專利名稱：葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法，更具體的地
說，其特征在于使蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸(及其鹽)(葡糖醛酸基-果 糖苷，P-D-果糖基-(2—l)-a-D-葡糖醛酸及其鹽)，然后加入酵母等微生 物，將其果糖部分水解，同時進行同化，收集生成的葡糖醛酸和/或葡糖 醛酸內(nèi)酯。
背景技術：
葡糖醛酸以及葡糖醛酸內(nèi)酯或其衍生物可廣泛應用于藥物、藥物原 料。已知這些葡糖醛酸或葡糖醛酸內(nèi)酯的合成方法有多種。通常的方法 是以葡萄糖衍生物或淀粉等葡萄糖衍生物作為原料，使用硝酸等氮化合 物進行氧化，水解，獲得葡糖醛酸和葡糖眵酸內(nèi)酯的方法(參照專利文獻 1、 2)。
但是，上述方法作為可以以工業(yè)化規(guī)模進行的合成方法，其中用作 氧化劑的氮氧化物成本較高。另外，副生的一氧化氮氣體發(fā)泡，使規(guī)模 增大，并且該副生的氣體成為公害的原因。因此，在環(huán)境問題日益嚴峻 的今天，必須考慮增加回收裝置。也有一些改良的發(fā)明，這些方法雖然 解決了副生氣體的問題，但是仍有產(chǎn)率提高等未解決的問題(參照專利文 獻3、 4)。
還有保護葡萄糖的C-l位、接著氧化C-6位、然后水解、脫保護、 獲得葡糖醛酸和葡糖醛酸內(nèi)酯的方法。該方法存在脫保護步驟復雜的問 題(參照專利文獻5)。
另夕卜，還有通過氧化催化劑6,6-四曱基哌啶N-氧化物(TEMPO)進行 選擇性氧化的方法(參照專利文獻6)。該方法轉(zhuǎn)化效率高，優(yōu)選的原料 是保護葡萄糖C-l位的曱基葡糖苷等的單糖衍生物。另外，以TEMPO 為代表的胺氧化物的制造成本高，并且可能對人體產(chǎn)生不良影響。
有人提出了一種解決這些問題的方法，其特征在于使用吸附樹 脂，使作為催化劑的胺氧化物與含卣素的氧化物或含卣素化合物的電解 氧化物反應(參照專利文獻7)。
但是，該方法中，雖然葡萄糖衍生物向糖醛酸的轉(zhuǎn)化效率高，催化 劑容易回收，但是催化劑依然價格昂貴。并且，雖然原料葡萄糖衍生物
中也含有蔗糖，但優(yōu)選的是較為昂貴的曱基-a-葡糖苷、異丙基-a和卩葡 糖苦。作為所使用的原料，生成卣酸離子的次氯酸鈉等不能說是安全的 原料。該方法中，由甲基-a-吡喃葡糖苷基糖醛酸等的所得到的葡糖醛酸 衍生物進行的葡糖醛酸內(nèi)酯的合成必須進行規(guī)定方法的水解反應的步驟。
目前，還公開了以海藻糖為原料，使用氧化鉑、載鈀碳、鉑碳等氧 化催化劑制備海藻糖羧酸(a-D-葡糖醛酸基-a-D-葡糖醛酸鹽)，使用氧或 酶水解，獲得目標葡糖醛酸和葡糖醛酸內(nèi)酯的方法(參照專利文獻8)。
該方法中，原料的收率好，但是氧化催化劑所需量多，成本高，并 且中間原料海藻糖羧酸的葡糖苷鍵穩(wěn)定，因此如果不進行比較劇烈的酸 水解反應，葡糖醛酸不會游離。也有使用a-葡糖醛酸糖苷酶等酶的方 法，其價格通常較為昂貴，并且水解能力不高。
專利文獻1:日本特公昭46-3871號公報
專利文獻2:英國專利第900977號
專利文獻3:日本特公昭42-2595號公報
專利文獻4'.日本特公昭43-5882號公報
專利文獻5:日本特公昭44-7325號公凈艮
專利文獻6:日本特開平2-107790號公報
專利文獻7:日本特開平11-147043號公報
專利文獻8:日本特開平10-251263號公報

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明的目的在于提供高收率、廉價、容易且安全 地制備葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的方法。
