專利名稱：利用SrMV-P₁基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法
利用SrMV-Pi基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種運(yùn)用基因工程技術(shù)培育甘蔗抗花葉病 種質(zhì)材料的方法，包括高粱花葉病毒Pi蛋白(SrMV-P》的氨基酸和核酸 序列，利用該序列構(gòu)建的載體及培育的轉(zhuǎn)基因植株，屬于植物基因工程技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著全球氣溫的升高，帶毒種苗的大量種植， 我國(guó)的閩、臺(tái)、粵、桂、滇、浙等省蔗區(qū)花葉病非常嚴(yán)重。目前除通過(guò)培 育抗性品種外，主要是莖尖和愈傷組織培養(yǎng)脫除感染的病毒，恢復(fù)品種特 性，提高產(chǎn)量和糖分。但是脫毒苗易退化而重新感病導(dǎo)致花葉病的爆發(fā)流 行。因此，選育與利用抗病品種是控制甘蔗花葉病發(fā)生的根本措施。從1986年，美國(guó)Powel-Abel最先報(bào)道了將TMV-CP基因轉(zhuǎn)入煙草獲 得了對(duì)TMV具有抗性的轉(zhuǎn)CP基因煙草植株以來(lái)，利用病毒的CP基因獲 得抗病植株的可行性己在多種病毒、多種植物中得到證實(shí)。但由于轉(zhuǎn)CP 基因的?；院軓?qiáng)，只對(duì)同一株系的病毒有很強(qiáng)的抗性。當(dāng)接種不同屬的 病毒或是同一屬不同株系的病毒，其抗病性就會(huì)下降，甚至消失。故許多 育種工作者正利用病毒的其它蛋白進(jìn)行抗病育種。P,位于SrMV基因組的5，端，是絲氨酸型的蛋白酶，可自身進(jìn)行剪切 從多聚蛋白前體中分離出來(lái)，其蛋白分子量為30~60 kDa不等。在Potyvims 屬中，Pt除了 C端Potyvims屬中P,保守區(qū)及蛋白酶的結(jié)構(gòu)域外，其保守 性很低，這表明它可能與特異的病毒和寄主互作有關(guān)。對(duì)Potato virus Y (PVY) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)的Pi分離物進(jìn)行聚類(lèi)分析 發(fā)現(xiàn)，其多態(tài)性很高，且根據(jù)分離物的病癥及地理位置聚類(lèi)。Yam mosaic vims(YMV)分離物的核酸序列同源性分析表明，Pj勺同源性僅為65%，而 HC-Pro同源性達(dá)80%。 P,蛋白的C端147個(gè)氨基酸殘基為水解功能， His214、 Asp223 、 Asp288是水解酶最大活性所必需的氨基酸殘基，這在 Potyvirus中非常保守，只有在少數(shù)病毒中發(fā)現(xiàn)Asp被替換成Glu。但是，
在絲氨酸水解殘基(即Phe或Tyr后)與切點(diǎn)之間這段氨基酸序列的同源 性卻很低。近年來(lái)通過(guò)突變或部分堿基的缺失方法對(duì)P,的功能進(jìn)行了大量 的研究。1994年，Klein分別構(gòu)建兩個(gè)突變體， 一個(gè)是在P！的C-端水解 酶活性區(qū)Asp和Ser中插入一個(gè)片斷，另一個(gè)是突變N端區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， C端突變會(huì)使病毒致死，而突變N端對(duì)病毒生活力沒(méi)有太大影響。但在將 C端突變體中的P,/HC-Pro的切點(diǎn)替換成NIa的切點(diǎn)后病毒又可生存，表 明P,蛋白酶活性不僅決定其自身，同時(shí)NIa也會(huì)延時(shí)或恢復(fù)其活性。1998 年Jelena et.al發(fā)現(xiàn)去除P,的病毒突變體對(duì)病毒的傳播長(zhǎng)距離運(yùn)輸影響不 大，但會(huì)明顯抑制基因放大，證明了 Pi與病毒復(fù)制有關(guān)。P!參與RNA結(jié) 合也得到了證實(shí)。P,與CI同時(shí)參與病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)Pi與HC-Pro 協(xié)作具有抑制寄主抗性及轉(zhuǎn)入后基因沉默的作用(posttranscriptkmal gene silencing ,PTGS)。本發(fā)明就是針對(duì)以上背景技術(shù)，通過(guò)分離克隆SrMV的Pt蛋白基因， 并利用其構(gòu)建無(wú)篩選標(biāo)記基因的高效植物表達(dá)載體，通過(guò)共轉(zhuǎn)化的方法， 以及快速、高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和抗病評(píng)價(jià)技術(shù)，大幅度提高甘蔗抗花葉病 育種效率，為甘蔗抗花葉病品種的培育奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用SrMV-P基因培育抗花葉 病甘蔗品種的方法。所解決的技術(shù)問(wèn)題是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良甘蔗抗 花葉病的方法。