專利名稱：：具有優(yōu)化的5’端前導(dǎo)功能(5’-utr)的人工dna序列用以改進(jìn)異源蛋白質(zhì)在植物內(nèi)的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用以改善異源蛋白質(zhì)在植物中表達(dá)的人工DNA序列。
背景技術(shù)：
：在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)，對于提高引入相關(guān)生物的基因的表達(dá)水平有著強(qiáng)烈的需求。這一表達(dá)水平往往并不能令人滿意，并成為植物和動物生物技術(shù)中的創(chuàng)新付諸工業(yè)應(yīng)用的障礙。有大量數(shù)據(jù)顯示了前導(dǎo)區(qū)在調(diào)控基因表達(dá)水平中的重要性，同時有多種結(jié)構(gòu)元件來表征其調(diào)控能力。在此情況中，如同對于廣泛普及的載體(例如pBI121及其衍生物、pCAMBIA及其衍生物)所提出的，5，端的非翻譯前導(dǎo)序列(5，-UTR)存在著大量的缺陷，使其不適合指導(dǎo)基因修飾的生物體內(nèi)足夠水平的基因表達(dá)。特別是，想要最大化產(chǎn)量時(例如利用植物作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)對人有用的化合物)，必須消除5，-UTR序列產(chǎn)生的產(chǎn)量限制。為此，已提議將前導(dǎo)序列11(自然存在于煙草花葉病毒TMV中的序列)用于植物中。然而，這也有缺陷和冗余之處，使其有待改善。人們已知存在于TMV前導(dǎo)序列ft中的翻譯增強(qiáng)子中的多聚(CAA)區(qū)域(Gallie和Walbot1992NucleicAcidsRes"20，4631-4638)顯著提高表達(dá)水平，也就是說，它對異源蛋白質(zhì)在體外和體內(nèi)的翻譯水平有積極的影響(Gallie等人，1988aNucleicAcidsRes.，16，883-893,Gallie等人，1988bNucleicAcidsRes"16，8675-8694，Gallie2002NucleicAcidsRes.，30，3401-3411)。在前導(dǎo)序列11中，多聚(CAA)序列與三個ACAATTAC重復(fù)序列相連(Gallie等人，1988a)，但缺失研究表明，負(fù)責(zé)提高表達(dá)水平的調(diào)控元件可能包含與基序(CAA)n組合的單拷貝ACAATTAC序列(Gallie和Walbot1992)。人們還知道，CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(/"r)有助于mRNA的有效加帽(Guilley等人，1982Cell,30，763-773)。此外，人們已知許多植物前導(dǎo)序列(Bolle等人，1996PlantMol.Biol.32，861-868)具有富含CT元件的序列，并且該富含CT元件的序列可以改變轉(zhuǎn)錄水平(Chen等人，1996J.Virol"70，8411-8421)。人們還知道，長度超過40個核苷酸的序列易于識別第一個AUG作為真正的起始翻譯密碼子(Kozak1989J.Cell.Biol"108，229-241)。例如，已觀察到，將前導(dǎo)區(qū)從29個核苷酸延長至74個核苷酸導(dǎo)致mRNA在體外(Kozak1991，J.Biol.Chem.,266，19867-19870)和體內(nèi)(Gallie和Walbot1992)翻譯水平的增加。前導(dǎo)序列的A/T含量越高導(dǎo)致表達(dá)水平越高，原因是阻礙了由于分子自身折疊而導(dǎo)致的雙鏈mRNA片段的形成。事實(shí)上，可以肯定這種二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率具有不利影響(Pelletier和Sonenberg1985Cell,40，515-526;Kozak1986Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83，2850-2854)。此外，已注意到，源自病毒的5，-UTR的部分向植物前導(dǎo)區(qū)中的引入可以由報道蛋白表達(dá)水平的增加反映出來(DowsonDay等人，1993PlantMol.Biol"23，97-109)。因此本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)本領(lǐng)域現(xiàn)狀的缺陷，并獲得增加植物中重組蛋白表達(dá)水平的前導(dǎo)序列。本申請的申請人設(shè)計、測試并具體實(shí)施了本發(fā)明以克服本領(lǐng)域現(xiàn)狀中的缺點(diǎn)并達(dá)到這些以及其他目的和優(yōu)勢。發(fā)明概述獨(dú)立權(quán)利要求闡述并表征了本發(fā)明，而從屬權(quán)利要求描述本發(fā)明的其他特征或主要發(fā)明的想法的變型。按照上述目的，根據(jù)本發(fā)明的具有5'端前導(dǎo)功能(5，-UTR)的人工DNA序列(以下用LL-TCK表示)同時包含有利基因表達(dá)的元件，如重復(fù)的CAA三核苷酸元件，其與重復(fù)的CT二核苷酸元件組合。根據(jù)本發(fā)明的LL-TCK序列是通itA工合成的方法獲得的，是智慧的結(jié)晶，因?yàn)樗皇翘烊淮嬖诘摹８鶕?jù)有利方案，根據(jù)本發(fā)明的LL-TCK序列提供三核苷酸元件CAA與二核苷酸元件CT的組合，以及存在于前導(dǎo)序列Q中的激活翻譯的序列的修飾。根據(jù)變型，根據(jù)本發(fā)明的序列含有多聚(CAA)區(qū)域，即含有兩個或更多的CAA元件拷貝的寡核苦酸，優(yōu)選所述CAA元件彼此鄰接，但非必需。根據(jù)另一變型，根據(jù)本發(fā)明的序列含有多聚(CT)區(qū)域，即含有兩個或多個CT元件拷貝的寡核苷酸，優(yōu)選所述CAA元件彼此鄰接，但非必需。本發(fā)明的變型提供的序列含有一個或多個拷貝的ACAATTAC八聚體。由組合具有多聚(CAA)區(qū)域的序列和具有多聚(CT)區(qū)域的序列所獲得的序列也涵蓋在;^發(fā)明的范圍內(nèi)。由組合具有多聚(CAA)區(qū)域的序列和具有一個或多個ACAATTAC八聚體拷貝的序列所獲得的序列也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，由組合具有多聚(CT)區(qū)域的序列和具有一個或多個ACAATTAC八聚體拷貝的序列所獲得的序列也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，可以提供由組合具有多聚(CAA)區(qū)域的序列、具有多聚(CT)區(qū)域的序列和具有一個或多個ACAATTAC八聚體拷貝的序列所獲得的序列。