溫度接近80°C的33個CP和33個CE。使用所得到的序列來設(shè)計六重細(xì)胞因子分析面板(panel)。由于探針顯示出在細(xì)胞因子分析中有一些交叉反應(yīng)性，因此通過將探針的解鏈溫度限定到約85。C,可就最小的交叉反應(yīng)性對探針進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。篩選和測試得到的最佳組的探針由圖IB的公式描述并在表1中示出。表1的序列加入十一重細(xì)胞因子bDNA分析面板時，該序列展現(xiàn)出高度正交的表現(xiàn)，即交叉反應(yīng)性極少甚至沒有。下列縮寫用于隨后的表中F=iso-C,J=iso陽G,Lgth=寡核苷酸的長度Tm=解鏈溫度，為50%的寡核香酸探針與其互補序列退火的溫度(°C);Td=解離溫度，為50%的寡核苷酸探針與其膜結(jié)合互補序列退火的溫度(°C)，以及Bck-背景。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表1正交通用序列<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表1<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例3多重細(xì)胞因子mRNA分析的特異性將表1的通用正交序列CP1-CP9和CE1-CE9(SEQIDNO.1-22)用于多重細(xì)胞因子mRNA定量分析，其中采用了bDNA設(shè)計原理和用于讀數(shù)的Luminex⑧懸浮陣列技術(shù)。表2示出了使用CPl-CP9和CE1-CE9針對九種細(xì)胞因子對約60,000,000個分子的靶標(biāo)進(jìn)行多重mRNA分一斤的性能。在該實驗中，針對每種細(xì)胞因子進(jìn)行完整的bDNA分析。如表2所示，在所預(yù)期的小球上觀察到非常強的RFU信號，并且與分析小球的背景信號相比，所選擇通用序列的交叉雜交可忽略不計。圖2以三維柱狀圖示出了該分析的結(jié)果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例4通用正交序列與ZipCode序列的交叉雜交將表1的前十一個正交通用序列即CP1-CP11和CE1-CE11(SEQIDNO.l-22)與由Iannone等人(同上)描述的ZipCode序列相比較;ZipCode序列為一組完全基于天然堿基的通用序列。設(shè)計該實驗是為了確定含有非天然iso-C和iso-G堿基的通用正交序列在功能上是否明顯勝于含有全部天然堿基的序列。在該對比分析中使用的ZipCode序列在表3中列出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>為檢測含有iso-G和iso-C殘基的通用序列相對于完全基于天然堿基的序列的優(yōu)越性，用表3的十對ZipCode序列和從表1隨機選出的正交通用序列來構(gòu)建用于雜交的兩個10xIO矩P車。用結(jié)合Luminex⑧小球的捕獲探針和生物素化互補捕獲輔助探針(captureextenderprobe)進(jìn)行由兩部分組成(two-piece)的雜交分4斤。反應(yīng)4吏用約1000個Luminex⑧小球每種捕獲序列類型，這相當(dāng)于約1-2fentomole的DNA結(jié)合能力。雜交步驟之后用鏈霉親和素藻紅蛋白綴合物進(jìn)行標(biāo)記；通過這種方式觀察到正交對(orthogonalpairs)之間僅有非特異性相互作用。如圖3A和圖3B所示，在ZipCode非互補序列之間觀察到顯著量的交叉相互作用，而本發(fā)明的正3A示出在0.1pmol靶標(biāo)時的實驗結(jié)果，圖3B示出在1pmol靶標(biāo)時的實驗結(jié)果。靶標(biāo)的量是溶液中游離探針的量，0.1pmol和1.0pmol表示相對于以共價方式固定在小球的捕獲探針的量而言大大地摩爾過量。權(quán)利要求1.高度正交的六堿基通用序列，其包含四個天然堿基和兩個非天然堿基，其中以非特定順序排列的一至四個所述天然堿基選自鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺苷(A)和胸苷(T)或尿嘧啶(U)，并由所述一個或兩個非天然堿基所分隔，由此使得約50％的所述序列含有G/C堿基，并使得所述序列的解鏈溫度(Tm)約為80-85℃。2.權(quán)利要求1的高度正交的通用序列，其中所述兩個非天然堿基為異鳥嘌呤或異力包嘧啶。3.權(quán)利要求1的高度正交的通用序列，其中所述序列的Tm約為85°C。4.權(quán)利要求1的高度正交的通用序列，其中所述序列長度為20-25個堿基。5.權(quán)利要求1的高度正交的通用序列，用作通用捕獲探針，以將靶擴增產(chǎn)物固定至基底。6.權(quán)利要求5的高度正交的通用序列，其中所述靶擴增產(chǎn)物是由多聚酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的擴增子。7.權(quán)利要求6的高度正交的通用序列，其中所述基底為經(jīng)與所述捕獲探針互補的序列衍生化的固相結(jié)合表面。8.使用權(quán)利要求1的高度正交的通用序列進(jìn)行的bDNA分析。9.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于檢測DNA病毒。10.