專利名稱：磁性細胞及其使用方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及在醫(yī)療、尤其是再生醫(yī)療中有效使用的磁性細胞及其使 用方法。
背景技術(shù)：
一般而言，在給藥后藥物分布于全身，因此，對于以抗癌藥為首的:. 副作用較強的藥物，希望其以高濃度存在于作用部位，而不分布于其它 部位。為了使藥物集中于局部，已嘗試了各種方法，其中之一為使用磁 性粒子，通過外部的磁力使藥物集中于局部的方法。例如，將磁性體與 藥物一同包含在脂質(zhì)體內(nèi)給藥，并通過磁力向局部誘導，從而能夠提高
藥物的局部濃度。(例如參照日本口腔外科學會志1997年2月號p55 -、 61)。
另外，已知有將由磁鐵礦等鐵磁體和高分子形成的磁珠表面以抗體 修飾、利用抗原抗體反應進行細胞分離形成的技術(shù)，該技術(shù)用于HLA 的定型、造血干細胞的選擇等(例如參照Biomaterial 2003年2月號p113. -119)。

發(fā)明內(nèi)容
但是還沒有在可應用于再生醫(yī)療等之中的間葉細胞或軟骨細胞等 細胞中結(jié)合了磁性粒子的實例。因此在結(jié)合了磁性粒子的細胞給藥后能 否通過外部的磁力而在局部滯留、或者細胞能否發(fā)揮其本來的作用等方'— 面還存在有較多需要解決的未知問題。
本發(fā)明人等經(jīng)過深入研究，結(jié)果著眼于細胞表面的性能而完成了本 發(fā)明。即，本發(fā)明的第一種方案為提供一種在細胞表面具有磁性粒子的' 磁性細胞。通過該細胞的構(gòu)成，能夠利用磁性粒子的磁性將細胞移動至理想的部位。
本發(fā)明的磁性細胞的優(yōu)選方案中，前述表面與前述磁性粒子通過連
接體(linker)結(jié)合，或者前述表面通過前述磁性粒子具有的特定氨基酸 序列粘合。作為前述特定的氨基S吏序列，例如可以舉出精氨酸-甘氨酸 -天冬氨酸-絲氨酸的四個氨基酸構(gòu)成的肽(RGDS )、或者甘氨酸-精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸的五個氨基酸構(gòu)成的肽(GRGDS )。
本發(fā)明的；茲性細胞的優(yōu)選方案中前述表面和前述連4妄體通過抗原 抗體反應進行結(jié)合。
本發(fā)明的磁性細胞的優(yōu)選方案中，前述連接體和前述》茲性粒子通過 化學鍵結(jié)合。
本發(fā)明的磁性細胞的優(yōu)選方案中，前述磁性粒子中至少包含磁性體。
本發(fā)明的磁性細胞的優(yōu)選方案中，前述磁性粒子中還包含藥物。
本發(fā)明的磁性細胞的優(yōu)選方案中，前述細胞選自軟骨培養(yǎng)細胞、間 葉細胞、淋巴細胞及表達整聯(lián)蛋白的細胞。
本發(fā)明的第二種方案為提供一種培養(yǎng)磁性細胞的方法，所述方法包 括制備前述磁性細胞的步驟和培養(yǎng)前述磁性細胞的步驟。
另外，本發(fā)明的第三種方案為提供一種滯留磁性細胞的方法，所述 方法包括下述步驟，即，使前述磁性細胞向病灶部位移動并保留在該部 位的步驟，和通過磁場使前述磁性細胞長時間滯留在前述病灶部位的步 驟。
本發(fā)明的滯留方法的優(yōu)選方案中，前述滯留步驟通過在體外對病灶 部位施加前述磁場或?qū)⒋攀袢塍w內(nèi)而得以實施。
另外，本發(fā)明的第四種方案為提供一種控制磁性細胞活動的方法， 所述方法包括以下步驟，即，將前述磁性細胞和含有藥物的磁性粒子同 時或者分別給予病灶部位的步驟，和從前述磁性粒子中釋放前述藥物的 步驟。
本發(fā)明的控制方法的優(yōu)選方案中，前述藥物選自促骨形成藥、癌治 療藥、或者癡呆癥治療藥。.另外，本發(fā)明的第五種方案為提供一種治療方法，所述方法包括以 下步驟，即，將前述磁性細胞和含有藥物的磁性粒子同時或者分別給予 病灶部位的步驟，和從前述磁性粒子中釋放出前述藥物的步驟。
本發(fā)明的治療方法的優(yōu)選方案中，前述藥物選自促骨形成藥、癌治 療藥、或者癡呆癥治療藥。 ，
通過將本發(fā)明的磁性細胞導入生物體內(nèi)，并利用體外的磁場作用，
可以將其長時間保留在病灶部位，因而能夠有效發(fā)揮該細胞本來具有的 功能。另外，通過利用本發(fā)明中的磁性細胞，可根據(jù)治療的需要，適用
于軟骨形成等再生醫(yī)療或抗癌藥等的藥物釋;^文系統(tǒng)。'


圖l示出本發(fā)明的第一種實施方案中磁性細胞的簡圖。 圖2示出本發(fā)明的第二種實施方案中磁性細胞的筒圖。
圖3示出作為再生醫(yī)療的軟骨修復說明圖。
圖4示出將本發(fā)明的磁性細胞注射到關(guān)節(jié)內(nèi)l個月后，約72小時不存 在外部磁場的情況(A)以及存在外部磁場的情況(B)觀測到的顯樣吏鏡 照片(50倍)。
圖5示出在大鼠骨髓間葉干細胞中觀測到的、本發(fā)明磁性細胞的制 備例2 (A)及3. (B)中制備的磁性細胞的顯《鼓鏡照片(4S0倍)。