此外，根據(jù)本發(fā)明，還可以提供這樣的序列，其由一個或多個上M列與CaMV35Shr位點(diǎn)組合獲得，CaMV35S/"/位點(diǎn)也就是花椰菜花葉病毒35S啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。因此根據(jù)本發(fā)明的LL-TCK序列能夠提高異源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平。根據(jù)本發(fā)明的有利方案，合成了新的LL-TCK序列，從而根據(jù)獨(dú)有的創(chuàng)新^=莫式生成下列元件的組合(1)用于有效的mRNA加帽的CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(/"/);(2)與存在于TMV前導(dǎo)序列Q中的翻譯增強(qiáng)子相似的多聚(CAA)區(qū)；(3)像許多植物的前導(dǎo)序列那樣，富含CT元件的序列。此外，LL-TCK序列的長度超過40個核苷酸，以促進(jìn)識別第一個AUG作為真正的翻譯起始密碼子(Kozak1989)，且其G+C的總體含量少于40%。根據(jù)本發(fā)明的具體方案，LL-TCK序列如SEQIDNO:1(5，-3，)所示?？梢灶A(yù)見，小的突變并不會改變LL-TCK序列的效力，因此，本發(fā)明還涉及源自此序列的前導(dǎo)序列，例如經(jīng)過CAA三聯(lián)體的缺失或重復(fù)、單個威基的取代或缺失等的序列。LL-TCK序列的創(chuàng)新在于它在單個前導(dǎo)區(qū)中匯聚了1務(wù)飾的多聚(CAA)元件、TMV前導(dǎo)序列Q中的八聚體和植物來源的富含CT的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明有利方案的人工序列LL-TCK提供了單個的ACAATTAC八聚體，其與位于該八聚體5'端位置的9個CAA重復(fù)序列相連。由于ACAATTAC元件中的ATT三聯(lián)體可以表示非典型的翻譯起始位點(diǎn)(Tyc等人，1984Eur.丄Biochem.,140，503-511，Schmitz等人，1996NucleicAcidsRes.，24，257-263)，在LL誦TCK前導(dǎo)序列中，這個三聯(lián)體已被置于具有終止密碼子的讀碼框內(nèi)。此外，在人工LL-TCK前導(dǎo)序列中，已將(CT)4元件添加到由ACAATTAC八聚體和多聚(CAA)序列結(jié)合得到的調(diào)控元件的3，端。已知這兩個元件各自都對基因表達(dá)有積極的影響，這兩個元件的組合從未在自然界中發(fā)現(xiàn)過，之前也從未人工制造。組合了這兩個元件的LL-TCK前導(dǎo)序列使得相關(guān)基因的翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平均得到增強(qiáng)。用35S-LL-TCK::"WA(pSTART)和35S::n,V/A(具有原始前導(dǎo)序列的pBI121)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草植林(A7cW/"mi紐&cc"附)，通過對比從中獲得的w,V/A基因的表達(dá)水平證實(shí)了這一效果。通過用LL-TCK替代pBI121(Clontech)中的前導(dǎo)序列獲得pSTART載體。具體而言，替代和操作的對象是在/"r區(qū)域(ACACG)和限制位點(diǎn)I(TCTAGA)之間所包含的pBI121序列。這兩個構(gòu)建體中《,V/A的起始翻譯密碼子側(cè)翼的核苷酸序列保持不變，以防止AUG密碼子識別的變異。決定選擇使用",V/A基因編碼的P-葡糖苷酸酶(GUS)作為報道蛋白，是由于煙草中沒有可以觀察的天然GUS樣活性這一事實(shí)，且轉(zhuǎn)基因",V/A的表達(dá)水平可以通過熒光試驗(yàn)的方法(Jefferson等人，1987EMBOJ.，6,3901-3907)測量，其特點(diǎn)是具有相當(dāng)高的敏感度、精度、速度和易于操作。按Jefferson(1987)的描述，測量轉(zhuǎn)化后的再生植林(T!代植林)中關(guān)于GUS酶活性的熒光讀數(shù)，該熒光讀數(shù)顯示與原始構(gòu)建體相比，LL-TCK前導(dǎo)序列的存在導(dǎo)致肌V/A基因的表達(dá)水平有可觀的提高(達(dá)15倍)。方差分析確定了涉及的兩種煙草群體(用pSTART和pBI121轉(zhuǎn)化)之間所見的差異是統(tǒng)計上顯著的，兩個群體的最佳表達(dá)子之間也差異顯著。為了排除來自后生變異的影響，用由最佳的原代轉(zhuǎn)化植抹自交獲得的T2子代植林重復(fù)該分析。在這種情況下，pSTART轉(zhuǎn)化的植林顯示的",V/A基因表達(dá)水平也比pBI121轉(zhuǎn)化的植林高得多。具體來說，以所有植林的整體考慮，所見的活性增加等于8.6倍，僅考慮高于平均的表達(dá)子的話，活性增加等于12.5倍。為了測定LL-TCK對"iWA基因轉(zhuǎn)錄的影響，杏匕選特點(diǎn)為GUS水平居中間的T2代植林(pBI121的10林，pSTART的13林)，用實(shí)時RT-PCR的方法分析轉(zhuǎn)錄物水平。從各植林中提取的總RNA開始，合成在實(shí)時RT-PCR中作為才莫板使用的cDNA。使用兩對引物(一對為",V/A基因特異性的，一對用于18SRNA的內(nèi)源基因)和SYBR-GreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)。通過連續(xù)稀釋對照質(zhì)粒的方法繪制兩條校準(zhǔn)線(一條用于轉(zhuǎn)基因，一條用于內(nèi)源基因)，使正確定量成為可能。然后用檢測到的轉(zhuǎn)基因的mRNA量與相應(yīng)的核糖體18SRNA的量之間的百分比率，計算各樣品中w/rfA基因相對的轉(zhuǎn)錄水平。這種分析可以證實(shí)，pSTART植林中wV/A基因的平均轉(zhuǎn)錄物水平比pBI121植林中所見的高1.7倍。對于7對特征在于轉(zhuǎn)錄物數(shù)值相似的pSTART和pBI121植株，計算TEI(翻譯效率指數(shù))。TEI等于GUS蛋白質(zhì)的值(用熒光測定法測量)與相對標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA值(通過實(shí)時RT-PCR測定)之間的比率。通過比較TEI，清楚地看到新的LL-TCK前導(dǎo)序列不僅影響mRNA水平，而且還導(dǎo)致mRNA翻譯效率的增加。LL-TCK序列通過作用于有關(guān)基因涉及的mRNA的含量水平、同時還作用于存在的蛋白質(zhì)的最終數(shù)量水平這兩者，使異源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平得以提高。