專利名稱：：一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，特別涉及一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。具體說是以一株含油量高生長快的原始小球藻為產(chǎn)油藻種，在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)，所得藻油再經(jīng)過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油。
背景技術(shù)：
：當今世界日益嚴峻的環(huán)境污染和能源匱乏問題使人類正面臨前所未有的巨大挑戰(zhàn)，為此，人們開始從環(huán)境和經(jīng)濟可持續(xù)性發(fā)展的角度考慮，開發(fā)可再生的碳中性燃料來取代傳統(tǒng)的石化燃料。生物柴油就是這樣一種環(huán)境友好的可再生清潔能源。生物柴油指的是動、植物或微生物油脂經(jīng)酯化反應(yīng)后得到的長鏈脂肪酸烷基單酯，在世界各地特別是歐美地區(qū)有著廣泛的應(yīng)用。但是，高昂的原料價格，造成生物柴油的生產(chǎn)成本高于傳統(tǒng)的石化柴油，這成為制約生物柴油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸，因此，設(shè)法降低生物柴油的原料成本，是生物柴油產(chǎn)業(yè)突破的主要方向。目前，大豆、油菜、葵花籽等經(jīng)濟作物是生產(chǎn)生物柴油的主要原料。這種以傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)的生物能源生產(chǎn)方式不僅產(chǎn)量低而且與糧食作物爭奪耕地、淡水、肥料等資源，因此不能滿足生物柴油產(chǎn)業(yè)對原料油持續(xù)增長的需求。微藻是一種能進行光合作用的微生物。"微藻生物燃料"的概念在很早以前就已提出，但是迄今為止，利用微藻生產(chǎn)生物柴油成本依然高昂，無法滿足商業(yè)化的要求。主要原因在于自養(yǎng)狀態(tài)下，含油量高的藻種生長緩慢，而生長迅速的藻種往往含油量相對較低。為此，吳慶余課題組以一株淡水綠藻CWore^a/7ro"^6"cc)i^s為材料，率先開展了利用異養(yǎng)微藻來生產(chǎn)生物柴油的研究。在該課題組己經(jīng)發(fā)表的論文(1)MiaoXL，WuQY.2006.Biodieselproductionfromheterotrophicmicroalgaloil.BioresourTechnol97:841-846;(2)XuH，MiaoXL.，WuQY.2006.HighqualitybiodieselproductionfrommicroalgaChlorellaprotothecoidesbyheterotrophicgrowthinfermenters.JBiotechnol126:499-507;(3)XiufengLi，HanXu，QingyuWu，2007，Large-scalebiodieselproductionfrommicroalgaGWore^sjOrc^6^力ecoic(sthroughheterotrophiccultivationinbioreactors.BiotechnologyandBioengineering.98(4):764-771.禾口已經(jīng)申請專利CN1699516A、CN1837352A的內(nèi)容顯示，Cprotot/ec^Vas細胞的單位產(chǎn)量低于16g(干重)/L，含油量低于56%，如此低的微藻細胞產(chǎn)量和含油量還不能滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。它是在已有研究成果和專利技術(shù)的基礎(chǔ)上，進一步提高生物反應(yīng)器中C;r^oA^:o/^s的產(chǎn)量和含油量，在保證高含油量的同時，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)來滿足利用異養(yǎng)小球藻細胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求。本發(fā)明的特征在于篩選含油量高、生長迅速的小球藻藻株，進一步優(yōu)化該藻株異養(yǎng)發(fā)酵的條件，建立向生物反應(yīng)器中流加營養(yǎng)物的策略和方法、控制攪拌速率、通氣量等等，最終得到的微藻細胞密度(單位產(chǎn)量)為108g(干重)/L(以下細胞密度或濃度均是千重)，細胞油脂含量為61%，均大大高于我們早先發(fā)表的研究數(shù)據(jù)(最高細胞密度為15.5g/L，最高含油量55.2%)[1，2，3]。相對于植物油、動物脂肪、餐飲廢油等生物柴油原料，高達108g/L的細胞密度和61%的含油量，降低生物柴油的原料成本，使本技術(shù)成為一條生物柴油原料油脂制備的經(jīng)濟、高效途徑。