圖6示出用軟骨誘導培養(yǎng)基對本發(fā)明中通過CD44或RGDS肽制成的 磁性細胞(大鼠骨髓間葉干細胞)進行21天沉淀培養(yǎng)后，利用RT-PCT 法研究II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖(來自軟骨)的mRNA (基因)表 達的結(jié)果。
圖7為利用大鼠的神經(jīng)干細胞說明本發(fā)明磁性細胞的形成狀態(tài)的照 片，(A)為400倍的照片，(B)為1600倍的照片。
具體實施例方式
下述實施方案是用于說明本發(fā)明的示例，本發(fā)明不僅限于所述實施 方案。只要不脫離本發(fā)明的要點，也可以通過各種方案實施本發(fā)明。(第一種實施方案) 本發(fā)明的磁性細胞是基于對存在于細胞表面的粘合成分的利用而 得到的。圖1為本發(fā)明的第一種實施方案中磁性細胞10的簡圖。該磁
性細胞10含有it性粒子60,所述磁性粒子60通過連接體50與糖蛋白 質(zhì)40結(jié)合，所述糖蛋白質(zhì)40表達在含有核30的細胞20的表面。本發(fā) 明中利用的糖蛋白質(zhì)40并不限定于下述物質(zhì)，但優(yōu)選CD44或HLA。 ■
作為本發(fā)明的磁性粒子60,例如可以舉出含有磁性體70的脂質(zhì)體。 所述脂質(zhì)體中可以進一步含有能夠控制細胞功能的藥物80,另外，磁性 體及藥物也可以使用其它類型的包封材料進行包封。
此處，脂質(zhì)體為具有水性內(nèi)部的球形脂質(zhì)雙層。形成脂質(zhì)體時，存 在于水性溶液中的分子進入水性內(nèi)部。脂質(zhì)體的內(nèi)容物被保護于外部的 微環(huán)境之外，并且由于脂質(zhì)體與細胞膜融合因而該內(nèi)容物可被有效輸送 至細胞質(zhì)內(nèi)。
本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體只要是普通的公知脂質(zhì)體即可，尤其可以舉 出能夠用于口服給藥或者注射的脂質(zhì)體。可以適用上述脂質(zhì)體，也可以 利用公知的材料重新設計、形成脂質(zhì)體。具體而言，優(yōu)選使用含有磷脂、 甘油醚磷脂(ether glycerophosphatide )、.(神經(jīng))鞘磷脂、甘油糖脂、神 經(jīng)鞘糖脂作為脂質(zhì)體膜的主要構(gòu)成成分，并含有甾醇類或生育酚類等作 為使脂質(zhì)體膜穩(wěn)定化的脂質(zhì)成分的脂質(zhì)體等。
作為上述磷脂，可以使用天然磷脂、合成磷脂等普通的公知磷脂。 優(yōu)選使用下述磷脂，例如(1)磷脂酰膽堿、(2)磷脂酰乙醇胺、(3) 磷脂酰甘油、(4)磷脂酰絲氨酸、(5)磷脂酸、以及(6)磷脂酰肌醇 等。
上述(1)的磷脂酰膽堿可以舉出，例如蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、 氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、源自大豆的磷脂酰膽堿、源自大豆 的氫化磷脂酰膽堿等天然磷脂酰膽堿類；含有碳原子數(shù)為7~22的飽和 或者不飽和羧酸作為構(gòu)成成分的磷脂酰膽堿等合成磷脂酰膽堿類。作為 具體例可以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰 磷脂酰膽堿等。作為上述脂肪酸殘基可以舉出辛?；?octanoyl)、壬酰
基(nonanoyl)、癸?；?decanoyl)、十一烷?；?undecanoyl )、十二烷 ?；?rauroyl )、 肉豆蔻酰基(myristovl )、棕櫚?；?palmitoyl )、油基 (oleyl )、硬脂基(stearyl )、棕櫚油?；?palmitoleyl )、亞油?；?linoleyl )、 亞麻?；?linolenyl)、花生四烯酰(arachidonyl)等基團。另外，結(jié)合 在甘油的1-位、2-位的脂肪酸殘基部分可以相同也可以不同。
前述(2)的磷脂酰乙醇胺可以舉出例如，源自大豆的磷脂酰乙醇 胺、源自大豆的氬化磷脂酰乙醇胺等天然磷脂酰乙醇胺類；含有碳原子 數(shù)為7 22的飽和或者不飽和羧酸的磷脂酰乙醇胺等合成磷脂酰乙醇胺 類。作為具體例可以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙 醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等。作為脂肪酸殘基，可以舉出與前述(l) 同才羊的基團。
前述(3)的磷脂酰甘油可以舉出例如，含有碳原子數(shù)為7~22的
飽和或者不飽和羧酸的磷脂酰甘油等合成磷脂酰甘油類。作為具體例可 以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘
