專利名稱：一種分離嚴格厭氧產(chǎn)甲烷古菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到微生物菌種選育、廢水治理和生物能源領域。本發(fā)明通過 控制嚴格厭氧產(chǎn)甲烷古菌厭氧生長的環(huán)境，提供一種分離嚴格厭氧產(chǎn)甲垸古 菌的方法。
背景技術：
厭氧甲烷古菌是一類在地球生命起源中出現(xiàn)極早的特殊微生物，這與當 時的原始地球大氣環(huán)境及其地球環(huán)境的生物轉化有著緊密聯(lián)系。由于受環(huán)境 條件的限制，使得這一物種僅分布于河底淤泥，海洋底部等極端嚴格厭氧的 狹窄環(huán)境或生命出現(xiàn)初期的自然環(huán)境中，在常規(guī)條件下分離培養(yǎng)及其困難， 為其生理生化性質的研究和工藝開發(fā)與利用造成了很大的難度，使得目前關 于甲烷古菌的有關知識非常貧乏。也因為生長環(huán)境的狹窄及單調性，與其相 應的物種多樣性也受到極大限制。 與生長條件簡單，分布廣泛的真細菌及其 他物種相比，其種屬非常少，種質資源稀缺而寶貴。
厭氧甲垸古菌的最大生理特征是代謝簡單有機物而產(chǎn)甲烷，這一特征因 而賦予了該類微生物在環(huán)境有機污染物的生物處理，生物質能源的轉化利用 方面被廣泛利用而受到關注。然而他們通常是與其他厭氧微生物處于一個有 機的微生物生態(tài)群落中以共棲互利方式才得以發(fā)揮作用，加上分離純培養(yǎng)極 為困難，因而對他們的利用和認識都是從復雜微生物群落體系的整體上進行 的。這種認識由于其他相關微生物的廣泛存在難免受到干擾，使得其認識無 法深入甚至不夠準確。

發(fā)明內(nèi)容
為了充分利用厭氧甲烷古菌在環(huán)境和生物能源領域的潛能，本發(fā)明提供 一種分離嚴格厭氧甲烷古菌的方法。
一種分離嚴格厭氧產(chǎn)甲烷古菌的方法，在平皿上鋪設上、下兩層固體培 養(yǎng)基，其中下層為選擇性固體培養(yǎng)基，主要提供被分離微生物生長的營養(yǎng)基 質，上層為隔氧固體培養(yǎng)基，主要起隔絕氧的作用。
隔氧固體培養(yǎng)基主要由水和2-3% (W/V)瓊脂粉構成的無營養(yǎng)基質。下層選擇性固體培養(yǎng)基組成含量為NHXl: 0.7-L2g/1， MgCl2: 0.08-0. 14g/l， NaCl: 17-22g/l， CaCl2: 0.2-0.4g/l， K2HP04: 0.3_0.5g/l， K跳:0.3-0.5g/l，酵母膏0.8-1.2g/l ，蛋白胨0.8-1.2g/l，碳源h 甲酸鈉1. 7-2. 4 g/1,碳源2:乙酸鈉1. 7-2. 4g/l，碳源3:甲醇1. 7-2. 4g/l， 蒸餾水lOOOmL，瓊脂2-3% (W/V)， pH: 7.0-7.2 (用鹽酸調節(jié))；按1L 選擇性培養(yǎng)基時加入微量元素母液1ml 。
微量元素母液組成為
所述微量元素母液組成為FeCl3'4H20: 2000 mg/1; CoCl2'6H20: 2000 mg/1 ， MnCl2.4H20: 500 mg/1 ， CuCl2. 2H20: 30 mg/1 , ZnCl2: 50 mg/1 ， H3B03 : 50 mg/1 ， Na2Se03-5H20: 100mg/l， NiCl2'6H20: 50 mg/1 ， EDTA: 1000mg/l， 36%HC1: 1 ml。
本發(fā)明利用甲垸菌對能量譜很窄，通過在下層培養(yǎng)基中分別加入甲酸鈉， 乙酸鈉，甲醇幾種有限碳源， 一方面可以通過這種由于碳源利用的不同帶來 的選擇壓力而盡量抑制其他厭氧菌的生長，另一方面，單獨加入這幾種碳源 中某一種可定向分離到不同的產(chǎn)甲烷菌屬。