利用組成型CaMV35S啟動子和編碼P-葡糖苷酸酶(GUS)的《/rfA基因，在煙草中研究LL-TCK的影響，但結(jié)合其他啟動子和其他基因，(LL-TCK)也可有其他應(yīng)用。盡管在本文報道的實(shí)施例中，LL-TCK前導(dǎo)序列與CaMV35S啟動子組合使用來增強(qiáng)煙草植林中",V/A的表達(dá)，但所述前導(dǎo)序列也在煙草和馬鈴薯中于光誘導(dǎo)的rbcSl啟動子(GenBank登錄號AY163904)下游和在水稻中于胚乳特異性、相位依賴性的glub4啟動子(GenBank登錄號AY427571)下游成功使用。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的基因?yàn)榫幋a鼠BCL1抗體、人P-葡糖苷酶和合成的彈性蛋白樣聚合物的基因。利用具有不同的長度、堿基組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的不相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些基因受具有不同轉(zhuǎn)錄活性的啟動子控制，在雙子葉植物和單子葉植物物種中均表達(dá)，由于在這些實(shí)驗(yàn)中沒有功能性喪失的記錄，可以說LL-TCK前導(dǎo)序列或類似組成的5'-UTR是通用的，也就是不局限于與某些啟動子和/或編碼序列的組合，且不限于某些宿主物種。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包含在一系列的生物技術(shù)應(yīng)用中，其包含對生物/非生物脅迫和除草劑的抗性，生產(chǎn)生物燃料、生物塑料、合成的生物聚合物和工業(yè)酶，生物藥劑(如抗體及其片段、疫苗、人類的酶、細(xì)胞因子和生長因子)的分子農(nóng)業(yè)，改善糧食、飼料和纖維的質(zhì)量，開發(fā)才艮道和標(biāo)記基因系統(tǒng)。此夕卜，本發(fā)明的范圍涵蓋在植物表達(dá)載體中構(gòu)建5，-UTR，其中同時存在有以下元件CaMV35S/"r位點(diǎn)、多聚(CAA)n、ACAATTAC八聚體、多聚(CT)n，其中n是大于或等于2的任何數(shù)。如上所述的構(gòu)成5'-UTR前導(dǎo)序列元件的所有可能的組合、或其相關(guān)的變體，無論它們5，-3，的相對位置如何，均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明還涉及如上所述序列的互補(bǔ)序列或相關(guān)變體。依據(jù)變型，本發(fā)明的序列長度包括在20至200個核苷酸之間，優(yōu)選為40至150個核苷酸之間。依據(jù)變型，本發(fā)明的序列的G+C含量少于60。/。，優(yōu)選少于50%。本發(fā)明的范圍還包括一個或多個擴(kuò)增引物，其包括的核普酸序列選自SEQIDNO:2-7或者其互補(bǔ)序列。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明的序列可以獲得自a)人工合成；b)天然或人工序列中天然或誘導(dǎo)的重組或突變方法。本發(fā)明的一個特點(diǎn)還涉及使用一種或多種所述擴(kuò)增引物人工合成上述序列的方法。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可能發(fā)現(xiàn)、并視為不顯著變體的天然5，-UTR前導(dǎo)序列，如果它們在功能上與本發(fā)明的序列相似，則也屬于本發(fā)明的范圍。由本發(fā)明序列進(jìn)行突變得到的序列，其產(chǎn)生了對技術(shù)人員來說不顯著的變體，如果它們在功能上與本發(fā)明的序列相似，則也屬于本發(fā)明的一部分；突變涉及本發(fā)明序列或其互補(bǔ)序列中一個或多個核苷酸的無論是缺失、插入、轉(zhuǎn)換、顛換均可。本發(fā)明還涉及攜帶含有本發(fā)明序列的質(zhì)粒的菌林，特別是涉及物種大腸桿菌(&cMr/c/n'aco//)、根癌農(nóng)桿菌(i4gro6a"eW咖t咖e/"ac/e"s)和毛根農(nóng)桿菌(y^ro6a"er/咖r力/zc^e/7es)。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明序列的工程菌林，不論宿主生物體的類型。此外，用含有本發(fā)明序列、受組成型啟動子控制的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及以下內(nèi)容-用含有本發(fā)明序列、在組織特異性啟動子尤其是種子特異性啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；-用含有本發(fā)明序列、在誘導(dǎo)型啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；-用含有本發(fā)明序列、在具有相位依賴性轉(zhuǎn)錄活性的啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；-用含有本發(fā)明序列、在葉綠體內(nèi)具有活性的啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；-用含有本發(fā)明序列、在線粒體內(nèi)具有活性的啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。本發(fā)明還包括這樣的植物，其特征在于瞬時表達(dá)信使RNA含有本發(fā)明序列的任何蛋白，瞬時表達(dá)意味著通過病毒載體、農(nóng)桿菌浸潤(agroinfiltration)、電穿孑L、基因槍(particledelivery)的方法生產(chǎn)所述蛋白。本發(fā)明還涉及雙子葉植物，特別涉及但并不限于屬于茄科(Solanaceae)、蝶形花科(Papilonaceae)和十字花科(Cruciferae)的物種，其用含有本發(fā)明序列的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且還涉及所述雙子葉植物的子代。本發(fā)明還涉及單子葉植物，特別涉及但并不限于屬于禾本科(Graminaceae)(禾本科(Poaceae))的物種，其用含有本發(fā)明序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，并且還涉及所述單子葉植物的子代。