權(quán)利要求9的bDNA分析，其中所述DNA病毒選自?；蛉巳轭^瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、皰滲病毒和肝炎病毒構(gòu)成的組。11.權(quán)利要求10的bDNA分析，其中所述多瘤病毒選自猿猴病毒40和人多瘤病毒構(gòu)成的組。12.權(quán)利要求10的bDNA分析，其中所述皰瘆病毒選自愛潑斯坦-巴爾病毒、人巨細(xì)胞病毒和單純皰滲病毒構(gòu)成的組。13.權(quán)利要求10的bDNA分析，其中所述肝炎病毒選自曱型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎構(gòu)成的組。14.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于檢測反轉(zhuǎn)錄病毒。15.權(quán)利要求14的bDNA分析，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒選自腫瘤病毒和'f"曼病毒構(gòu)成的組。16.權(quán)利要求15的bDNA分析，其中所述腫瘤病毒選自鼠白血病病毒、牛白血病病毒和人T-細(xì)月包親'淋巴病毒構(gòu)成的組。17.權(quán)利要求14的bDNA分析，其中所述慢病毒為人類免疫缺陷病毒(HIV)。18.權(quán)利要求17的bDNA分析，用于檢測不到50個分子/mL的HIV。19.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在單重分析中對樣本中的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型。20.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在多重分析中對樣本中的多種單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型。21.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在單重分析中對樣本中的mRNA進(jìn)行定量。22.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于以多重形式對樣本中的mRNA進(jìn)行定量。23.權(quán)利要求21的bDNA分析，其中所述單重分析用于對樣本的一種細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量。24.權(quán)利要求22的bDNA分析，其中所述多重分析用于對樣本的多種細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量。25.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在單重分析中測量樣本中單個基因的拷貝的擴增情況。26.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在單重分析中測量樣本中單個基因的拷貝的缺失情況。27.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在多重分析中測量樣本中多個基因的拷貝的擴增情況。28.權(quán)利要求8的bDNA分析，用于在多重分析中測量樣本中多個基因的拷貝的缺失情況。29.—種制備用于雜交的高度正交的通用序列的方法，包括如下步驟(a)從六個核苷酸堿基制備5，至3'序列，所述六個核苦酸堿基包含兩個非天然堿基和選自鳥苷(G)、胞嘧啶(C)、腺苷(A)和胸苷(T)或尿嘧啶(U)的四個天然堿基，其中所述序列含有以非特定順序排列的一至四個所述天然堿基，并由一個或兩個所述非天然堿基所分隔；(b)篩選所述序列，僅選擇G/C濃度為50%或50%以上的那些序列；(c)測試所述序列的解鏈溫度(Tm)，僅選擇Tm約為80-85°C的那些序列；(d)分別用相同序列和互補序列交叉雜交所述序列；(e)僅選擇與所述相同序列最多3體相互作用的那些序列。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述非天然堿基選自異鳥嘌呤核苷和異胞嘧啶。31.權(quán)利要求29的方法，其中所述序列的Tm約為85°C。32.權(quán)利要求29的方法，其中所述序列長度為20-25個堿基。全文摘要本發(fā)明提供了用于bDNA單重和多重核酸雜交分析的一組高度正交的六密碼子通用序列。所述六密碼子通用序列不會交叉雜交，因此可將第二代和第三代bDNA分析中所固有的3體交叉雜交最小化或?qū)⑵湎?。該高度正交的通用序列可用于單重或多重bDNA分析，以定性和定量地測定樣本中的mRNA水平；篩選少量存在于樣本中的靶標(biāo)例如病毒，并對其進(jìn)行基因分型；篩選SNP并對其進(jìn)行基因分型；以及，測量例如在基因擴增或缺失時樣本中基因的量的改變。該高度正交的通用序列還可用作通用捕獲探針，通過有助于對其進(jìn)行進(jìn)一步分析的方式選擇性結(jié)合分析組分。文檔編號C12Q1/68GK101111607SQ200680003780公開日2008年1月23日申請日期2006年1月31日優(yōu)先權(quán)日2005年2月1日發(fā)明者B·沃納,C·-A·常,D·阿爾,M·吳,M·鄭申請人:西門子醫(yī)療診斷解決方案公司