本發(fā)明人進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以蔗糖作為原料制備蔗糖羧 酸(和/或其鹽)(葡糖醛酸基-果糖苷)，使酵母等具有轉(zhuǎn)化酶(^ >《'》夕 —七)活性的微生物與其作用，可以以高收率獲得目標葡糖醛酸和/或葡 糖醛酸內(nèi)酯。
在該制備步驟中，不使用硝酸等氮氧化物等作為氧化劑，或者即使 使用其量也很少，因此可安全且對環(huán)境沒有影響地制備目標產(chǎn)物。
對酵母等的添加量、反應條件、脫鹽、結(jié)晶化方法進行研究，得出 了可以進行比以往更簡便且效率高的生產(chǎn)方法的認識，從而完成了本發(fā)明。
權利要求1的本發(fā)明是葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法，其
特征在于使蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸或其鹽，接著加入具有轉(zhuǎn)化酶活 性的微生物水解并同化該蔗糖羧酸或其鹽的果糖部分，收集生成的葡糖 醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯。
權利要求2的本發(fā)明是權利要求1的制備方法，其中，具有轉(zhuǎn)化酶 活性的微生物是酵母。
權利要求3的本發(fā)明是權利要求1的制備方法，其中，蔗糖是精制
糖、清凈汁(7 7 4 > y力)、原料糖、甜菜糖、加糖調(diào)制品、槭糖漿
或廢糖蜜。
權利要求4的本發(fā)明是權利要求1的制備方法，其中，向蔗糖羧酸 或其鹽中加入具有轉(zhuǎn)化酶活性的微生物，使該蔗糖羧酸或其鹽的果糖部 分水解的反應是在溫度0-60。C、 pH3-10下，使該微生物與濃度為1-50% 的蔗糖羧酸或其鹽水溶液作用進行的。
本發(fā)明不僅由低成本的原料蔗糖生產(chǎn)，還可以以非常高的收率獲得 目標葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯。
并且如上所述，在其制備步驟中，不使用硝酸等氮氧化物等作為氧 化劑，或者即使使用其量也極少，因此可安全且對環(huán)境沒有影響地制備 目標產(chǎn)物。并且設備投資也較少。
因此，本發(fā)明的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法與現(xiàn)有方法 比較，是生產(chǎn)效率更為優(yōu)異的工業(yè)化方法。
附圖簡述


圖1表示蔗糖羧酸鈉鹽的HPLCi普。
圖2表示將蔗糖羧酸鈉鹽進行酵母同化后的葡糖醛酸和/或葡糖醛 酸內(nèi)酯的結(jié)晶原液的HPLC鐠。
圖3表示所得葡糖醛酸內(nèi)酯的HPLC譜。
實施發(fā)明的最佳方式
以下詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法中的 一 系列反應 如下所示。 [化1]<formula>formula see original document page 6</formula>
本發(fā)明中使用的蔗糖(化學式CuHuO! 0是植物通過光合作用合成 的非還原性二糖類，主要是由甘蔗、甜菜的榨汁液反復純化、結(jié)晶制備。 本發(fā)明中，對于蔗糖的來源等沒有限制，優(yōu)選為精制糖，進一步優(yōu)
選為清凈汁、原料糖、甜菜糖、槭糖漿等。只要含有蔗糖均可使用，例