油等。作為構(gòu)成脂肪酸殘基，可以舉出與前述(l)同樣的基團。
前述(4)的磷脂酰絲氨酸可以舉出例如，源自大豆的磷脂酰絲氨 酸、源自大豆的氫化磷脂酰絲氨酸等天然磷脂酰絲氨酸類；含有碳原子 數(shù)為7 ~ 22的飽和或者不飽和羧酸的磷脂酰絲氨酸等合成磷脂酰絲氨酸 類。作為具體例可以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲 氨酸、二油酰磷脂酰絲氨酸等。作為構(gòu)成脂肪酸殘基，可以舉出與前述 (1)同樣的基團。
前述(5)的磷脂酸可以舉出例如，含有碳原子數(shù)為7~22的飽和 或者不々包和羧酸的磷脂酸等合成磷脂酸類。作為具體例可以舉出二肉豆 蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酸等。作為構(gòu)成脂肪酸殘基， 可以舉出與前述(l)同樣的基團。前述(6)的磷脂酰肌醇可以舉出例 如，源自大豆的磷脂酰肌醇、源自大豆的氬化磷脂酰肌醇等天然類磷脂 酰肌醇；也可以使用合成類磷脂酰肌醇。作為構(gòu)成脂肪酸殘基，可以舉 出與前述(1 )同樣的基團。 另外，作為本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體膜的構(gòu)成成分，也可以使用甘油 磷脂、(神經(jīng))鞘磷脂、甘油糖脂、神經(jīng)鞘糖脂等。本發(fā)明中作為使脂 質(zhì)體膜穩(wěn)定化的脂質(zhì)成分，可以使用甾醇類或生育酚類。作為前述甾醇 類，只要是普通公知的甾醇類即可，可以舉出例如，膽甾醇、谷甾醇、 菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇等，從購入性方面考慮，優(yōu)選使用膽甾醇。 作為前述生育酚類，只要是普通公知的生育酚類即可，從購入性方面考 慮，優(yōu)選使用市售的CC-生育酚。
作為本發(fā)明中使用的包封材料，可以使用離子交換樹脂、結(jié)晶性陶 瓷、生物體可適性玻璃、膠乳，也可以與'各種表面活性劑一同制成微球 進行使用。而且，也可以使用毫微球、及其它脂質(zhì)、聚合物或者蛋白質(zhì)
材料作為前述包封材料。包封材料的直徑優(yōu)選為數(shù)十~數(shù)百nm,沒有
特別的限制。另外，所述藥物的包封材料至少含有磁性體，可以包含藥 物，也可以不包含藥物，但是從細胞控制方面考慮，優(yōu)選包含藥物。
另外，本發(fā)明的藥物包封材料也可設置用于控制藥物釋放的藥物釋 放控制成分，作為控制藥物釋放速度的成分，可以舉出高分子、溫度敏
感性分子、超聲波及/或磁敏感性物質(zhì)。具體可以舉出特開平5 -228358 記載的具有濁點的高分子化合物(聚丙烯酸類聚合物)，特開平11-92360記載的超聲波敏感性物質(zhì)(外啉衍生物、.卩占噸衍生物)等。
作為本發(fā)明中利用的磁性體，只要是具有磁性的物質(zhì)即可，無任何 限制，常磁性、超常磁性、強磁性均可，強磁性中除了亞鐵磁性，也包 括鐵磁性。作為磁性體的具體例，除了磁鐵礦(Fe304)、磁赤鐵礦之外， 還可以舉出鐵、鈷、鎳等強磁性元素的化合物粒子。所述強磁性化合物 中，磁鐵礦、磁赤鐵礦未表現(xiàn)出對生物體的毒性，并且穩(wěn)定，因此被優(yōu) 選4吏用。特別優(yōu)選磁鐵礦。
前述磁性體不僅包括前述強磁性化合物單獨存在的情況，也可以包 括用纖維素、淀粉、糊精、瓊脂、甲基丙烯酸酯或苯乙烯等進行包埋或 由磁性細菌生物合成、經(jīng)磷脂被覆磁鐵礦得到的磁性粒子。
下面說明本發(fā)明中使前述細胞的表面具有磁性粒子的方法。作為該 方法，可以舉出細胞表面的反應性官能團和磁性粒子的反應性官能團通
過共價4建結(jié)合的方法、或通過連接體使其結(jié)合的方法等。作為本發(fā)明中 使用的連接體，可以舉出兩個末端具有羧基或氨基等反應性官能團的化
合物(以下，簡稱為"雙官能性間隔體(bifimctional spacer)")或者抗 體。作為細胞與磁性粒子通過連接體結(jié)合的方法，可以舉出下述優(yōu)選例， 例如，使粉碎磁性細菌得到的被覆有磷脂膜的磁性粒子通過雙官能性間 隔體與細胞表面的反應性官能團結(jié)合的方法；或者通過抗原抗體反應使 細胞表面的HLA或CD44等粘合分子結(jié)合在下述結(jié)構(gòu)上的方法等，前述 結(jié)構(gòu)為使表面經(jīng)羧基修飾的磁性粒子和用作連接體的抗體的氨基鍵合 成酰胺《定而形成的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的磁性細胞可以為下述任一形式，即，磁性粒子含有在細胞 內(nèi)部，^磁性粒子結(jié)合在細胞表面，或者磁性粒子通過連接體結(jié)合在細胞 表面。作為使磁性粒子含有在細胞內(nèi)部的方法，可以通過對磁性粒子實 施例如特開平6 - 133784記載的利用粒子槍的方法而實現(xiàn)。.