所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻作為制備生物柴油的原料，按照如下步驟進行(1)篩選一株含油量高、生長迅速的小球藻藻株；(2)將篩選到的藻株直接接種至搖瓶中作為一級種子培養(yǎng)；(3)將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進行二級高密度發(fā)酵；(4)在一級種子培養(yǎng)和二級高密度發(fā)酵過程中流加營養(yǎng)液、條件優(yōu)化和過程控制至細胞密度達到最佳；(5)離心收集小球藻細胞并干燥；(6)從干藻粉中抽提藻油；(7)以所得油脂為原料，經(jīng)過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油。所述用于異養(yǎng)高密度發(fā)酵的C/^WW力e"^fes藻株的含油量高，優(yōu)選于20%-61%之間，高含油量的藻株采用離心的方式篩選，在上清液中的藻細胞密度較小，含油量較高，將這些細胞接種于瓊脂平板中，劃線分離，形成單個藻落；為了篩選到生長速度快的藻株，篩選包括一步從平板中挑取大的、單克隆菌落的步驟，發(fā)酵罐中細胞密度優(yōu)選于15-108g/L之間；篩選得到到一株生長速度快、含油量高的藻株CproZJo"eco/c/es077。。本發(fā)明中，一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基都補加含碳水化合物，一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)液中補加的碳水化合物包括但不限于葡萄糖以及其他單糖，二糖和多糖等，濃度優(yōu)選于0.01-100g/L之間。這些碳水化合物包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、小麥淀粉水解物和高粱汁。本發(fā)明中，一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時接種量優(yōu)選于0.01%-50%之間。一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時搖床轉(zhuǎn)動或攪拌速度優(yōu)選于5-1000轉(zhuǎn)/分之間。一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時溶氧一般保持在5%以上，優(yōu)選20%以上。一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時流加的有機氮源包括但不限于甘氨酸、酵母粉、市售酵母提取物和玉米漿。本發(fā)明中，一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時pH值優(yōu)選6.0-8.0之間，通過流加堿性溶液來降低培養(yǎng)基的酸性，優(yōu)選氫氧化鉀為堿性溶液。一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時溫度控制優(yōu)選20-45"C之間。本發(fā)明中，一級種子培養(yǎng)和二級發(fā)酵培養(yǎng)時細胞干重優(yōu)選20-108克/升之間，油脂含量優(yōu)選40%-61%之間。本發(fā)明中涉及的其他對象、技術(shù)流程、優(yōu)勢和特點將會出現(xiàn)在下文的詳細描述中。本發(fā)明方法涉及的技術(shù)流程詳細描述如下(1)篩選生長速率快，含油量髙的藻株優(yōu)選離心率為8000~12000g，30min，4""C對異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻細胞進行兩次離心。上清中的藻細胞密度較小，含油量較高。接種該細胞于瓊脂平板中，劃線分離，經(jīng)過240至360小時的培養(yǎng)形成單個菌落，平板中體積相對較大的單菌落被分別接種至搖瓶中液體培養(yǎng)，分別考察比較各搖瓶中細胞的生長速度及含油量。從細胞的生長速度及含油量最高的一組培養(yǎng)中得到一株含油量高、生長速度快的藻株。藻細胞在瓊脂平板上劃線分離后的培養(yǎng)使用了添加30g/L葡萄糖和4g/L市售酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方與下一部分種子培養(yǎng)和高密度發(fā)酵培養(yǎng)相同。倒制平板時，添加1.5%的瓊脂粉形成固體培養(yǎng)基，平板培養(yǎng)時培養(yǎng)箱的溫度控制在28士0.5nC。(2)在一級反應(yīng)器中進行藻細胞種子培養(yǎng)將篩選得到的藻株接種至含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的搖瓶中作種子培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下KH2P040.7g丄-1,K2HP。40.3g丄-',MgS04'7H200.3g丄"，F(xiàn)eS04.7H203mg丄"，甘氨酸0.1g丄"，維生素B1O.Olmg丄"，A5微量元素液lml丄'1。其中A5微量元素液包含H3B03，Na2MoCV2H20，ZnS04'7H20，和MnCl2'4H20CuS04'5H20等組分。優(yōu)化的A5微量元素液包含H3B032.86g丄"，Na2Mo04.2H200.039g丄陽1，ZnS04.7H200.222g丄"，MnCl2'4H201.81g丄國1,CuS04'5H200.074g丄"。在恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶中的培養(yǎng)條件對小球藻細胞生長的影響，包括但不限于如葡萄糖濃度、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速、光強等。生長條件如下將5至50g/L的葡萄糖和1至10g/L市售的酵母提取物分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。其中，采用30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物時，細胞生長達到最優(yōu)，在20-45°C的范圍內(nèi)，28T為最佳培養(yǎng)溫度。搖瓶速度，200轉(zhuǎn)/分對細胞生長最佳。培養(yǎng)過程中還采用了5ymol.m-2s-1的弱光照射(3)種子細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進行二級高密度發(fā)酵，將經(jīng)過168小時培養(yǎng)，處于對數(shù)生長末期的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至二級生物反應(yīng)器中進行過程控制與優(yōu)化，該步反應(yīng)優(yōu)選在5-11,000L的發(fā)酵罐中進行。發(fā)酵開始時，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物。通過調(diào)整和控制接種量、底物流加、溶氧、攪拌速率、和溫度、pH值等參數(shù)對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵工藝進行了反復(fù)優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，基于溶氧反饋的有機碳源流加補給對生物量和脂肪的積累至關(guān)重要。在培養(yǎng)基中分別嘗試流加葡萄糖、果糖、蔗糖，玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉水解物以及高粱汁、含糖廢水等碳水化合物溶液，然后通過在線監(jiān)測耗氧量的變化考察細胞生長的狀況。發(fā)酵工藝優(yōu)化表明由攪拌速度和通氣量變化引起發(fā)酵液溶氧(DO)波動對細胞的高密度培養(yǎng)極為重要。通過反復(fù)的發(fā)酵條件優(yōu)化和過程控制實驗，異養(yǎng)小球藻的高密度發(fā)酵條件設(shè)定如下接種量為25%;溫度28±0,5"C;通氣速率180L/h;通過補加10g/L的KOH，將pH值控制在6.3±0.1的范圍之內(nèi)；通過補加500g/L的葡萄糖維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在5-18g/L的范圍內(nèi)波動；以0.75g/l/h的速度連續(xù)補加有機氮源(巿售酵母提取物)，培養(yǎng)88小時以后，通過逐步提高攪拌速率，使發(fā)酵液中的溶氧飽和度維持在20%以上；在128小時以后同時補加氮源和葡萄糖；213小時時，細胞密度達到108g/L,油含量達到細胞干重的61%，終止發(fā)酵。(4)收集藻細胞細胞濃度優(yōu)選20-108g/L，通過取樣測定細胞濃度以后，將藻細胞從發(fā)酵液中分離出來。該過程包括但不限于過濾和離心工藝。分離得到的藻細胞干粉或者其他固體形態(tài)。(5)從干燥的藻細胞中提取油脂從干燥的藻細胞中提取油脂的方法包括但不限于索式抽提法。采用索式抽提法，以正己垸為標準萃取溶劑，從干藻粉中提取油脂。正己烷反復(fù)淋洗，直至細胞中不再殘留脂肪，然后減壓去除溶劑。(6)酯化反應(yīng)制備生物柴油從藻細胞中提取的油脂制備生物柴油可采用酯化反應(yīng)。脂肪酸到脂肪酸酯的轉(zhuǎn)化可通過強酸，如濃硫酸催化，或酶催化。脂肪酶(TriacylglycerolAcylhydrolase，EC3.1.1.3)在油/水界面催化水解長鏈脂肪酸甘油酯，有效催化酯化和酯交換反應(yīng)。脂肪酶從C朋力'^印.99-725中提取的，催化活力可達12000Ug人最佳甲酯化條件的組合為pH值7.0，加入2.5倍體積的正己烷溶劑，60%固定化脂肪酶(相對于油的質(zhì)量，酶活12000Ug—0、10%質(zhì)量分數(shù)的水，38°C、160rpm恒溫搖床中溫育，醇油摩爾比3:1，分三次加入反應(yīng)體系。用脂肪酶催化生成的脂肪酸甲酯為生物柴油的主要成分。本發(fā)明的有意效果是本方法以篩選含油量高、生長迅速的小球藻藻株，進一步優(yōu)化該藻株異養(yǎng)發(fā)酵的條件，采用向生物反應(yīng)器中流加營養(yǎng)物的方式、控制攪拌速率、通氣量等等，最終得到的微藻細胞密度(單位產(chǎn)量)為108g(干重)/L，細胞油脂含量為61%的高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻細胞，降低生物柴油的原料成本，滿足利用異養(yǎng)小球藻細胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求，使本技術(shù)成為一條生物柴油原料油脂制備的經(jīng)濟、高效途徑。