如有廢糖蜜、加糖調(diào)制品、果糖低聚糖等含蔗糖的物質(zhì)等，可以考慮價
格和制備步驟適當選擇。
對于將蔗糖氧化的方法可利用現(xiàn)有方法。即，可將硝酸、亞硝酸以
及它們的鹽等無機氮化合物，錳、鉻、鉛化合物等金屬化合物，其它的
鹵素、臭氧、氧等作為氧化劑。還可以使用氧化鉑、鉑碳、氧化釩、載
鈀碳等作為氧化劑，但該方法中產(chǎn)生副產(chǎn)物。
因此，優(yōu)選如專利文獻7所示，與吸附有胺氧化物的樹脂一起使用
電解氧化的含卣素化合物，對構(gòu)成蔗糖的葡萄糖部分的伯羥基(1級水
酸基)進行選擇性氧化，制備葡糖醛酸基-果糖苷。
最有效的方法如日本專利第3556690號記載，是通過 尸^wc/og/wcowoZ ac^ race /^rayb&gewM等微生物進行氧化發(fā)酵。
該方法中，對構(gòu)成蔗糖的葡萄糖部分的伯羥基進行選擇性氧化，可 以制備葡糖醛酸基-果糖苷(P-D-果糖基-(2—l)-a-D-葡糖醛酸及其鹽)。
酶作用，可制備蔗糖羧酸(葡糖醛酸基-果糖苷)(及其鹽)。微生物發(fā)酵或 使用酶進行的氧化反應可在溫和條件下進行，因此可以安全且對環(huán)境沒 有影響地制備目標產(chǎn)物。并且設備投資較少。
總之，可以將構(gòu)成蔗糖的葡萄糖部分的伯羥基進行選擇性氧化，制 備含有蔗糖羧酸(及其鹽)(葡糖醛酸基-果糖苷)的反應液。
為了獲得目標葡糖醛酸或葡糖醛酸內(nèi)酯，可以使酵母等具有轉(zhuǎn)化酶 活性的微生物與上述方法中制備的蔗糖羧酸或其鹽(葡糖基-果糖苷)作 用。酵母等可以水解并同化葡糖醛酸基-果糖苷的果糖部分。結(jié)果可獲得 目標葡糖醛酸或葡糖醛酸內(nèi)酯。
使酵母等與蔗糖羧酸或其鹽(葡糖醛酸基-果糖苷)作用時的條件只 要是酵母等可以水解并同化葡糖醛酸基-果糖苷的果糖部分的條件即 可。
上述反應中，用于溶解蔗糖羧酸或其鹽(葡糖醛酸基-果糖苦)的溶劑 優(yōu)選水。
上述反應中，蔗糖羧酸或其鹽(葡糖醛酸基-果糖苷)的濃度通常為
1-50%,優(yōu)選5-30%。
上述反應的溫度通常是0-60。C的范圍，優(yōu)選15-4(TC,只要是通過 酵母等水解并同化果糖部分進行的水解且同化將其從該體系中除去的
條件即可，并沒有限定。
上述反應的pH通常為3-10,優(yōu)選4-8，根據(jù)酵母等的種類，其最佳 值也不同，因此，只要是供試酵母等可以水解并同化果糖部分的條件即 可，對此并沒有特別限定。
通常反應進行的同時pH有降低的傾向，但只要在上述范圍內(nèi)則無 需調(diào)節(jié)pH值。反應時優(yōu)選進行攪拌，由此可以使酵母等的增殖和同化 得到進展。
可用于水解蔗糖羧酸或其鹽的微生物是具有轉(zhuǎn)化酶活性的微生 物，特別優(yōu)選酵母。酵母的種類是以例如面包酵母、釀酒酵母為代表的 酵母屬，包括假絲酵母屬(C"^fe/")、畢赤氏酵母屬(尸ZC/H")、裂殖糖 酵母屬(Sc/^oracc/^rom，e力等。除此之外，即使是真菌、細菌，只要 具有轉(zhuǎn)化酶活性、可同化果糖部分即可，均可在本發(fā)明中使用。
考慮到由本發(fā)明得到的葡糖醛酸或葡糖醛酸內(nèi)酯的安全性、以及這 些化合物在食品、藥物等領域中的應用，微生物優(yōu)選使用面包酵母、啤 酒酵母為代表的酵母屬的酵母。進一步優(yōu)選使用價格便宜且轉(zhuǎn)化酶活性 強的面包酵母。
向反應體系中添加的酵母的量根據(jù)反應時間、溫度、濃度、pH等 條件而不同，通常為0.1-10%,優(yōu)選1-5%。
反應時間通常為1-240小時，優(yōu)選24-120小時，只要是酵母等可水 解果糖部分且可同化的條件即可，對此沒有限定。
