專利名稱：用于開發(fā)變性疾病新藥的治療性靶分子的制作方法
用于開發(fā)變性疾病新藥的治療性乾分子
本發(fā)明整體上涉及治療、預(yù)防和診斷變性疾病(degenerative disease ) (尤其是神經(jīng)變性疾病)的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及基因和蛋白質(zhì)， 其在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控并用于治療、預(yù)防、和診斷變性疾 病，尤其是神經(jīng)變性疾病。另外，本發(fā)明涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激 而受調(diào)控的基因和蛋白質(zhì)的用途，用于篩選候選物質(zhì)以鑒定預(yù)防和/或治療 劑，所述試劑調(diào)節(jié)基因和/或蛋白質(zhì)的生物活性，所述基因和/或蛋白質(zhì)在細(xì) 胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到活化。另外，本發(fā)明涉及診斷變性疾病(尤 其是神經(jīng)變性疾病)的方法、和鑒定預(yù)防和/或治療劑的方法，所述試劑調(diào) 節(jié)基因和/或蛋白質(zhì)的生物活性，所述基因和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧 化應(yīng)激而受到活化。另外，本發(fā)明涉及進(jìn)行診斷方法的試劑盒。
需氧生物體以及其它生物體，使用氧化反應(yīng)來(lái)從食物中獲取能量并提 供代謝物，以維持整個(gè)分解和代謝。因此，在細(xì)胞中不斷形成活性氧類別 (reactive oxygen species, ROS)和活性氮中間體(reactive nitrogen species, RNS)，諸如超氧化物陰離子、羥基自由基、過(guò)氧化氫、過(guò)氧亞硝酸鹽和氧 化氮。這些反應(yīng)性分子的產(chǎn)生或(更確切地是)形成必須被精確調(diào)節(jié)，以 防止細(xì)胞中的生物分子，如蛋白質(zhì)、DNA、和脂類不受控制的氧化和硝化。 在對(duì)ROS和/或RNS出現(xiàn)不平衡時(shí)，細(xì)胞則受到氧化應(yīng)激，其可導(dǎo)致以不 受控的和不需要的方式來(lái)修飾生物分子，由此導(dǎo)致細(xì)胞死亡(變性)。神經(jīng) 元是特別易受氧化應(yīng)激的，這是由于它們的高能量消耗和高代謝活性造成 的。
神經(jīng)元的死亡對(duì)于受影響的人來(lái)說(shuō)是有災(zāi)難性和不可恢復(fù)的影響的。 例如，神經(jīng)元的死亡可例如是中風(fēng)、心月幾梗塞、創(chuàng)傷性腦和脊髓損傷、感 染、炎癥反應(yīng)、興奮性神經(jīng)毒性、缺血、低氧、或其他腦和脊髓供給受限 的結(jié)果。而且，神經(jīng)元的死亡出現(xiàn)于神經(jīng)變性疾病，諸如阿爾茨海默病 (Alzheimer's disease )、 盧Y尹體病(Lewy body diseases)諸如帕金森病 (Parkinson's disease )、彌漫性盧4尹體病(diffuse Lewy body disease )、亨廷 頓病(Huntington's disease )、肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、朊病毒病(prion diseases, PrD)、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease )、 唐氏綜合癥(Down syndrome )、額顳葉癡呆(frontotemporal dementia, FTD)、 皮質(zhì)基底變性(corticobasal degenerations )、多發(fā)性才更塞性癡呆(multi-infarct dementias )、進(jìn)4亍性核上麻痹(progressive supranuclear palsy )、 多系統(tǒng)萎縮 (multiple system atrophy )和科爾薩科夫氏綜合癥(Korsakoff's syndrome )。 神經(jīng)元的死亡也可是藥物影響的結(jié)果。相應(yīng)地，較長(zhǎng)期施用神經(jīng)抑制藥物 治療患者精神病狀況，可導(dǎo)致慢性延遲性運(yùn)動(dòng)障礙，其是由受影響的神經(jīng) 元中自由基濃度增加并接著發(fā)生神經(jīng)元變性而造成的。
神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)元選擇性和進(jìn)行性死亡的原因還未被揭示。這些 疾病的每一種中最多有10%呈常染色體遺傳性形式，然后在其65歲前就影 響患者("早發(fā)")。阿爾茨海默病的特征在于細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié) (neurofibrillar tangle, NFT)(其主要由過(guò)磷酸化的tau蛋白質(zhì)組成)和老年 斑(senile plaque， SP )中細(xì)胞外淀粉樣蛋白(3 (amyloid |3， A卩)40-42沉積。 結(jié)果是膽堿能神經(jīng)元的選擇性喪失?？墒牵泊嬖跓o(wú)斑形式的阿爾茨海默 病。遺傳形式主要由基因突變?cè)斐傻模龌蚓幋aAP前體蛋白質(zhì)(A(3 precursor protein, APP)和早老蛋白(分別為PS1和PS2)。以該結(jié)果為基礎(chǔ)的 淀粉樣蛋白假說(shuō)考慮到了 A(3穩(wěn)態(tài)改變，其造成了漸進(jìn)性Ap沉積和Ap聚 集，這造成膽;威能神經(jīng)元的死亡。
帕金森病候是由腦黑質(zhì)神經(jīng)元死亡導(dǎo)致的多巴胺不足所造成的。在細(xì) 胞水平上，可觀察到產(chǎn)生盧伊體，其主要由聚集的a-突觸核蛋白組成，還 包含其他蛋白質(zhì)，諸如泛素C-末端水解酶。家族性累積的帕金森病迄今與 超過(guò)10個(gè)染色體區(qū)域相關(guān)，其中編碼a-突觸核蛋白(PARKl)、 Parkin (PARK2)、和DJ-1 (PARK7)的基因中的突變清楚地是疾病成因。
ALS是由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的累進(jìn)性喪失造成的。該病家族形式中20%與 Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)中超過(guò)90個(gè)突變相關(guān)。
亨廷頓病是由編碼亨廷頓蛋白的基因中的CAG三核苷酸重復(fù)序列的 致命延伸而造成的。該延伸導(dǎo)致積聚在細(xì)胞內(nèi)的富含谷氨酰胺的異常亨廷 頓蛋白形成，并在紋狀體神經(jīng)元中形成凝聚體及其它物質(zhì)。
可是，對(duì)于大多數(shù)神經(jīng)變性疾病，其以65歲后零星形式("遲發(fā)")發(fā)生， 不涉及已知的各個(gè)突變。它們是由環(huán)境影響和內(nèi)源因素的多因子協(xié)同造成 的。年齡被認(rèn)為是主要風(fēng)險(xiǎn)因素。近幾年中，ROS和RNS造成的細(xì)胞損傷性氧化應(yīng)激正日益被視為引發(fā) 或促進(jìn)疾病的因素。相應(yīng)地，蛋白質(zhì)硝化、蛋白質(zhì)羰基化、糖氧化、和脂 過(guò)氧化物在阿耳茨海默病和帕金森病的腦樣品中被頻繁地4企測(cè)到。其他證 據(jù)分別是抗氧化酶的補(bǔ)償性上調(diào)和增強(qiáng)RNA和DNA的氧化、以及修復(fù)這 類損傷能力的降低。另外，在帕金森病中，能發(fā)現(xiàn)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合 物I和細(xì)胞內(nèi)硫醇的水平降低以及鐵增加。動(dòng)物模型支持了帕金森病發(fā)生的 氧化應(yīng)激假說(shuō)。相應(yīng)地，給藥6-OH-多巴胺或1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)能誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的變性，長(zhǎng)期暴露于殺蟲劑也一 樣。PARK7-區(qū)編碼的DJ-1蛋白在細(xì)胞中能起抗氧化功能。也已知，a-突觸 核蛋白的積聚由氧化應(yīng)激造成。在ALS中，硝基酪氨酸常常在脊髓中被觀 察到。在亨廷頓病中，8-羥基脫氧鳥香和硝基酪氨酸常常在紋狀體中被作為 氧化應(yīng)激標(biāo)志而觀察到。
所以在神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)理中，氧化應(yīng)激是外部因素(如環(huán)境毒性 化合物)和內(nèi)部因素(如遺傳誘因)之間的關(guān)鍵連結(jié)。另外已知，自由基 解毒系統(tǒng)(如谷胱甘肽(GSH)系統(tǒng))的功效在年老時(shí)下降。需要直接干擾 該細(xì)胞針對(duì)應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制并由此產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的療法，其預(yù)計(jì)能阻 止疾病進(jìn)程。
當(dāng)前沒(méi)有有效的藥物針對(duì)神經(jīng)變性疾病。使用的試劑僅針對(duì)癥狀?？?是，它們不能終止疾病進(jìn)程。在某種程度上，產(chǎn)生了相當(dāng)大的副作用，如 運(yùn)動(dòng)障礙、精神錯(cuò)亂狀態(tài)等。藥物治療目標(biāo)分別在于代替缺少的神經(jīng)遞質(zhì) 并使幸存神經(jīng)元功能最大化，神經(jīng)元數(shù)量在癥狀開始時(shí)就急劇下降，如阿 爾茨海默病中下降超過(guò)50 %。
60-80%的阿耳茨海默病患者對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑類沒(méi)反應(yīng)。唯一可 用的其他選擇僅有NMDA受體拮抗劑金剛烷胺。處于臨床開發(fā)中的有針對(duì) 煙堿乙酰膽堿受體和NMDA受體的選擇性配體、分別針對(duì)(3-和，分泌酶以 及tau凝聚體的抑制劑、抗P-淀粉樣蛋白的免疫接種、非類固醇類抗炎藥物、 降膽固醇水平的藥物(他汀(Statine))以及非特異性抗氧化劑(其中有自旋 4甫獲劑(spin trapping agent))，及其它。
在帕金森病中，左旋多巴和脫羧酶抑制劑的組合僅在約5年的時(shí)間內(nèi) 有效。另外，可給藥多巴胺激動(dòng)劑或單胺氧化酶或兒茶酚-O-曱基轉(zhuǎn)移酶的 抑制劑。處于臨床開發(fā)中的有神經(jīng)原生長(zhǎng)因子、神經(jīng)親免素(neuroimmunophilin )、非特異性抗氧化劑、激酶抑制齊寸(CEP 1347)以及 細(xì)胞替代療法(其中有Spheramine⑧)等。