本發(fā)明的第一種實施方案中，作為前述磁性粒子60中含有的藥物 80,可以舉出以細胞因子(cytokin)等負責細胞信息傳遞體系的物質(zhì)為 代表的生理活性物質(zhì)等，但是并不限定于此。作為細胞因子的具體例， 可以舉出干擾素類(IFN- a 、 IFN- (3 、 IFN- y等)、白細胞介素類(IL-1 ~ 18等)、淋巴毒素類、腫瘤壞死因子(TNF-cx等)、粒細胞巨噬細胞集落 刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF、 CSF-1 )、粒細胞 集落刺激因子(G-CSF)、促紅細胞生成素、血栓形成素、造血干細胞因 子(SCF)、單核細胞趨化活化因子(MCAF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-a、 TGF-P )、成纖維細胞生長因子(FGF)、上皮細胞生長因子(EGF)、血 小板衍生生長因子(PDGF)、神經(jīng)細胞生長因子(NGF)等。特別優(yōu)選 干擾素類、白細胞介素類、肺瘤壞死因子、促紅細胞生成素、血栓形成 素、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細胞生長因子、上皮細胞生長因子、血小板 衍生生長因子、神經(jīng)細胞生長因子等。
另外，作為前述藥物80,也可以舉出需要對病灶部位進行預防及/ 或治療的疾病的藥物等，作為藥物的具體例，抗癌藥可以舉出伊立替康 三水鹽酸鹽(Irii德can HC1 Trihydmte)、自力霉素(mitomycin )、 5-氟
尿嘧咬、順氯氨柏(cisplatin )、鹽酸吉西他濱(gemcitabine hydrochloride )、 阿霉素(doxorubicin),紫杉醇(taxol)等，但并不局限于此。另外作為 阿爾茨海默病(Alzheimer)治療藥可以舉出鹽酸多奈哌齊(donepezil hydrochloride)等。通過將所述藥物80置于構(gòu)成磁性細胞的脂質(zhì)體內(nèi)， 可以將本發(fā)明的磁性細胞活用為藥物釋放系統(tǒng)。
前述藥物80也可以形成鹽。所述鹽的優(yōu)選例可以舉出與無機酸形 成的鹽、與有機酸形成的鹽、與無機堿形成的鹽、與有機堿形成的鹽、 與酸性或者^ 威性氨基酸形成的鹽等，其中優(yōu)選藥理學允許的鹽。作為與 無機酸形成的鹽的優(yōu)選例，可以舉出例如與鹽酸、氬溴酸、硫酸、硝酸、 磷酸等形成的鹽。作為與有機酸形成的鹽的優(yōu)選例，可以舉出例如與醋 酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、枸櫞酸、乳酸、硬脂酸、苯曱 酸、曱磺酸、乙磺酸、對曱苯磺酸等形成的鹽。作為與無機堿形成的鹽 的優(yōu)選例可以舉出，例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；釣鹽、鎂鹽等堿土類 金屬鹽；鋁鹽、銨鹽等。與有機堿形成的鹽的優(yōu)選例可以舉出，例如與 二乙胺、二乙醇胺、葡甲胺(meglumine), N, N， -二千基乙二胺等形
前述藥物80在作為相關(guān)疾病的預防或者治療藥給予患者時，給藥 途徑、給藥量、給藥次數(shù)因患者的癥狀、疾病的種類.程度、年齡、 心'肝'腎功能等而異，無法進行限定。例如，用于治療人類癌癥時， 成人口服給藥量為0.01mg~ 1000mg/日、優(yōu)選為0.1mg~ 1000mg/日、更 優(yōu)選為0.1mg~ 100mg/日，成人靜脈給藥量為0.01mg 500mg/日、優(yōu) 選為0.1mg 500mg/日、更優(yōu)選為O.lmg ~ 100mg/日，可根據(jù)癥狀，一 曰分成1次至5次進行給藥。
也可以制成含有前述藥物80的藥物組合物導入磁性細胞，前述組 合物可以使用賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、矯味矯臭劑、 稀釋劑等添加劑,.以公知的方法進行制備。賦形劑的具體例可以舉出乳 糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、oc-淀粉、糊精等淀粉衍生 物；結(jié)晶纖維素等纖維素衍生物；阿拉伯膠、糊精、支鏈淀粉等有^i類 賦形劑；及輕質(zhì)硅酸酐、合成硅酸鋁、硅酸4丐、硅酸鋁酸鎂等硅酸鹽衍
生物；磷酸氬鉤等磷酸鹽；碳酸釣等碳酸鹽；硫酸4丐等硫酸鹽等無機類 賦形劑等。潤滑劑的具體例可以舉出硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等硬 脂酸金屬鹽；.滑石粉；膠態(tài)二氧化硅；硅酸鋁鎂、鯨蠟等蠟類；硼酸； 己二酸；硫酸鈉等硫酸鹽；乙二醇；富馬酸；苯曱酸鈉；DL亮氨酸； 脂肪酸鈉鹽；月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂等月桂基硫酸鹽；硅酸酐、 硅酸水合物等硅酸類；以及上述淀粉衍生物。作為粘合劑的具體例，可 以舉出鞋基丙基纖維素、羥丙曱基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙(烯) 二醇(macrogol)、及與前述賦形劑相同的化合物。作為崩解劑的具體例， 可以舉出低取代羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、 內(nèi)交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等纖維素衍生物；羧甲基淀粉、羧甲基淀粉鈉、 交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮等經(jīng)過化學修飾的淀粉、纖維素類等。作為穩(wěn)定 劑的具體例可以舉出對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯曱酸丙酯等對羥基苯 甲酸酯類；氯丁醇、節(jié)醇、苯乙醇等醇類；苯扎氯銨；苯酚、甲(苯) 酚等酚類；乙基汞硫代水楊酸鈉(thimerosal);脫氳醋酸；及山梨酸等。 作為矯味矯臭劑的具體例可以舉出通常用于制劑中的甜味劑、酸味劑、 香料等。