本發(fā)明有著有利的工業(yè)用途，因?yàn)樗采婕皩l(fā)明的序列用于下列行為中的任意一個-以生物^L術(shù)生產(chǎn)分子；-合成重組蛋白；-合成重組蛋白，以誘導(dǎo)對病毒、細(xì)菌或真菌病原體的抗性；-合成重組蛋白，以誘導(dǎo)對除草劑的抗性；-合成重組蛋白，以使原料和由其得到的產(chǎn)品中脂肪酸的組成得到改變；-合成重組蛋白，以使原料和由其得到的產(chǎn)品的營養(yǎng)價值得到改變；-合成重組蛋白，以生產(chǎn)燃料、橡膠和生物塑料；-合成工業(yè)酶和商業(yè)蛋白質(zhì)；-合成藥物蛋白質(zhì)；-合成用于人和動物的口服疫苗；-合成用于人和動物的注射疫苗；-合成患者特異性注射疫苗，優(yōu)選為個體基因型特異性，用于治療淋巴系統(tǒng)的肺瘤；-合成參與次生代謝物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)；-合成直接或間接作為因子鑒定和/或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的蛋白質(zhì)。附圖簡述下面對一些優(yōu)選實(shí)施方案的描述，將使本發(fā)明的這些以及其他特點(diǎn)變得顯見，所述優(yōu)選實(shí)施方案作為非限制性實(shí)例給出，并參考附圖，其中圖1、比較pBI121和pSTART中的前導(dǎo)序列，其中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出。由于在pSTART和pBI121中，￡coRV位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間、」VftflI位點(diǎn)和iV/A的ATG三聯(lián)體之間的序列是相同的，已將其部分省略(圓點(diǎn))；圖2、顯示了轉(zhuǎn)基因植林T,代中P-葡糖苷酸酶(GUS)的表達(dá)水平；圖3、顯示了轉(zhuǎn)基因植林T2代中p-葡糖苷酸酶(GUS)的表達(dá)水平；植林被分為四組，^f戈表從最佳T,代轉(zhuǎn)化體繼代的姊,。最小顯著差異(P=0.01)=4.7U/mg總蛋白質(zhì)；圖4a、顯示在用pSTART和pBI121(轉(zhuǎn)化)得到、以P-葡糖苷酸酶的表達(dá)水平居中間為特征的T2代植林中，"iWA(gusA)的相對轉(zhuǎn)錄物水平，該水平由實(shí)時RT-PCR測定。鑒定了七對具有相似的轉(zhuǎn)錄物水平的植林；圖4b、顯示了具有相似的轉(zhuǎn)錄物水平的T2代植林的翻譯效率指數(shù)(TEI)的值。TEI計算方式如下對于各轉(zhuǎn)化體，用P-葡糖苷酸酶(GUS)的濃度[U/mg總蛋白質(zhì)]除以相對標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA水平；最高的TEI視為等于1.00，相應(yīng)地表達(dá)記錄的各轉(zhuǎn)化植林的值；圖5、為通過遞歸式PCR方法合成LL-TCK所用反向和正向引物的重疊的圖解。發(fā)明詳述A)SEQIDNO:1所示的人工前導(dǎo)序列LL-TCK的合成A.l)利用市售可得的專門服務(wù)，LL-TCK序列或具有相似組成的5'-UTR的合成能夠最方便地通itA工合成而完成。由于序列的長度有限，在前導(dǎo)序列的每一側(cè)添加側(cè)翼區(qū)是尤其有用的，該側(cè)翼區(qū)以啟動子序列中已存在的限制性位點(diǎn)(5，側(cè)翼區(qū))和編碼序列(3，側(cè)翼區(qū))結(jié)束。對本行業(yè)內(nèi)的技術(shù)人員顯見，除非同時計劃修飾啟動子和/或編碼序列，這些側(cè)翼區(qū)將分別精確復(fù)制起始位點(diǎn)(/wr)的上游序列和編碼序列。A.2)獲得所述前導(dǎo)序列的另一方法是遞歸式PCR(Podromou和Pearl1992ProteinEng.,5，827-829，Wheeler等人，1996Gene,169，251-255，Prytulla等人，1996FEBSLetters,399，283-289)。一旦用任一方法獲得了LL-TCK序列或具有相似組成的5，-UTR，則通過PCR或任何其他用于隨機(jī)或者原位誘變的方法均可以^f艮容易地生產(chǎn)前導(dǎo)序列的變體。在此實(shí)施例中報道了對用遞歸式PCR的方法合成LL-TCK將其插入pBI121(GenBank登錄號AF485783)的描述，特別是將其插入CaMV35S啟動子和wV/A編石馬序列之間。用5種合成的寡核苷酸作為引物，其長度在42和54個核苷酸之間，部分重疊度等于24個核苷酸，以及19個核苷酸的末端反向引物，分別顯示在SEQIDNO:2、3、4、5、6和7的序列中。所有的引物是以5，-3，的方向書寫的。序列SEQIDNO:2、4、6是正向引物，而序列SEQIDNO:3、5和7^^向引物。正向和反向引物如圖5所示彼此重疊。為了便于操作以及將LL-TCK序列插入相關(guān)的載體序列中，將以五coRV位點(diǎn)起始的末端部分添加到5，端，同時將單個ATMI位點(diǎn)添加到3，邊緣。因此，引物的i殳計使35S啟動子(從五coRV位點(diǎn)到iW區(qū))3，末端部分重組，以便隨后插入載體pBI121(Clontech)中。外部反向引物在3，末端引入JV^iI位點(diǎn)，而在5，端使用五"RV位點(diǎn)。在pBI121中，這些位點(diǎn)分別位于CaMV35S啟動子內(nèi)部和接近wiV/A翻譯起始信號。因此，為合成提供期望的序列和克隆以代替[EcoRV-A^1片段。設(shè)計并制造了包含SEQIDNO:2-7所示的核苷酸序列的引物，以確定處于EcoRV位點(diǎn)和CaMV35S起始位點(diǎn)之間的區(qū)域的啟動子序列，從而合成LL-TCK前導(dǎo)序列，并為3'末端提供分子掛鉤(molecularhook)以供克隆。LL-TCK的合成用單個PCR完成，所使用的PCR反應(yīng)混合物中外部引物SEQIDNO:2和7(對應(yīng)合成片段的兩端)的濃度比內(nèi)部引物SEQIDNO:3、4、5和6高100倍。為了使DNA合成實(shí)現(xiàn)更高的保真度，將校正DNA聚合酶與濃度減少了50%的dNTP結(jié)合使用。PCR反應(yīng)混合物如下含有15mMMg2+的10XPfu緩沖液IOjliL引物SEQIDNO:2[10pM2jnL引物SEQIDNO:3:2jiLPfuDNA聚合酶3綁L0.8LdNTP[各2.5mM]:4pL加水至終體積100|aL。特別地，對于DNA合成和擴(kuò)增，使用Taq聚合酶Pfu(Promega)和如下循環(huán)lx(95X:進(jìn)^f亍5分鐘)；40x(95"C進(jìn)行15秒；48"C進(jìn)行30秒；72C進(jìn)行20秒)；lx(72。C進(jìn)行7分鐘)。PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，用處于TAE緩沖液中的1%瓊月旨糖:^進(jìn)行電泳，使用商業(yè)試劑盒從凝膠中回收，用AmpliTaqGold加A尾巴，并連入pGEM⑧-T(Promega)進(jìn)行雙鏈測序。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM101菌林。通過雙鏈測序驗(yàn)證了克隆序列和設(shè)計序列之間沒有任何錯配。