在ALS中，NMDA受體拮抗劑Riluzol用于對(duì)癥治療。這期間，觀察 到存活期稍微延長(zhǎng)2個(gè)月，其中該病在診斷后2-5年內(nèi)導(dǎo)致死亡。
因此，對(duì)于對(duì)神經(jīng)變性疾病有更高效果、特異性和接受性的新藥物有 著巨大的需求。整體上存在大量治療方法，其追求抗炎、抗凝集、抗興奮、 抗凋亡、抗氧化、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)-再生以及轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯修飾的策略。盡可能在變性 級(jí)聯(lián)的更多階段使用的、具有廣泛基礎(chǔ)的治療方法以病理生理過(guò)程的復(fù)雜 性來(lái)看似乎是當(dāng)前最有希望的。
以前針對(duì)神經(jīng)變性疾病的抗氧化治療策略僅使用非特異性抗氧化劑 (諸如維生素E、艾地苯(idebenon))。可是，這些并不能改善疾病癥狀。 所有這些方法缺乏對(duì)細(xì)胞內(nèi)源基因和蛋白質(zhì)的靶向調(diào)節(jié)，這些基因和蛋白 質(zhì)通過(guò)作為氧化應(yīng)激的成因或結(jié)果而發(fā)揮關(guān)鍵功能并由此進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)作 用。分別鑒定這些基因和蛋白質(zhì)的最有希望的機(jī)會(huì)是在以下條件時(shí)，即細(xì) 胞正與氧化應(yīng)激對(duì)抗，可是它們?nèi)阅艽婊?，即它們暴露于長(zhǎng)期的和特別是 暴露于亞致死量的氧化應(yīng)激條件下。
從所描述的現(xiàn)有技術(shù)來(lái)看，本發(fā)明的問(wèn)題是要分別提供基因和它們的 產(chǎn)物，其在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到調(diào)控。另外，本發(fā)明的問(wèn)題是 要分別通過(guò)這些基因和它們的產(chǎn)物鑒定用于治療和/或預(yù)防變性(尤其是神 經(jīng)變性)疾病的試劑。
該問(wèn)題由專利權(quán)利要求書定義的主題所解決。 "氧化應(yīng)激，，理解為活性氧類別和活性氮中間體在細(xì)il包或組織中的形 成。氧類別可以是過(guò)氧化物陰離子、羥基自由基和11202。活性氮中間體可 以是超氧亞硝基(peroxinitrite )和氧化氮。例如，這些類別例如在每個(gè)細(xì) 胞線粒體中的電子傳遞鏈反應(yīng)中形成。如當(dāng)在高代謝活性在腦中占上風(fēng)時(shí)， 細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)增加。通常，氧類別被抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、過(guò) 氧化氫酶、或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)去除。如果不能完全實(shí)現(xiàn)這樣的去除， 則形成羥基自由基、過(guò)氧化物陰離子和過(guò)氧化氫，其可造成嚴(yán)重的細(xì)胞損 傷和細(xì)胞死亡，并最終形成諸如神經(jīng)變性疾病。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"長(zhǎng)期氧化應(yīng)激(chronic oxidative stress )"或"長(zhǎng)期亞 致死性氧化應(yīng)激"，指相對(duì)于對(duì)照條件，細(xì)胞由一種或多種氧化應(yīng)激劑作用而造成的至少一種活性氧或氮化合物的增加，其中該增加持續(xù)至少4小時(shí)
并多至35天或更長(zhǎng)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"氧化應(yīng)激劑"，指導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激的分子。 本文所用的術(shù)語(yǔ)核酸的"衍生物"或"變體"指核酸序列，如本領(lǐng)域普通才支
術(shù)人員已知的，其相對(duì)于被比核酸，呈現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)缺失、取代、添力口、
插入、和/或倒位。
本文所用的術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的"衍生物"或"變體"指氨基酸序列，如本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知的，其相對(duì)于被比蛋白質(zhì)，呈現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)缺失、取 代、添加、插入、和/或天然和非天然蛋白質(zhì)修飾(如，糖基化或GPI錨定 分子)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"同源序列"或"同源物"指與被比序列或片段相比有顯 著相似性的核酸或蛋白質(zhì)序列，其中呈現(xiàn)這些同源序列的核酸和蛋白質(zhì)與 被比序列相比展示出核酸和蛋白質(zhì)活性的可相比較的活性或部分活性。核
緊或較嚴(yán)緊的條件，參見Sambrook等，Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6)下雜交，則其^皮認(rèn)為是同 源序列。嚴(yán)緊雜交條件的例子是在4 x SSC中于65°C (可選的是在50%曱 酰胺和4xSSC中于42。C)雜交，然后在0.1xSSC中于65。C進(jìn)行幾個(gè)洗滌 步驟，總共一小時(shí)。較嚴(yán)緊的雜交條件是在4 x SSC中于37。C，雜交， 然后在lxSSC中于室溫進(jìn)行幾個(gè)洗滌步驟。另夕卜，利用相似性算法BLAST (基本局部配對(duì)檢索工具，Altschul等，Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)，核酸或蛋白質(zhì)序列或其片段呈現(xiàn)出與用作比較的序列的核 酸和氨基酸序列的顯著相似性，應(yīng)被認(rèn)為是同源序列。如本文所用的，序 列被認(rèn)為是顯著相似的，則當(dāng)與其相比較的序列或片段比較時(shí)，其例如利 用NCBI的Blast服務(wù)，展示出P<10-5的顯著性水平(概率)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)劑，，指試劑，其具有改變(尤其能增加或減少) 基因的表達(dá)率和/或蛋白質(zhì)的生物活性的能力。對(duì)此，表達(dá)率或生物活性的 改變可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法在核酸水平(如產(chǎn)生的mRNA)和 蛋白質(zhì)水平(如免疫印跡、2D凝膠電泳或FRET)上直4妄來(lái)確定。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)變性疾病(neurodegenerative disease)"，指變 性和神經(jīng)疾病，如中風(fēng)和多發(fā)性硬化，以及特征在于神經(jīng)元死亡的神經(jīng)變性疾病，如癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、ALS或亨廷頓病。術(shù)語(yǔ)神經(jīng)
變性疾病還涉及神經(jīng)變性進(jìn)程在其中起作用的那些疾病，如藥物影響造成 的細(xì)胞變性(如延遲性運(yùn)動(dòng)障礙)、或精神病(如精神分裂癥或抑郁癥)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療性靶分子"或"藥靶，，指基因或蛋白質(zhì)，其通過(guò)結(jié)合 分子或物質(zhì)有目標(biāo)地影響它們的表達(dá)率或生物活性而用于治療、診斷、治
愈、延遲和/或預(yù)防疾病。
本發(fā)明分別涉及基因和蛋白質(zhì)，其在長(zhǎng)期亞致死氧化應(yīng)激條件下受調(diào) 控并屬于細(xì)胞保護(hù)性的細(xì)胞兵工廠。本發(fā)明的目的在于分別使用這些基因 和蛋白質(zhì)、以及其衍生的衍生物、變體、同源物、和片段、以及靶向后者 的抗體，用于治療、預(yù)防和診斷變性疾病(尤其是神經(jīng)變性疾病)的方法 中，以及用于鑒定調(diào)節(jié)這些基因和/或蛋白質(zhì)生物活性的預(yù)防劑和/或治療劑 的方法中。另外，本發(fā)明提供了診斷試劑盒和基因和蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞中 伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控。試劑盒、基因、和蛋白質(zhì)被用于早期通過(guò)合 適的方法防止變性疾病(尤其是神經(jīng)變性疾病)，治療或it斷這些疾病，并 通過(guò)這種診斷降低該疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了代表基因的核酸，其在真核細(xì)胞中伴隨 長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到調(diào)控。接著，本發(fā)明提供了這些基因編碼的蛋白質(zhì)。 另外，本發(fā)明還提供了這種蛋白質(zhì)，其伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到調(diào)控，而 不在核酸水平上進(jìn)行調(diào)控作用。尤其是，本發(fā)明涉及核酸的同源物、衍生 物、變體、和片段以及核酸編碼的蛋白質(zhì)。
在真核(優(yōu)選人)細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到調(diào)控的基因優(yōu)選編
碼MAC30(與腦膜瘤相關(guān)的蛋白質(zhì))、BRI3(同義詞13、 pRGR2)、 G1P3、 LOC222171、 1型含CUE結(jié)構(gòu)域(CUE domain containing 1 ) (CUEDC1)、 Niemann-Pick病C2型(NPC2)、硬脂酰-CoA去飽和酶(SCD; A-9-去飽和酶) 和異戊歸基-二磷酸5異構(gòu)酶1 (isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1 ) 蛋白質(zhì)(IDI1;=異戊烯基二磷酸二曱基烯丙基二磷酸異構(gòu)酶1 (isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1 ))。另夕卜，本發(fā)明涉及相應(yīng) 基因的轉(zhuǎn)錄變體。