■作為本發(fā)明中使用的細胞，優(yōu)選淋巴細胞、間葉干細胞、軟骨培養(yǎng) 細胞等，但并不局限于此。 (第二種實施方案)
圖2為本發(fā)明的第二種實施方案中磁性細胞的簡圖。本發(fā)明的第二 種實施方案中利用了存在于細胞表面的整聯(lián)蛋白110和對于該整聯(lián)蛋白 有粘合活性的肽120。作為前述肽可以舉出RGDS (由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸四種氨基酸構(gòu)成的肽，分子量433.42),但不限定于此。
本發(fā)明的第二種實施方案通過使用以RGDS的氨基酸序列修飾》茲珠 表面而得到的活化磁珠130,提供了表面具有磁性粒子的磁性細胞200。
所述磁性細胞的制備方法如下。第一，利用試劑將表面預先經(jīng)羧基 修飾的磁珠活化。該活化步驟中只要使用可活化羧基的試劑即可，沒有 特別的限制，但優(yōu)選使用碳二亞胺類。第二，使存在于磁珠表面的活化 羧基和肽的氨基反應，形成酰胺鍵，從而能夠在磁珠的表面導入肽。
對于本發(fā)明的磁珠上的肽被覆量而言，相對于3mg磁珠，作為配體 的肽或者抗體能夠被覆至10ng 20Mg，優(yōu)選為15ng~15jig,進一步 優(yōu)選為20ng~ 10jug。因此相對于每單位重量的磁珠，即，相對于每lmg 的^茲珠，可被覆3ng 6.6jag。當肽在磁珠上的襪覆量過多時，使最終 的磁性纟田胞之間相互粘合，由此使其難以向作為革巴部位的病灶部位移 動。如果被覆量過少，則可能無法發(fā)揮磁性細胞本身的性能。
然后，使導入了肽的磁珠和所希望的細胞表面的粘合分子發(fā)生反 應，從而可以制備出本發(fā)明的磁性細胞。發(fā)生上述反應時雖然也受到所 導入肽的比例的影響，但相對于數(shù)量為2x 105的前述所希望的細胞而 言，導入了肽的萬茲珠的量優(yōu)選為0.1 |ul~20|Lil,更優(yōu)選為0.2|ul~ 18jlU, 進一步優(yōu)選為0.5yl~15pl。如果導入了肽的磁珠量為0.1 Ml以下，則 不能發(fā)揮磁性細胞自身的功能；如果導入了肽的磁珠量為20jul以上， 則f茲性細胞之間相互粘合，難以向作為耙部位的病灶部位移動。
作為導入了肽的磁珠與存在于細胞表面的粘合分子的反應溶液，可 以舉出BSA (牛血清白蛋白)的磷酸緩沖食鹽水(以下稱為 "BSA/PBS"),更優(yōu)選使用在BSA/PBS中添加EDTA (乙二胺四乙酸) 而得到的溶液、0.5%BSA4.4jaMEDTAinPBS(-) (EDTA濃度為4.4 ja M 2mM),"怛不限于上述溶液。
另外，在本發(fā)明的第二種實施方案中，可以同樣利用前述第一種實 施方案中的磁性體和藥物，這是本領域技術(shù)人員容易理解的。
下面說明本發(fā)明的磁性細胞的使用方法。通過將上述制備的磁性細 胞在各種細胞中進行培養(yǎng)，可以將其用于后述的治療之中。需要說明的 是，可以適當選擇培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液及培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)液因所用細胞 不同而不同，例如，對于軟骨培養(yǎng)細胞而言，適用DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)為基礎的i喬養(yǎng)液。
可以通過使本發(fā)明的磁性細胞在所希望的病灶部位長期滯留，根據(jù) 所述細胞的種類而用于治療。例如，使用骨髓間葉干細胞時，可以在病 灶部位形成軟骨樣組織。因此，在所希望的病灶部位長期滯留較為重要。
本發(fā)明中的用語"使磁性細胞在病灶部位長期滯留"是指滯留足夠長的時間以使磁性細胞發(fā)揮其具有的功能，該時間優(yōu)選為1~90日的期
間，更優(yōu)選1 ~ 80日的期間，進一步優(yōu)選1 ~ 50日的期間。作為本發(fā)明 磁性細胞的給藥部位，只要是體內(nèi)存在病灶的部位、或者實施治療的部 位即可，例如，可以舉出例如腦、骨、肝臟、心臟、關(guān)節(jié)等。作為疾病 的具體例，可以舉出中風、惡性胂瘤、脊髓損傷、軟骨缺損、肌肉缺損、 韌帶損傷等。
作為使本發(fā)明的磁性細胞存留于體內(nèi)的給藥方法，可以通過外科手 術(shù)進行給藥，也可以通過注射進行給藥。此處所謂外科給藥是指例如在 骨中開孔進行給藥；注射給藥是指通過注射對患部直接給藥或者經(jīng)靜脈 注射對全身給藥。
為了^t化磁性粒子，本發(fā)明中所使用的用語"磁場"優(yōu)選為60高 斯(以下記為"G")或60高斯以上，為了防止磁性粒子在體內(nèi)擴散而 使其在局部滯留，更優(yōu)選為70G或70G以上?？梢詮捏w外施加磁場，也 可以通過在體內(nèi)埋置磁石而施加磁場。此時從磁力、穩(wěn)定性、強度方面 考慮，》茲石優(yōu)選為釹磁石。
圖3示出適用本發(fā)明磁性細胞的治療的模式簡圖。如圖3所示，本 發(fā)明的磁性細胞經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)注射而導入生物體內(nèi)。由于在磁性細胞應該移 動、存留的位置配置永磁鐵，因此可以使本發(fā)明的磁性細胞在前述永磁 鐵的磁力作用下向理想的位置移動。圖3中磁性細胞可被移至關(guān)節(jié)軟骨 的缺損部位并存留于該部位。本發(fā)明的磁性細胞所使用的細胞只要是骨 髓間葉干細胞，就可以在上述部位形成軟骨樣組織而修復前述缺損部 位。
