專利名稱：：肺癌的多基因預(yù)后試驗(yàn)的制作方法肺癌的多基因預(yù)后試驗(yàn)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2007年6月1日提交的USSN60/941，550的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用全文納入本文。在聯(lián)邦資助研發(fā)下作出發(fā)明的權(quán)利的聲明不適用對(duì)以光盤(pán)提交的“序列表”、表格或計(jì)算機(jī)程序列表附件的引用不適用
背景技術(shù)：
：借助臨床分期和組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)來(lái)確定肺癌患者的長(zhǎng)期死亡率可能性不佳。我們的假設(shè)是多基因定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試驗(yàn)可預(yù)計(jì)肺癌患者的死亡率風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供為對(duì)象的肺癌提供預(yù)后的方法，該方法包括以下步驟(a)將該對(duì)象的生物學(xué)樣品與特異性結(jié)合一組生物標(biāo)記物的試劑接觸，所述生物標(biāo)記物包括ctnnbl、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2和dusp6，和(b)通過(guò)比較該樣品與對(duì)照非癌性細(xì)胞樣品來(lái)測(cè)定所述標(biāo)記物在該樣品中是否差別表達(dá)；從而提供肺癌的預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是核酸。在另一實(shí)施方式中，所述試劑是寡核苷酸。在另一實(shí)施方式中，所述試劑是PCR引物組(primerset)。在另一實(shí)施方式中，所述試劑是抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品來(lái)自外科手術(shù)切除的腫瘤。在另一實(shí)施方式中，所述樣品來(lái)自肺組織或肺腫瘤活檢。在一方面，本發(fā)明提供裝有特異性結(jié)合一組生物標(biāo)記物的試劑的試劑盒，所述生物標(biāo)記物包括ctnnbI、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2禾口dusp。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是PCR引物組。在另一方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少兩種(例如，至少三種或至少四種)基因的表達(dá)水平來(lái)確定患肺癌對(duì)象的預(yù)后的方法，所述基因選自下組Rnd3、wnt3a、erbb3、Ick、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3禾口brcalo在該方面，所述生物學(xué)樣品(例如，腫瘤活檢、肺活檢和血液樣品)源自該對(duì)象，而所述表達(dá)水平是預(yù)后的標(biāo)志。在以上任一方面，所述表達(dá)水平可以是mRNA表達(dá)水平或蛋白質(zhì)水平，或二者的組合。本發(fā)明的特征在于通過(guò)，例如定量rtPCR測(cè)定mRNA表達(dá)水平。本發(fā)明的特征在于通過(guò)，例如抗體結(jié)合試驗(yàn)(例如，ELISA試驗(yàn))測(cè)定蛋白質(zhì)水平。在還有另一方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)檢測(cè)生物學(xué)樣品中至少兩種(例如，至少三種或至少四種)基因的甲基化水平來(lái)確定患肺癌對(duì)象的預(yù)后的方法，所述基因選自下組Rnd3、wnt3a、erbb3、Ick、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3禾口brcalo在該方面，所述生物學(xué)樣品(例如，腫瘤活檢、肺活檢和血液樣品)源自該對(duì)象，而所述甲基化水平是預(yù)后的標(biāo)志。在以上任一方面，肺癌可以是肺腺癌，例如I期、II期、III期或IV期。在以上任一方面，所述預(yù)后還提供長(zhǎng)期死亡率的高或低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示肺癌是癌癥死亡最常見(jiàn)的原因，并顯示對(duì)于1期癌癥，長(zhǎng)期死亡率的預(yù)后(5年存活率)是約60%。圖2顯示預(yù)后的基因組模型。圖3描述了RTPCR分析所用的樣品。圖4描述了進(jìn)行預(yù)后的患者群體。圖5描述了定量測(cè)(RT)PCR的方法。圖6描述了所有肺腺癌標(biāo)記物的訓(xùn)練組的結(jié)果。圖7描述了所有肺腺癌標(biāo)記物的驗(yàn)證組的結(jié)果。圖8描述了1期肺腺癌標(biāo)記物的驗(yàn)證和訓(xùn)練組的結(jié)果。圖9列出了1期肺腺癌的RT-PCR多基因預(yù)后試驗(yàn)所用的8種基因。圖10顯示了包含驗(yàn)證組的分期、腫瘤尺寸和高評(píng)分的Cox模型的結(jié)果。圖Ila是利用4-基因預(yù)后模型比較低_和高_(dá)風(fēng)險(xiǎn)患者(所有階段)總存活率的卡-邁曲線(Kaplan-Meiercurve)。圖lib是比較低-和高-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者(所有階段)無(wú)疾病存活率的卡-邁曲線。圖12a是利用4-基因預(yù)后模型比較低_和高_(dá)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的I期患者總存活率的卡-邁曲線。圖12b是比較低_和高_(dá)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的I期患者無(wú)疾病存活率的卡-邁曲線。圖13是利用Chen及其同事公布的5_基因預(yù)后模型比較低-和高-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的I期患者的卡-邁曲線。發(fā)明詳述引言本發(fā)明的特征在于鑒定到某些組合的基因的表達(dá)概況能對(duì)早期肺癌的長(zhǎng)期死亡率作出精確預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方式中，我們鑒定了65種基因，這些基因在以前公布的3項(xiàng)微陣列研究和2項(xiàng)基于PCR的研究中鑒定為早期肺癌的長(zhǎng)期死亡率預(yù)后。從肺腺癌完全切除的連續(xù)患者的124份新鮮冷凍的腫瘤樣品中提取RNA，所述患者至少臨床隨訪3年。將80份樣品隨機(jī)指定為測(cè)試組，將其余樣品指定為驗(yàn)證組。采用Taq-man試驗(yàn)對(duì)測(cè)試組進(jìn)行65種鑒定基因的實(shí)時(shí)PCR。采用反向模型選擇(backwardsmodelselection)，利用標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)水平的比例危險(xiǎn)率模型產(chǎn)生預(yù)測(cè)模型。利用模型系數(shù)和各基因表達(dá)水平計(jì)算各患者的模型評(píng)分。如果模型評(píng)分大于中值評(píng)分，則患者確定為高風(fēng)險(xiǎn)。在所有80位患者中鑒定了充分的實(shí)時(shí)PCR概況。最終模型包括18種基因。鑒定為高-風(fēng)險(xiǎn)和低-風(fēng)險(xiǎn)的患者比例分別是是52%和48%。低-風(fēng)險(xiǎn)組中卡-邁(Kaplan-Meier)預(yù)計(jì)5年存活率是82%，在高-風(fēng)險(xiǎn)組中是5%(P<0.001，時(shí)序檢驗(yàn))。高_(dá)風(fēng)險(xiǎn)組中，中值存活是22個(gè)月，低-風(fēng)險(xiǎn)組中未獲得。在多變量存活分析中，預(yù)后評(píng)分預(yù)計(jì)的存活率不依賴于腫瘤階段和尺寸(P<0.001)。根據(jù)模型log-可能性值，預(yù)后評(píng)分預(yù)計(jì)死亡率優(yōu)于臨床分期(P<0.001)。臨床分期可參見(jiàn)，例如Mountain，CliftonF；HermanILibshitz,KayEHermes.AHandbookforStaging,Imaging,andLymphNodeClassification(分期、成像和淋巴結(jié)分類手冊(cè)).CPY公司(CharlesPYoungCompany),和Mountain,CF(1997).“Revisionsintheinternationalsystemforstaginglungcancer"(肺癌分期國(guó)際體系的修訂).Chest111:1710-1717。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于定量測(cè)定作為肺癌所致死亡率的預(yù)后指標(biāo)的以下基因表達(dá):rnd3>wnt3a>erbb3>lck、sh3bgr>fut3>illl、cdc6>cdk2apKbagl>emx2>six3、和brcal(例如，wnt3a、rnd3、lck、和erbb3)(參見(jiàn)以下實(shí)施例2)。8成員的多-基因RT-PCR試驗(yàn)(ctnnbl、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2和dusp6)、13成員的多-基因RT-PCR試驗(yàn)(rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3、和brcal)、或包括wnt3a、rnd3>lck、和erbb3的任{可多-基因RT-PCR試驗(yàn)有助于預(yù)測(cè)肺癌患者的長(zhǎng)期死亡率。本發(fā)明還包括多基因診斷試劑盒，其由本文所述可用于提供肺癌患者預(yù)后的標(biāo)記物構(gòu)成。定義“肺癌”通常指由惡性細(xì)胞的尺寸和外觀分類的主要兩類肺癌非小細(xì)胞(80%)和小細(xì)胞(約20%)肺癌?！胺切〖?xì)胞肺癌”(NSCLC)包括鱗狀細(xì)胞癌，約占肺癌的29%。肺腺癌是NSCLC的最常見(jiàn)亞型，約占肺癌的32%。肺腺癌的一種亞型是細(xì)支氣管肺泡癌，其在從不吸煙女性中更常見(jiàn)。大細(xì)胞癌約占肺癌的9%?！靶〖?xì)胞肺癌”包括SCLC(也稱為“燕麥形細(xì)胞癌”)，其是不常見(jiàn)的肺癌形式。肺癌的其它類型包括類癌、腺樣囊性癌、圓柱瘤、和粘液表皮樣癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照I-IV期對(duì)肺癌分期，其中I是早期，IV是最晚期?！邦A(yù)后”指，例如總存活率、長(zhǎng)期死亡率和無(wú)疾病存活率。在一個(gè)實(shí)施方式中，長(zhǎng)期死亡率指診斷為肺癌后存活5年。在一個(gè)實(shí)施方式中，長(zhǎng)期死亡率的預(yù)后是“高風(fēng)險(xiǎn)的”，例如高死亡率風(fēng)險(xiǎn)，或“低風(fēng)險(xiǎn)的”，例如低死亡率風(fēng)險(xiǎn)。癌癥的階段和預(yù)后可用于為患者定制治療以提供較好的后果，例如靶向治療和外科手術(shù)、單用外科手術(shù)或單用靶向治療。癌癥的其它形式包括癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括實(shí)體和淋巴癌癥、頭頸癌，例如口腔癌、咽和舌癌、腎癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、腦癌、頭頸癌、皮膚癌、子宮癌、睪丸癌、食道癌、和肝臟癌癥，包括肝癌、淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(例如，伯基特、小細(xì)胞、和大細(xì)胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤、白血病、和多發(fā)性骨髓瘤。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”指細(xì)胞中表達(dá)的、與非癌細(xì)胞相比表達(dá)在癌細(xì)胞表面上或由癌細(xì)胞分泌的分子(通常是蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或脂質(zhì))，其可用于診斷癌癥、提供預(yù)后以及可將藥理學(xué)制劑優(yōu)先靶向癌細(xì)胞。這些標(biāo)記物通常是與非癌細(xì)胞相比，在肺癌或其它癌癥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的分子，例如與正常細(xì)胞相比1-倍過(guò)表達(dá)、2-倍過(guò)表達(dá)、3-倍或更多倍過(guò)表達(dá)。此外，標(biāo)記物可以是與正常細(xì)胞表達(dá)的分子相比，在癌癥細(xì)胞中不成比例合成的分子，例如含有缺失、添加或突變的分子。或者，這些生物標(biāo)記物是與非癌癥細(xì)胞相比，在癌癥細(xì)胞中表達(dá)不足的分子，例如1-倍低表達(dá)、2-倍低表達(dá)、3-倍或更多倍低表達(dá)。此外，標(biāo)記物可以是與正常細(xì)胞表達(dá)的分子相比，在癌癥中不成比例合成的分子，例如含有缺失、添加或突變的分子。技術(shù)人員應(yīng)明白標(biāo)記物可與任何應(yīng)用，例如本文公開(kāi)的癌癥預(yù)測(cè)、診斷或預(yù)后的其它標(biāo)記物或測(cè)試聯(lián)用。“生物學(xué)樣品”包括組織切片，例如活檢和尸檢樣品，以及為組織學(xué)目的取得的冷凍切片。這種樣品包括血液和血液組分或產(chǎn)物(例如，血清、血小板、紅細(xì)胞等)、痰、支氣管肺泡灌洗液、培養(yǎng)細(xì)胞，例如原代培養(yǎng)物、外植塊、以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞、糞便、尿液等。生物學(xué)樣品一半獲自真核生物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類，如黑猩猩或人；牛；狗；貓；嚙齒類動(dòng)物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；家兔；或鳥(niǎo)類；爬行類；或魚(yú)類。“活檢”指為診斷或預(yù)后評(píng)價(jià)而取出組織樣品的過(guò)程，還指組織樣本自身。