對上下層培養(yǎng)基分別配制和滅菌后，先向平皿中倒入下層選擇性培養(yǎng)基， 冷卻凝固后，將帶分離樣品涂布其上，再加入較低溫度的上層隔氧培養(yǎng)基， 冷卻凝固，將其置于玻璃干燥器中，充氮氣后置于恒溫箱培養(yǎng)。
具體操作過程如下
1. 視被分離樣品中微生物濃度大小，將其微生物濃度調節(jié)至O. 5X107-1. 5 X10Vml，用于涂布平皿。
2. 將上層選擇性培養(yǎng)基和下層隔氧培養(yǎng)基分別按以上提供的配方配制 后，115r高溫蒸汽滅菌20min。
3. 將下層選擇性培養(yǎng)基在無菌操作臺快速倒入平皿中，其厚度大概在 0.4-0. 7cm左右，冷卻凝固后，將預先調整好微生物濃度的樣品取lOOul均勻 涂布在該培養(yǎng)基上。
4. 將上層隔氧培養(yǎng)基冷卻到4(TC左右，快速倒入涂有樣品的上述平皿中， 其厚度大概在0. 6-0. 7cm左右。冷卻凝固后倒置于玻璃干燥器中。
5. 將玻璃干燥器蓋邊緣均勻涂上凡士林(用于密封干燥器)，蓋上蓋子， 然后將氮氣管通過蓋子頂部的開口插入干燥器底部，充氣10min。密閉開口，將這個裝置置于37。C恒溫箱培養(yǎng)3-5天后即可觀察到甲烷菌單菌落，可用接 種針小心挖取菌落塊進行擴大培養(yǎng)及后續(xù)研究。
本發(fā)明利用雙層平皿培養(yǎng)基和外加氮氣的雙重隔氧保護機制，在上述基 礎上，再利用甲烷菌屬之間及與其他厭氧微生物在碳源利用上的差異性，限 制性的加入有限的碳源，從而達到定向篩選分離不同產(chǎn)甲垸菌的目的。本方 法無需復雜昂貴的厭氧設備，操作簡單可靠，可快速定向分離到甲烷菌，同 時也為其他特殊厭氧菌種選育提供了新的思路。


圖1:雙層培養(yǎng)基制備示意圖；其中l(wèi)-平皿蓋；2-上層隔氧培養(yǎng)基；3-菌液涂布層；4-下層選擇培養(yǎng)基；
圖2:玻璃干燥器充氣示意圖；其中5-氮氣充氣口； 6-活動橡膠塞； 7-平皿隔板。
具體實施例方式
實施例1
1. 將上層隔氧培養(yǎng)基(1000 mL水和20 g瓊脂粉)和下層選擇性培養(yǎng)基 (組分如下NHUCl: 1.2g/l, MgCl2: 0.14g/l， NaCl: 22g/l， CaCl2 : 0.3g/l，
K2HP04: 0.5g/l， KH2P04: 0.5g/l，酵母膏1.2g/l ，蛋白胨1.2g/l，碳源1: 甲酸鈉2.4 g/l，碳源2:乙酸鈉2.4g/l，碳源3:甲醇2.4g/l，蒸餾水lOOOmL, 瓊脂2% (W/V)，)分別配制后，加入微量元素母液lml/L; 115t:高溫蒸汽 滅菌20min。
2. 將下層選擇性培養(yǎng)基在無菌操作臺快速倒入平皿中，其厚度大概在 0.4-0. 7cm左右，冷卻凝固。
3. 將分離樣品中其微生物濃度調節(jié)至0. 6X 107ml，取100ul均勻涂布在 下層培養(yǎng)基上。
4. 將上層隔氧培養(yǎng)基冷卻到40'C左右，快速倒入涂有樣品的上述平皿中， 其厚度大概在0. 6-0. 7cm左右。冷卻凝固后倒置于玻璃干燥器中。
5. 將玻璃干燥器蓋邊緣均勻涂上凡士林(用于密封干燥器)，蓋上蓋子， 然后將氮氣管通過蓋子頂部的開口插入干燥器底部，充氣10min。密閉開口， 將這個裝置置于37。C恒溫箱培養(yǎng)5天后即可觀察到甲烷菌單菌落，可用接種 針小心挖取菌落塊進行擴大培養(yǎng)及后續(xù)研究。實施例2
1. 將上層隔氧培養(yǎng)基(1000 mL水和20g瓊脂粉)和下層選擇性培養(yǎng)基 (組分如下NHjCl: 0,7g/l, MgCl2: 0.09g/l， NaCl: 19g/l， CaCl2 : 0.3g/l，