定義除非特別說明，本文中涉及的名詞定義如下.-生物柴油從可再生生物脂質(zhì)資源，如植物油或動物脂中得到的長鏈脂肪酸烷基單酯。"生物"表示相對于石油基柴油來言，它是一種可再生的生物資源;"柴油"指的是它可用于柴油發(fā)動機或像柴油一樣作為燃料使用。烷基單酯/單酯一般是指化學(xué)組成為脂肪酸酯的生物柴油。例如，脂肪酸烷基單酯生物柴油是由油酸，亞油酸，硬脂酸，棕櫚油酸以及其他脂肪酸等成份組成的。藻類指一類水生的光合作用生物，包括單細胞藻和多細胞大型藻類如海帶、紫菜等。藻類曾一度被劃歸為植物，但由于它缺乏根、莖、葉和胚胎等植物特征，因此目前被單獨分為一類。微藻個體非常微小的藻類，一般指需借助于顯微鏡才能觀察和識別的單細胞水生藻。異養(yǎng)生物體以有機化合物作為碳源和氮源的營養(yǎng)方式。轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)通過引入含有羥基的化合物，使烷氧基發(fā)生交換的反應(yīng)。長鏈脂肪酸烷基單酯/脂肪酸甲酯甲醇和脂肪酸加成并脫去一分子水生成的一類有機化合物。生物反應(yīng)器是一種用于生物細胞培養(yǎng)或涉及生物化學(xué)反應(yīng)過程并具有適當環(huán)境條件的容器或設(shè)備(包括培養(yǎng)瓶、恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶和發(fā)酵罐等)。異養(yǎng)培養(yǎng)/發(fā)酵微生物細胞在耗氧條件下利用葡萄糖或其他有機碳源生長的過程。酵母發(fā)酵在厭氧條件下利用酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精的過程。燃料乙醇以微生物發(fā)酵得到的酒精為原料制備的一種生物燃料。油/脂肪一類具有長鏈結(jié)構(gòu)的天然碳氫化合物。在本發(fā)明中，指的是脂肪酸及其衍生物，包括甘油單酯、二酯、三酯、磷脂以及其他的脂溶性甾醇類物質(zhì)(如膽固醇等)尼羅紅是一種親脂的熒光染料，在富含脂肪的環(huán)境中能發(fā)出金黃色熒光。熱解在缺氧條件下，有機質(zhì)高溫化學(xué)降解的過程。單菌落/藻落在瓊脂平板上由單個細胞生長分裂堆積形成的菌落或藻落。恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶是一種溫度、濕度等環(huán)境條件可控，供微生物生長或進行其他生化反應(yīng)的設(shè)備。有機碳是一族來自于有機體的含碳化合物(如蔗糖、脂肪等)，它區(qū)別于C02等無機碳源。有機氮是指來自于有機體的含氮化合物，如蛋白質(zhì)、尿素等。高梁禾本科蜀黍?qū)僖荒晟叽蟛荼局参?。甜高梁蔗糖含量一般?0%以上的高粱品種。木薯一種根部富含淀粉的灌木狀多年生作物。索式抽提器是一種半自動的溶劑萃取裝置，在本發(fā)明中用于從藻細胞中分離油脂。熱值單位質(zhì)量的燃料完全燃燒所釋放的熱量。單糖不能被進一步水解，分子式一般為CnH2n0n的碳水化合物，如葡萄糖、果糖、木糖等。二糖由兩個單糖單元構(gòu)成的碳水化合物。多糖由兩個以上的單糖單元構(gòu)成的碳水化合物。水解物經(jīng)水解反應(yīng)得到的化合物，在本發(fā)明中，一般指纖維素、淀粉或其他多糖物質(zhì)經(jīng)水解后得到的單糖或短鏈寡糖混合物。圖1為利用異養(yǎng)小球藻進行高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法及步驟。圖2為在5L生物反應(yīng)器中異養(yǎng)微藻高密度發(fā)酵的細胞生長和葡萄糖消耗曲線。圖3為熒光顯微鏡下尼羅紅染色細胞熒光強度測定相對油脂含量。圖4為轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中隨反應(yīng)時間的產(chǎn)物組成變化。具體實施方式本發(fā)明提供一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。它是在已有研究成果和專利技術(shù)的基礎(chǔ)上，按照圖1所示的利用異養(yǎng)小球藻進行高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法及步驟，進一步提高生物反應(yīng)器中C./^o幻Meco^/es的產(chǎn)量和含油量，利用高密度培養(yǎng)技術(shù)，篩選含油量高、生長迅速的小球藻藻株C/ro"We②ic/Mw07/。匸此菌種不是新的菌種，利用現(xiàn)有菌種培養(yǎng)得到，因此不需要保存)。在保證高含油量的同時，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)來滿足利用異養(yǎng)小球藻細胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求。下面列舉實施例對本發(fā)明予以進一步說明。