本領(lǐng)域已知的任何活檢技術(shù)適用于本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法。所應(yīng)用的活檢技術(shù)取決于待評(píng)價(jià)的組織類型(例如，肺)、腫瘤的尺寸和類型等因素。代表性活檢技術(shù)包括但不限于切除活檢、切開(kāi)式活檢、針吸活檢、手術(shù)活檢和骨髓活檢?！扒谐顧z”指取出整個(gè)腫瘤塊以及其周圍的少量正常組織?！扒虚_(kāi)式活檢”指取出包括腫瘤橫斷面直徑的楔形組織。通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查或熒光鏡檢作出的診斷或預(yù)后可能需要“芯針活檢”或“細(xì)針抽吸活檢”，這些技術(shù)通常從靴組織內(nèi)得到細(xì)胞懸液。例如，Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine(哈里森內(nèi)科原理)，Kasper等編，第16版，2005，第70章，和整個(gè)V部分討論了活檢技術(shù)。術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”或“過(guò)表達(dá)的”可互換指代與正常細(xì)胞相比，通常在癌細(xì)胞中可檢測(cè)到更高水平的轉(zhuǎn)錄或翻譯的蛋白質(zhì)或核酸(RNA)。該術(shù)語(yǔ)包括與正常細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細(xì)胞定位(例如，細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、核、細(xì)胞表面)和RNA及蛋白質(zhì)穩(wěn)定所致的過(guò)表達(dá)?？刹捎脵z測(cè)mRNA(S卩，RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白質(zhì)(即，ELISA、免疫組化技術(shù))等常規(guī)技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)。與正常細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)可以是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在某些情況中，與正常細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)是1-倍、2-倍、3-倍、4-倍或更高水平的轉(zhuǎn)錄或翻譯。術(shù)語(yǔ)“低表達(dá)”、“低表達(dá)的”或“下調(diào)”可互換指代與正常細(xì)胞相比，在癌癥細(xì)胞中低于可檢測(cè)水平轉(zhuǎn)錄或翻譯的蛋白質(zhì)或核酸。該術(shù)語(yǔ)包括與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細(xì)胞定位(例如，細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、核、細(xì)胞表面)和RNA及蛋白質(zhì)穩(wěn)定所致的低表達(dá)。可采用檢測(cè)mRNA(S卩，RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白質(zhì)(即，ELISA、免疫組化技術(shù))等常規(guī)技術(shù)檢測(cè)低表達(dá)。與對(duì)照相比，低表達(dá)可以是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更低。在某些情況中，與對(duì)照相比，低表達(dá)是1-倍、2-倍、3-倍、4-倍或更低水平的轉(zhuǎn)錄或翻譯。就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“差異表達(dá)”或“差異調(diào)節(jié)”通常指與至少一份其它樣品相比，一份樣品中的蛋白質(zhì)或核酸過(guò)表達(dá)(上調(diào))或低表達(dá)(下調(diào))，通常是在癌癥患者中，與沒(méi)有癌癥的患者相比?！爸委熜灾委煛焙汀鞍┌Y治療”指化療、激素治療、放療、免疫治療和生物(靶向)治療。本文的“治療有效量或劑量”或“有效量或劑量”表示產(chǎn)生給藥所需作用的劑量。精確的劑量取決于治療的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定(參見(jiàn)，例如Lieberman,PharmaceuticalDosageForms(M^l^OM)(H1-3^,1992)；Lloyd,TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(藥物配白勺領(lǐng)域、禾斗學(xué)禾口技術(shù))(1999)；Pickar，DosageCalculations(劑量計(jì)算)(1999)；和Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐)，第20版，2003，Gennaro編，Lffff公司(Lippincott,Williams&Wilkins))。就兩條或更多條核酸或多肽序列而言，術(shù)語(yǔ)“相同”或“相同性”百分比指利用默認(rèn)參數(shù)如下所示的BLAST或BLAST2.0序列比較算法，或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)觀察(參見(jiàn)，例如NCBI網(wǎng)址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等)測(cè)定到兩條或更多條序列或子序列相同或具有一定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)域進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)性的比較和比對(duì)時(shí)，在特定區(qū)域上有約60%相同性，優(yōu)選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高相同性)。然后稱這些序列“基本上相同”。該定義還指或可適用于測(cè)試序列的互補(bǔ)序列。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些序列。如下所述，優(yōu)選的算法可解釋空位等。優(yōu)選在至少約25個(gè)氨基酸或核苷酸長(zhǎng)度，或更優(yōu)選在50-100個(gè)氨基酸或核苷酸長(zhǎng)度的區(qū)域具有相同性?？捎锰结槞z測(cè)本文所述的生物標(biāo)記物，所述探針(例如)在特定區(qū)域與登錄號(hào)所示參比序列有70%以上相同性，或80%以上相同性、或90%以上相同性直至100%相同性。對(duì)于序列比較，通常將一條序列用作參比序列，將測(cè)試序列與其比較。當(dāng)采用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列座標(biāo)(如果需要的話)并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選利用默認(rèn)參數(shù)，或者可以指定參數(shù)。然后序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列相同性百分比。本文所用的“比較窗”包括參考選自20-600，通常約50-200，更常見(jiàn)約100-150中任一數(shù)量的毗連位置的區(qū)段，對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)后，可將該區(qū)段中的序列與相同數(shù)量毗連位置的參比序列作比較。比對(duì)序列進(jìn)行比較的方法是本領(lǐng)域熟知的。可通過(guò)，例如Smith和Waterman，Adv.App1.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和ffunsch,J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對(duì)算法，通過(guò)Pearson和Lipman，Proc.Nat，1.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索法，通過(guò)計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些算法(遺傳學(xué)計(jì)算組(GeneticsComputerGroup)的威斯康星遺傳學(xué)軟件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，575科學(xué)Dr.，威斯康星州麥迪遜(Madison，WI))，或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)(參見(jiàn)例如，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(Ausubel^11,1987-2005,WI(WileyInterscience)))進(jìn)行最優(yōu)序列比對(duì)以便比較。適合測(cè)定序列相同性和序列相似性百分比的算法的優(yōu)選例子分別是BLAST和BLAST2.0算法，參見(jiàn)Altschul等，Nuc.AcidsRes.25:3389_3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。使用BLAST和BLAST2.0，參數(shù)如本文所述來(lái)確定本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的序列相同性百分比。實(shí)施BLAST分析的軟件通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)為公眾所得。該算法包括首先通過(guò)在查詢序列中鑒定長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒定高評(píng)分序列對(duì)(HSP)，該短字與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，匹配或滿足一些正值閾值評(píng)分Τ。T稱為相鄰字評(píng)分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動(dòng)搜索發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)的HSP的種子。該字命中在沿各序列的兩個(gè)方向上延伸，直到累積比對(duì)評(píng)分可增力口。對(duì)于核苷酸序列，利用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)評(píng)分；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算累積評(píng)分。對(duì)于氨基酸序列，用評(píng)分矩陣計(jì)算累積評(píng)分。在以下情況時(shí)字命中在各個(gè)方向上的延伸中止累積比對(duì)評(píng)分比最大獲得值降低X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的累積，造成累積評(píng)分變?yōu)榱慊蛄阋韵?；或者達(dá)到各序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)核苷酸序列而言)采用的默認(rèn)值如下字長(zhǎng)(W)11，期望值(E)10,M=5,N=-4，以及比較兩條鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)3，期望值(E)10，BL0SUM62評(píng)分矩陣(參見(jiàn)Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989))比對(duì)(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比較兩條鏈?！昂怂帷敝竼捂溁螂p鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它們的聚合物及其互補(bǔ)體。該術(shù)語(yǔ)包括含有已知核苷酸類似物或修飾主鏈殘基或連接鍵的核酸，它們是合成、天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的，它們與參比核酸的結(jié)合特性類似，并且與參比核苷酸的代謝方式類似。這類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有表明，特定核酸序列也隱含包括其保守修飾變體(如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體地說(shuō)，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選擇的(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列而獲得簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer等，NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。術(shù)語(yǔ)核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。特定的核酸序列還隱含包括“剪接變體”和編碼截短形式蛋白質(zhì)的核酸序列。類似地，核酸編碼的特定蛋白質(zhì)隱含包括該核酸的剪接變體或截短形式編碼的任何蛋白質(zhì)。如其名稱所暗示的，“剪接變體”是基因的另路剪接產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，可剪接初始核酸轉(zhuǎn)錄物，因而不同的(另路)核酸剪接產(chǎn)物能編碼不同多肽。產(chǎn)生剪接變體的機(jī)制有所不同，但包括外顯子的另路剪接。該定義還包括通過(guò)通讀轉(zhuǎn)錄而源自同一核酸的另路多肽(alternatepolypeptide)。該定義包括剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括重組形式的剪接產(chǎn)物。核酸可以在5’端或3’端截短。多肽可以在N-末端或C-末端截短。截短的核酸或多肽序列可以是天然產(chǎn)生或重組產(chǎn)生的。