酵母等可以采用海藻酸鈉等已報道的方法等固定，由此使用后可以 回收，可以降低成本，因此是優(yōu)選的方案。
反應進行過程中，果糖通過同化被從反應體系中除去，然后除去酵 母等，濃縮，脫色，脫鹽。
酵母在同化被水解的果糖并增殖的同時生成乙醇和二氧化碳、甘 油、有機酸等。其中，乙醇和二氧化碳可通過加熱或濃縮時除去。乙醇 可回收另行使用。
含有所得葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的反應液含有鹽、有機酸、著 色物、來自微生物的蛋白質(zhì)等，因此可使用具有酸性或堿性、或者兩者
性質(zhì)的樹脂除去。還可根據(jù)需要使用活性碳、電透析裝置等。
可使用對糖或糖衍生物進行結(jié)晶時的常用方法由含有脫色、脫鹽的
葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的溶液獲得目標產(chǎn)物。具體來說，將該溶液
濃縮，然后接種葡糖醛酸內(nèi)酯或葡糖醛酸的晶體，使其結(jié)晶。
通常，通過一定的溫度和時間，葡糖醛酸和葡糖醛酸內(nèi)酯實現(xiàn)平
衡。葡糖醛酸內(nèi)酯容易結(jié)晶，因此通?？蓪舛日{(diào)節(jié)成固體成分含量
40-70%,接種葡糖醛酸內(nèi)酯的晶體，使目標產(chǎn)物晶析。而想獲得葡糖醛 酸的晶體時，可以將固體成分含量濃縮至65%或以上，使葡糖醛酸的晶 體晶析。
含有晶體的溶液可通過離心等分離，再次濃縮，再次結(jié)晶，將上述 步驟反復進行，可以高效回收目標產(chǎn)物。
通過上述一系列反應，可以以重量比20-40%的高收率由原術+蔗糖 制備目標產(chǎn)物。本發(fā)明中，通過使用廉價的蔗糖作為原料，可以低成本 制備目標產(chǎn)物。
如日本特許第3556690號記載，通過使用微生物進行蔗糖的氧化反 應，可以在整個步驟中采用溫和的條件制備目標產(chǎn)物，因此對環(huán)境的不 良影響小。
由本發(fā)明的制備方法得到的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯具有與由 已知方法得到同等或更高的純度，因此與以往同樣，作為具有肝功能恢 復作用、恢復疲勞作用、綴合解毒作用、抗類風濕作用等的物質(zhì)，在藥 品工業(yè)、食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、化學合成品工業(yè)等各領域中具有廣泛 用途。
實施例1
通過以下實施例進一 步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限定。 (1)蔗糖羧酸鈉鹽的制備
按照日本特許第3556690號實施例1所述方法，使用氧化酶生產(chǎn) 菌，由360 kg蔗糖(白砂糖)制備等量的蔗糖羧酸鈉鹽(葡糖醛酸基-果糖 苷)的溶液。即，向發(fā)酵罐中加入30kg蔗糖和250L水，溶解，再向上 述所制備的溶液中加入50 L在同等量的發(fā)酵罐中另外制備的 尸^ewc/og/wcowo6a"er racc/zaro^"ogewes洗涂菌液，使總量為300 L。 接 著在32。C下一邊以200rpm攪拌一邊以100 L/分鐘的比例通入空氣，進
行24小時反應，得到目標蔗糖羧酸鈉鹽。接著除去菌體，根據(jù)活性有
無再次使用，將上述方法進行12次，制備360kg蔗糖一羧酸鈉鹽(葡糖
酪酸基-果糖苦)固體成分的溶液。
(2) 蔗糖一羧酸鈉鹽的分解