實施例原始小球藻(GWorW^3;ro""ecoic^)出發(fā)藻株購自美國Texas大學(xué)藻種中心，自1990年起，清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系微藻生物能源實驗室長期培養(yǎng)該藻種用于生物能源的研究，其基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下-KH2P040.7g/L，K2HP040.3g/L，MgS04'7H200.3g/L，F(xiàn)eS04-7H203mg/L，甘氨酸0.1g/L，維生素B^.01mg/L，A5微量元素液lml/L。其中A5微量元素液包含H3B03，Na2Mo(V2H20，ZnSCV7H20，和MnCl2-4H20,CuS04.5H20等組分。優(yōu)化的A5微量元素液包含H3B032.86g丄"，Na2Mo04.2H200.039g丄'1，ZnS04'7H200.222g丄-1,MnCl2'4H201.81g丄—'，CuSO,5H200.074g丄"。通過步驟l中所描述的定向篩選技術(shù)，得到一株生長迅速、含油量高的藻株Cjarotoz^ecoic/ess/。77。。與出發(fā)藻株相比,C;zrotot力eccu'ofe51s/(9Z/(密度低，色澤金黃，最大生物量可達108克/升(如圖2所示)，含油量高達61%。相比之下，在我們過去已經(jīng)發(fā)表的文獻中，出發(fā)藻株的最高細胞密度為15.5克/升，最高含油量為55.2%。表1顯示了以C/^o力ot力ecojWes邵(W。高密度發(fā)酵制備的生物柴油與原初出發(fā)藻株一般發(fā)酵制備的生物柴油在成分與含量上的差別。將篩選得到的藻株接種至含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500ml搖瓶中作一級種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，搖瓶速度為200轉(zhuǎn)/分。在恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物。培養(yǎng)至168小時(細胞密度約為15g/L)，細胞進入對數(shù)生長末期。培養(yǎng)過程中還釆用了5umol.m-2s-l的弱光照射。在一級種子培養(yǎng)和二級高密度發(fā)酵過程中，在恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶中考察了不同培養(yǎng)條件如葡萄糖濃度、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速等對小球藻細胞生長的影響。生長條件優(yōu)化過程如下將濃度為5，10，15,20，25，30，35，40，45，50g/L的葡萄糖和濃度為l，2，3，4，5，6，7，8，9,10g/L的市售酵母提取物分別加入到上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為20、25、28、30、33、35、4CTC，搖瓶速度為200轉(zhuǎn)/分的條件下進行考察培養(yǎng)，其中優(yōu)選后，采用在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入30gZL葡萄糖和4g/L市售酵母提取物，培養(yǎng)溫度為28。C，搖瓶速度為200轉(zhuǎn)/分時，細胞生長最佳。處于對數(shù)生長期的細胞被接種至發(fā)酵罐中繼續(xù)進行二級高密度培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)在5L攪拌式生物反應(yīng)器(MINITORS，瑞士)中進行，處于對數(shù)生長期的原始小球藻細胞接種至加入30g/L葡萄糖和4g/L市售酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量為25%(V/V)。高密度培養(yǎng)條件如下28±0.5"C，通氣速率跪/h，pH值6.3±0.1，在線監(jiān)測發(fā)酵罐中的溶氧變化，一旦溶氧低于飽和度的20%以下時，通過逐步提高攪拌速率，同時連續(xù)添加葡萄糖，葡萄糖濃度控制在5-18g/L范圍內(nèi)，使發(fā)酵液中的溶氧飽和度維持在20%以上，在128小時以后同時補加市售酵母提取物和葡萄糖，補加氮源速度為0.75g/l/h，通過在5L發(fā)酵罐中采用補料流加和過程控制的方式建立高密度培養(yǎng)策略，同時監(jiān)控發(fā)酵罐中葡萄糖、甘氨酸、磷濃度以及pH值和溶氧的變化(如圖3所示)。發(fā)酵完成后，從發(fā)酵液離心收集細胞，并真空干燥。高密度發(fā)酵過程中細胞密度通過定時測定光密度值(0D54。n)來估算。005.,。與細胞干重的線性關(guān)系可以用以下公式表示y=0.4155x,(R2二0.9933，P<0.05)，其中y表示細胞密度(克/升)，x表示540nm處光密度值。發(fā)酵完成后，發(fā)酵液于4"C以10000轉(zhuǎn)/分的速度離心2分鐘，收集沉淀，真空干燥，稱重，共得到108克/升的干藻粉。采用索式抽提法，利用半自動的溶劑萃取裝置一索式抽提器，以正己烷為標準萃取溶劑，從干藻粉中提取油脂。在索式抽提器中，用正己烷反復(fù)淋洗細胞，直至細胞中不再殘留脂肪。異養(yǎng)藻油脂的分子量計算公式如下分子量(M)=56.1X1000X3/(SV-AV)，式中SV(SaponificationValue)代表微藻油脂的皂化值，AV(AcidValue)代表微藻油脂的酸值，計算得到的微藻油脂的分子量是無量綱數(shù)值。