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可互換使用，指代氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)于天然產(chǎn)生的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然產(chǎn)生和合成的氨基酸以及通過(guò)與天然產(chǎn)生氨基酸相類似方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是遺傳密碼編碼的那些，以及隨后修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然產(chǎn)生的氨基酸相同基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)，即，具有結(jié)合氫的α碳、羧基、氨基和R基團(tuán)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍(methioninemethylsulfonium)。這種類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然產(chǎn)生的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指結(jié)構(gòu)與氨基酸的通用化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但通過(guò)與天然產(chǎn)生氨基酸相類似方式起作用的化合物。本文可用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)(BiochemicalNomenclatureCommission)推薦的公知三字母標(biāo)志或單字母標(biāo)志指稱氨基酸。類似地，可用其一般接受的單字母密碼指稱核苷酸。“保守修飾變體”適用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定的核酸序列，保守修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼丙氨酸。因此，在密碼子指定為丙氨酸的每個(gè)位置上，可將密碼子改變?yōu)樗龅娜魏蜗鄳?yīng)密碼子而不改變編碼多肽。這種核酸變異是“沉默變異”，保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文各核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，可修飾核酸中的各密碼子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物，所述各序列中暗示了編碼多肽的核酸的各沉默變異，但對(duì)于實(shí)際的探針序列不是這樣。對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單個(gè)取代、缺失或添加以在編碼序列中改變、添加或刪除一個(gè)氨基酸或少部分氨基酸是“保守修飾變體”，其中改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸取代某氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。這種保守修飾的變體應(yīng)加上且不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間類似物和等位基因。以下八組各含有可彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。參見(jiàn)例如，Creighton，Proteins(1984)?！皹?biāo)記物”或“可檢測(cè)部分”是能通過(guò)分光光度方法、光化學(xué)方法、生物化學(xué)方法、免疫化學(xué)方法、化學(xué)方法或其它物理方法檢測(cè)的組成物。例如，有用的標(biāo)記物包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(如經(jīng)常用于ELISA的)、生物素、地高辛或半抗原以及可通過(guò)例如將放射性標(biāo)記物摻入肽中而可檢測(cè)或可用于檢測(cè)與所述肽特異性反應(yīng)的抗體的蛋白質(zhì)。在述及例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”表示該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過(guò)引入異源核酸或蛋白質(zhì)或改變天然核酸或蛋白質(zhì)作了修飾，或該細(xì)胞源自如此修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)在天然(未重組)形式的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)在其它情況下異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的基因。短語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指探針與其靶子序列(通常在核酸的復(fù)雜混合物中)雜交，但不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，在不同情況下不同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的廣泛指南參見(jiàn)Tijssen，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)-與核酸探針雜交》(TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes)，“核酸測(cè)定的雜交原理和方案概覽，，(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays)(1993)。通常，選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件比特定序列在確定離子強(qiáng)度、pH下的熱解鏈溫度(Tffl)低約5-10°C。Tm是50%靶標(biāo)互補(bǔ)探針與靶序列雜交平衡時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)(靶序列過(guò)量，在Tm時(shí)50%探針被平衡地占據(jù))。也可加入去穩(wěn)定齊U，如甲酰胺獲得嚴(yán)謹(jǐn)條件。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景雜交信號(hào)的兩倍，優(yōu)選10倍。示范性的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可以如下所示50%甲酰胺、5xSSC和SDS,420C溫育，或者5xSSCU%SDS、65°C溫育，65°C用0.2xSSC禾口0.1%SDS洗滌。如果編碼的多肽基本相同，那么在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不相互雜交的核酸仍然基本相同。例如，用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)，可能發(fā)生這種情況。在這種情況下，核酸一般在中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下雜交。示范性“中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”包括37°C，在40%甲酰胺、IMNaClU%SDS的緩沖液中雜交，45°C，IXSSC洗滌。陽(yáng)性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難認(rèn)識(shí)到，可利用其它雜交和洗滌條件提供類似的嚴(yán)謹(jǐn)性條件。許多參考文獻(xiàn)提供了確定雜交參數(shù)的其它指導(dǎo)，例如《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，Ausubel等編，同上。對(duì)于PCR，低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增的溫度通常是約36°C，雖然退火溫度可以根據(jù)引物長(zhǎng)度而介于約32°C和48°C之間不等。對(duì)于高嚴(yán)謹(jǐn)性PCR擴(kuò)增，典型的溫度是約62°C，雖然高嚴(yán)謹(jǐn)性退火溫度可以根據(jù)引物長(zhǎng)度和特異性而介于約50°C和約65°C之間不等。高和低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包括90°C-95°C，30秒-2分鐘的變性階段，持續(xù)30秒-2分鐘的退火階段，和約72°C，1-2分鐘的延伸階段。低和高嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指導(dǎo)見(jiàn)，例如Irmis等，(1990)PCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplications(PCR方案，方法和應(yīng)用指南)，學(xué)術(shù)出版社公司(AcademicPress,Inc.)，紐約)?！翱贵w”指包含免疫球蛋白基因的框架區(qū)的多肽，或其特異性結(jié)合和識(shí)別抗原的片段。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε、和μ恒定區(qū)基因以及大量免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為Y、μ、α、δ或ε，進(jìn)而分別限定了免疫球蛋白類別，IgG,IgM,IgA,IgD和IgE?？贵w的抗原結(jié)合區(qū)對(duì)于結(jié)合的特異性和親和力至關(guān)重要。抗體可以是多克隆或單克隆的，衍生自血清、雜交瘤或重組克隆的，還可以是嵌合型、靈長(zhǎng)類化或人源化的。示范性免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。各四聚體由相同兩對(duì)多肽鏈構(gòu)成，各對(duì)具有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)。各鏈的N-末端限定了主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100-110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。存在的抗體可以是，例如完整的免疫球蛋白或用各種肽酶消化產(chǎn)生的許多充分表征的片段。因此，例如，胃蛋白酶消化抗體絞鏈區(qū)下的二硫鍵以產(chǎn)生F(ab)，2，即Fab的二聚體，F(xiàn)ab本身是通過(guò)二硫鍵連接于Vh-ChI的輕鏈。F(ab)，2可在溫和條件下還原以打開(kāi)絞鏈區(qū)的二硫鍵，從而將F(ab)’2二聚體轉(zhuǎn)化成Fab’單體。Fab’實(shí)質(zhì)上是具有絞鏈區(qū)部分的Fab(參見(jiàn)FundamentalImmunology(基礎(chǔ)免疫學(xué))(Paul編，第3版，1993)。雖然根據(jù)完整抗體的消化定義了各種抗體片段，技術(shù)人員應(yīng)知道，可通過(guò)化學(xué)方法或采用重組DNA技術(shù)從頭合成這種片段。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括通過(guò)修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，或采用重組DNA方法從頭合成的那些(例如，單鏈Fv)或利用噬菌體展示文庫(kù)鑒定的那些(參見(jiàn)，例如McCafferty等，Nature348:552_554(1990))。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體偶聯(lián)于“效應(yīng)”部分。效應(yīng)部分可以是任何數(shù)量的分子，包括標(biāo)記物部分，例如放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物，或者可以是治療部分。在一方面，抗體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性。本發(fā)明的差別表達(dá)基因的核酸或它們編碼的多肽指所有形式的核酸(例如，基因、前-mRNA、RNA)或蛋白質(zhì)、它們的多態(tài)變體、等位基因、突變體和種間同源物，所述這些具有以下特點(diǎn)(適用于核酸或蛋白質(zhì))(1)具有的氨基酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、200,500,1000或更多氨基酸的區(qū)域上與參比核酸編碼的多肽或本文所述氨基酸序列具有高于約60%的氨基酸序列相同性，6570%,75%,80%,85%,90%、優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的氨基酸序列相同性；(2)特異性結(jié)合抗體，例如用包含參比氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段產(chǎn)生的多克隆抗體及其保守修飾變體；(3)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與編碼參比氨基酸序列的核酸及其保守修飾變體特異性雜交；(4)具有的核酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸上與參比核酸序列具有高于約95%，優(yōu)選高于約96%、97%、98%、99%或更高的的核酸序列相同性。多核苷酸或多肽序列通常來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)類，例如人；嚙齒類，如大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠；牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)包括天然產(chǎn)生的或重組分子。該定義包括截短和另路剪接形式的這些抗原。述及蛋白質(zhì)、核酸、抗體或小分子化合物時(shí)，短語(yǔ)“特異性(或選擇性)結(jié)合”指確定蛋白質(zhì)或核酸的存在的結(jié)合反應(yīng)，例如本發(fā)明差別表達(dá)的基因，所述蛋白質(zhì)或核酸通常處于蛋白質(zhì)或核酸和其它生物物質(zhì)的異質(zhì)群體中。