B)含有LL-TCK序列的植物表達(dá)載體的構(gòu)建。給LL-TCK序列或具有相似組成的5，-UTR添加側(cè)翼區(qū)或分子桂鉤，可為不同類型的表達(dá)載體提供廣泛的克隆方案。在此實(shí)施例中，描述了克隆實(shí)施例1中的EcoRV-JVft"1片段以取代pBI121(GenBank登錄號AF485783)的[jE"coRV-A^tfI]片段所j吏用的方法。由于pBI121除了在CaMV35S啟動子內(nèi)部之外還有多個五②RV位點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶H/m/III和JVZwI將該啟動子從pBI121(Clontech)中切除(Jefferson等人，1987)。將片段從處于TAE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠中回收，并亞克隆到經(jīng)相同的酶消化的pUC18中(Pharmacia,GenBank登錄號L08752)。如我們所說，此過渡是必要的，因?yàn)閜BI121有多個五coRV位點(diǎn)。用得到的pUC18/35S載體制備35S啟動子一LL-TCK前導(dǎo)序列的新組合。通過用五coRV和AT6flI(NEB)消化的方法從pGEM-T載體切除LL-TCK序列，通過瓊脂糖凝膠電泳與載體序列分離，然后4吏用商業(yè)試劑盒從凝膠中回收。接下來用同樣的酶消化pUC18/35S載體，經(jīng)過堿性磷酸酶(Pharmacia)處理，進(jìn)行如上的電泳并從凝膠中回收。然后在T4DNA連接酶(Promega)存在下在4。C進(jìn)行16個小時的連接反應(yīng)。具體是，在10nL體積中含有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液，在1U的T4DNA連接酶存在下，用3.5ngRV-AT6"I片段與25ng載體結(jié)合。用A*flI和J^/"JIII(NEB)消化pBI121載體(Clontech),以移除CaMV35S啟動子。接下來用同樣的酶消化pUC18克隆載體，從中切除35S-LL-TCK復(fù)合體；對pBI121載體框和35S-LL-TCK插入片段進(jìn)行電泳并如上從凝膠中回收。最后，將35S-LL-TCK連接入pBI121構(gòu)架中，獲得載體pBI121/35S畫LL誦TCK::",V/A::NOS,其被命名為pSTART(圖1)。C)用含有LL-TCK序列的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化植物。含有LL-TCK序列或具有相似組成的5，-UTR的轉(zhuǎn)基因植物可以通過一系列方法產(chǎn)生，其包含與農(nóng)桿菌屬(々ro6ac&r/咖spp.)工程菌林共感染、用植物病毒(phytovirus)工程林感染或轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因槍、DNA顯孩"主射。pSTART表達(dá)載體通過電穿孔iiA根癌農(nóng)桿菌EHA105菌林中，將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞用于珊西煙(A7o^Vmflto6"c"附L.，cv.Xanthi)轉(zhuǎn)化。簡言之，用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞接種補(bǔ)加了卡那霉素(50mg/L)的2mlLB培養(yǎng)基。細(xì)菌培養(yǎng)物在29'C孵育16個小時。用木栓穿孔器從無菌生長、30天大的幼苗上或者從釆集自處于蓮座后期(late-rosettestage)植林的成熟葉片上取得葉盤(直徑7毫米)。在后一種情況下，將煙草葉片用蒸餾水清洗，用1%的次氯酸鈉表面消毒5分鐘，再用95%乙醇消毒30秒，在層流罩超靜臺中用無菌濾紙吸干。將葉盤置于培養(yǎng)臟中，培養(yǎng)皿中含有15mL的MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基，其中補(bǔ)加0.1mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L6-爺基腺嘌呤(BA)、30g/L蔗糖，并用8g/L瓊脂固化。此轉(zhuǎn)移之后，立即將2ml上述農(nóng)桿菌培養(yǎng)物倒入培養(yǎng)亞，使葉盤均勻浸濕。移除多余的LB培養(yǎng)基后，密封培養(yǎng)臟，在25。C見光(30.5|iE/m2/sec)孵育24小時。然后將葉盤轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)亞中，培養(yǎng)臟中含有15mL的MS培養(yǎng)基，其中補(bǔ)加0.1mg/L的萘乙酸(NAA)、1mg/L的6-千基腺噤呤(BA)、500mg/L的頭孢漆將、30g/L蔗糖，并用8g/L瓊脂固化。將其在28"C孵育一周，光照16小時/天；最后將其轉(zhuǎn)移到同前面一樣、但具有200mg/L的卡那霉素的底物中。外植體每3周進(jìn)行繼代培養(yǎng)；將再生苗從愈傷組織中分離出來，在半固體MS培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基中補(bǔ)加2mg/L的吲咮-3-丁酸、500mg/L的頭孢噻肟、200mg/L的卡那霉素，30g/L蔗糖。將假定的轉(zhuǎn)基因植物用泥炭盆栽，在溫室中生長，在PowerstarHQI-T燈(Osram)(于林冠水平，200mM光子/mVsec)下光照16小時/天，光照/黑暗溫度分別是25*C和19匸。在此實(shí)施例中，用PCR和P-葡糖苷酸酶測定法證實(shí)轉(zhuǎn)化。對于PCR測定，根據(jù)Doyle和Doyle(19卯)提取總DNA，4吏用下列引物正向5，-ACAATTACGTATTTCTCTCTCTAGA-3，反向5，-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3，正向和反向引物分別退火至LL-TCK序列末端和部分NOS終止子，且在非轉(zhuǎn)化的珊西煙(Xanthi)植林中不產(chǎn)生任何擴(kuò)增產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因植物中的擴(kuò)增子長度如預(yù)期一樣，為1936bp)。當(dāng)形成標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)混合物并使用如下循環(huán)溫度時，發(fā)現(xiàn)約93%的再生植林為轉(zhuǎn)基因植林lx(94C進(jìn)行5分鐘)；40x(94X:進(jìn)行1分15秒；60t:進(jìn)行45秒；72C進(jìn)行2分鐘)，lx(72C進(jìn)行5分鐘)。