MAC30的核酸序列優(yōu)選涉及cDNA序歹'j , 其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL登錄號(hào)NM—014573， BC045655, BC091504, CR613993, CR590967, CR612870, L19183, BC017362 (參見實(shí)施例1)。BRB的核酸序列優(yōu)選涉及cDNA序列，其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL 登錄號(hào)BC018737, BC071992, AF041430, AB055977 ， NM—015379， BC062370, AF106966(參見實(shí)施例2)。
G1P3的核酸序列優(yōu)選涉及cDNA序列，其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL 登錄號(hào)NM—022872， NM—022873， NM—002038， X02492, AK024814, BN000257, BC011601, BC015603和BT006850 (參見實(shí)施例3)。
LOC222171的核酸序列優(yōu)選涉及cDNA序列，其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL登錄號(hào)BC029131, NM—175887， CR619478, CR608739, CR610203, BC018144, CR604389 (參見實(shí)施例4)。
CUEDC1的核酸序列優(yōu)選涉及cDNA序列，其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL登錄號(hào)NM—017949, AK000746, BC056882, AK000977 (參 見實(shí)施例5)。
Niemann-Pick病C2型(NPC2)的核酸序列優(yōu)選涉及cDNA序列，其對(duì)應(yīng) 于NCBI Genbank/EMBL登錄號(hào)NM—006432, BC002532, CR609490, CR608935, CR605546, CR622486, AK222474, CR624497， CR601885, X67698, CR595914(參見實(shí)施例6)。
硬脂酰-CoA去飽和酶(SCD; A-9-去飽和酶)的核酸序列優(yōu)選涉及 cDNA序列，其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL登錄號(hào)S70284, Y13647, NM—005063， BC005807, AK222862, AB208982, BC062303, AF097514, AB032261 (參見實(shí)施例7)。
IDI1 (異戊烯基二磷酸二曱基烯丙基二磷酸異構(gòu)酶1)的核酸序列優(yōu)選 涉及cDNA序列，其對(duì)應(yīng)于NCBI Genbank/EMBL登錄號(hào)NM—004508， BC057827, BC019227, BC022418, BC025375, BC006999, BC005247, AF271720 (參見實(shí)施例8)。
在真核(優(yōu)選人)細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到調(diào)控的蛋白質(zhì)涉及 前述基因和它們轉(zhuǎn)錄變體的表達(dá)產(chǎn)物。
蛋白質(zhì)MAC30的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)NP—055388, AAH91504, AAH45655, AAA16188。
蛋白質(zhì)腦蛋白i3 (Brain protein i3 ) (BRB)的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄 號(hào)AAH18737, AAH71992, AAD05167, BAB32785, NP—056194, AAH62370, AAF18565, 095415。蛋白質(zhì)腦蛋白i3不應(yīng)與登錄號(hào)Q9NQX7的蛋白質(zhì)混淆，其具有相同的BRB命名而與本發(fā)明的蛋白質(zhì)無(wú)任何相似性。
蛋白質(zhì)干擾素誘導(dǎo)的6-16蛋白(Interferon induced 6-16 protein)的氨 基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)NP—075010， NP—075011， NP—002029， AAH15603, CAE12275, AAH11601, AAP35496, CAA26322。
蛋白質(zhì)LOC222171的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)AAH29131, NP一787083， EAL24204。
1型含CUE結(jié)構(gòu)域蛋白的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)NP-060419, BAA91357, AAH56882, BAA91452, Q9NWM3。
NPC2蛋白的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)NP_006423, AAH02532, BAD96194, CAA47928, P61916。
人SCD蛋白質(zhì)的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)BAA93510, BAD92219, AAH62303, AAD29870, NP—005054， AAH05807, 000767, BAD96582, AAB30631, CAA73998。
人異戊烯基-二磷酸S異構(gòu)酶1蛋白(IDI1;=異戊烯基二磷酸二曱基 烯丙基二磷酸異構(gòu)酶l)的氨基酸序列優(yōu)選涉及登錄號(hào)Q13907, NP—004499， AAH19227, AAK49435, AAK49434, AAK29357, AAH06999。
本發(fā)明優(yōu)選涉及呈現(xiàn)SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及呈現(xiàn)SEQ IDNO: 64至113序列的蛋白質(zhì)、和它們的同源物、衍生物、變體和片段。 當(dāng)涉及與本發(fā)明所述的核酸的同源物時(shí)，則同源物展示出與具有SEQ ID NO: l-63序列的核酸至少80%的同源性，優(yōu)選約85%、 90%、 95%、或99% 的同源性。當(dāng)涉及與本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的同源物時(shí)，則同源物展示出與 具有SEQ ID NO: 64-113序列的蛋白質(zhì)至少70%的同一性，至少75%、 85%、 90%、 95°/?；?9%的同一性。接著，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)可顯示有修飾。示 例性的修飾是化學(xué)修飾的氨基酸，如不天然存在的(非天然)氨基酸，氨基 酸序列中的缺失、突變和添加，蛋白質(zhì)與異源多肽的融合(融合蛋白)以及通 過(guò)天然存在的和不存在的結(jié)構(gòu)(如糖基化、GPI錨定分子和/或脂化)進(jìn)行 的氨基酸的化學(xué)和生物修飾。
本發(fā)明所述的核酸分子可以是天然或非天然存在的基因組DNA、 RNA、 cDNA、微小RNA、 siRNA、以及其同源物、衍生物、片段和變體(尤 其是可變剪切變體)、或修飾的(尤其是轉(zhuǎn)錄或化學(xué)修飾的)核酸或肽核酸 (PNA)等。在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸，其作為探針或引物選擇性地與本 發(fā)明所述的核酸雜交，并可用于檢測(cè)和/或擴(kuò)增生物樣品材料中的這些核酸
分子。寡核苷酸可以是DNA、 RNA、或PNA。對(duì)于DNA或RNA，寡核普 酸由以下核苷酸中連續(xù)的至少6、優(yōu)選6-50、 10-45、 12-40、 15-35、 15-30、 20-45、 25-40個(gè)組成，或可顯示出與本發(fā)明所述的核酸互補(bǔ)的反義核苷酸序 列。寡核苷酸可以是修飾的，如與酶偶聯(lián)，與發(fā)色團(tuán)、熒光、或發(fā)光底物 反應(yīng)，或與以下分子連接染料、熒光、發(fā)光、或放射性分子、和/或質(zhì)譜 活性化合物(同位素標(biāo)記)。此外，寡核苷酸的修飾可以是單個(gè)核苷酸間的鍵 的一個(gè)或多個(gè)修飾，例如硫代磷酸酯或曱基膦酸。本發(fā)明所述的寡核香酸 可用于核酸生物芯片中，尤其是本發(fā)明所述的方法中的電子生物芯片中。
在另一方面，本發(fā)明分別涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的 核酸的用途、和這些核酸編碼的蛋白質(zhì)的用途，用于醫(yī)學(xué)研究，例如研究 神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明尤其分別涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控 的核酸的用途、和這些核酸編碼的蛋白質(zhì)的用途，用作靶分子(藥靶)來(lái)鑒 定調(diào)節(jié)基因和/或蛋白質(zhì)生物活性的試劑，所述基因和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴 隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控。因此，本發(fā)明尤其涉及呈現(xiàn)SEQ ID NO: l至 63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、變體、和片段、和呈現(xiàn)SEQIDNO: 64至113序列的蛋白質(zhì)、以及其同源物、衍生物、變體、和片段的用途。 如本文定義的，所用的核酸和蛋白質(zhì)也可顯示有修飾。
本發(fā)明所述的用途能鑒定治療劑和/或預(yù)防劑，其用來(lái)分別對(duì)抗與氧化 應(yīng)激相關(guān)的疾病和/或(慢性)疾病有關(guān)的狀況，尤其是癌癥、心血管病、 動(dòng)脈硬化癥、糖尿病、免疫系統(tǒng)的炎癥性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸 病、早老性進(jìn)程、變性和神經(jīng)性疾病，如中風(fēng)和多發(fā)性硬化以及特征在于 神經(jīng)元死亡的神經(jīng)變性疾病，如癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、ALS或 亨廷頓病，以及預(yù)防這些疾病和/或('f曼性)疾病相關(guān)狀況。