以抗體為例，在指定的免疫測(cè)定條件下，特定抗體與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合至少是背景的兩倍，更典型的是背景的10-100倍以上。在這種條件下，與抗體的特異性結(jié)合要求選擇的抗體對(duì)特定蛋白質(zhì)具有特異性。例如，可選擇多克隆抗體從而只獲得與所選抗原而不與其它蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的那些多克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)排除與其它分子交叉反應(yīng)的抗體來(lái)實(shí)施這種選擇?？刹捎酶鞣N免疫測(cè)定形式來(lái)選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定常規(guī)用于選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體(可用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定的形式禾口條件可參見(jiàn)，例如Harlow禾口Lane，Antibodies,ALaboratoryManual(抗體的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(1988))。就測(cè)試能調(diào)節(jié)標(biāo)記物蛋白質(zhì)的化合物的試驗(yàn)而言，短語(yǔ)“功能效應(yīng)”包括測(cè)定間接或直接受本發(fā)明生物標(biāo)記物影響的參數(shù)，例如化學(xué)的或表型的。因此，功能效應(yīng)包括配體結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄活化或阻遏、細(xì)胞增殖的能力、遷移能力，等等?！肮δ苄?yīng)”包括體外、體內(nèi)和離體活性?！皽y(cè)定功能效應(yīng)”表示檢驗(yàn)?zāi)郴衔锸欠衲茉黾踊蚪档烷g接或直接受本發(fā)明生物標(biāo)記物影響的參數(shù)，例如檢測(cè)物理和化學(xué)或表型效應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法檢測(cè)這種功能效應(yīng)，例如光譜特征(如，熒光、吸光度、折射率)的變化；流體動(dòng)力學(xué)(如，形狀)、色譜特征的變化；或蛋白質(zhì)的溶解特性；配體結(jié)合試驗(yàn)，例如與抗體的結(jié)合；檢測(cè)誘導(dǎo)型標(biāo)記物或標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄活化；檢測(cè)酶活性的變化；提高或降低細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期停滯的能力；檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物的改變?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法評(píng)估功能效應(yīng)，例如定量或定性檢測(cè)形態(tài)學(xué)特征改變的顯微術(shù)、檢測(cè)胎盤(pán)組織中表達(dá)的其它基因在RNA或蛋白質(zhì)水平上的變化、檢測(cè)RNA穩(wěn)定性、鑒定下游或報(bào)道基因表達(dá)(CAT、螢光素酶、β-gal、GFP，等等)，例如通過(guò)化學(xué)發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)、抗體結(jié)合、誘導(dǎo)型標(biāo)記物寸。標(biāo)記物的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”用于指代采用癌癥生物標(biāo)記物的體外和體內(nèi)試驗(yàn)鑒定的活化、抑制或調(diào)節(jié)性分子。抑制劑是，例如結(jié)合、部分或完全阻斷活性、降低、阻止、延遲活化、滅活、脫敏或下調(diào)癌癥生物標(biāo)記物活性或表達(dá)的化合物?！盎罨瘎笔窃黾?、打開(kāi)、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)、活化、敏化、激動(dòng)或上調(diào)癌癥生物標(biāo)記物活性的化合物，例如激動(dòng)劑。抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑還包括癌癥生物標(biāo)記物的遺傳修飾形式，例如活性改變的形式，以及天然產(chǎn)生和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、抗體、肽、環(huán)肽、核酸、反義分子、核酶、RNAi和siRNA分子、有機(jī)小分子等。抑制劑和活化劑的這種試驗(yàn)包括，例如在細(xì)胞或細(xì)胞提取物中體外表達(dá)癌癥生物標(biāo)記物，施加推定的調(diào)節(jié)化合物，然后測(cè)定對(duì)活性的功能效應(yīng)，如上所述。將包含癌癥生物標(biāo)記物并用可能的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的樣品或試驗(yàn)與不含抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品作比較以檢測(cè)抑制程度。對(duì)照樣品(未用抑制劑處理)指定為相對(duì)蛋白質(zhì)活性值為100%。當(dāng)與對(duì)照相比，活性值是約80%、優(yōu)選50%、更優(yōu)選25-0%時(shí)，獲得癌癥生物標(biāo)記物的抑制作用。當(dāng)與對(duì)照(未用活化劑處理)相比，活性值是110%、更優(yōu)選150%、更優(yōu)選200-500%(即，與對(duì)照相比，兩倍或五倍)、更優(yōu)選1000-3000%時(shí)，獲得癌癥生物標(biāo)記物的活化作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”或“候選藥物”或“調(diào)節(jié)劑”或其語(yǔ)法等價(jià)體描述了要檢驗(yàn)其直接或間接調(diào)節(jié)癌癥生物標(biāo)記物的能力的天然產(chǎn)生或合成的任何分子，例如蛋白質(zhì)、寡肽(例如，長(zhǎng)約5-約25個(gè)氨基酸，優(yōu)選長(zhǎng)約10-20或12-18氨基酸，優(yōu)選長(zhǎng)12、15或18氨基酸)、有機(jī)小分子、多糖、肽、環(huán)肽、脂質(zhì)、脂肪酸、siRNA、多核苷酸、寡核苷酸等。測(cè)試化合物可以是測(cè)試化合物文庫(kù)的形式，例如提供足夠多樣性的組合或隨機(jī)文庫(kù)。測(cè)試化合物任選與融合伴侶，例如靶向化合物、拯救化合物、二聚化化合物、穩(wěn)定化合物、可尋址化合物和其它功能部分相連。一般可通過(guò)鑒定具有某些所需特性或活性，例如抑制活性的測(cè)試化合物(稱為“前導(dǎo)化合物”)、產(chǎn)生該前導(dǎo)化合物的變體并評(píng)估那些變體化合物的特性和活性來(lái)產(chǎn)生具有有用特性的新化學(xué)實(shí)體。這種分析常采用高通量篩選(HTS)方法。“有機(jī)小分子”指天然產(chǎn)生或合成的有機(jī)分子，其分子量大于約50道爾頓并小于約2500道爾頓，優(yōu)選小于約2000道爾頓，優(yōu)選介于約100-約1000道爾頓之間，更優(yōu)選介于約200-約500道爾頓之間。預(yù)后方法本發(fā)明提供通過(guò)檢測(cè)在癌癥中差別表達(dá)的一組標(biāo)記物的表達(dá)情況而對(duì)肺癌作出預(yù)測(cè)或預(yù)后的方法。所述標(biāo)記物的例子包括以下基因中的一些或全部ctrmbl、wnt3a,tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2禾口dusp6，以下基因中的一些或全部rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr>fut3>illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3、禾口brcal(例如，wnt3a>rnd3>lck、和erbb3)。預(yù)測(cè)和預(yù)后包括測(cè)定患者或患者樣品中的一組肺癌生物標(biāo)記物多核苷酸或相應(yīng)多肽的水平，然后將該水平與基線范圍作比較?；€水平通常代表未患或不會(huì)產(chǎn)生肺癌的健康人中該多核苷酸或核酸的水平，如利用生物學(xué)樣品，如肺活檢或體液樣品檢測(cè)的。本發(fā)明多核苷酸或相應(yīng)多肽的水平偏離基線范圍(上調(diào)或下調(diào))表明該患者的長(zhǎng)期死亡率風(fēng)險(xiǎn)升高。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用生物學(xué)樣品，例如腫瘤組織的RNA，采用實(shí)時(shí)或定量PCR檢測(cè)檢測(cè)該組中8種生物標(biāo)記物的表達(dá)。無(wú)需顯微解剖?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行RNA提取，例如采用Trizol和RNeasy?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，例如采用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司試驗(yàn)(AppliedBiosystemassays)的Taqman實(shí)時(shí)PCR。相對(duì)于正常肺RNA計(jì)算基因表達(dá)，根據(jù)持家基因標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的寡核苷酸引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試驗(yàn)用于I期、II期、III期或IV期癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組織樣品來(lái)自外科手術(shù)切除的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用核酸結(jié)合分子，例如探針、寡核苷酸、寡核苷酸陣列和引物檢測(cè)RNA生物標(biāo)記物，從而檢查患者樣品中RNA的差別表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法利用RT-PCR。在另一實(shí)施方式中，可采用定量PCR試驗(yàn)，例如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的丁aqman試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)核酸及其變體。在其它實(shí)施方式中，可利用核酸微陣列檢測(cè)核酸?？刹捎贸Ｒ?guī)技術(shù)，例如northern分析進(jìn)行核酸分析，或者本發(fā)明還包括基于核酸序列雜交的任何其它方法(例如，狹線印跡雜交)，所述核酸序列與標(biāo)記物編碼序列的一部分互補(bǔ)。結(jié)合所選核酸生物標(biāo)記物的試劑可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備或商品化購(gòu)得。適用的PCR擴(kuò)增技術(shù)描述于，例如Ausubel等，和Irmis等，同上。通用核酸雜交方法描述于Anderson，“NucleicAcidHybridization(核酸雜交)，，生物科學(xué)出版社(BIOSScientificPublishers)，1999。還可從安排在微陣列中的mRNA或cDNA序列進(jìn)行多個(gè)核酸序列(例如，基因組DNA、mRNA或cDNA)的擴(kuò)增或雜交。微陣列方法通常描述于Hardiman,"MicroarraysMethodsandApplications:Nuts&Bolts(微陣列方法禾口應(yīng)用螺母與螺栓)”DNAPress,2003；Baldi等，“DNAMicroarraysandGeneExpressionFromExperimentstoDataAnalysisandModeling(DNA微陣列和基因表達(dá)從實(shí)驗(yàn)到數(shù)據(jù)分析和建模)”，劍橋大學(xué)出版社(CambridgeUniversityPress)，2002?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法分析核酸標(biāo)記物，包括但不限于序列分析和電泳分析。序列分析的非限制性例子包括馬克西姆_吉爾伯特測(cè)序(Maxam-Gilbertsequencing)、桑格測(cè)序(Sangersequencing)、毛細(xì)管陣列DNA測(cè)序、熱循環(huán)測(cè)序(Sears等，Biotechniques，13:626-633(1992))、固相測(cè)序(Zimmerman等，MethodsMol.CellBiol.，3:39-42(1992))、質(zhì)譜學(xué)測(cè)序，例如襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行質(zhì)譜法(MALDI-T0F/MS;Fu等，Nat.Biotechnol.，16:381-384(1998))和雜交測(cè)序。Chee等，Science，274:610-614(1996)；Drmanac等，Science,2601649-1652(1993)；Drmanac等，Nat.Biotechnol.，16:54_58(1998)。電泳分析的非限制性例子包括平板凝膠電泳，例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳和變性梯度凝膠電泳。在另一實(shí)施方式中，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多免疫測(cè)定，在測(cè)定中利用抗體試劑來(lái)檢測(cè)本發(fā)明蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的表達(dá)水平。免疫試驗(yàn)技術(shù)和方法通常描述與Price禾口Newman，“PrinciplesandPracticeofImmunoassay(免疫測(cè)定的原理與實(shí)踐)，”第2版，格羅夫詞典公司(Grove'sDictionaries),1997；Gosling,"Immunoassays:APracticalApproach(免疫測(cè)定一種實(shí)用方法)”牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress)，2000?？