經(jīng)過溶劑減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾后對索式抽提法獲得的油脂干燥后進行稱中，以油脂凈中除以細胞干重，得細胞千重的油脂含量為61%(wV)。酯化反應(yīng)由來源于Ca/7力'^g邵.效-7M的脂肪酶催化完成，醇油摩爾比3:1，反應(yīng)在180轉(zhuǎn)/分的恒溫搖床中進行，反應(yīng)結(jié)束后，混合反應(yīng)體系分成上下兩層，分離位于上層的生物柴油，并置于5CTC的溫水中淋洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑，得到純凈的生物柴油。為了考察不同操作條件對生物柴油產(chǎn)率的影響，使反應(yīng)產(chǎn)物滿足美國生物柴油國家標準(ASTM6751)中對甘油三酯、二酯、一酯、甲醇和甘油等含量的要求，我們對各種操作變量進行了分析。這些變量包括反應(yīng)體系中脂肪酶的用量、甲醇用量、甲醇流加速度、脂肪含量、有機溶劑用量、水含量等參數(shù)以及pH值和反應(yīng)時間等。通過利用氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)可分析體系中甘油三酯、二酯、一酯、甲醇和甘油等的含量(如圖4所示)，據(jù)此可計算從油脂到脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率。采用DSQGC(Thermo,USA，VARIANVF-5ms毛細管柱30M*0.25麗)氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀進行分析。流速設(shè)定為10mlmin—1。升溫程序先升溫到70。C，保持2min;然后以10°Cmin—1的速度將溫度上升到300°C，保持20min。注射口溫度250°C，分流比為30:1。在上述條件下，經(jīng)過213小時的高密度培養(yǎng)，細胞密度達到108克/升，油含量為細胞干重的61%。在12小時的酯化反應(yīng)過程中，98.15%的微藻油脂轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯(生物柴油)，生物柴油的產(chǎn)率為64.66克Z升。共檢測到9種脂肪酸甲酯，其中含量最高的是油酸甲酯、亞油酸甲酯和棕櫚酸甲酯，其含量占全部生物柴油的80%以上。主要結(jié)果如表l所示。表l利用異養(yǎng)小球藻制備的生物柴油的組成成分與含量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，該方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)的異養(yǎng)小球藻作為制備生物柴油的原料，具體步驟包括(1)篩選一株生長速率快，含油量高的小球藻藻株；(2)將篩選得到的藻株接種至含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的搖瓶或小型生物反應(yīng)器中進行種子培養(yǎng)，還添加碳水化合物和有機氮源為細胞生長提供營養(yǎng)；(3)將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至含有營養(yǎng)液的發(fā)酵罐或其他生物反應(yīng)器中進行藻細胞高密度發(fā)酵即二級培養(yǎng)，發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中細胞密度介于15-120g/L之間；(4)在一級種子培養(yǎng)和二級高密度發(fā)酵過程中，向發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中流加營養(yǎng)液并通過其他條件控制至細胞密度達到最佳；(5)離心收集小球藻細胞并干燥；(6)從干藻粉中抽提藻油；(7)以所得油脂為原料，經(jīng)過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述篩選一株生長速率快，含油量高的小球藻藻株，還包括使C.prato^ecoW^油脂含量達到細胞干重61%的異養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)；由于高含油量的藻株密度小，離心后仍懸浮于上清液中，而平板中，體積大的單菌落具有較快的生長速率，因此，篩選得到的藻株是由離心取上清和篩選大的單菌落的方式得到的，所得藻株被命名為C.prato^eco/(5fe07川。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，將篩選得到的藻株C.prato^ecoW^0770接種至含有碳水化合物濃度為0.01-100g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的搖瓶或小型生物反應(yīng)器中作種子培養(yǎng)，按接種量為0.01%-50%，搖瓶轉(zhuǎn)動或攪拌速度為5-1000轉(zhuǎn)/分，溶氧保持在5%20%或20%以上；在恒溫、攪拌培養(yǎng)搖瓶或小型生物反應(yīng)器中間歇或連續(xù)補加入濃度為550g/L的碳水化合物和110g/L的有機氮源，通過流加堿性溶液來降低培養(yǎng)基的酸性，使pH值為6-8，溫度控制在20-45。