GUS組織化學(xué)測定(Jefferson等人，1987)和GUS活性的萸光測定進(jìn)一步證明了植物轉(zhuǎn)化。對照包括由未感染的葉盤體外培養(yǎng)的珊西煙植林。用于熒光檢測的方法和獲得的結(jié)果在D部分詳細(xì)才艮道。遵循同樣的程序生產(chǎn)和表征含有原始前導(dǎo)序列的轉(zhuǎn)基因植物。其它條件相同時，未發(fā)現(xiàn)再生和轉(zhuǎn)化率受到LL-TCK影響。D)LL-TCK序列對轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的影響。如前所述，分別將質(zhì)粒pBI121和pSTART用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化。因?yàn)樵谶@兩種情況下，受控基因都是wV/A(也稱為g附A)，用LL-TCK和廣泛分布的pBI121前導(dǎo)序列可達(dá)到的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平可以通過測定",V/A編碼的酶(P-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.31))的活性而直接進(jìn)行對比。各群體中取約20個原代轉(zhuǎn)化體(即屬于第一代T,的轉(zhuǎn)基因植物)，用PCR測定轉(zhuǎn)基因的存在，f^分析P-葡糖苷酸酶的活性(圖2)。當(dāng)?shù)竭_(dá)蓮座后期(煉苗(hardening)30天)，從每#物上采集3片最嫩的葉片，通過壓榨(ErichPoimhne)獲得原液；將100HL的原液與含有12mg的高分子量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的二倍體積的提取緩沖液(Jefferson1989)混合。11,500xg下離心15分鐘后，收集上清，用4誦甲基傘形酮-P-D-葡糖苦酸(MUG;Sigma-Aldrich)作為底物，一式兩份進(jìn)行熒光分析(DynaQuant200焚光計；GEHealthcare)。通過試驗(yàn)確定了由于樣品的固有熒光、猝滅、以及重組酶以外的因子引發(fā)的底物降解所產(chǎn)生的背景噪音。轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平是通過每毫升原液的P-葡糖苷酸酶單位數(shù)衡量的，定義一個單位為使用與前述相同的測定條件(Jefferson1989)，每分鐘釋放lnM4-甲基傘形酮(4-MU)的酶的量。為了避免方差與均值間的任何相關(guān)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換；用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)檢查對數(shù)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性、并用Bartlett公式進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)后，進(jìn)行方差分析。用Duncan多重范圍檢驗(yàn)于概率水準(zhǔn)P-0.05對比平均值。對熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行的方差分析顯示，同一植林的嫩葉之間不存在任何顯著變化，而植林之間存在著顯著差異。明確地，合成的前導(dǎo)序列決定了",V/A表達(dá)的高度顯著的增長(達(dá)15倍)(表l)。表1:隨機(jī)選擇的1\代植物中P-葡糖苷酸酶的活性(U/ml原液)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>為了證明這些結(jié)果不因?yàn)楹笊儺惗a(chǎn)生偏差，用T2子代重復(fù)了分析。特別地，每個群體中最好的4個T,代植林自交，產(chǎn)生的種子接種在富含卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；在各子代中隨匕選5-7林T2代抗性植株，并培養(yǎng)至蓮座后期，用PCR和通過熒光測定法測量P-葡糖普酸酶的活性來證實(shí)轉(zhuǎn)基因的存在；酶水平再次用"單位/mL原液"表示，還用"單位/mg總蛋白質(zhì)"(由Bradford法確定)表示，以報償新陳代謝中植林與植林之間的差異。與在Ti代觀察到的一樣，含有新的前導(dǎo)序列的轉(zhuǎn)基因T2代植物顯示顯著更高的",V/A表達(dá)水平(圖3);與pBI121前導(dǎo)序列相比，以整個植物群體或高于平均水平的表達(dá)子計，估計活性分別增加8.6倍和12.5倍(表2)。表2:從最好的4個A代植林獲得的T2代植林中p-葡糖苦酸酶的活性(U/mg蛋白質(zhì))<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>E)LL-TCK序列對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響LL-TCK或具有相似組成的5，-UTR中不同元件的組合，反映了給定的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的可測量的改進(jìn)。在此實(shí)施例中，如前面所描述，在用pBIUl和pSTART獲得的轉(zhuǎn)基因T2代煙草植林中顯示了這樣的改進(jìn)。為了采集這樣的證據(jù)，分析屬于pBI121或pSTART組(分別為10和13林T2代)、并以特點(diǎn)為"iV/A表達(dá)水平居中間的植林以測定i."iWA的平均轉(zhuǎn)錄物水平；ii.18SRNA的平均轉(zhuǎn)錄物水平；iii.實(shí)際生產(chǎn)的P-葡糖苷酸酶的量。為了最小化實(shí)驗(yàn)溪差，從各植林上取一嫩葉并將其切為兩半，一半用于RNA分離，另一半用于P-葡糖苷酸酶測定。用RNAgents總RNA分離系統(tǒng)(RNAgentsTotalRNAIsolationSystem)(Promega)提取總RNA。在隨機(jī)引物存在下，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)由1|JgRNA合成cDNA第一鏈。以1:5稀釋cDNA的合成反應(yīng)物，取ljLi1用于實(shí)時PCR(qRT-PCR)。qR-PCR用SYBR-GreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)進(jìn)行，各特異性引物終濃度為0.3JJM。所有反應(yīng)均用iCycleriQ多色實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行，運(yùn)行以下程序lx(95"C進(jìn)行10分鐘)；50x(95C進(jìn)行15秒；62n進(jìn)行30秒；72"C進(jìn)行30秒)。