刹捎酶鞣N免疫測(cè)定技術(shù)，包括競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定。參見(jiàn)，例如Self等，Curr.Opin.Biotechnol.，7=60-65(1996)術(shù)語(yǔ)“免疫測(cè)定”包括的技術(shù)包括但不限于酶免疫測(cè)定(EIA)，例如酶放大免疫分析技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、IgM抗體捕捉ELISA(MACELISA)、和微粒酶免疫測(cè)定(MEIA)；毛細(xì)管電泳免疫測(cè)定(CEIA)；放射性免疫測(cè)定(RIA)；免疫放射測(cè)定(IRMA)；熒光極化免疫測(cè)定(FPIA)；和化學(xué)發(fā)光測(cè)定(CL)。如果需要，這些免疫測(cè)定可自動(dòng)進(jìn)行。免疫測(cè)定還可與激光誘導(dǎo)熒光聯(lián)用。參見(jiàn)，例如Schmalzing等，Electrophoresis,18:2184_93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.，699=463-80(1997)。脂質(zhì)體免疫測(cè)定，例如流動(dòng)-注射脂質(zhì)體免疫測(cè)定和脂質(zhì)體免疫傳感器也適用于本發(fā)明。參見(jiàn)，例如Rongen等，J.Immunol.Methods,204105-133(1997)。此外，濁度法試驗(yàn)適用于本發(fā)明方法，該試驗(yàn)中蛋白質(zhì)/抗體復(fù)合物的形成導(dǎo)致可轉(zhuǎn)換成峰比率信號(hào)(peakratesignal)的光散射增加，而該信號(hào)與標(biāo)記物濃度呈函數(shù)關(guān)系。濁度法試驗(yàn)可商品化購(gòu)自加利福尼亞州貝瑞阿市的貝克曼考特爾公司(BeckmanCoulter,Brea,CA；試劑盒編號(hào)449430)，可利用白令濁度計(jì)分析儀(Behring^phelometerAnalyzer)進(jìn)行(Fink等，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,27:261_276(1989))?？蓹z測(cè)部分可用于本文所述試驗(yàn)(直接或間接檢測(cè))?？衫酶鞣N可檢測(cè)部分，標(biāo)記物的選擇取決于所需靈敏度、與抗體偶連的便利性、穩(wěn)定性要求和可用的儀器以及處置規(guī)定。合適的可檢測(cè)部分包括但不限于放射性核素、熒光染料(例如，熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、0regOnGreen、羅丹明、德克薩斯紅、異硫氰酸四羅丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、熒光素標(biāo)記物(例如，綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關(guān)蛋白酶活化的自猝滅熒光化合物、酶(例如，螢光素酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、洋地黃毒苷、金屬等。利用核酸的特異性化學(xué)發(fā)光抗體的化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)適合于靈敏地非放射性檢測(cè)蛋白質(zhì)水平。用熒光染料標(biāo)記物的抗體也合適。熒光染料的例子包括但不限于DAPI、熒光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺(Iissamine)。間接標(biāo)記物包括本領(lǐng)域熟知的各種酶，例如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ΑΡ)、半乳糖苷酶、脲酶等。辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)可利用，例如顯色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，其在有過(guò)氧化氫存在下產(chǎn)生可在450nm檢測(cè)的可溶產(chǎn)物。堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)可利用，例如顯色底物對(duì)_硝基苯基磷酸酯，其產(chǎn)生不難在405nm檢測(cè)的可溶產(chǎn)物。類似地，β“半乳糖苷酶檢測(cè)系統(tǒng)可利用顯色底物鄰_硝基苯基_β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，其產(chǎn)生可在410nm檢測(cè)的可溶產(chǎn)物。脲酶檢測(cè)系統(tǒng)可利用例如脲-溴甲酚紫等底物(西格瑪免疫化學(xué)公司(SigmaImmunochemicals)；圣路易斯，密蘇里州)。例如，可利用分光光度計(jì)檢測(cè)顯色底物的顏色；利用輻射計(jì)數(shù)器檢測(cè)輻射，例如檢測(cè)125I的Y計(jì)數(shù)器；或在有某種波長(zhǎng)的光存在下利用熒光計(jì)檢測(cè)熒光，來(lái)分析直接或間接標(biāo)記物的信號(hào)。對(duì)于檢測(cè)酶連抗體，可按照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，利用分光光度計(jì)，例如加利福尼亞州門(mén)洛帕克市分子裝置公司(MolecularDevices；MenloPark,CA)的EMAX微板讀數(shù)計(jì)作定量分析。如果需要，本發(fā)明的試驗(yàn)可以自動(dòng)進(jìn)行或由機(jī)器人實(shí)施，可同時(shí)檢測(cè)多份樣品的信號(hào)?？蓪⒖贵w固定在各種固體支持物，例如磁性或色譜基質(zhì)顆粒，試驗(yàn)平板的表面(微量滴定板孔)、多片固體基材或膜上(例如，塑料、尼龍和紙)，等等?？赏ㄟ^(guò)在固體支持物上的陣列中包被抗體或多種抗體來(lái)制備測(cè)定條帶。然后可將該帶浸入測(cè)試樣品并經(jīng)洗滌和檢測(cè)步驟快速處理從而產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，例如色斑。有用的物理形式包括具有多個(gè)離散、可尋址位置的表面，從而能檢測(cè)多個(gè)不同的標(biāo)記物。這種形式包括微陣列和某些毛細(xì)管裝置。參見(jiàn)，例如Ng等，J.CellMol.Med.,6329-340(2002)；美國(guó)專利號(hào)6，019，944。在這些實(shí)施方式中，各離散表面位置可包含抗體以固定一種或多種標(biāo)記物以便在各位置檢測(cè)。或者，表面可包含固定在表面的離散位置處的一個(gè)或多個(gè)離散顆粒(例如，微?；蚣{米顆粒)，這些微粒包含抗體以固定一種或多種標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。可采用各種物理形式進(jìn)行分析。例如，可利用微量滴定板或自動(dòng)設(shè)備以促進(jìn)大量測(cè)試樣品的處理?；蛘?，可開(kāi)發(fā)單樣品形式，從而有助于以及時(shí)方式診斷或預(yù)后?；蛘?，可將本發(fā)明的抗體或核酸探針應(yīng)用于固定在顯微鏡載玻片上的患者活檢切片?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的各種光學(xué)或熒光顯微方法目測(cè)觀察得到的抗體染色或原位雜交模式。在另一形式中，本發(fā)明的各種標(biāo)記物還提供了用于體內(nèi)成像的試劑，例如檢測(cè)本發(fā)明生物標(biāo)記的核酸或所編碼蛋白質(zhì)的標(biāo)記試劑的成像。出于體內(nèi)成像目的，可用合適的標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物標(biāo)記檢測(cè)癌癥生物標(biāo)記所編碼蛋白質(zhì)存在與否的試劑，例如抗體。報(bào)道在另一方面，本發(fā)明的特征在于表明患癌癥對(duì)象預(yù)后的報(bào)道。該報(bào)道可以是，例如電子形式或紙件形式。該報(bào)道可包括基本患者信息，包括對(duì)象標(biāo)識(shí)符(例如，對(duì)象的姓名、社保號(hào)、醫(yī)療保險(xiǎn)號(hào)或隨機(jī)產(chǎn)生的號(hào)碼)、對(duì)象的物理特征(例如，年齡、體重或性別)、委托醫(yī)師(requestingphysician)的姓名、進(jìn)行預(yù)后的日期和收集樣品的日期。報(bào)道的預(yù)后可以是關(guān)于一定時(shí)期存活的可能性、一定時(shí)期內(nèi)對(duì)某些治療(例如，化療或手術(shù)治療)起反應(yīng)的可能性、和/或癌癥復(fù)發(fā)的可能性。報(bào)道預(yù)后的形式可以是一定時(shí)期存活的百分比幾率、對(duì)治療起良好反應(yīng)(良好反應(yīng)可定義為，例如腫瘤縮小或腫瘤生長(zhǎng)減緩)、或在限定時(shí)期復(fù)發(fā)(例如，5年存活幾率為20%)的百分比幾率。或者，報(bào)道預(yù)后的形式可以是計(jì)算的評(píng)分。例如，評(píng)分較高或較低可表明有利的預(yù)后。在另一實(shí)施方式中，報(bào)道的預(yù)后可以是存活、對(duì)治療的反應(yīng)或一定時(shí)期內(nèi)復(fù)發(fā)的可能性的總體描述(例如，非常可能、可能或不可能存活5年)。在另一實(shí)施方式中，報(bào)道的預(yù)后可以是圖表的形式。除了基因表達(dá)水平，報(bào)道的預(yù)后還考慮了對(duì)象的其它特征(例如，年齡、癌癥的階段、性別、以前的治療、適合性、心血管健康狀況和精神健康狀況)。除了預(yù)后，該報(bào)道還可任選包括涉及以下至少兩種基因的表達(dá)水平的原始數(shù)據(jù)Rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3、禾口brcal0組合物、試劑盒和集成系統(tǒng)本發(fā)明提供利用本發(fā)明多肽的特異性抗體或?qū)Ρ景l(fā)明多核苷酸具有特異性的核酸來(lái)實(shí)施本文所述試驗(yàn)的組合物、試劑盒和集成系統(tǒng)。實(shí)施本發(fā)明診斷試驗(yàn)的試劑盒通常裝有探針和檢測(cè)探針是否存在的標(biāo)記物，所述探針包含特異性結(jié)合本發(fā)明多肽或多核苷酸的抗體或核酸序列。所述試劑盒還可裝有幾種抗體或編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列，例如識(shí)別本發(fā)明生物標(biāo)記所編碼蛋白質(zhì)的抗體的混合物。實(shí)施例提供以下實(shí)施例是為了說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1.CTNNBl、WNT3A、TP53、KRAS、ERBB3、MUCl、ERBB2和DUSP6本發(fā)明分析了105位手術(shù)切除肺腺瘤的患者的數(shù)據(jù)，所述患者具有至少3年隨訪并可獲得高質(zhì)量組織。對(duì)65種基因和持家基因(18S和P0L2RA，也參見(jiàn)表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。按照可商品化購(gòu)得的合并正常肺RNA和18S作為持家基因標(biāo)準(zhǔn)化PCR輸出(以周期閾值，CT計(jì))。得到的數(shù)值(如表2所示)是與正常肺RNA相比的表達(dá)比例。在表2中，基因以行排列并采用縮寫(xiě)。各基因前的數(shù)字(例如，7-FZD)是我們用于標(biāo)識(shí)基因的數(shù)字，沒(méi)有其它意義。然后對(duì)這些數(shù)值取對(duì)數(shù)(表2中第二組數(shù)值)。如下所示進(jìn)行分析。將樣品(患者)隨機(jī)分成兩組訓(xùn)練組(η=70)和驗(yàn)證組(η=35)。對(duì)訓(xùn)練組中的各基因進(jìn)行Cox建模，利用存活率的自由P值閾值為0.2來(lái)選擇基因。然后我們將所有這些基因一起在訓(xùn)練組上作后向選擇(backwardsselection)，即，根據(jù)P值標(biāo)準(zhǔn)為0.2逐一投下(dropping)這些基因，在投下該基因在一個(gè)或多個(gè)其余基因的系數(shù)中產(chǎn)生有意義的變化時(shí)終止。最終的模型含有以下8種基因Ctrmbl、wnt3a、tp53、kras,erbb3,mucUerbb2和dusp6。然后將各樣品表達(dá)值輸入該模型以獲得各樣品的評(píng)分。我們選擇將高評(píng)分的割點(diǎn)(cutpoint)設(shè)置為評(píng)分的頂極三分位組(toptertile)。產(chǎn)生所有樣品以及只有I期患者的卡-邁曲線。在驗(yàn)證組中重復(fù)該操作。為這些其它變量作調(diào)整后運(yùn)行cox模型，包括腫瘤尺寸和腫瘤階段以及預(yù)示較高死亡風(fēng)險(xiǎn)的高評(píng)分。實(shí)施例2.WNT3A、RND3、LCK和ERBB3預(yù)后工具應(yīng)能理想地提供精確的風(fēng)險(xiǎn)分類，在臨床上每日實(shí)施是可行的，并且應(yīng)是節(jié)約成本的。這種試驗(yàn)對(duì)于外科手術(shù)切除了I期NSCLC的患者特別有利。目前對(duì)于I期NSCLC的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)是葉切除術(shù)和縱隔淋巴結(jié)切除，無(wú)需輔助化療。更好地鑒定良好預(yù)后的患者亞組可能較少地采用外科手術(shù)而具有相同的存活可能性。相反，可選擇預(yù)后差的I期亞組納入檢驗(yàn)新方法和新療劑的臨床試驗(yàn)。考慮到目前I期疾病化療的局限性，對(duì)于化療益處有預(yù)后和預(yù)示作用的生物測(cè)定非常有利。最后，I期NSCLC的重要性在將來(lái)可能增加。雖然約20%的患者目前診斷為I期NSCLC，該比例可能因通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描篩選肺癌的最新進(jìn)展而升高。我們發(fā)現(xiàn)Wnt3a、rnd3、lCk和erbb3的表達(dá)可預(yù)后肺癌患者的存活。所研究患者的臨床和組織學(xué)特征見(jiàn)表3。我們首先分析了整個(gè)數(shù)據(jù)組，隨后將分析局限于I期患者。根據(jù)年齡、腫瘤尺寸和階段強(qiáng)迫調(diào)整后，交叉驗(yàn)證支持含有按以下順序選擇的4種基因的模型Wnt3a,rnd3,Ick和erbb3。