具體地說(shuō)，從高度感染甘蔗花葉病毒亞組中髙粱花葉病毒 株系SrMV的甘蔗品種"福農(nóng)91-4621"中分離克隆SrMV-Pi基因，構(gòu)建 植物表達(dá)載體，利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)將其插入到甘蔗品種"福農(nóng)95-1702"的 基因組中，培育抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗品種，以提高其抗病性。所述的SrMV (Sorghum Mosaic Virus)指甘蔗花葉病毒亞組中高粱花葉病毒株系；所述 的SrMV-Pi基因指編碼甘蔗花葉病毒亞組中高粱花葉病毒株系的P蛋白 基因。本發(fā)明利用SrMV-P,基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-Pt 基因的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)P,基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病 轉(zhuǎn)P1基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定，其
特征在于1 、 SrMV-P,的核苷酸序列為序列表中SEQ.ID.NO. l所示的堿基序列；2、 SrMV-P,的核苷酸序列所推演的氨基酸序列為序列表中SEQ. ID. NO. 2所示的氨基酸序列；3、 構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pUbi-SrMV-P,;所述的pUbi-SrMV-P,指以 SrMV-P,為目的基因，Ubi為啟動(dòng)子，Nos為終止子，無(wú)篩選標(biāo)記基因的植 物表達(dá)載體；4、 利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗品種，其外源SrMV-Pi基因插入基 因組的拷貝數(shù)為2 4個(gè)。 '根據(jù)上述培育方法獲得的轉(zhuǎn)SrMV-P,基因品種，其抗病性優(yōu)于甘蔗受 體品種"福農(nóng)95-1702"及其組培后代。已獲得的轉(zhuǎn)SrMV-Pi基因的甘蔗無(wú) 性系分別為福農(nóng)5、福農(nóng)37、福農(nóng)50、福農(nóng)51，福農(nóng)53和福農(nóng)64。本發(fā)明的序列與已報(bào)道的其它病毒Pi基因有明顯不同，SrMV-P,全長(zhǎng) 699bp。病毒采用翻譯后修飾進(jìn)行蛋白編譯，整個(gè)病毒核酸序列只有一個(gè) 大的ORF，由一個(gè)起始密碼子ATG決定氨基酸編碼的起始位置，Pt為于 病毒的N端，所以所得基因序列的ORF始于ATG，但沒(méi)有終止密碼子。 P,的C端147個(gè)氨基酸殘基為水解功能，His214、 Asp223、 Asp^是水解酶 最大活性所必需的氨基酸殘基。P,與CI同時(shí)參與病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)， 同時(shí)P！與HC-Pro協(xié)作具有抑制寄主抗性及轉(zhuǎn)入后基因沉默的作用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因甘蔗品種具有以下優(yōu)點(diǎn)甘蔗花葉病發(fā)病率為0，且 不同無(wú)性世代間基本保持穩(wěn)定，而受體品種發(fā)病率達(dá)82.7%，組培后代發(fā) 病率也高于66.8%。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因甘蔗品種在溫室和大田生長(zhǎng)均快于受 體品種。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合 實(shí)施例加以說(shuō)明。實(shí)施例利用SrMV-P,基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括以下
歩驟1、 甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因(SrMV-P。的克隆通過(guò)GENBANK己經(jīng)公布的甘蔗花葉病毒亞組基因序列，并對(duì)其所編 碼的多聚蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列分析后，根據(jù)保守氨基酸序列，設(shè) 計(jì)合成1組特異引物(1) FP11: 5' -ATTGGATCCATGGCAGGAGCATGGAAC-3，(2) RP1" 5， -GGGAGATCTAAAATAAGTTATTTCATT-3，利用上述特異引物，以Trizol方法提取的感病葉片總RNA為模板， 使用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈，其反應(yīng)按照如下進(jìn)行取1 ^總RNA 樣品(約1嗎)，分別加入下列成分l^d的lOxRT-RNA緩沖液，3.25pl 的無(wú)RNase的水，l^il的dNTPs，加入0.5 (il的Oligo(dT)l5，0.25^1的RNase 抑制劑以及0.5^1的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。