為了擴(kuò)增",V/A轉(zhuǎn)錄物，使用以下引物正向5，國TTACGCTGAAGAGATGCTCGAC-3，反向5，-CCTAAAGAGAGGTTAAAGCCGACAG畫3，對于18SRNA耙序列，引物設(shè)計以GenBank登錄號AJ236016為基礎(chǔ)正向5'畫ACATCCAAGGAAGGCAGCAG-3'反向5，-GACTCATAGAGCCCGGTATTGTTATT-3，在兩種情況下，擴(kuò)增子長度均為卯bp。各個PCR反應(yīng)中，其包含對照質(zhì)粒的系列稀釋，同時包括已知數(shù)量的i^拷貝數(shù)，以畫出標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。特別地，使用含有wWA的pBI221質(zhì)粒的10倍系列稀釋(從105到102拷貝)作為模板。為同樣的目的，將18SRNA基因(AJ236016)的550bp的片段克隆進(jìn)pGEM-TEasy(Promega),并以108-105拷貝的范圍使用。",V/A轉(zhuǎn)錄物和對照RNA的起始數(shù)量用ICyderIQ實(shí)時檢測系統(tǒng)軟件3.0版本測定。對于各個樣品，至少進(jìn)行3次獨(dú)立的評價；在所有情況下，變異系數(shù)(VC-SD/平均值)的最大值固定于20%。計算各樣品"/rfA和18SRNA的平均轉(zhuǎn)錄物水平之間的的百分比率(％ratio)。為使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，最高的wV/A轉(zhuǎn)錄物水平視為等于1.00，并據(jù)此表達(dá)記錄的各轉(zhuǎn)基因植林的值。qRT-PCR得到的結(jié)果表明，LL-TCK取代pBI121前導(dǎo)序列使m,V/A平均轉(zhuǎn)錄物水平明顯增加。特別地，發(fā)現(xiàn)含有LL-TCK前導(dǎo)序列的植林的轉(zhuǎn)錄效率高1.7倍(表3)。表3:若干T2代植抹中",V/A和18S轉(zhuǎn)錄物之間的百分比率(％ratio)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>此外，鑒定了7對具有近乎重疊的轉(zhuǎn)錄物水平的植林(圖4a)之后，確定各植林的翻譯效率指數(shù)(TEI)(圖4b)，計算P-葡糖苷酸酶的濃度和"/rfA轉(zhuǎn)錄物相對標(biāo)準(zhǔn)化水平之間的比率。通過比較TEI值，發(fā)現(xiàn)兩個前導(dǎo)序列所決定的"iV/A轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率明顯不同，4吏用本發(fā)明的前導(dǎo)序列則效率更高(表4)。表4:在一些T2代植林中測量的GUS酶活性和基因相對轉(zhuǎn)錄水平的比率TEIpSTARTpBI121TEI1.00299.07103.060.340.93277.0766.580.220.71211.8758.520.200.68203.7619.820.070.65195.2442.970.140,65194.1247.180.160.52154.9120.860.070.34102.0129.520.100.3089.488.940.030.2780.2612.340.040.2573.6922.810.080.2059.700.1749.40權(quán)利要求1.5’-UTR核苷酸前導(dǎo)序列，其特征在于包括促進(jìn)基因表達(dá)的元件，如重復(fù)的CAA三核苷酸元件，其與重復(fù)的CT二核苷酸元件組合。2.權(quán)利要求l所述的序列，其包含多聚(CAA)區(qū)域，所述多聚(CAA)區(qū)域指由兩個或多個拷貝的CAA元件組成的寡核普酸，所述CAA元件優(yōu)選但非必需為彼此相鄰。3.權(quán)利要求1所述的序列，其包含多聚(CT)區(qū)域，所述多聚(CT)區(qū)域指由兩個或多個拷貝的CT元件組成的寡核苷酸，所述CT元件優(yōu)選但非必需為彼此相鄰。4.權(quán)利要求1所述的序列，其包含一個或多個拷貝的ACAATTAC八聚體。5.權(quán)利要求l所述的序列，其包含權(quán)利要求2和3所述序列的組合。6.權(quán)利要求1所述的序列，其包含權(quán)利要求2和4所述序列的組合。7.權(quán)利要求1所述的序列，其包含權(quán)利要求3和4所述序列的組合。8.權(quán)利要求l所述的序列，其包含權(quán)利要求2、3和4所述序列的組合。9.權(quán)利要求1所述的序列，其包含權(quán)利要求2至8任一項(xiàng)所述序列的組合，并具有CaMV35S的/wr位點(diǎn)，即花椰菜花葉病毒35S啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。10.權(quán)利要求1所述的序列，其包含SEQIDNO:1所示的序列。11.5，-UTR的植物表達(dá)載體中的構(gòu)建體，其中同時存在下述元件CaMV35S的/wr位點(diǎn)、多聚(CAA)n、ACAATTAC八聚體、多聚(CT)n，其中n是大于或等于2的任何數(shù)。12.權(quán)利要求1所述的序列，其包含構(gòu)成前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的5，-UTR前導(dǎo)序列的元件的所有可能的組合，無論其5，-3，的相對位置如何。13.權(quán)利要求1所述的序列，其包含前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述序列的互補(bǔ)序列。14.權(quán)利要求1所述的序列，其長度包括在20至200個核苷酸之間，優(yōu)選為40至150個核苷酸之間。15.權(quán)利要求l所述的序列，其G+C含量小于60。/。，優(yōu)選小于50%。16.權(quán)利要求1所述的序列，其可獲得自a)人工合成；b)天然序列或人工序列中天然或誘導(dǎo)的重組方法。17.擴(kuò)增引物，其包含的核苷酸序列選自SEQIDNO:2-7所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。18.可能發(fā)現(xiàn)的天然5'-UTR前導(dǎo)序列，其視為前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述序列的不顯著變體，前提是功能相似。19.由前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述序列的突變得到的序列，其視為產(chǎn)生前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述序列的不顯著變體，前提是功能相似，其中，突變涉及前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述序列及其互補(bǔ)序列中一個或多個核苷酸的無論是缺失、插入、轉(zhuǎn)換、顛換均可。