利用這4種基因，采用該模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(Li收縮系數(shù))來(lái)分析總體存活率(OS)。根據(jù)年齡、疾病階段和腫瘤尺寸作調(diào)整后，作為連續(xù)變量的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的危害比(HR)是6.7(95%CI:1.6-28.9，ρ=0.005)，如表4所示。基于4基因模型的二分風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的整個(gè)研究對(duì)象的存活曲線見(jiàn)圖Ila和lib。70位I期患者中二分風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相應(yīng)存活曲線見(jiàn)圖12a和12b。所有患者的5-年OS是56%，I期患者為65%。在所有患者中，低風(fēng)險(xiǎn)患者中5-年OS為62%，高風(fēng)險(xiǎn)患者中為41%(ρ=0.0054)。低-風(fēng)險(xiǎn)患者中5-年DFS為60%，高-風(fēng)險(xiǎn)患者中為28%(ρ=0.0053)。在I期患者中，低風(fēng)險(xiǎn)患者中5-年OS為87%，高風(fēng)險(xiǎn)患者中為38%(ρ=0.0002)，低風(fēng)險(xiǎn)患者中DFS為77%，高風(fēng)險(xiǎn)患者中為35%(ρ=0.0045)。將Chen及其同事的5-基因模型應(yīng)用于我們的研究組，根據(jù)年齡、階段和腫瘤尺寸調(diào)節(jié)的HR為2.4(95%CI:1·3-4.3，ρ=0.0047)13。(Chen等，NEnglJMed35611-20(2007)。在所有患者中，低風(fēng)險(xiǎn)中的5-年OS為65%，高風(fēng)險(xiǎn)患者中的為43%(ρ=0.045)。在I期患者中，低風(fēng)險(xiǎn)患者中5-年OS為80%，高風(fēng)險(xiǎn)中為47%(ρ=0.022)，圖13。我們通過(guò)定量PCR，根據(jù)4種基因的基因表達(dá)鑒定了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，可預(yù)后完全手術(shù)切除肺腺癌的患者的長(zhǎng)期存活。這種根據(jù)基因表達(dá)的評(píng)分對(duì)存活(調(diào)節(jié)的HR6.7)和疾病復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)優(yōu)于根據(jù)臨床階段和腫瘤尺寸的。我們的模型最好地預(yù)示了I期疾病患者中的死亡風(fēng)險(xiǎn)。在我們的交叉驗(yàn)證組中，I期患者中的低-和高-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與5-年總體存活率為87%和38%相關(guān)。對(duì)于模型選擇和模型驗(yàn)證，我們采用交叉驗(yàn)證。交叉驗(yàn)證采用反復(fù)數(shù)據(jù)分離而不是將數(shù)據(jù)分成測(cè)試和驗(yàn)證組，從而防止模型過(guò)度擬合(over-fitting)并產(chǎn)生模型系數(shù)的精確估計(jì)值。交叉驗(yàn)證能產(chǎn)生經(jīng)驗(yàn)證的模型系數(shù)，但利用數(shù)據(jù)比簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)分離更有效。該預(yù)后模型對(duì)于診斷和提供肺癌預(yù)后有重要的臨床意義，例如作為在I期肺腺癌的風(fēng)險(xiǎn)分類患者中進(jìn)行臨床分階段的補(bǔ)充工具。目前對(duì)于I期NSCLC的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)是單用外科手術(shù)切除，通常是葉切除術(shù)。相反，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低的切除后患者最好只進(jìn)行觀察，甚至可以是徹底肺切除不足的候選對(duì)象。在我們的患者群中，與Chen及其同事(同上)的相比，我們模型的預(yù)后值更好。該發(fā)現(xiàn)有幾種可能的解釋。首先，我們模型的候選基因是基于以前公布的基因組-廣泛表達(dá)微陣列研究，而Chen模型中的基因是選自更有限的定制表達(dá)陣列平臺(tái)。此外，在確定我們的基因模型之前通過(guò)RT-PCR評(píng)估了較大的一組基因。另外，我們的患者隨訪時(shí)間較長(zhǎng)，隨訪時(shí)期至少3年，中值隨訪為61個(gè)月。該因素使得我們能更精確地檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)組之間存活率的差異。方法患者在1997年1月-2004年9月間，經(jīng)歷完全手術(shù)切除肺腺癌并保存了新鮮冷凍組織以供基因組分析的120位患者納入研究。適格的患者經(jīng)歷醫(yī)療意圖的手術(shù)切除并對(duì)縱隔淋巴結(jié)進(jìn)行適當(dāng)分階段。接受手術(shù)前化療的患者排除出研究，從而不會(huì)混淆純粹預(yù)后工具的開(kāi)發(fā)。13位患者因保存組織不足、RNA質(zhì)量不夠或持家基因表達(dá)弱而排除。初級(jí)終末點(diǎn)是總存活率。無(wú)疾病存活(DFS)定義為從外科手術(shù)到疾病復(fù)發(fā)的χ射線照片證據(jù)的時(shí)間，或者在沒(méi)有疾病復(fù)發(fā)時(shí)到最后一次記錄在案的醫(yī)師隨訪的時(shí)間。預(yù)期患者同意組織樣本收集，該項(xiàng)研究由USCF研究檢查委員會(huì)批準(zhǔn)(UCSFinstitutionalreviewboard)(CHR#H8714-28880-01)?；蜻x擇在以前公布的早期肺癌預(yù)后的微陣列和PCR研究中鑒定的217種基因中(參見(jiàn)，例如Beer等，NatMed8:816(2002)；Potti等，NEnglJMed355:570(2006)；Wigle等，CancerRes62:3005(2002)；Garber等，ProcNatlAcadSciUSA9813784(2001)；Miura等，CancerRes62:3244(2002)；Schneider等，BrJCancer83:473(2000))，通過(guò)愿意的專家或文獻(xiàn)查詢鑒定了76種癌癥-相關(guān)基因。15種基因由于在前導(dǎo)研究中無(wú)功能性引物或通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中表達(dá)非常弱而排除。其余61種基因見(jiàn)表5。樣品制備和分析操作時(shí)所有組織冷凍在液氮中。將組織大塊切割成Icm3切片，并在液氮中研磨。采用加利福尼亞州卡爾斯巴德市英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)的TriZol提取方案提取RNA。利用加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的Prism7900HT儀器在384-孔平板中對(duì)cDNA進(jìn)行TaqmanRT-PCR0各基因的表達(dá)進(jìn)行一式三份的檢驗(yàn)。將樣品與加利福尼亞州芒廷維尤市克隆技術(shù)公司(Clontech，MountainView,CA)的市售購(gòu)得合并正常肺RNA作比較，根據(jù)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的18S核糖體rRNA標(biāo)準(zhǔn)化。從新鮮肺切片獲得約Icm3的腫瘤樣本塊，立即在液氮中速凍。-80°C保存冷凍的組織。采用英杰公司的TriZol提取方案從131份各腫瘤樣品中提取總RNA。利用安捷侖公司(Agilent)的安捷侖2100BioAnalyzer驗(yàn)證RNA樣品的質(zhì)量，通過(guò)納滴公司(Nanodrop)的NanodropND-1000測(cè)定各樣品的RNA-濃度。用3μg總RNA作為模板，利用拜爾萊得公司(BioRad)WiScriptcDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的裝有自動(dòng)化配件的ABIPRISM7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)86種不同基因轉(zhuǎn)錄物各自的相應(yīng)表達(dá)水平。一式三份進(jìn)行的各20μL反應(yīng)包括應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的TaqMan通用PCR主混合物、應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的適當(dāng)Taqman基因表達(dá)測(cè)定和每次反應(yīng)的對(duì)應(yīng)于120ng總RNA的1.8μLcDNA模板。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的序列檢測(cè)系統(tǒng)(SDS)2.3軟件獲得Ct值，將相對(duì)基因表達(dá)值計(jì)算成△ACt，從而產(chǎn)生根據(jù)相對(duì)于校準(zhǔn)樣品(所有樣品的參比)的內(nèi)源性參比基因表達(dá)水平作標(biāo)準(zhǔn)化的靶基因相對(duì)表達(dá)水平。所用的校準(zhǔn)樣品是有克隆技術(shù)公司從正常人肺總RNA合成的cDNA(目錄號(hào)636524)。為選擇內(nèi)源性參比基因，比較了早期公布的常規(guī)使用的大量參比基因在肺癌(腫瘤和正常組織)中的表達(dá)水平。選擇三種基因-編碼18S核糖體RNA亞單位、P0L2RARNA聚合酶和TBPTATA盒蛋白，比較了腫瘤和正常樣品的幾種cDNA樣本稀釋液中它們的表達(dá)水平。18SrRNA在肺樣品(腫瘤和正常)中顯示表達(dá)最穩(wěn)定，因此，按照18SrRNA標(biāo)準(zhǔn)化原始基因表達(dá)值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析我們數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的突出特征是(i)正確檢查的存活終點(diǎn)(死亡)與適度的事件數(shù)量(47-構(gòu)建子集以排除遺漏后)；(ii)通過(guò)RT-QPCR所得(log)基因表達(dá)值(它處所述的Δ-ACt)構(gòu)成的多種(61)預(yù)測(cè)因子；和(iii)選擇臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)共變量(covariate)0鑒于這些特征和量綱，我們利用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析工具是Ll罰分的Cox相對(duì)金回歸^去(LipenalizedCoxproportionalhazardsregression)。i亥方^去>^己證明ι效的Ll罰分固有的同時(shí)系數(shù)收縮(simultaneouscoefficientshrinkage)和預(yù)測(cè)因子選擇拓展至存活數(shù)據(jù)設(shè)置。由微陣列基因表達(dá)應(yīng)用主要推動(dòng)的早期拓展在計(jì)算上受限制或者依賴于近似計(jì)算。我們采用交叉驗(yàn)證來(lái)確定模型大小，即，所選基因的數(shù)量。然后根據(jù)模型系數(shù)產(chǎn)生各對(duì)象的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。將得到的預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分二分(在中值處)，顯示相應(yīng)的卡-邁存活曲線并通過(guò)時(shí)序統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包R(版本2.3.1,2006)進(jìn)行所有分析。應(yīng)該知道本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式中只是出于說(shuō)明的目的，這些實(shí)施例和實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員提示了各種改進(jìn)或改變，這些改進(jìn)或改變應(yīng)屬于本申請(qǐng)的構(gòu)思和權(quán)限以及隨附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)出于所有目的通過(guò)引用全文納入本文。表1Taqman試驗(yàn)列表數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID2FZD7Frizzled同NM_003507.1,AB017365.1,BC01591Hs00275833_sl源物7(果5.1蠅)6WIFlWNT抑制ΝΜ_007191·2，AF122922.1，BX64742Hs00183662_ml因子17.1，BC018037.1，AY358344.17FUT3巖藻糖轉(zhuǎn)移NM_000149.1，U27326.1，U27327.1，UHs00356857_ml酶3(半乳27328.1，AF131913.1糖苷3(4)-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，包括路易斯血液組)11NXFl核RNA輸ΝΜ_006362·3，AJ132712.1，U80073.1Hs00234741_ml出因子1，AF112880.1，AF126246.1，AK027192.1,BC004904.2，CR749674.1，AB209915.1，BC028041.115ASMTL乙酰血清素ΝΜ_004192·1，ΑΚ001090.1，BC0100Hs00414020_ml0-甲基轉(zhuǎn)移89.2，BC002508.2，AK090498.1酶-樣16CTNNBl連環(huán)蛋白NM_001904.2，Z19054.1，X87838.1，AHs00170025_ml(鈣粘蛋白-B062292.1，BC058926.1相關(guān)蛋白)，βl,88kDa17SH3BGR富含SH3結(jié)ΝΜ_001001713·1，ΝΜ_007341·2，X9Hs00201109_ml構(gòu)域結(jié)合性3498.1，BC006371.2，BM474020.1谷氨酸蛋白18ARAFν-raf鼠肉NM_001654.1,X04790.1,BC007514.Hs00176427_ml瘤3611病2，BC002466.2，BT019864.1，AK13004毒癌基因同3.1源物19TYROBPTYRO蛋白NM_198125.1,NM_003332.2,AF019Hs00182426_ml酪氨酸激酶562.1，AJ010098.1，BCOl1175.1，CR45結(jié)合蛋白0342.1，CR542202.1，AY074782.1，BQ576278.1,BT009851.120MGST2微粒體谷胱NM_002413.3，U77604.1，AA122237.Hs00182064_ml甘肽S-轉(zhuǎn)移1，CR407640.1，AK130948.1，BC0254酶216.121LRP3低密度脂蛋NM_002333.1，AB009462.1，BC00740Hs00233925_ml白受體-相8.2關(guān)蛋白322PIK3CG磷酸肌醇NM_002649.2，X83368.1，AF327656.Hs00176916_ml-3-激酶，催1，BX648341.1，BC035683.1化性，γ多肽23BMP7骨形態(tài)發(fā)生NM_001719.1，M60316.1，X51801.1，Hs00233477_ml蛋白7(成BC008584.1，BC004248.1骨蛋白1)24TP53I3腫瘤蛋白NM_147184.1，NM_004881.2，AF010Hs00153280_mlp53誘導(dǎo)型309.1，BC000474.2，BC018819.2，BTO蛋白307149.1，AK223382.1數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID25BAGlBCL2-相關(guān)NM_004323.3，Z35491.1，AF022224.1Hs00185390_ml永生基因，U46917.1，AFl16273.1，BC001936.1.