輕輕混勻，稍離心，于42'C溫育30 min。然后將反應(yīng)混合物加熱至95'C，溫育5 min終止反應(yīng)，冰上冷卻并 稍離心，-2(TC保存?zhèn)溆谩Ｈ缓蟛捎蒙鲜鲈O(shè)計(jì)的RT-PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，其反應(yīng)組成如下10)^1的5xPCR緩沖液，35.5^1的滅菌超純水，0.5^1 的TaKaRa Ex Taq酶以及FCP和RCP引物各1^1以及2^1的cDNA模板。 PCR按如下反應(yīng)條件進(jìn)行94。C變性5min，然后94。C變性30sec、 52。C退 火45sec、 68"延長(zhǎng)45sec， 35個(gè)循環(huán)，最后72'C延長(zhǎng)5 min， 4。C保存?zhèn)?用。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，以新鮮的TAE Buffer為電泳緩沖液，在1%的瓊脂 糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用PCR Fragment Recovery Kit的方法回收RT-PCR 產(chǎn)物，然后連接到pMD-18-T載體上進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)試，以pMD-18-T 載體通用引物，在ABI PRISM 377XL型DNA測(cè)序儀上對(duì)pMD-18-T-CP 質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果見(jiàn)SEQ.ID.NO. 1。采用BLAST、 DNAMAN4.0、 OMIGA2.0軟件進(jìn)行序列分析，上述這些方法都是常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)。2、 抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)SrMV-P,基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建用Sg///和雙酶切T-P,質(zhì)粒和pZMLR14表達(dá)載體，將切下的目 的基因P,片段和載體片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收，連接目的 基因和載體片段，轉(zhuǎn)化DH5a并進(jìn)行PCR和酶切鑒定后得到Ubi啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的Pi基因植物表達(dá)載體pUbi-SrMV-Pi 。將載體pUbi-SrMV-Pi和 pZMLR14以l: l的比例混合，采用基因槍的方法共轉(zhuǎn)化甘蔗。操作過(guò)程 中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和 PCR鑒定為分子生物學(xué)的常規(guī)方法。 3、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)SrMV-P,基因材料的培育(1) 受體材料預(yù)處理在基因槍轟擊前先將受體材料轉(zhuǎn)入JDA培養(yǎng) 基中預(yù)培養(yǎng)2d，然后轉(zhuǎn)入含滲透劑0.2 mol/L甘露醇和0.2 mol/L山梨醇 的JDA培養(yǎng)基中預(yù)處理4 6 h。(2) 基因槍轟擊將預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有愈傷組織的小培養(yǎng)皿放入基因 槍室的托盤(pán)上，關(guān)閉基因槍門(mén)，利用氣壓1100psi和射擊距離6cm直接轟 擊甘蔗胚性愈傷組織。(3) 過(guò)渡培養(yǎng)轟擊后的愈傷組織仍放回預(yù)處理培養(yǎng)基(MS+2,4-D2 mg/L+Sorbitol 0.2 mol/L+Mannitol 0.2 mol/L)上繼續(xù)處理18h，其后接入 MS+2,4-D 2 mg/L的培養(yǎng)基上25。C暗恢復(fù)培養(yǎng)5 8 d。(4) 篩選繼代培養(yǎng)恢復(fù)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至總糖為10.0g/L，內(nèi)含 5.5g/L甘露糖的JDA培養(yǎng)基上篩選繼代培養(yǎng)，15 d繼代一次；(5) 篩選分化培養(yǎng)選擇繼代三次后仍存活的愈傷組織，轉(zhuǎn)接入正常 培養(yǎng)基進(jìn)行篩選分化。(6) 篩選促根培養(yǎng)抗性苗長(zhǎng)到2 4cm后，轉(zhuǎn)入SG培養(yǎng)基上篩選 和生根培養(yǎng)。