將上述(1 )得到的60 kg蔗糖羧酸鈉鹽的固體成分的量的溶液濃縮至 30%,然后在37。C下添加按固體成分計為3% (10.8 kg)的面包酵母 (Oriental Yeast Co., Ltd.制備、FD-1),進行72小時水解反應。反應中并 未進行體系的pH控制，但pH最終還是在4附近。水解結(jié)束后，在80 。C下加熱5分鐘進行滅菌，進行UF過濾，回收濾液。濾液用濃縮裝置((株) 大川原制作所制造、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))濃縮至50%,回收濾液中所含的乙醇(通 過酵母同化水解產(chǎn)物生成)。將同樣的方法重復6次，得到蔗糖羧酸濃縮 液。
接著濃縮液分6次過50 L活性^碳柱(白鷺、日本EnviroChemicals ,Ltd. 制備)、50 L石咸性離子交換樹脂(Amberlite IRA-96SB、Organo Corporation 制備)、150L強酸性離子交換樹脂(DiaionPK-216、三菱化學(林)制備)， 進行脫色、脫鹽。
(3) 葡糖醛酸內(nèi)酯的結(jié)晶
將上述所得脫鹽液用濃縮裝置((林)大川原制作所制造、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)) 濃縮至50%,制成結(jié)晶原液。該結(jié)晶原液轉(zhuǎn)移到結(jié)晶罐(月島機械(株) 制造)中，濃縮至62%,在45。C附近使反應液中的葡糖醛酸和葡糖醛酸 內(nèi)酯的比例平衡改變，增加葡糖醛酸內(nèi)酯的含量，然后加入50g內(nèi)酯種 晶，自然冷卻過夜，使其結(jié)晶。
第二天， 一邊減壓濃縮一邊使晶體生長(68%、 42°C),然后升溫至 45-60。C。接著提高溶液的流動性，然后轉(zhuǎn)移到助晶機(月島機械(林)制造) 中， 一晝夜間冷卻至20°C (2。C/小時)。所得的內(nèi)酯晶體通過離心(1200 rpm)回收，用70%乙醇洗滌，用晾架式干燥機在5(TC下干燥。
以上操作中， 一次結(jié)晶可以得到28.1 kg晶體?；厥諡V液，進行同 樣的結(jié)晶，可回收100kg葡糖醛酸內(nèi)酯。
結(jié)晶原液中的在酵母同化步驟中生成的甘油和未知成分可簡單地 通過結(jié)晶除去。
所得葡糖醛酸內(nèi)酯的純度通過HPLC (柱島津制作所SCR-101H 柱、流動層20mM硫酸、檢測IR、流速0.5ml/分鐘)確認，純度為 99.9%或以上。HPLC的洗脫時間與葡糖醛酸內(nèi)酯試劑的相同。
實施例2
按照實施例1的方法，由15kg蔗糖制備等量的蔗糖羧酸鉀鹽。
從其中取100g蔗糖羧酸鉀鹽，向其中加入7g市售的面包酵母(干 酵母)，在37。C下進行水解反應以及同化反應。
結(jié)果，24小時以內(nèi)蔗糖羧酸被水解，得到含有葡糖醛酸和葡糖醛酸 內(nèi)酯的溶液。接著，將該溶液過1 L活性石友柱(白鷺、日本 EnviroChemicals ,Ltd.制備)、1 L堿性離子交換樹脂(Amberlite IRA-96SB、 Organo Corporation制備)、3 L強酸性離子交換樹脂(Diaion PK-216、三菱化學(抹)制備)，進行脫色、脫鹽。
該脫鹽液在4(TC下濃縮至65%，加入0.2 g葡糖醛酸的種晶，自然 冷卻。將析出的晶體離心，得到40g葡糖醛酸。
所得葡糖醛酸的純度通過HPLC(柱島津制作所SCR-101H柱、流 動層20mM硫酸、檢測IR、流速0.5ml/分鐘)確認，純度為99.9% 或以上。
實施例3
按照實施例1記載的方法，由15 kg原料糖制備等量的蔗糖羧酸鈉鹽。