(athanogeneBC014774.1，AK096038.1，AK222749).126MINAMYC誘導(dǎo)NM_032778.3,AK027299.1,AY3905Hs00262155_ml的核抗原36.1，CR627479.1，AB083190.1，AY302110.2，AY456380.1，BC014928.1，AB083189.127BCL2B—細(xì)胞NM_000633.2，M13994.1，M14745.1，Hs00608023_mlCLL/淋巴X06487.1，BC027258.1瘤228DNMT2DNA(胞嘧NM_004412.3,NM_176081.1,NM_17Hs00189402_ml啶-5-)-甲基6083.1，NM_176084.1，NM_176085.1，轉(zhuǎn)移酶2NM_176086.1，AJ223333.1，AF012128.1，AF045888.1，AF329944.1，AF329940.1，AF329941.1，AF329942.1，AF329943.1，CR450316.1，BX537961.1，BCO47733.129SCUBE2信號(hào)肽，NM_020974.1，AK131552.1，AK1230Hs00221277_mlCUB結(jié)構(gòu)39.1域，EGF-樣230PRKCA蛋白激酶C，NM_002737.2，X52479.1，AB209475.Hs00176973_mlα131ILll白介素11ΝΜ_000641.2，Χ58377.1，Μ57765.1，Hs00174148_mlBC012506.132GLIl神經(jīng)膠質(zhì)瘤NM_005269.1，X07384.1，BC013000.Hs00171790_ml-相關(guān)癌基2因同源物1(鋅指蛋白)33GLI2GLI-KruppeNM_030379.1,NM_030380.1,NM_03Hs00257977_ml1家族成員0381.1，NM_005270.2，AB007295.1，AGLI2B007296.1，AB007297.1，AB007298.1，AB209354.1，DQ086814.134BCL7AB-細(xì)胞NM_001024808.1,NM_020993.3,X8Hs00277139_mlCLL/淋巴9984.1，BC094723.1瘤7A35MUCl粘蛋白1，NM_001018016.1,NM_001018017.1,Hs00159357_ml跨膜NM_001018021.1，NM_002456.4，M34088.1，M34089.1，J05581.1，X80761.1，X52229.1，U60259.1，U60260.1，AF125525.1，AF348143.1，AY327582.1，AY327584.1，AY327585.1，AY327586.1，AY327587.1，AY336NRP2神經(jīng)粗蛋白NM_018534.3，NM_201264.1，NM_20Hs00187290_ml21266.1，NM_201267.1，NM_201279.1，NM_003872.2，AF016098.1，AF022859.1，AF022860.1，BC009222.2，AF280544.1，AF280545.1，AF280546.1，BX537423.1，AK130198.1，AL833606.137WDHDlWD重復(fù)序ΝΜ_001008396.1,NM_007086.2,AJOHs00173172_ml列和HMG-06266.1，AK001538.1，AK001585.1，A盒DNA結(jié)K001620.1，BC063041.1數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID合蛋白138ACSL6?；?CoAΝΜ_001009185·1，ΝΜ_015256·2，ABHs00362960_ml合成酶長(zhǎng)鏈020644.1，AF099740.1，AF129166.1，B家族成員6C026161.1，BC047453.140MFHASl惡性纖維組NM_004225.1，AB016816.1，BC01422Hs00180264_ml織細(xì)胞瘤擴(kuò)6.2增序列142NMTlN-肉豆蔻酰NM_021079.3，M86707.1，AF020500.Hs00221506_ml基轉(zhuǎn)移酶11,AF043324.1，BC008312.2，BC008579.1，BC006538.2，BC006569.2，BC007258.243UQCRC2泛醇-細(xì)胞NM_003366.2,J04973.1，BC000484.2，Hs00268685_ml色素C還原BC003136.1，AK094006.1酶核心蛋白II44EPOR促紅細(xì)胞生NM_000121.2，M34986.1，M60459.1，Hs00181092_ml成素受體BC019092.2，AK074082.145RARG視黃酸受NM_000966.3，M57707.1，M38258.1，Hs00171273_ml體，YBC064524.1,BC072462.1,BC019098.2，BC093729.1，BC093727.1，BC098421.146CAMK4依賴于鈣-ΝΜ_001744·3，L17000.1，L24959.1，DHs00174318_ml鈣調(diào)蛋白的30742.1，BC025687.1，BC016695.1蛋白激酶IV47SH2D1ASH2結(jié)構(gòu)域NM_002351.1，AL023657.1，AF07293Hs00158978_ml蛋白1A，0.1，AF073019.1，AF100539.1，AF1005鄧肯病(淋41.1，CR542031.1，CR542043.1，BC02巴細(xì)胞增生0732.1綜合征)480V0L2ovo-樣2(果NM_021220.2,AL079276.1,AK0222Hs00221902_ml蠅)84.1,BC006148.1，BT007295.149VEGF血管內(nèi)皮生ΝΜ_001025366.1，ΝΜ_001025367.1，Hs00900054_ml長(zhǎng)因子ΝΜ_001025368.1，ΝΜ_001025369.1，NM_001025370.1，NM_003376.4，AB021221.1，AJ010438.1，M32977.1，M27281.1，X62568.1，AF022375.1，S85192.1，AF091352.1，AF214570.1，BC065522.1，AY263145.1，50LAMBl層粘連蛋NM_002291.1，BC026018.2，M61916.Hs00158620_ml白，β1,BX648251.153WNT3A無(wú)翅-型ΝΜ_033131·2，ΑΒ060284.1，ΑΚ0562Hs00263977_mlMMTV整78.1合位點(diǎn)家族成員3A54CDC6CDC6細(xì)胞NM_001254.3，U77949.1，AF022109.Hs00154374_ml分裂周期61,BC025232.1同源物(釀酒酵母)55MYBL2v-myb^髓NM_002466.2,X13293.1,BC007585.Hs00231158_ml細(xì)胞血癥病1，BC053555.1，BU178833.1，AK2234數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID毒癌基因同82.1源物(禽)-樣256WNTlOB無(wú)翅-型NM_003394.2，U81787.1，X97057.1，AHs00559664_mlMMTV整B070724.1，BC096353.1，BC096354.1，合位點(diǎn)家BC096355.1，BC096356.1族，成員IOB57MMPll基質(zhì)金屬蛋NM_005940.3，X57766.1，CR602252.Hs00171829_ml白酶11(間1，CR612686.1，CR626443.1，AK0754充質(zhì)溶解素48.1，BC057788.1，AK129792.1，AK123)5911.158RND3Rho家族NM_005168.3，X95282.1，S82240.1，CHs00170603_mlGTP酶3R542038.1，CR542070.1，X97758.1，BC012513.1，AF498969.1，BT006769.159CTSL2組織蛋白酶NM_001333.2，AB001928.1，Y14734.Hs00952036_mlL21，AF070448.1，BC067289.1，AY358641.160CSTB抑半胱氨酸NM_000100.2，L03558.1，BC010532.1Hs00164368_ml蛋白酶蛋白，BC003370.1，CR542148.1，BT007040B(stefinB).161CD68CD68抗原ΝΜ_001251·1，S57235.1，BC015557.2Hs00154355_ml，BT009923.1，AK222492.1，AK222514.164WNT2無(wú)翅-型NM_003391.1，X07876.1，BC078170.Hs00608224_mlMMTV整1，BT019608.1，AK056742.1，BC02985合位點(diǎn)家族4.1成員265TP53腫瘤蛋白NM_000546.2，K03199.1，M14694.1，Hs00153349_mlp53(李弗M14695.1，X02469.1，X60011.1，X600勞明綜合12.1，X60013.1，X60014.1，X60015.1，征)X60016.1，X60017.1，X60018.1，X60019.1，X60020.1，X01405.1，AF307851.1，BC003596.1，BT019622.1，AB082923.1，AY429684.66MKI67單克隆抗體NM_002417.2，X65550.1，X65551.1，AHs00606991_mlKi-67鑒定J567756.1的抗原67KRASv-Ki_ras2NM_004985.3,M54968.1,BC013572.Hs00270666_mlKirsten大2，AF493917.1，BT007153.1鼠肉瘤病毒癌基因同源物68STK6絲氨酸/蘇NM_003600.2，AFOl1468.1，AL71107Hs00269212_ml氨酸激酶65.170BIRC5桿狀病毒NM_001012271.1，NM_001168.2，AFHs00153353_mlIAP重復(fù)-077350.1，BC008718.2，AB028869.1，含有5(生BC065497.1，CR541740.1，BC034148.存素)1，ΑΚ223428·171ERBB2v-erb_b2成NM_01005862.1,NM_004448.2,XOHs00170433_ml紅細(xì)胞白血3363.1，Ml1730.1，AK131568.1，BC08數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID病病毒癌基0193.1因同源物2，神經(jīng)/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤衍生的癌基因同源物(禽)72CCNBl細(xì)胞周期蛋NM_031966.2，M25753.1，BC006510.Hs00259126_ml白Bl2,BT020128.173CDK2AP1CDK2-相關(guān)NM_004642.2,AB006077.1,AF00648Hs00428063_ml蛋白14.1，BC034717.174CCNDl細(xì)胞周期蛋NM_053056.1，M73554.1，M74092.1，Hs00277039_ml白DlM64349.1，X59798.1，BC000076.2，CR(PRAD1536538.1，CR542099.1，BT019844.1，B甲狀旁腺腺T019845.1，BC001501.2，BC014078.2，瘤病1)BC025302.1，BC023620.275RHOHRas同源物ΝΜ_004310·2，Z35227.1，BG025818.Hs00180265_ml基因家族，1，BC014261.2，CD703012.1成員H76CTSL組織蛋白酶NM_145918.1，NM_001912.2，X1245Hs00377632_mlL1.1，AF217997.1，CR457053.1，AK055599.1，AK075100.1，BX537395.1，BX647101.1，BX647102.1，BX647413.1，BX647434.1，BX647435.1，BX648848.1，BX648849.1，BX649140.1，BCO12612.1，AL832167.177DUSP6雙特異性磷NM_001946.2，AB013382.1，X93920.Hs00169257_ml酸酶61，BC005047.1，BC003562.1，BC003143.1，CR593797.1，BC037236.1，AK091753.1，BT006895.1，DQ895701.178MMD單核細(xì)胞至NM_012329.2，X85750.1，BI546449.1，Hs00202450_ml巨噬細(xì)胞分BC026324.1，AY424289.1化-相關(guān)79STATl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物NM_139266.1，NM_007315.2，M9793Hs00234829_ml和轉(zhuǎn)錄的激6.1，M97935.1，BC002704.2，CR61828活物1，6.1，CR749636.1，AK096686.1，BT0079IkDa241.1,AK225853.180ERBB3v-erb_b2成ΝΜ_001005915.1，ΝΜ_001982.2，M2Hs00176538_ml紅細(xì)胞白血9366.1，M34309.1，S61953.1，BC00270病病毒癌基6.2，CR621450.1，BC082992.1，BM837因同源物3872.1，BT007226.1(禽)81LCK淋巴細(xì)胞-NM_001042771.1,NM_005356.3,UO特異性蛋白7236.1，M36881.1，X13529.1，X05027.