(7) 煉苗和移栽當(dāng)幼苗的根長(zhǎng)至2.5cm長(zhǎng)時(shí)，移到室外煉苗2d， 然后將小苗取出，用流水洗凈附著的培養(yǎng)基，移栽到小花盆中(草木灰: 砂子:耕作土=1:1:1，混合后高壓滅菌)定時(shí)噴澆稀釋10倍的MS無(wú)機(jī)鹽液。(8) 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)根據(jù)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的甘蔗花葉病病毒蛋白基 因序列設(shè)計(jì)特異引物，分別進(jìn)行PCR、 Southern和RT-PCR，對(duì)轉(zhuǎn)基因植 株進(jìn)行目的基因分子檢測(cè)，經(jīng)Southern雜交證實(shí)，轉(zhuǎn)基因抗花葉病品種的
外源P,基因的拷貝數(shù)福農(nóng)5為2個(gè)拷貝，福農(nóng)37為4個(gè)拷貝，福農(nóng)50、 福農(nóng)51和福農(nóng)53和福農(nóng)64為3個(gè)拷貝。Southern雜交采用Roche公司 DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitI的試劑盒，操作過(guò) 程嚴(yán)格按照試劑盒提供的指南方法。RT-PCR按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0，產(chǎn)品編號(hào)為DRR0194。經(jīng)氯酚紅檢測(cè)上述幾個(gè)轉(zhuǎn)Pi基 因無(wú)性系均沒(méi)有pmi標(biāo)記基因。4、抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系的篩選鑒定 根據(jù)國(guó)家轉(zhuǎn)基因安全管理?xiàng)l例，將獲得的轉(zhuǎn)基因植株及相應(yīng)的對(duì)照 (空載體轟擊獲得的植株以及受體原種福農(nóng)95-1702)分別在人工氣候箱、 大棚溫室以及大田進(jìn)行抗病性的篩選鑒定，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因無(wú)性系?？共⌒澡b定 *接種鑒定病毒液粗提參照周仲駒等(1987)方法，取嚴(yán)重感染相同花葉病的 病葉加3倍量的(v/w) 0.1 mol/LpH7.2含NaS03的磷酸緩沖液，經(jīng)高速組織 搗碎機(jī)搗碎5 min，雙層紗布過(guò)濾榨汁或12,000 g離心10 min，取上清。汁 液用于田間或溫室病毒接種。接種方法用上述病毒汁液磨擦接種生長(zhǎng)至7-8片葉的轉(zhuǎn)基因甘蔗植 株。接種時(shí)，接種葉片大小一致，先用鑷子輕輕劃傷嫩葉，然后沾取少量 病毒液涂抹傷口處。重復(fù)接種3次，每次間隔6d。發(fā)病率調(diào)查首次接種7d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率，以后每周調(diào)查一次，直 至發(fā)病率穩(wěn)定。 *自然誘發(fā)接種鑒定以空載體轉(zhuǎn)化植株、受體原種作為對(duì)照，每隔兩個(gè)轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系， 種植一行原種作為誘發(fā)行。田間自然發(fā)病在甘蔗齊苗后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病率， 每周調(diào)查一次，直到發(fā)病率穩(wěn)定。 結(jié)果在人工接種條件下，受體品種(原種)的發(fā)病達(dá)82.7%，組培無(wú) 性系發(fā)病率達(dá)66.8%，福農(nóng)95-1702通過(guò)組培后其發(fā)病率雖然也大幅度降低， 但是還極易感病，而轉(zhuǎn)基因甘蔗均無(wú)發(fā)病，說(shuō)明轉(zhuǎn)入外源SrMV-P,基因后提高了甘蔗抗花葉病的能力。SEQUENCE LISTING<110〉福建農(nóng)林大學(xué)<120〉利用SrMV-Pl基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法<130〉 〈160〉 4<170> Patentln version 3. 