在另一方面，本發(fā)明涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸 或蛋白質(zhì)的用途，用于鑒定、監(jiān)測(cè)、疾病分類(疾病階段分類)、治療、診斷、 和/或預(yù)后評(píng)估由細(xì)胞的氧化應(yīng)激而造成的疾病或疾病相關(guān)狀況。本發(fā)明尤 其涉及呈現(xiàn)SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、變 體、和片段的用途、以及呈現(xiàn)SEQIDNO: 64至113序列的蛋白質(zhì)、以及 其同源物、衍生物、變體、和片段的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和/或分析在細(xì)胞中伴隨 長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的診斷方法。
因此，該方法包括以下步驟
a) 從樣品中分離核酸，
b) 制備cDNA或任選之前合成cRNA用于線性擴(kuò)增，
c) 加入靶向伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的基因的寡核苷酸，之后擴(kuò)增 步驟b)的cDNA，
d) 分析步驟c)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
如果為了進(jìn)行分析需要增強(qiáng)信號(hào)，則步驟c)的擴(kuò)增產(chǎn)物可與化學(xué)修飾 的寡核苷酸或互補(bǔ)的核酸序列在生物芯片上雜交。
在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及檢測(cè)和/或分析核酸的診斷方法， 所述核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，該方法包括以下步驟
a) 從樣品中分離核酸，其中RNA任選是直接^皮標(biāo)記的，
b) 加入靶向基因的寡核苷酸，所述基因伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控， 之后與步驟a)分離的核酸雜交，
c) 分析雜交信號(hào)。
分離的樣品可以是生物樣品，例如，組織才豐品，諸如腦組織樣品、或 體液，如血液、唾液、血清、或腦脊液(CSF)。樣品也可以是以前乂人生物材 料中得到的DNA或RNA。
要檢測(cè)的核酸可以是在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的DNA或 RNA，其中優(yōu)選DNA。因此，本文中特別優(yōu)選的要檢測(cè)的核酸可以是一個(gè) 或多個(gè)呈現(xiàn)SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、變 體、和片段。如果核酸是RNA，則在核酸擴(kuò)增前進(jìn)行RNA向cDNA的反 轉(zhuǎn)錄。如果核酸是RNA，則優(yōu)選通過(guò)RT-PCR方式進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增。
確定一個(gè)或多個(gè)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)率 水平，優(yōu)選通過(guò)本發(fā)明所述的方法來(lái)進(jìn)行。另外，優(yōu)選從樣品中分離出總 RNA或mRNA,并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。為了線性擴(kuò)增，第一cDNA合 成后，用DNA依賴性RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，借助該聚合酶用相應(yīng)的 cDNA繼續(xù)進(jìn)行cDNA合成。為了直接標(biāo)記，例如，將堿性磷酸酶與RNA 偶聯(lián)，之后檢測(cè)酶活性。為該目的，優(yōu)選用本發(fā)明所述的方法擴(kuò)增cDNA, 其如現(xiàn)有技術(shù)所已知的，進(jìn)行定量PCR。另外，在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)率可通過(guò)與其雜交的寡核苷酸來(lái)檢測(cè)。因此，其
表達(dá)要被定量的核酸優(yōu)選是一個(gè)或多個(gè)呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63序列的核 酸、以及其同源物、衍生物、變體、和片段。
確定核酸的表達(dá)率例如能診斷氧化應(yīng)激是否在細(xì)胞中發(fā)生(樣品由所 述細(xì)胞中或用所述細(xì)胞獲得)，從而對(duì)鑒定、監(jiān)測(cè)、疾病分類、診斷和/或預(yù) 后評(píng)估疾病和疾病相關(guān)狀況作出說(shuō)明，所述疾病由細(xì)胞氧化應(yīng)激造成。本 發(fā)明所述的方法能診斷與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病和/或(慢性)疾病相關(guān)狀況， 尤其是癌癥、心血管病、動(dòng)脈^更化癥、糖尿病、免疫系統(tǒng)的炎癥性疾病、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、早老性進(jìn)程、變性和神經(jīng)性疾病，如中風(fēng)和
默病、帕金森病、ALS或亨廷頓病。接著通過(guò)本發(fā)明所述的方法，進(jìn)行鑒 定、評(píng)估、和/或監(jiān)測(cè)藥物副作用，該副作用因相應(yīng)藥物造成的氧化應(yīng)激而產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一方面是用于進(jìn)行本發(fā)明所述的分析和檢測(cè)方法的試劑
對(duì)。因此，相應(yīng)引物對(duì)的引物包括與細(xì)胞中長(zhǎng)期氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控的核 酸雜交的各個(gè)DNA序列。引物優(yōu)選包括各個(gè)DNA序列，其與一個(gè)或多個(gè) 呈現(xiàn)SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、變體、和 片段雜交。另外，與要進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法相對(duì)應(yīng)的試劑盒可包括合適的 試劑，如緩沖劑、核苷酸、和酶(如DNA聚合酶)、以及至少一種合適的 參照核酸。
在另一方面，本發(fā)明涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白 質(zhì)的用途，用于鑒定、監(jiān)測(cè)、疾病分類、治療、診斷、和/或預(yù)后評(píng)估由細(xì) 胞的氧化應(yīng)激而造成的疾病或疾病相關(guān)。因此，本發(fā)明尤其涉及呈現(xiàn)SEQ ID NO: 64至113序列的蛋白質(zhì)、以及其同源物、衍生物、變體、和片段的用途。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及定量在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激 而受調(diào)控的蛋白質(zhì)的分析和/或診斷方法。因此，該方法包括以下步驟
a) 在分離的樣品(優(yōu)選來(lái)自生物材料，如腦、CSF、血液、唾液)中定 量至少一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)。
b) 比較參照樣品中至少一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)的確定量，其中參照樣品源自未患變性疾病的受試者，
其中步驟a)中測(cè)試的樣品中至少一種蛋白質(zhì)的量相對(duì)于參照樣品的 相應(yīng)蛋白質(zhì)的量的增加，表示患有變性疾病或有患變性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
優(yōu)選進(jìn)行至少一種蛋白質(zhì)的定量，其選自呈現(xiàn)SEQ ID NO: 64至113 序列的蛋白質(zhì)、以及其同源物、衍生物、變體、和片段的組。
優(yōu)選通過(guò)免疫學(xué)方法進(jìn)行定量，例如通過(guò)ELISA測(cè)試、免疫印跡、RIA、 免疫組化、或免疫細(xì)胞化學(xué)。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)定量?jī)?yōu)選通過(guò)免疫學(xué)方 法利用單克隆或多克隆抗體或其它分子來(lái)進(jìn)行，所述分子特異結(jié)合在細(xì)胞 中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)，并特異結(jié)合選自呈現(xiàn)SEQIDNO: 64至113序列的蛋白質(zhì)、以及其同源物、衍生物、變體、和片段的組的蛋 白質(zhì)。由此，分子可與下述治療或預(yù)防結(jié)合物相同，并分別可以是生物分 子或化學(xué)制品，尤其是下述用作表達(dá)和生物活性調(diào)節(jié)劑的化學(xué)小分子。定 量也可優(yōu)選通過(guò)非免疫學(xué)方法用NMR或PET 4罙針進(jìn)行。同樣優(yōu)選通過(guò)質(zhì) 譜法的定量。如本文所定義的，要確定的蛋白質(zhì)可展示出修飾。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，樣品與抗體或結(jié)合物接觸，并且通過(guò) 上述方法分別確定抗體和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物、和結(jié)合物和蛋白質(zhì)形成的 復(fù)合物的量?？贵w或結(jié)合物可以是化學(xué)修飾的。例如，抗體或結(jié)合物可以 與和(發(fā)色團(tuán))底物反應(yīng)的酶偶聯(lián)，其中所述反應(yīng)、以及由所述反應(yīng)所形 成的抗體和蛋白質(zhì)復(fù)合物、和結(jié)合物和蛋白質(zhì)復(fù)合物通過(guò)產(chǎn)生的熒光、發(fā) 光、或磷光而可視化，并可檢測(cè)。此外，抗體或結(jié)合物可以分別直接連上 染料、熒光、發(fā)光、或放射性分子，并可以含有質(zhì)譜活性同位素，從而可 直接可視化抗體和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物、和蛋白質(zhì)和結(jié)合物質(zhì)形成的復(fù)合 物的檢測(cè)，而不需要插入酶反應(yīng)步驟。