C之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述種子細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至二級發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中進行高密度發(fā)酵與過程控制，其接種量介于總體積的0.01%-50%之間，向發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中流加營養(yǎng)液的方法還包括間歇或連續(xù)流加操作，發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中原有營養(yǎng)液或添加營養(yǎng)液含有的碳水化合物包括葡萄糖或其他單糖、二糖或多糖，碳水化合物來源包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、小麥淀粉水解物和高粱汁；碳水化合物濃度控制在0.01-100克/升之間；發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中原有的營養(yǎng)液或添加的營養(yǎng)液含有的有機氮源包括甘氨酸、酵母粉、市售酵母提取物或玉米漿；高密度發(fā)酵方法還包括攪拌操作和通氣，攪拌速率控制在5-1000轉(zhuǎn)/分之間，通氣操作保持培養(yǎng)基中溶氧(DO)值保持在5%20%或20%以上；所述高密度發(fā)酵方法還包括向發(fā)酵罐中流加堿液用以維持體系pH值在6.0-8.0之間，堿液包括氫氧化鉀及其他強堿性化合物；發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵的溫度控制在20-45'C之間。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述酯化反應(yīng)制備生物柴油，首先采用索式抽提法，以正己烷或氯仿為標準萃取溶劑，從發(fā)酵液中分離收集的小球藻細胞干粉中提取藻粉油脂，然后以酯交換反應(yīng)在藻粉油脂中加入醇油摩爾比26:1的甲醇，分三次加入反應(yīng)體系，在脂肪酶TriacylglycerolAcylhydrolase,EC3丄1.3的有效催化酯化作用下，加熱至30。C90。C，160rpm恒溫搖床中溫育，反應(yīng)生成的產(chǎn)物，經(jīng)石油醚及水洗滌，離心取有機相，將有機溶劑蒸發(fā)、干燥后獲得生物柴油，并分離出副產(chǎn)品甘油。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)和高密度發(fā)酵營養(yǎng)液含有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下KH2P040.7g丄"，K2HP040.3g丄"，MgS04-7H200.3g丄—1,FeS04'7H203mg丄.1，甘氨酸O.lg丄"，維生素BlO.Olmg丄-1，A5微量元素液lml丄"；其中A5微量元素液的組成為H3B032.86g丄"，Na2Mo04'2H200.039g丄-1,ZnS04-7H200.222g丄隱1,MnCl2-4H201.81g丄"，CuS04'5H200.074g丄1.全文摘要本發(fā)明公開了屬于可再生生物能源領(lǐng)域的一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。該方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)的異養(yǎng)小球藻為原料，主要通過高生長速率與高油脂含量藻種的篩選、直接接種至搖瓶中作為一級種子培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進行二級高密度發(fā)酵培養(yǎng)，進行條件優(yōu)化與過程控制，并流加含有碳水化合物的培養(yǎng)液為細胞生長提供營養(yǎng)，使達到108g/L、油脂含量達到61％的高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻細胞，經(jīng)過分離、收集并干燥、抽提藻油，再經(jīng)過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油；本發(fā)明降低生物柴油的原料成本，滿足利用異養(yǎng)小球藻細胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求，使本技術(shù)成為一條生物柴油原料油脂制備的經(jīng)濟、高效途徑。文檔編號C12P7/64GK101230364SQ20081010087公開日2008年7月30日申請日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2008年2月25日發(fā)明者吳慶余,周文廣,偉熊申請人:清華大學(xué)