圖3中說明了作為再生醫(yī)療而受到關(guān)注的軟骨修復，如果治療郜位 為癌細胞，則可以通過使構(gòu)成磁性細胞的磁性粒子中含有抗癌藥而使藥 物集中于局部。
給予至生物體內(nèi)的本發(fā)明的磁性細胞通過酶等的作用或溫度等釋 方文出藥物。
本發(fā)明中"控制磁性細胞的活動"是指利用細胞因子等藥物控制分 化、生長等細胞活動。
磁性細胞和藥物包封材料可以同時給予也可以分別給予，例如可以 舉出以下方式，即將磁性細胞及藥物包封材料分別制成注射劑，裝入 一個包裝盒中制成藥物試劑盒等。
用下述實施例進一步詳細地說明本發(fā)明， <旦本發(fā)明的范圍并不局限 于此。本領域技術(shù)人員能夠基于本發(fā)明的記載實施各種變更、修改，上 述變更、修改也包括在本發(fā)明之中。
實施例 (磁性細胞的制備之一)
1. 》茲^朱的活化
從作為磁珠的Ferri Sphere 100C原液(50mg/ml)(日本Paint)中取 出相當于3mg (60yl)的量，加入0.01NNaOH,用攪拌器在室溫下攪拌 IO分鐘后進行洗滌。重復進行一次上述洗滌操作后加入去離子水，用攪 拌器在室溫下攪拌5分鐘后洗滌。將上述洗滌操作重復3次。為了使磁珠 活化，在除去剩余的水分之后，先將25mM 2- [ N-嗎啉代]乙磺酸(以 下稱為"MES，， ) ( SIGMA社制)、pH5.0下制備的50mg/ml的l-乙基-3國 (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(以下稱為"EDC" ) ( SIGMA社 制)和N-羥基琥珀酰亞胺(以下稱為"NHS，， ) ( SIGMA社制)各50 ja 1 與磁珠在試管.中充分混合，然后在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn)攪拌30分鐘。將反應 后的試管在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。最后用25mMMES、 pH5.0 下洗滌2次，使最終溶液的體積為40 M 1。
2. 活化后的抗體的固定
用60 y l的25mM MES溶解大鼠的CD44抗體(20 y g) ( CHEMICON 社制)，加入上述活化磁珠，在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn)攪拌3小時，將抗體固定 在活化磁珠上。將反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。 為了除去未與磁珠反應的抗體，添加處于磷酸緩沖液中的0.05M乙醇 胺，并在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn)攪拌l小時。將固定后的磁珠用0.5 %BSA (SIGMA社制)的磷酸緩沖液在4。C下洗滌5分鐘。將上述洗滌操作反復 進行4次后，懸浮在lml的0.5。/。BSA磷酸緩沖液中，在4。C下保存。
3. 將固定化磁珠結(jié)合在細胞上
將培養(yǎng)的大鼠骨髓間葉干細胞從皿(dish)中剝離并移至試管中， 在4。C下保存10分鐘。添加60jal配制成細胞懸浮液(lX106cells)的上 述磁珠后，在4。C下緩慢地翻轉(zhuǎn)攪拌1小時使其發(fā)生抗原抗體反應。將反 應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。用0.5。/。BSA的磷酸緩 沖液使其重懸。將該洗滌操作進行4次。然后使其懸浮在磷酸緩沖液等 之中用于試驗。
(具有磁性脂質(zhì)體的磁性細胞的制備例l )
1. N- [3- (2-吡啶基二硫代).丙酰基]磷脂酰乙醇胺(以下稱為 "PDP-PE，，)的合成
在3ml無水乙醇中溶解25mg N-琥珀酰亞胺基3- ( 2-吡咬基二硫代) 丙酸酯和50jumol三乙醇胺，進一步溶解50jumol磷脂酰乙醇胺，并進行 攪拌。5小時后減壓除去無水乙醇，并將殘留物溶解于氯仿中。用氯仿 洗滌150。C下活化了 一夜的硅膠柱(10ml )。洗柱后使反應物流過柱子， 進一步用20ml氯仿洗滌。分別流過氯仿:'曱醇的比例為40: 1、 30: 1、 25: 1、20: 1及15: l的混合溶液各20ml，最后流過10: l的混合溶液60ml。 將15: 1及10: l的洗出液合并，進行減壓濃縮。
2. 脂質(zhì)體的制備
將10 )i mo 1蛋黃磷脂酰膽石威(Egg phosphatidylcholin) 、 10 n mol月旦 甾醇及l(fā) jumolPDP-PE溶解于3ml的乙醚中，將乙醚減壓氣化。加入lml 含有磁牲體鐵(Fe203 ) 5mg及包封藥物(TGF-P、 bFGF )的0.9%生理 鹽水、以及硼酸/枸櫞酸緩沖液(pH6.0 )，用渦流混合器(Vortex mixer) 進行震蕩，使燒杯內(nèi)附著的薄層被膜完全剝離。在水浴超聲波儀(Bath sonicator)(同上)中進行50分鐘超聲處理。用0.45T的永^茲鐵(同上) 將制成的磁性體脂質(zhì)體及未包封的磁性體從溶液中分離出來。在1000xg (ppm)下離心分離15分鐘，將作為上清液的磁性體脂質(zhì)體和作為沉淀 的未被封入的磁性體分離。
3. 脂質(zhì)體與抗體的結(jié)合
在60 n l的25mM MES中溶解人的CD44抗體(20 m g),加入制成的 脂質(zhì)體，在室溫下緩慢地翻轉(zhuǎn)攪拌3小時將抗體固定在脂質(zhì)體上。反應
后在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。為了除去未反應的抗體，加入