在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，蛋白質(zhì)芯片用于在患者材料(如血 液、血清、CSF、腦、唾液)中^r測(cè)抗在細(xì)^^中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控 的蛋白質(zhì)的抗體。
在另 一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，蛋白質(zhì)芯片分別含抗體或結(jié)合物， 用于在患者材料(如血液、血清、CSF、腦、唾液)中^f企測(cè)本發(fā)明所述的在 細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)。
定量在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)，能鑒定、監(jiān)測(cè)、疾 病分類、-^斷和/或預(yù)后評(píng)估由細(xì)胞氧化應(yīng)激造成的疾病和/或疾病相關(guān)狀況。本發(fā)明所述的方法能診斷與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病和/或('f曼性)疾病相 關(guān)狀況，尤其是癌癥、心血管病、動(dòng)脈石更化癥、糖尿病、免疫系統(tǒng)的炎癥 性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、早老性進(jìn)程、變性和神經(jīng)性疾病， 如中風(fēng)和多發(fā)性硬化以及特征在于神經(jīng)元死亡的神經(jīng)變性疾病，如癡呆、
阿爾茨海默病、帕金森病、ALS或亨廷頓病。此外通過(guò)本發(fā)明所述的方法 鑒定、評(píng)估、和/或監(jiān)測(cè)藥物副作用，該副作用因相應(yīng)藥物造成的氧化應(yīng)激 而產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一方面是進(jìn)行本發(fā)明所述的方法的試劑盒，用于定量至少 一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)。因此，試劑盒包括至 少一種單克隆或多克隆抗體或其它結(jié)合物，所述結(jié)合物特異于在細(xì)胞中伴 隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)，并優(yōu)選特異于選自呈現(xiàn)SEQ ID NO: 64至113序列的蛋白質(zhì)、以及其同源物、衍生物、變體、和片段的組的蛋 白質(zhì)。另外，與要進(jìn)行的蛋白質(zhì)定量方法相對(duì)應(yīng)的本發(fā)明所述的試劑盒可 包括合適的試劑(如緩沖劑)以及合適的參照蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的試劑 盒可進(jìn)一步包含NMR標(biāo)簽、PET探針、用于質(zhì)i瞽的同位素標(biāo)記和/或適體。
在另一方面，本發(fā)明涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸 的用途，用于分別鑒定調(diào)節(jié)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的 表達(dá)、或調(diào)節(jié)這些核酸編碼的蛋白質(zhì)生物活性的治療劑和/或預(yù)防劑。因此， 本發(fā)明尤其涉及呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63序列的核酸和呈現(xiàn)SEQ ID NO: 64至113序列的蛋白質(zhì)以及它們的同源物、衍生物、變體、和片段的用途。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化
應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)的治療劑和/或預(yù)防劑的方法，其中該方法包括 以下步驟
a) 提供表達(dá)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的細(xì)胞
b) 將所述細(xì)^^與候選物質(zhì)"^妻觸，并
c) 將在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)與未加入候選 物質(zhì)時(shí)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)相比較，
其中在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)改變，表示候
選物質(zhì)是在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的調(diào)節(jié)劑。
在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化
應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)的生物活性的治療劑和/或預(yù)防劑的方法，其中該方法包括以下步驟
a) 分別提供細(xì)胞，其含有在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋
白質(zhì)，并在載體材料上固定至少一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控 的蛋白質(zhì)，
b) 將在載體材料上的細(xì)胞和蛋白質(zhì)分別與候選物質(zhì)接觸，并
c) 通過(guò)生物物理方法，如等離子表面共振、FRET、定量HPLC、生物
測(cè)定、和質(zhì)譜，檢測(cè)與蛋白質(zhì)結(jié)合的候選物質(zhì)的量，所述蛋白質(zhì)在細(xì)胞中 伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，
其中結(jié)合表示它是潛在的調(diào)節(jié)劑。
如本發(fā)明所述的，檢測(cè)核酸表達(dá)和該核酸表達(dá)的蛋白質(zhì)的量分別可通 過(guò)RNA分析(尤其是通過(guò)Northern印跡、帶有可能的信號(hào)增強(qiáng)的 RNA/cDNA雜交或RT-PCR)、或通過(guò)蛋白質(zhì)分析法(尤其是通過(guò)免疫印跡 分析或ELISA )來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明所述的方法優(yōu)選利用基因文庫(kù)、表達(dá)文庫(kù)、天然化合物文庫(kù)、 化學(xué)小分子文庫(kù)、重組的化學(xué)產(chǎn)生的前導(dǎo)結(jié)構(gòu)等來(lái)鑒定治療劑和/或預(yù)防劑。
本發(fā)明所用的所述候選物質(zhì)可以是生物分子或化學(xué)制品，尤其是以下 定義的化學(xué)小分子。
分別用作表達(dá)和生物活性調(diào)節(jié)劑的生物分子的例子是核酸，如多核 苷酸和寡核苷酸、嘌呤、嘧啶、多肽、抗體、寡糖、多糖、脂、脂肪酸、 類固醇或其結(jié)構(gòu)類似物、片段或衍生物、和/或其組合。
表達(dá)調(diào)節(jié)劑的例子是微小RNA、 siRNA或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知 的其它RNA干擾(RNAi)分子；寡核苷酸、多核苷酸、反義核酸、PNA、 適體、或核酶，其分別作為轉(zhuǎn)錄活化劑或抑制劑、和轉(zhuǎn)譯活化劑或抑制劑 對(duì)諸如核酸轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯具有特異效應(yīng)，所述核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化 應(yīng)激而受調(diào)控。表達(dá)調(diào)節(jié)劑可展現(xiàn)出修飾。
生物活性調(diào)節(jié)劑的例子是任意長(zhǎng)度的多聚化形式的氨基酸(如多肽、 蛋白質(zhì))，其包括天然存在的和非天然氨基酸，并以單個(gè)氨基酸鏈或作為多 聚體分子存在；多肽包括氨基酸類似物、修飾或衍生化的氨基酸；帶有環(huán) 或雙環(huán)肽骨架的多肽；融合蛋白、酯肽、PNA、或肽模擬物。生物活性調(diào) 節(jié)劑可展現(xiàn)出修飾。
生物活性調(diào)節(jié)劑可額外對(duì)所述蛋白質(zhì)的結(jié)合能力具有效應(yīng)。優(yōu)選的生物活性調(diào)節(jié)劑是抗體，例如多克隆或單克隆抗體，其激動(dòng)性、 拮抗性、或中和性地對(duì)蛋白質(zhì)生物活性起作用，所述蛋白質(zhì)與細(xì)胞氧化應(yīng) 激相關(guān)受調(diào)控并結(jié)合抗體?？贵w優(yōu)選是人源或人源化的。根據(jù)本發(fā)明抗體 優(yōu)選用作調(diào)節(jié)劑的抗體包含以下結(jié)構(gòu)域中的至少 一種免疫球蛋白的可變 區(qū)、免疫球蛋白的恒定區(qū)、免疫球蛋白的重鏈、免疫球蛋白的輕鏈和免疫 球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)。
此外，生物活性調(diào)節(jié)劑還包括抗體生物活性片段，其與抗原或蛋白質(zhì) 表位特異結(jié)合，所述蛋白質(zhì)與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控?；钚云慰梢允?br> Fab片段、Fc片段、重鏈或輕鏈的可變區(qū)片段。
此外，生物活性調(diào)節(jié)劑也包括抗體或其活性片段，所述片段特異結(jié)合 蛋白質(zhì)配體，所述蛋白質(zhì)與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控，由此調(diào)節(jié)配體活性。
細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控。該結(jié)合可以是共價(jià)的。合適的試劑如放射性 同位素、非特異性抗氧化劑、神經(jīng)元生長(zhǎng)因子以及凝集抑制劑。
分別作為核酸表達(dá)調(diào)節(jié)劑(所述核酸在細(xì)胞中與氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控) 和作為這些核酸編碼的蛋白質(zhì)的生物活性調(diào)節(jié)劑的化學(xué)制品的例子是任 何化學(xué)種類的化學(xué)制品，合成、半合成或天然存在的、無(wú)機(jī)或有機(jī)分子， 小分子或大分子復(fù)合物或金屬元素(如鋰)，或氣體。上述化學(xué)小分子的例 子是分子量至少約30道爾頓并小于約5000道爾頓的小有機(jī)化合物。