接著同樣按照實施例1的方法，將15 kg蔗糖羧酸鈉鹽溶液濃縮至 30%,然后按固體成分計添加3。/o面包酵母(Oriental Yeast Co., Ltd.制 備、FD-1)，在37。C下反應72小時。
將反應液同樣過活性碳柱和脫鹽樹脂柱，脫色、脫鹽。所得脫鹽液 在50。C下濃縮至58%,加入20 g葡糖醛酸內(nèi)酯的種晶，使晶體析出。 接著進行離心，得到2kg葡糖醛酸內(nèi)酯。
實施例4
按照實施例1的方法，由20 kg甜菜糖制備等量的蔗糖羧酸鈉鹽。 以下同樣按照實施例1的方法，將20kg蔗糖羧酸鈉鹽溶液濃縮至30。/0,
然后按照固體成分計添加4。/。面包酵母(Oriental Yeast Co., Ltd.制備、 FD-1),在37。C下反應72小時。
將反應液同樣過活性碳柱、脫鹽樹脂柱，脫色、脫鹽。將所得脫鹽 液在50。C下濃縮至58%,加入20g葡糖醛酸內(nèi)酯的種晶，使晶體析出。 然后進行離心，得到4kg葡糖醛酸內(nèi)酯。
產(chǎn)業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明，可以以高收率由廉價的原料蔗糖制備葡糖醛酸和/或葡 糖醛酸內(nèi)酯。
并且在該制備步驟中，不使用硝酸等氮氧化物等作為氧化劑，或者 即使使用其量也極少，因此可以安全且對環(huán)境沒有影響地制備目標產(chǎn)物。
權利要求
1.葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法，其特征在于使蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸或其鹽，接著加入具有轉(zhuǎn)化酶活性的微生物水解并同化該蔗糖羧酸或其鹽的果糖部分，收集生成的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯。
2. 權利要求1的制備方法，其中，具有轉(zhuǎn)化酶活性的微生物是酵母。
3. 權利要求1的制備方法，其中，蔗糖是精制糖、清凈汁、原料 糖、甜菜糖、加糖調(diào)制品、槭糖漿或廢糖蜜。
4. 權利要求1的制備方法，其中，向蔗糖羧酸或其鹽中加入具有 轉(zhuǎn)化酶活性的微生物、使該蔗糖羧酸或其鹽的果糖部分水解的反應是在 溫度0-6(TC、 pH3-10下使該微生物與濃度為1-50%的蔗糖羧酸或其鹽水 溶液作用進行的。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供可以高收率、廉價、容易且安全地制備D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸內(nèi)酯的方法。涉及葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯的制備方法，其特征在于將蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸(及其鹽)(葡糖醛酸基-果糖苷，β-D-果糖基-(2→1)-α-D-葡糖醛酸及其鹽)，接著加入酵母等，將該蔗糖羧酸(及其鹽)的果糖部分水解，同時同化，收集生成的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸內(nèi)酯。
文檔編號C12P19/00GK101171341SQ20068001589
公開日2008年4月30日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權日2005年5月11日
發(fā)明者伊藤哲也, 原耕三, 岸野惠理子, 濱保健一, 田所宏基, 藤田孝輝 申請人:鹽水港精糖株式會社