0.05M乙醇胺的磷酸緩沖液，在室溫下緩慢地翻轉(zhuǎn)攪拌l小時。在4。C下 用0.5。/。BSA的磷酸緩沖液洗滌5分鐘。將該洗滌操作反復進行4次，使其 在lml 0.5 % BSA的磷酸緩沖液中懸浮穩(wěn)定，在4。C下保存。 4.將固定了抗體的脂質(zhì)體結(jié)合在細胞上
將培養(yǎng)的人骨髓間葉干細胞從皿(dish).中剝離并移至試管中，在4 。C下保存10分鐘。添加配制成細胞懸浮液(lX106cells)的脂質(zhì)體后， 在4。C下緩慢地翻轉(zhuǎn)攪拌1小時使其發(fā)生抗原抗體反應。將反應后的試管 在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。用0.5。/。BSA磷酸緩沖液重懸。將 該洗滌操作進行4次。然后使其懸浮在磷酸緩沖液等之中直接用于試驗。
試驗例1 (體外試驗)
將結(jié)合了以前述方法制備的磁性粒子的骨髓間葉干細胞4X 106cells 》文入培養(yǎng)i中。本實施例中，在培養(yǎng)皿的下部中央設置了4300G的圓形 (直徑5mm )釹磁石；然而在比較例中未設置磁石。在培養(yǎng)皿中加入TGF畫 P和地塞米松。培養(yǎng)21天后，用曱苯胺藍染色進行評價。實施例中，以 》茲石對應的位置為中心，局部形成了軟骨樣組織。然而在比較例中未在 局部形成軟骨樣組織。
圖4示出將本發(fā)明的磁性細胞注射到關(guān)節(jié)內(nèi)1個月后，約72小時不存 在外部磁場(A)及存在外部磁場(B )的情況下觀測到的顯微鏡照片(50 倍)。由圖4 (A)可知，用黑點表示的磁性細胞在細胞中任意位置均能 被觀測到，然而，由圖4(B)可知，用黑點表示的磁性細胞集中存在于 圖4 (B)的左上方。需要說明的是，圖4 (A)及(B)實際是用蘇木精 -伊紅(hematoxylin-eosine)進行了染色，在圖4中表示為灰色。
從以上結(jié)果可知，本發(fā)明的磁性細胞可以通過磁石的作用向局部移 動。并且，受到外部磁場作用的細胞中可以觀測到利用玻璃軟骨進行的 修復。
試驗例2
(家兔的膝間部骨缺損修復)
在家兔的膝關(guān)節(jié)部，按照Bioindustry2002.Vol.l9.No.6p47-53記載的
方法制作2處寬5mm的骨缺損。在該缺損部位注射3.0 ju g實施例中得到的 磁性細胞。然后將具有700G磁場的磁石置留在缺損部位對應的表面，置 留9周。在比較例中不施加外部磁場地給予磁性細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實施 例中軟骨細胞局部存在于骨缺損部位并通過形成新生骨的交聯(lián)而修復 骨缺損，然而未施加外部磁場的比較例中未發(fā)現(xiàn)骨缺損的修復。 (磁性細胞的制備例2) 1.使用EDC和NHS進行的磁珠活化
從Ferri Sphere IOOC原液(50mg/ml)(日本Paint^土 )中取出相當于 3mg(60yl)的量，加入0.01NNaOH,用攪拌器在室溫下攪拌10分鐘后 洗滌。重復進行一次上述洗滌操作后加入去離子水，用攪拌器在室溫下 攪拌5分鐘后洗滌。將上述洗滌操作重復3次。為了使磁珠活化，在除去 了剩余的水分之后，先將25mMMES、 pH5.0下制備成的50mg/ml EDC、 和NHS各50y l與磁珠充分混合，并在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn)攪拌30分鐘。將 反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。最后用25mMMES、 在pH5.0下洗滌2次(使最終溶液的體積為40 ja 1 )。
2..活化后的抗體的固定
用60 w 1的25mM MES 、在pH5.0下溶解大鼠的CD44抗體 (CHEMICON社制)、或者RGDS peptides ( peptide研究所)(20 n g )， 加入活化磁5朱(40ja l的25mM MES pH5.0下懸浮)，在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn) 攪拌3小時，將抗體固定在活化磁珠上。將反應后的試管在釹磁石上放 置2分鐘，除去上清液。為了除去未與磁珠反應的抗體，添加處于PBS (-)pH8.0中的0.05M乙醇胺，并在室溫下緩慢地翻轉(zhuǎn)攪拌l小時。將固 定后的磁珠用處于PBS (-)中的0.5。/。BSA在4。C下洗滌5分鐘。將上述洗 滌操作反復進行4次后，懸浮在lml處于PBS (-)中的0.5。/。BSA中，在4 。C下保存。
3,將固定了抗體的磁珠結(jié)合在細胞上
將培養(yǎng)的大鼠骨髓間葉干細胞從皿中剝離并移至試管中。添加15 p l配制成500ja l細胞懸浮液(2X105cells)的磁珠后，在4。C下間斷進行翻轉(zhuǎn)攪拌，共計l小時，使其發(fā)生抗原抗體反應。此時的反應緩沖液為
處于PBS (-)中的0.5。/。BSA。將反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后 除去上清液。用處于PBS(-)中的0.5。/。BSA將其重懸。將該洗滌操作進 行3 4次。然后使其懸浮在PBS (-)等之中用于試驗。 (磁性細胞的制備例3 )
1. 利用EDC和NHS進行的磁珠活化
從Ferri Sphere IOOC原液(50mg/ml)(日本Paint社)中耳又出相當于 3mg (60|ul)的量，加入0.01NNaOH,用攪拌器在室溫下攪拌10分鐘后 洗滌。重復進行一次上述洗滌操作后加入去離子水，用攪拌器在室溫下 攪拌5分鐘后洗滌。將上述洗滌操作重復3次。為了使磁珠活化，在除去 了剩余的水分之后，先將25mMMES、 pH5.0下制備成的50mg/ml EDC、 和NHS各50n l與磁工朱充分混合，并在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn)攪拌30分鐘。將 反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。最后用25mM MES、 pH5.0下洗滌2次(使最終溶液的體積為40ju 1 )。