用作核酸或蛋白質(zhì)相互作用(尤其通過(guò)氫鍵)調(diào)節(jié)劑的化學(xué)制品和小 分子可顯示有以下功能團(tuán)的至少一種羥基、氨基、亞氨基、羧基、或羰 基。另外，用作調(diào)節(jié)劑的化學(xué)制品和小分子可以是或展示為單環(huán)或多環(huán)碳 結(jié)構(gòu)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)、和/或芳香或多聚芳香結(jié)構(gòu)，其用上述功能團(tuán)的至少一種 取代。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，調(diào)節(jié)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控 的蛋白質(zhì)的生物活性的試劑是結(jié)合在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的 蛋白質(zhì)的試劑(所謂"結(jié)合物")。為了鑒定這些結(jié)合物，優(yōu)選使用包括在細(xì) 胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)(尤其是包括如SEQ ID NO: 64 至113序列的蛋白質(zhì)以及其衍生物、變體、同源物、和片段)的蛋白質(zhì)芯 片。
本發(fā)明的另 一 方面是進(jìn)行本發(fā)明所述的方法的試劑盒，用于分別鑒定治療劑和/或預(yù)防劑，所述治療劑和/或預(yù)防劑調(diào)節(jié)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng) 激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)或這些核酸編碼的蛋白質(zhì)的生物活性，其中試劑 盒包括至少一種細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控
的核酸。細(xì)胞優(yōu)選包括一種或多種呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63序列的核酸、 以及其同源物、衍生物、變體、和片段。
本發(fā)明所述的方法所用的在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸 和編碼與氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控的蛋白質(zhì)并優(yōu)選呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63序
列的核酸、以及其同源物、衍生物、變體、和片段，可與允許有效表達(dá)(即 宿主細(xì)胞和/或宿主生物體中轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯)的調(diào)控元件功能性地相連。例 如，調(diào)控元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的組成型的、誘導(dǎo)型的、細(xì)胞或 組織特異性啟動(dòng)子。其它的調(diào)控元件是終止子序列和多聚腺苷酸化信號(hào)序 歹ll。功能性地與調(diào)控元件相連的核酸出現(xiàn)在載體中，例如在質(zhì)粒、粘粒、 噬菌粒、類病毒、病毒中，優(yōu)選是腺病毒和桿狀病毒。此外，功能性地與 調(diào)控元件相連的核酸可與標(biāo)記基因一起出現(xiàn)在宿主細(xì)胞和/或宿主生物體 中，其中標(biāo)記基因可與功能性地與調(diào)控元件相連的核酸一起出現(xiàn)在載體或 與這一載體不同的第二載體中。在第二種情況下，含標(biāo)記基因的載體與含
與調(diào)節(jié)元件功能性相連的核酸的載體可一起被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或宿主生物體 中。
此外，本發(fā)明分別涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸和 編碼與氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控的蛋白質(zhì)、優(yōu)選呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63的序 列的核酸、以及其同源物、衍生物、變體和片段的用途，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞和非人生物體，優(yōu)選是轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的另 一方面是細(xì)胞，其分別包含至少一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧 化應(yīng)激而受調(diào)控的重組核酸和至少一種編碼與氧化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控的蛋白 質(zhì)和優(yōu)選呈現(xiàn)SEQIDNO: l至63序列、其同源物、衍生物、變體和片,殳 的重組核酸，其中重組核酸功能性地與調(diào)控元件相連。
本發(fā)明的另一方面是非人生物體，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，其分別包含至少 一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的重組核酸和至少一種編碼與氧 化應(yīng)激相關(guān)受調(diào)控的蛋白質(zhì)和優(yōu)選呈現(xiàn)SEQIDNO: l至63序列、其同源 '物、衍生物、變體和片段的重組核酸，其中重組核酸功能性地與調(diào)控元件 相連。另一方面是在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸和蛋白質(zhì)在醫(yī)
學(xué)科學(xué)中的治療用途。因此，優(yōu)選使用呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至113序列的核 酸和蛋白質(zhì)、以及它們的同源物、衍生物、變體、和片段。
實(shí)施例
實(shí)施例1:
在無(wú)血清條件下以長(zhǎng)期亞致死濃度的氧化應(yīng)激劑氟哌丁笨 (haloperidol )(Sigma;目錄號(hào)H-1512)處理細(xì)胞之后，利用焚光標(biāo)記的cDNA 在微陣列分析中檢測(cè)MAC30-mRNA在NT2-N神經(jīng)元細(xì)胞(Andrews P. W., Dev. Biol.， 103, pp 285 — 293， 1984; Pleasure S丄 Page C.， Lee V.M,Y.， J. Neurosci., 12, pp 1802 - 1815， 1992)中的增加。才艮據(jù)廠商 說(shuō)明，通過(guò)活/死-存活/細(xì)胞毒性測(cè)試(Molecular Probes)獲得針對(duì)細(xì)胞最佳存 活率的合適條件。分別通過(guò)二維凝膠電泳和DNA微陣列進(jìn)行表達(dá)語(yǔ)試驗(yàn)， 取樣時(shí)間點(diǎn)超過(guò)3天后，超過(guò)75%的神經(jīng)元在氧化應(yīng)激劑濃度介于1， 0 - 25 jiM的情況下存活。獲取ROS和RNS的濃度以及細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)以進(jìn) 一步表征對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)。用2', 7'-二氯二氫熒光素-二乙酸鹽(Sigma，目錄 號(hào)D6883)確定細(xì)胞中ROS總量。10 cm板中的細(xì)胞刮入PBS中，等分試樣 中加入5 juMDCFDA,于37。C孵育1 h。之后，超聲勻漿細(xì)胞，離心(20分 鐘，4。C, 20.000xg)，并測(cè)量上清液的熒光。標(biāo)準(zhǔn)品是DCF。所有數(shù)據(jù)用蛋 白質(zhì)濃度來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。ROS的相對(duì)增加相對(duì)于對(duì)照來(lái)計(jì)算。另外，通過(guò)二氫 乙啡啶(DHE; Sigma目錄號(hào)D7008)來(lái)確定ROS。將5 iuMDHE加入到等 分的洗下的細(xì)胞中，于37。C孵育1小時(shí)，過(guò)程類似于DCFDA的過(guò)程，并 確定上清液的熒光。用蛋白質(zhì)調(diào)整的線粒體ROS變化相對(duì)于未處理的對(duì)照 加以計(jì)算。
各種試驗(yàn)中所用的氟哌丁苯濃度介于1, 0-25pM?？墒牵瑧?yīng)激物的濃 度也可更高或低于所述的范圍。
通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR分析(qRTRTPCR)，用SYBR-Green 1焚光標(biāo)記可定 量MAC30-mRNA的增加。在處理細(xì)胞8天后，增加50%或更多，而且用 更長(zhǎng)期的處理可獲得多至200 %或更多的增加量。為了通過(guò)qRTRTPCR分 析MAC30 mRNA，使用PCR引物對(duì)MAC30-Forl (5'-AAGCCATCTTCCTTAGCCTCCCAAGTA-3') (SEQ ID NO: 114)和NO: 115)。用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，所述片段呈現(xiàn)長(zhǎng)度為69個(gè)氨基 酸的多肽的編碼序列(登錄號(hào)NP_055388和AAH45655)。同樣，用該引物 對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，所述片段呈現(xiàn)長(zhǎng)度為176個(gè)氨基酸的多肽的編碼序列 (登錄號(hào)AAH91504)。此外，通過(guò)該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，所述片段呈 現(xiàn)長(zhǎng)度為189個(gè)氨基酸的多肽的編碼序列(登錄號(hào)AAA16188)。這些片段是 同一蛋白質(zhì)長(zhǎng)度不同的部分，該蛋白質(zhì)除了一個(gè)氨基酸替換之外是相同的。 不同長(zhǎng)度源于第 一個(gè)ATG起始密碼子的不同位置，該起始密碼子在 NP一055388和AAH45655中由于序列變化而處在下游。對(duì)于AAA16188， 開放閱讀框(ORF)始于序列中的第一個(gè)密碼子，其不是ATG。相反， AAH91504使用該序列的第一個(gè)ATG。此外，用該引物對(duì)可檢測(cè)其它的 mRNA,其編碼不同長(zhǎng)度的其它MAC30蛋白質(zhì)，并顯示有至少50 °/。相似 性。