20.人工合成權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列的方法，其特征在于使用權(quán)利要求17所迷的一個或多個引物。21.攜帶含有前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述序列的質(zhì)粒的細(xì)菌林，特別涉及物種大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌。22.含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列的病毒工程林，不論其宿主生物體。23.用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列、受組成型啟動子控制的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。24.用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列、在組織特異性啟25.用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列、在誘導(dǎo)型啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。26.用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列、在具有相位依賴性轉(zhuǎn)錄活性的啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。27.用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列、在葉綠體內(nèi)具有活性的啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。28.用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列、在線粒體內(nèi)具有活性的啟動子的控制下的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。29.植物，其特征在于瞬時表達(dá)信使RNA含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列的任何蛋白，瞬時表達(dá)意味著通過病毒載體、農(nóng)桿菌浸潤、基因槍、電穿孔的方法生產(chǎn)所述蛋白。30.雙子葉植物，其用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列的表達(dá)栽體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。31.權(quán)利要求30所述的植物，其包含一個或多個屬于茄科、蝶形花科和十字花科的物種。32.權(quán)利要求30或31所述的雙子葉植物的子代。33.單子葉植物，其用含有權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。34.權(quán)利要求33所述的植物，其包含一個或多個屬于禾本科(禾本科)的物種。35.權(quán)利要求33或34所述的單子葉植物的子代。36.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述任何序列在分子的生物技術(shù)生產(chǎn)中的用途。37.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述任何序列在合成重組蛋白中的用途。38.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成重組蛋白中的用途，所述重組蛋白的合成意在誘導(dǎo)對病毒、細(xì)菌或真菌病原體的抗性。39.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成重組蛋白中的用途，所述重組蛋白的合成意在誘導(dǎo)對除草劑的抗性。40.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成重組蛋白中的用途，所述重組蛋白的合成意在使原料和由其得到的產(chǎn)品中脂肪酸的組成得至ij修飾。41.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成重組蛋白中的用途，所述重組蛋白的合成意在使原料和由其得到的產(chǎn)品的營養(yǎng)價值得到改變。42.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成重組蛋白中的用途，所述重組蛋白的合成意在生產(chǎn)燃料、橡膠和生物塑料。43.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成工業(yè)酶和商業(yè)蛋白質(zhì)中的用途。44.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成藥物蛋白質(zhì)中的用途。45.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成用于人和動物的口服疫苗中的用途。46.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成用于人和動物的注射疫苗中的用途。47.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述任何序列在合成患者特異性可注射疫苗中的用途，優(yōu)選所述疫苗為個體特異型，可用于治療'淋巴系統(tǒng)瘤。48.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述序列在合成參與次生代謝物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中的用途。49.權(quán)利要求l至19任一項(xiàng)所述序列在合成蛋白質(zhì)中的用途，全文摘要5，-UTR核苷酸前導(dǎo)序列，其包含有利于基因表達(dá)的元件，如重復(fù)的CAA三核苷酸元件，其與重復(fù)的CT二核苷酸元件組合。文檔編號C12N15/82GK101617048SQ200780051821公開日2009年12月30日申請日期2007年12月27日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者F·德阿米西斯,S·馬爾凱蒂,T·帕蒂申請人:烏迪內(nèi)大學(xué)