1<210〉 1〈211〉 699<212〉 薩〈213〉 Sorghum Mosaic<400〉 1Virus (SrMV)atggcaggagcatggaacactgtgacttacaagtggagaccgaatttggacaatgcaagg60gatgttcgaaaagtgatggaacactttgcagcaaagcaccaagtttacgacgcaaagcga120gcagcggagcataacagtagaatccttcgaaggacttttgtgc犯gaaatC3taaa犯cs180cctgaagagaagattcagcgceiaatctcaggtgtgggtcgcaacEiatcc3240acaattcatctgcactatgttaggttcaaaaac犯ggagaagaaggcatcacctgaaatt300scttcaggatcagttgcaaagttgacgcgacaggtacttgaactcagcaaaatcacaaag360cttg犯gtagaactcattggcaagaagaggtgca33tca^Ct犯3Ct3gC420aagagtatctacattgtg貼accagacacgagacaaataaattcaagcgc480attgatatcaacttagaacggcactggtttccacttgtgaag犯gaXtacaaagtgttat540ggtcacataccaccaagaatgttttgga膽atgagcaaaggtgatagtgggttaacgttc600Pit tcas肌tggtgagttgttcataattcgagga認(rèn)cgagatggcgtcctacttaatagt660atcactagtgaaactcgaattaatgaaataacttatttt699<210〉 2<211〉 233<212〉 PRT<213> Sorgh咖Mosaic<棚〉2Virus (SrMV)Met Ala Gly Ala Trp Asn Thr Val Thr Tyr Lys Trp Arg Pro Asn Leu 15 10 15Asp Asn Ala Arg Asp Val Arg Lys Val Met Glu His Phe Ala Ala Lys 20 25 30His Gin Val Tyr Asp Ala Lys Arg Ala Ala Glu His Asn Ser Arg lie 35 40 45Leu Arg Arg Thr Phe Val Gin Glu lie Met Lys Thr Pro Glu Glu Lys 50 55 60lie Gin Arg Lys Ser Gin Val Trp Val Glu Lys Gin Asp Asn Asn Pro 65 70 75 80Thr lie His Leu His Tyr Val Arg Phe Lys Asn Lys Glu Lys Lys Ala 85 9b &Ser Pro Glu lie 丁hr Ser Gly Ser Val Ala Lys Leu Thr Arg Gin Val 100 105 110
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1、一種利用SrMV-P1基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P1基因的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)P1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)P1基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定，其特征在于(1)SrMV-P1的核苷酸序列為序列表中SEQ.ID.NO.1所示的堿基序列；(2)SrMV-P1的核苷酸序列所推演的氨基酸序列為序列表中SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列；(3)構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pUbi-SrMV-P1；(4)利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗品種，其外源SrMV-P1基因插入基因組的拷貝數(shù)為2～4個(gè)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用SrMV-P,基因培育抗花葉病甘 蔗品種的方法，其特征在于設(shè)計(jì)合成的特異引物為(1) FP11: 5' -ATTGGATCCATGGCAGGAGCATGGAAC-3，(2) RP11: 5， -GGGAGATCTAAAATAAGTTATTTCATT-3，
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法培育的轉(zhuǎn)SrMV-Pi基因甘蔗無(wú)性系，其抗病性優(yōu)于甘蔗受體品種。
全文摘要
一種利用SrMV-P₁基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)P₁基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)P₁基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定。已獲得的轉(zhuǎn)SrMV-P₁基因甘蔗無(wú)性系，其抗病性優(yōu)于甘蔗受體品種及其組培后代。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101126089SQ20071000922
公開(kāi)日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者張木清, 鶯 郭, 阮妙鴻, 陳如凱 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)