實(shí)施例2:
用氟哌丁苯處理后，利用熒光標(biāo)記的cDNA在微陣列分析中檢測(cè) NT2-N神經(jīng)元細(xì)胞中BRB-mRNA的增加(如實(shí)施例1所述)。通過(guò)實(shí)時(shí) RT-PCR分析(qRTRTPCR)，用SYBR Green 1熒光標(biāo)記可定量該增加。處 理3天后已經(jīng)檢測(cè)到增加量。在處理細(xì)胞8天后，已經(jīng)增加40 °/?；蚋啵?而且用更長(zhǎng)期的處理可獲得多至200 %或更多的增加量。PCR引物對(duì) BRB-Forl (5'-CTTTGGGTTCATTTGCTGTTTTG-3') (SEQ ID NO: 116)和 BRB-Rev2 (5'-CATTAGAAAAAGAGAGCTGGGTGTA國(guó)3') (SEQ ID NO: 117) 適于通過(guò)qRTRTPCR分析BRD mRNA。用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA-BRI3片段， 其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為125個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。
實(shí)施例3:
用氟哌丁苯處理后，利用熒光標(biāo)記的cDNA在微陣列分析中檢測(cè) NT2-N神經(jīng)元細(xì)胞中GlP3-mRNA的增加(如實(shí)施例1所述)。通過(guò)實(shí)時(shí) RT-PCR分析(qRTRTPCR)，用SYBR GREEN 1熒光標(biāo)記可定量該增加。3 天后，已可^r測(cè)到明顯的增加量，該增加量在8天處理后為50%或更多， 而且用更長(zhǎng)期的處理可獲得多至400 %或更多的增加量。PCR引物對(duì)GlP3-For 1 (5'畫GCTATTCACAGATGCGAACATAGTA-3') (SEQ ID NO: 118) 和GlP3-Rev2 (5'-GGAGAGTGATAGACAAAGTTCTGGA-3') (SEQ ID NO: H9)適于通過(guò)qRTRTPCR分析GlP3mRNA。用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段， 其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為134個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。同樣，用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA 片段，其呈現(xiàn)出長(zhǎng)度為138個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。此外，還用該引物 對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，其呈現(xiàn)出長(zhǎng)度為130個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。差異 可由編碼區(qū)中轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度的微小差異來(lái)解釋。
實(shí)施例4:
用氟哌丁苯處理后，利用熒光標(biāo)記的cDNA在微陣列分析中檢測(cè) NT1N神經(jīng)元細(xì)胞中LOC2Bni-mRNA的增加(如實(shí)施例1所述)。通過(guò) SYBR Green 1用熒光標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR (qRTRTPCR)分析，定量該增加。 氟哌丁苯處理15天后，可4企測(cè)到明顯的增加量，其為50%或更多，而且用 更長(zhǎng)期的處理可進(jìn)一步增加。PCR引物對(duì)LOC222171-Forl (5'-TGGCTGTTATTTAGGACTCTGTGGAAA-3') (SEQ ID NO: 120)和 LOC222171-Rev2 (5'-TCCCCCACTCCTTCACTTAAGGTATAA-3') (SEQ ID NO: 121)適于通過(guò)qRTRTPCR分析LOC222171 mRNA。用該引物對(duì)擴(kuò)增 cDNA片段，其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為129個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。
實(shí)施例5:
用氟哌丁苯處理細(xì)胞后，利用焚光標(biāo)記的cDNA在微陣列分析中檢測(cè) NT2-N神經(jīng)元細(xì)胞中CUEDCl-mRNA的增加(如實(shí)施例1所述)。通過(guò) SYBR GREEN 1用焚光標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析(qRTRTPCR)，可進(jìn)一 步定量該增加。長(zhǎng)期氧化應(yīng)激15天后，檢測(cè)到增加量超過(guò)30%,該量用更 長(zhǎng)期的處理可進(jìn) 一 步增加。PCR 引物對(duì) CUEDCl-Forl (5'-CTTATTCAGGGACAAGCTGAAACACAT-3') (SEQ ID NO: 122)和 CUEDC1-Rev2 (5'-AGTGTTTCCTCTTTGACTTCCTCATTTT-3') (SEQ ID NO: 123)適于通過(guò)qRTRTPCR分析CUEDC1 mRNA。用該引物對(duì)擴(kuò)增 cDNA片段，其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為386個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。同樣，用該引 物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，呈現(xiàn)長(zhǎng)度為358個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。檢測(cè)到 2個(gè)多肽的可能性是源于AK000977在編碼區(qū)中出現(xiàn)缺失，由此形成短了約28個(gè)氨基酸的多肽，除此之外，該多肽與其他的一級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)別僅在于在
成熟蛋白質(zhì)的氨基酸47位上有一個(gè)保守氨基酸替換。 實(shí)施例6:
氟哌丁苯處理后，用熒光標(biāo)記的cDNA在微陣列分析中檢測(cè)NT2-N神 經(jīng)元細(xì)胞中NPC2-mRNA的增加(如實(shí)施例1所述)。用SYBRGREEN 1通 過(guò)熒光標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析(qRTRTPCR),可進(jìn)一步定量該增加。 處理3天后，與未處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，已經(jīng)4企測(cè)到NPC2-mRNA顯著 增加了。長(zhǎng)期亞致死氧化應(yīng)激15天后，增加50%或更多，而且用更長(zhǎng)的處 理可進(jìn)一步增加。PCR引物對(duì)NPC2-Forl
(5'-AATTAACTGCCCTATCCAAAAAGAC-3') (SEQ ID NO: 124)和 NPC2-Rev2 (5'-CAGAAGAGACTTTGGTTTTTGTCAT-3') (SEQ ID NO: 125) 適于通過(guò)qRTRTPCR分析NPC2-mRNA。用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，其 呈現(xiàn)長(zhǎng)度為151個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。同樣，用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片 段，其呈現(xiàn)出長(zhǎng)度為151個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)，其與前一多肽的區(qū)別 在于2個(gè)保守氨基酸替換。
實(shí)施例7:
用氟艱丁苯處理NT2-N神經(jīng)元細(xì)胞后，利用熒光標(biāo)記的cDNA在微陣 列分析中檢測(cè)SCD-mRNA的增加(如實(shí)施例1所述)。用SYBR GREEN 1 通過(guò)熒光標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析(qRTRTPCR),定量該增加。15天處 理后，相對(duì)于未處理的神經(jīng)元細(xì)胞，檢測(cè)到約50%或更多的SCD-mRNA的 增加。PCR引物對(duì)SCD畫Forl (5'-AAAGATGATATATATGACCCCACCT-3') (SEQ ID NO: 126)和SCD畫Rev2 (5'-CCAAGTGTAGCAGAGACATAAGGAT-3') (SEQ ID NO: 127)適于通過(guò)qRTRTPCR分析SCD-mRNA。用該引物對(duì)擴(kuò)增 cDNA片段，其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為359個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。同樣，用該引 物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為366個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。此外， 用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為355個(gè)氨基酸的多肽的編碼區(qū)。 另外，用該引物對(duì)擴(kuò)增cDNA片段，其呈現(xiàn)長(zhǎng)度為237個(gè)氨基酸的多肽的 編碼區(qū)。實(shí)施例8:
用氟哌丁苯處理NT2-N神經(jīng)元細(xì)胞后，用二維聚丙烯酰胺凝月交電泳、 以及之后用質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)，來(lái)^^測(cè)IDI1蛋白質(zhì)(IDI1 -異戊烯基-二磷 酸5異構(gòu)酶l;=異戊烯基二磷酸二曱基烯丙基二磷酸異構(gòu)酶1)的增加(如 實(shí)施例1所述)。用氟哌丁苯處理15天內(nèi)，IDIl-蛋白增加約30 %或更多。