K2HP04: 0.3g/l， KH2P04: 0.3g/l，酵母膏0.8g/l ，蛋白胨0.8g/l，碳源1: 甲酸鈉1.8 g/l，碳源2:乙酸鈉1.7g/l，碳源3:甲醇1.7g/l,蒸餾水lOOOmL， 瓊脂2% (W/V)，)分別配制后，加入微量元素母液lml/L; 115。C高溫蒸汽 滅菌20min。
2. 將下層選擇性培養(yǎng)基在無菌操作臺快速倒入平皿中，其厚度大概在 0.4-0. 7cm左右，冷卻凝固。
3. 將分離樣品中其微生物濃度調節(jié)至1. 5X 10Vml，取100ul均勻涂布在 下層培養(yǎng)基上。
4. 將上層隔氧培養(yǎng)基冷卻到4(TC左右，快速倒入涂有樣品的上述平皿中， 其厚度大概在0. 6-0. 7cm左右。冷卻凝固后倒置于玻璃干燥器中。
5. 將玻璃干燥器蓋邊緣均勻涂上凡士林(用于密封干燥器)，蓋上蓋子， 然后將氮氣管通過蓋子頂部的開口插入干燥器底部，充氣10min。密閉開口， 將這個裝置置于37-C恒溫箱培養(yǎng)5天后即可觀察到甲烷菌單菌落，可用接種 針小心挖取菌落塊進行擴大培養(yǎng)及后續(xù)研究。
權利要求
1. 一種分離嚴格厭氧產(chǎn)甲烷古菌的方法，其特征在于1)將被分離樣品中微生物濃度調節(jié)至0.5×107-1.5×107/ml；2)將上層選擇性培養(yǎng)基和下層隔氧培養(yǎng)基于115℃蒸汽滅菌20min；3)將下層選擇性培養(yǎng)基在無菌操作臺倒入平皿中，其厚度為0.4-0.7cm，冷卻凝固后，將預先調整好微生物濃度的樣品取100ul均勻涂布在該培養(yǎng)基上；4)將上層隔氧培養(yǎng)基冷卻到40℃左右，倒入涂有樣品的上述平皿中，其厚度為0.6-0.7cm，冷卻凝固后倒置于干燥器中；5)將干燥器密封后通入氮氣，充氣10min后于37℃恒溫箱培養(yǎng)3-5天，可觀察到甲烷菌單菌落；所述隔氧培養(yǎng)基是由水和重量體積為2-3％的瓊脂粉構成的無營養(yǎng)基質；所述選擇性培養(yǎng)基組成成份及含量為NH4Cl0.7-1.2g/l，MgCl20.08-0.14g/l，NaCl17-22g/l，CaCl20.2-0.4g/l，K2HP040.3-0.5g/l，KH2P040.3-0.5g/l，酵母膏0.8-1.2g/l，蛋白胨0.8-1.2g/l，碳源1甲酸鈉1.7-2.4g/l，碳源2乙酸鈉1.7-2.4g/l，碳源3甲醇1.7-2.4g/l，蒸餾水1000mL，瓊脂重量體積百分數(shù)為2-3％，pH7.0—7.2，按1L選擇性培養(yǎng)基加入微量元素母液1ml；所述微量元素母液組成為FeCl3·4H2O2000mg/l；CoCl2·6H2O2000mg/l，MnCl2·4H2O500mg/l，CuCl2.2H2O30mg/l，ZnCl250mg/l，H3BO350mg/l，Na2SeO3·5H2O100mg/l，NiCl2·6H2O50mg/l，EDTA1000mg/l，36％HCl1ml。
全文摘要
一種分離嚴格厭氧產(chǎn)甲烷古菌的方法。本發(fā)明利用雙層平皿培養(yǎng)基和外加氮氣的雙重隔氧保護，通過甲烷菌屬之間及與其他厭氧微生物在碳源利用上的特異性，限制性的加入有限的碳源，從而達到定向篩選分離不同甲烷菌的目的。本方法無需復雜昂貴的厭氧設備，操作簡單可靠，使常規(guī)難以分離的特殊環(huán)境下的甲烷菌在實驗室可快速定向分離得到，為深化甲烷菌的認識及開發(fā)其工藝應用潛能奠定了基礎。
文檔編號C12R1/01GK101434924SQ200810143979
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權日2008年12月17日
發(fā)明者夏樂先, 礎 尹, 張維新, 戴松林, 柳建設, 邱冠周 申請人:中南大學