2. 活化后的抗體的固定
用60 in 1的25mM MES pH5.0溶解大鼠CD44抗體(CHEMICON社制) 或者RGDS peptides (peptide研究所)(lOng),加入活化磁珠(40n l的 25mM MES pH5.0下懸浮)，在室溫下緩慢翻轉(zhuǎn)攪拌3小時，將抗體固定 在活化磁珠上。將反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。 為了除去未與磁珠反應的抗體，添加處于PBS (-) pH8.0中的0.05M乙醇 胺，并在室溫下緩慢地翻轉(zhuǎn)攪拌l小時。將固定的磁珠用處于PBS (-) 中的0.5。/。BSA在4。C下洗滌5分鐘。將上述洗滌操作反復進行4次后，懸 浮在lml處于PBS (-)中的0.5。/。BSA中，在4。C下保存。
3. 將固定了抗體的磁珠結(jié)合在細胞上
將培養(yǎng)的大鼠骨髓間葉干細胞從皿中剝離并移至試管中，添加l H 1 配制成500 n l細胞懸浮液(2X105ceUs)的磁珠后，在使用CD44抗體的 情況下，在冰箱中(4~10°C)間斷進行翻轉(zhuǎn)攪拌，共計l小時，使其發(fā) 生抗原抗體反應。'在使用RGDS peptides的情況下，在37。C下用1小時間 斷進行翻轉(zhuǎn)攪拌，使其與細胞發(fā)生反應。此時的反應緩沖液為處于PBS
(-)中的0.5。/。BSA4.4nMEDTA。將反應后的試管在釹磁石上放置2分 鐘，除去上清液。用處于PBS(-)中的0.5。/。BSA將其重懸，將該洗滌操 作進行3 4次，然后使其懸浮在PBS (-)等之中用于試驗。
圖5示出在大鼠骨髓間葉干細胞中觀測在前述制備例2 (A)、 3 (B) 中制備的磁性細胞(通過整聯(lián)蛋白和RGDS肽連接的磁性細胞)的顯微 .鏡照片(480倍)。由圖5可知，本發(fā)明磁性細胞的行為受到下述因素的 影響，即，具有磁性體的RGDS肽在磁珠上的導入壹，即，前述肽在磁 珠上的被覆量，和制備磁性細胞時細胞上的磁珠量。當前述導入量或磁 珠量較高時，最終在生物體內(nèi)的細胞中磁性細胞之間具有凝集的傾向。'
圖6示出用軟骨誘導培養(yǎng)基對本發(fā)明通過CD44或者RGDS肽制成的 磁性細胞(大鼠骨髓間葉干細胞)進行沉淀(pellet)培養(yǎng)21天后，利用 RT-PCT法，研究II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖(來自軟骨)的mRNA (基 因)表達的結(jié)果。在添加了TGF-e和地塞米松進行分化誘導的組(D + 組)中能夠確認到兩個基因的表達，在未添加TGF-(3和地塞米松進行培 養(yǎng)的組(D-組)中不能確認兩個基因的表達。從圖6的結(jié)果可以推測， 通過RT-PCR復合體的軟骨形成作用，以CD44抗原或RGDS肽作為連接體 的磁性細胞(骨髓間葉干細胞)可以分化誘導成軟骨細胞。
圖7為說明利用大鼠神經(jīng)干細胞形成本發(fā)明的磁性細胞的狀態(tài)的照 片。從圖7的結(jié)果可以確認，通過移液管(pipetting)將凝集的大鼠神經(jīng) 干細胞離散開，然后使前述經(jīng)RGDS肽修飾后的磁珠作用于該細胞，能 夠通過神經(jīng)干細胞的整聯(lián)蛋白形成利用大鼠神經(jīng)干細胞的磁性細胞。
產(chǎn)業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明的^茲性細胞，通過將其導入生物體內(nèi)并利用從體外施加 的磁場作用，能夠使其長期存留于病灶部位，因此能夠有效發(fā)揮該細胞 本來具有的功能。另外，根據(jù)治療的需要，本發(fā)明的磁性細胞可以適用 于軟骨形成等再生醫(yī)療、抗癌藥等的藥物釋放系統(tǒng)之中。
權(quán)利要求
1.一種磁性細胞，所述磁性細胞包含細胞和磁性粒子，所述磁性粒子具有由所述細胞表面粘合的特定氨基酸序列構(gòu)成的肽，且至少包含磁性體，相對于1mg所述磁性粒子，所述肽在所述磁性粒子上的被覆量為3ng～6.6μg。
2. 如權(quán)利要求1所述的磁性細胞，其特征為，所述細胞選自軟骨培 養(yǎng)細胞、間葉細胞、神經(jīng)干細胞、淋巴細胞及表達整聯(lián)蛋白的細胞。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的磁性細胞，其特征為，所述磁性粒子中 還包含藥物。
4. 一種培養(yǎng)磁性細胞的方法，其特征為，所述方法包括制備權(quán)利要 求1 ~3中任一項所述的磁性細胞的步驟和培養(yǎng)所述磁性細胞的步驟。.
全文摘要
由于目前還沒有在可應用于再生醫(yī)療等之中的在間葉細胞或軟骨細胞等細胞中結(jié)合了磁性粒子的實例，因此本發(fā)明研究了將結(jié)合了磁性粒子的細胞給藥后能否通過外部的磁力而在局部滯留、或者細胞能否發(fā)揮其本來的作用。本發(fā)明提供了一種磁性細胞，所述磁性細胞包含細胞和磁性粒子，所述磁性粒子具有由細胞表面粘合的特定氨基酸序列構(gòu)成的肽，至少包含磁性體，相對于1mg磁性粒子，所述肽在所述磁性粒子上的被覆量為3ng～6.6μg。
文檔編號C12N5/00GK101173250SQ20071016707
公開日2008年5月7日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者越智光夫 申請人:衛(wèi)材R&D管理有限公司;越智光夫