權(quán)利要求
1. 核酸或由這些核酸所編碼的蛋白質(zhì)用于鑒定治療劑和/或預(yù)防劑的用途，所述核酸和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，所述治療劑和/或預(yù)防劑是用于治療和/或預(yù)防變性疾病、對(duì)變性疾病進(jìn)行鑒定、監(jiān)測(cè)、疾病分類、診斷、預(yù)后評(píng)估、或治療的治療劑和/或預(yù)防劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述核酸呈現(xiàn)SEQIDNO: 1-63之一 的序列、所述蛋白質(zhì)呈現(xiàn)SEQ ID NO: 64-113之一的序列，或呈現(xiàn)它們的 同源物、衍生物、變體、或片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2之任一項(xiàng)的用途，其中所述變性疾病是神經(jīng)變 性疾病。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病， 盧伊體病諸如帕金森病，彌漫性盧伊體病，亨廷頓病，肌萎縮性側(cè)索硬化 (ALS)，朊病毒病(PrD)，克雅病，唐氏綜合癥，額顳葉癡呆(FTD)，皮質(zhì)基 底變性，多發(fā)性梗塞性癡呆，進(jìn)行性核上麻痹，多系統(tǒng)萎縮，和科爾薩科 夫綜合癥。
5. 鑒定調(diào)節(jié)核酸和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的治療劑和/或預(yù)防劑的方法，所述 核酸和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，其中該方法包括以 下步驟a) 提供表達(dá)核酸的細(xì)胞，該核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，b) 使細(xì)胞與候選物質(zhì)接觸，并且c) 將在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)與未加入所述 候選物質(zhì)時(shí)所述核酸的表達(dá)相比較，所述核酸是在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng) 激而受調(diào)控的，其中在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的核酸的表達(dá)改變，表示所 述候選物質(zhì)是所述核酸的調(diào)節(jié)劑，所述核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而 受調(diào)控。
6. 鑒定調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物活性的治療劑和/或預(yù)防劑的方法，所述蛋白質(zhì) 在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，其中該方法包括以下步驟a)提供含在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，并分 別將至少一種在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)固定在載體材料上，b)分別將載體材料上的細(xì)胞和蛋白質(zhì)與候選物質(zhì)接觸，并且 C)通過(guò)生物物理方法，檢測(cè)與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的候選物質(zhì)的量，所述 蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，所述生物物理方法例如等離子表面共振、FRET、定量HPLC、生物測(cè)定、和質(zhì)譜， 其中結(jié)合表示所述候選物質(zhì)是潛在的調(diào)節(jié)劑。
7. 進(jìn)行權(quán)利要求5或6的方法來(lái)鑒定治療劑和/或預(yù)防劑的試劑盒，該 治療劑和/或預(yù)防劑調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)或這些核酸編碼的蛋白質(zhì)的生物活性， 所述核酸是在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的，其中該試劑盒包括至 少一種表達(dá)核酸的細(xì)胞，所述核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控。
8. 檢測(cè)和/或分析核酸的方法，所述核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而 受調(diào)控，所述方法包括以下步驟a) 乂人樣品中分離核酸，b) 制備cDNA或任選先前合成cRNA,用于線性擴(kuò)增，c) 加入耙向在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的基因的寡核普酸， 并接著擴(kuò)增步驟b)的cDNA，d) 分析步驟c)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述分析通過(guò)與生物芯片上化學(xué)修飾 的寡核香酸或互補(bǔ)核酸序列雜交而進(jìn)行。
10. ^r測(cè)和/或分析核酸的方法，所述核酸在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激 而受調(diào)控，所述方法包括以下步驟a) 從樣品中分離核酸，其中任選RNA是^1直接標(biāo)記的，b) 加入耙向在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的基因的寡核苷酸， 并接著與步驟a)分離的核酸雜交，c) 分析雜交信號(hào)。
11. 用于定量蛋白質(zhì)的分析和/或診斷方法，所述蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨 長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，所述方法包括以下步驟a) 在分離的樣品中定量至少一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng) 期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，b) 與參照樣品中至少一種蛋白質(zhì)所確定的量進(jìn)行比較，該蛋白質(zhì)在細(xì) 胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控，其中所述參照樣品源自未患變性疾病的受試者，其中步驟a)所測(cè)試的樣品中至少一種蛋白質(zhì)的量與參照樣品中相應(yīng)蛋白質(zhì)的量相比有所增加，表示患有變性疾病、或有罹患變性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是生物樣品，如 組織樣品或體液；其中所述組織樣品諸如腦組織樣品，所述體液例如血液、 唾液、血清、或腦脊液(CSF)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求6和8至12之任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸選自由 具有SEQIDNO: 1至63之一的序列的核酸、和它們的同源物、衍生物、 變體、和片段組成的組，和/或所述蛋白質(zhì)選自由具有SEQIDNO: 64至113 之一的序列的蛋白質(zhì)、和它們的同源物、衍生物、變體、和片段組成的組。
14. 進(jìn)行權(quán)利要求8至10和13之任一項(xiàng)的方法的試劑盒，包括至少一 個(gè)引物對(duì)，所述至少一個(gè)引物對(duì)的引物與核酸雜交，所述核酸在細(xì)胞中伴 隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控。
15. 進(jìn)行權(quán)利要求11至13之任一項(xiàng)的方法的試劑盒，包括至少一種特 異于在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體 或其他結(jié)合物，并任選包括合適的參照蛋白質(zhì)以及進(jìn)一步包括NMR-標(biāo)簽、 PET-探針、用于質(zhì)諮的同位素標(biāo)簽、和/或適體。
16. 細(xì)胞，包含至少一種呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63之一或它們的同源 物、衍生物、變體、或片段的重組核酸，其中所述重組核酸與調(diào)控性控制 元件功能性相連。
17. 非人轉(zhuǎn)基因生物體，包含至少一種呈現(xiàn)SEQ ID NO: 1至63之一 或它們的同源物、衍生物、變體、或片段的重組核酸，其中所述重組核酸 與調(diào)控性控制元件功能性相連。
全文摘要
本發(fā)明整體上涉及治療、預(yù)防和診斷變性疾病(尤其是神經(jīng)變性疾病)的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及基因和蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控并用于治療、預(yù)防、和診斷變性疾病，尤其是神經(jīng)變性疾病。另外，本發(fā)明涉及在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受調(diào)控的基因和蛋白質(zhì)的用途，用于篩選候選物質(zhì)以鑒定預(yù)防和/或治療劑，所述試劑調(diào)節(jié)基因和/或蛋白質(zhì)的生物活性，所述基因和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到活化。另外，本發(fā)明涉及診斷變性疾病(尤其是神經(jīng)變性疾病)的方法、和鑒定預(yù)防劑和/或治療劑的方法，所述試劑調(diào)節(jié)基因和/或蛋白質(zhì)的生物活性，所述基因和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞伴隨長(zhǎng)期氧化應(yīng)激而受到活化。另外，本發(fā)明涉及進(jìn)行所述診斷方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101420971SQ200780013423
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月20日
發(fā)明者托馬斯·羅爾邁耶, 羅斯瑪麗·戴格 申請(qǐng)人:神經(jīng)譜型有限責(zé)任公司