酪氨酸激酶1，U23852.1，AF228313.1，CR594236.1，AJ865079.1，AK098027.182TBPTATA盒結(jié)ΝΜ_003194·3，M55654.1，Z22828.1，XHs00427620_ml合蛋白54993.1，M34960.1，CR456776.1，CR590323.1，CR612496.1，CR618783.1，BT019657.1，BC109054.1，BC109053.1，BCl10341.1數(shù)量基因代號(hào)基因名稱NCBI參比基因試驗(yàn)ID8318S真核18SX03205.1Hs99999901_slrRNA84P0LR2A聚合酶NM_000937.2，X63564.1，BC067295.Hs00172187_ml(RNA)II1(DNA指導(dǎo)的)多肽A，220kDa持家基因不再使用(暗灰色=一式兩份)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage31</image><image>imageseeoriginaldocumentpage32</image>....-..·Γ.-ζ.ζ.866,116ESO0O6ιηρη596二浮Ζ.9shst7(NissMZZOS9!rlο/ΛΙα#&=:這-:solslz.66,0Sl￡68G051S0Oo6so_0αζειηΓΟISKHO10￡(Ν9>8寸εοοPnffsεοιιη908οο￡888ΠΙειηεS69009631卜69990S氏29￡.09<ΝΚΡ&610ΓΖ,Ss-.O86868Ν·εS6t>&rn,088ΓΠ66Γ0R￡6sr99CS150O9Ν1960S4S.06寸S6寸<Ν卜9￡1寸ESlSOS^s一fKorrngggtsrοικο浮一μ二O〔rnrn寸986Ηs2s,l9ι/ζε9·Π二69_06r)tl9ro6ZSV10160KS0S06Z寸―8S800/.,{NSOSSO96rns6ro6S88190S.￡P(guān)sdεε6￡寸60f:6ro<Ν38ι6·Ssiro8寸ΙΠ寸rMlsorzS81697./.89isST5ε9ι6819ΙΛ1寸LVi860UOIΝζ,ιοπεο(Nsol苳5二￡,1i^s86ΓS寸Π1·1η92ιη.9Α=8ε·ι8lrlu-l9rJ9O9Ε3(Ν9ε9·_6R000S6is6066Ζ.196(NsltsoS669OS59Z.寸κοο寸9o-^lo68ε5^S-OZl￡iNs69(s(N6s寸SOS8959OΡ[:21666Ζ.06Ι6Γη8εποκ6ε6οεΗοο8069396S90"rs寸9￡soΞ￡ssllo.t(Νδδ.οεδεοΓΟS56SOS68二6ι￡6ιζεο98α6οEss寸ntsro6Π9958696586rN80CNo60tSssOOZXSOO9Π=:￡§S5Ι寸6st69一S寸~ε69￡9r-09rnKCN寸91ΚΛε19//1寸.0ΚΡ2s￡iNlalooS6CNSO8689005i.o￡6ε6ποKsoo-§0.0ιλο.οS860OK690009ε3Ν0·0πζ.=0Sz69ΚΚΙΕ69寸SOSsoro6515S5S.06α5S6LK0κκΓΟ00Z6SS0Ssso59169*00￡66€{νSzε09ιοοΡ8000Sso寸ε§99Γε￡6<Ν689Κ寸6Γ0？oosniO/Aia#81S96(NΓΓηοοΝ^ssε600￡9οisw.dsOSr-ΡΟ二oolslS5K.0δεδUdroS361O^FSiK898O9s3ro9sloro6SSS9寸S6οοΝ3〕￡98πΓΝκοΓηοοτgiNslσν卜OS50pin.0oosr-l寸9s8a,lNS960·ILsr-lros66roS(NSs寸6959Γ09S3OlfN￡s8OS986.0(NSISOSR々O90S6ST6AooPK0Z.6S9寸I卜Ko寸G6L91Oρζnss9寸sa9ZOεκ6Γ0穿UZ-O966&Γ08ΚΚ9Εε6.ε6898CS寸SS69寸98lsro<N6tpl,0βSS3S5601OΚ989Γ0ggseoP^s1839Γ0εκοοΖΓΟIaKrO^1.0S^sP96S.09ΖΚΓ08Sε3ε寸SlH卜寸60·03/.寸寸189sroS960￡tζ.6￡εεο60ΠΠsoo89ro6LKiN8o8ns寸snKOSs81868ΓΙ￡915600i§.0sKfsros(N6sro二9ΚΓ0εειποοZszsro-SiSSOrO90SH.0二ouroIsSS5.0ΔκοοΟsnlro(N590一ilol^oS6Z.SOPKSO8180sssoοο0οο6ε(Ν6Κ6Π8903Γ0JZZΚΡΖΓΟ19380.08619二,96ΚΠ0επαο二86S0￡09960.010886SOeiefss.os9z.nO二ΙS6S2O9Η96K:Krisooso.o§BSI寸196Γ0/.ΠΠοο￡9οεοοζ.6Π紹Κ80ispKOsiNscosiNurnoasono6ΠS寸6ΠΠ，610soooooslsro-SSO6oofsso8OO1/.S0661(Νεο(N66IS6piNavso19'ssoK9ao_o0ΠnooSKoεοοδ寸6Γ0ssr-yoS909T0SKlSO91908Γ0S5SOS^ssofsro30ssiNlζεΝεο寸，1ιε6εεο.οZ.199S0mou.oSssd§Bd6ssroU9i9n_rPZIMZ.Oε9η6Γ05Ζ.6ΡΙ6srnHOπι<NS191sKKrl8S/.61Oοο96εεΓ090s￡<slSps00S8SOζ,ει6551.09ε3￡siroZ二60fNiNH_0ssuoKstrolDgroιοοοο2Κ/.0εεοκΓΟεζκΓι99606ssooro32二，0IS900Q.0Sl5690ερκΓΟSs-O9寸ιιο1寸3.08i6iNSOIgsoO616160Fssεεο·Τν60οSPHOosiNdO5S5S0agcoOAooS-3.0￡95300.13Γ9εο16062:0-SR3is.oSsr-ΓΟ985999O06必SI9rs^SS-O00ZS19OS86dnnpfi^69so<N寸68Ρoolrigoos.o16S6OSZ.S6O96090,1ZusroOMSw-les9iSososlst.op￡6rolss￡oGsoo￡8^900ΙΙΝκΓΟssr-roe9sz.9_0sissSeso9(6￡ι￡·U009S06fos09ze9sitror-Ksrol9s6ros899roιοιοοεεοS6996O>009·S9OSfro9￡90u(s￡ossosopss.oS-SoS16009S0SO616SO998S.0RnSOΗοοοοεοr-pooSOS=SO93SS968ZροοΝ.οζζεεοεοοεο(Ν6οooulslsooooKroS9S0.￡6§(Ν6Γ0rnsisOSs寸ilsooroS.]<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentp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60ε·_UOZlnO-ssroΚ98-899SO-900Κ-εεοε9·9S61O-9S2:9Utr-ΓΟ-6u(sz.￡oooslz/o-896SOO00αεοοο—Sl--,6s9ro-SPZ.01Kslrio-lrs698.z-islrt509ε8ιε·ι-二οοοοοτ·S8HCN-寸06995§;9ε·ι-εοοεοκ.ιIs.T16.ι-1900S0-88ε6(Ν-tlts.o-寸Strz-SCSO—SWX9O-9S8￡(N,90ES1-93H9卜Cs寸ο,ι-9SZSO·苕O-ss9.l-6099S0-85ειη·ι-ιιπε.ο-ζΝ·1->ι(Ν0Γε-5USO-9ΗΡ-τ-<Nssl-SS6O-60Γι_8寸ε寸-SiS寸so,￡ΡΓ9-8浮699S^-VS/.￡69(Nρδοο-lnirnl-966S0-8Ρ6￡ιερ6·U300O-IEWrO-ooiNstn-Ss^o1911819ZJZZ寸Γ0ssr,￡0989丨rnCN6lr-r￡996Γ<Ν-.ιεοοζ,ΓΟ-O0699S-85091—600868·Spsl-ΖΡ90·8s6z.—(n999csn(NS9srzSffsl19SE寸SZZtNl.V30ΟΟΓΖ·6Π88Η-5Ζ.6ΚΖ9Γ-190Slpo-οοιεοοΟ-SOSO-6ηι￡εε,0(N9S8CNO9ssrr46SS1-δεε-S96t.0-S^S19SS61ilooEol-959LriooO,Γ>66·l5tro-SSCN-Limzs5360-Szoslsooooro-Ι￡ε66·0-988S9rnsSO-/.666iloSeul-Hszzi-8060S-89εε·1-￡9￡￡-εαι9·ι-P寸ε寸-898κτ-ΚΗΓΖ-η^,9ιηιΓ0-ζειΓιε-S9S-TSi-,Ι600ιη_IS9690Κ9699Sssο/ΛΙα#SOCNSTpfsazS516Tο/ΛΙα#^ioο/Λδ#Ut680-寸s(Nroft669o_S06Z.909r99-T6ιρδ·SSZ.60-工寸S-H·95S9￡8(Ν9Ζ.0ΠSslo-￡8S8O-9850ε-寸sso.o6S8O-ιοαοι-S86r0-￡86￡0rs-Ssrz-L6一εη-69S二1PS6.1-ooioiNlo-Sls.SS6TΖε66·0-？90+0-寸Sfo-3Ζ6Ζ.6+1-Π3Γ0-16ε006·ι-S9￡rnz-lKll-sl65_o58SCN-PL60O-Μοοιι丨ε5ιπ·3￡08吋CNn<stsOaoonl-￡8Tt-sro-εοεΓ.ε6ιζ.￡·ι-96S9O-寸6εε8ε·08<Ν969-<Λκε-二9￡一，1-9ts<N-V98s8(n-ssoqooo々ΜΟΟΟΙ-CNIS00S0-π-οιε,一srnfsto-s^-.o.rnsisO-6κΓε-lloosl-Π96606683εlsQO6Ιειη0Γιο/Λ1α#δ9^6·1oy>IQ#ssr.o5t988oo笤066Π866195Κ6ε9ε·Ssso-HiISVHJS-O寸Sguv-OOECSCDIM-9EGiisVSOH-寸￡ΖΙΟ·E￡50-isrnrd,!￡ssroinMHiQ·、οεa413.:2風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分析為連續(xù)變量3與所有其他患者相比，該階段的HR是I期患者，基因標(biāo)志基因名稱NCBI參比基因FZD7Frizzled同ΝΜ_003507·1，ΑΒ017365.1，BC015915.1源物7WIFlWNT抑制ΝΜ_007191·2，AF122922.1，ΒΧ647427.1，B因子1C018037.1，ΑΥ358344.1FUT3巖藻糖轉(zhuǎn)移ΝΜ_000149·1，U27326.1，U27327.1，U2732酶38.1，AF131913.1NXFl核RNA輸ΝΜ_006362.3，AJ132712.1，U80073.1，AFll出因子12880.1，AF126246.1，ΑΚ027192.1，BC004904.2，CR749674.1，ΑΒ209915.1，BC028041.1ASMTL乙酰血清素ΝΜ_004192·1，ΑΚ001090.1，BC010089.2，B0-甲基轉(zhuǎn)移C002508.2，ΑΚ090498.1酶-樣CTNNBl連環(huán)蛋白，ΝΜ_001904·2，Ζ19054.1，Χ87838.1，ΑΒ062βl，88kDa292.1，BC058926.1SH3BGR富含SH3結(jié)NM_001001713·1，NM_007341.2,X93498.1構(gòu)域結(jié)合谷，BC006371.2，BM474020.1氨酸的蛋白ARAFv-raf鼠肉ΝΜ_001654·1，Χ04790.1，BC007514.2，BCO瘤3611病02466.2，ΒΤ019864.1，ΑΚ130043.1毒癌基因同源物TYROBPTYRO蛋白ΝΜ_198125·1，ΝΜ_003332·2，AF019562.1，酪氨酸激酶AJ010098.1，BCOl1175.1，CR450342.1，CR5結(jié)合蛋白42202.1，ΑΥ074782.1，BQ576278.1，ΒΤ009851.1LRP3低密度脂蛋ΝΜ_002333·1，ΑΒ009462.1，BC007408.2白受體-相關(guān)蛋白3PIK3CG磷酸肌醇ΝΜ_002649·2，Χ83368.1，AF327656.1，ΒΧ6-3-激酶，催48341.1，BC035683.1化性，γ多ΒΜΡ7骨形態(tài)發(fā)生ΝΜ_001719·1，Μ60316.1，Χ51801.1，BC008蛋白7584.1，BC004248.1ΤΡ53Ι3腫瘤蛋白ΝΜ_147184·1，ΝΜ_004881·2，AF010309.1，ρ53誘導(dǎo)型BC000474.2，BC018819.2，ΒΤ007149.1，AK蛋白3223382.1BAGlBCL2-相關(guān)ΝΜ_004323·3，Ζ35491.1，AF022224.1，U469永生基因17.1，AFl16273.1，BC001936.1，BC014774.1，ΑΚ096038.1，ΑΚ222749.1MINAMYC誘導(dǎo)ΝΜ_032778·3，ΑΚ027299.1，ΑΥ390536.1，C的核抗原R627479.1，ΑΒ083190.1，ΑΥ302110.2，ΑΥ45基因標(biāo)志基因名稱NCBI參比基因6380.1，BC014928.1，ΑΒ083189.1BCL2B-細(xì)胞ΝΜ_000633.2，Μ13994.1，Μ14745.1，Χ0648CLL/淋巴7.1，BC027258.1瘤2DNMT2DNA-甲基ΝΜ_004412.3,NM_176081.1,ΝΜ_176083.轉(zhuǎn)移酶21，ΝΜ_176084.1，ΝΜ_176085.1，ΝΜ_176086.1，AJ223333.1，AFO12128.1，AF045888.1，AF329944.1，AF329940.1，AF329941.1，AF329942.1，AF329943.1，CR450316.1，ΒΧ537961.1，BC047733.1SCUBE2信號(hào)月太，NM_020974.1,ΑΚ131552.1,ΑΚ123039.1CUB結(jié)構(gòu)域，EGF-樣2PRKCA蛋白激酶C，ΝΜ_002737.2，Χ52479.1，ΑΒ209475.1αILll白介素11ΝΜ_000641.2，Χ58377.1，Μ57765.1，BC012506.1GLIl神經(jīng)膠質(zhì)瘤ΝΜ_005269.1，Χ07384.1，BC013000.2-相關(guān)癌基因同源物1GLI2GLI-KruppeNM_030379.1,NM_030380.1,ΝΜ_030381.1家族成員1，ΝΜ_005270.2，ΑΒ007295.1，ΑΒ007296.1，GLI2ΑΒ007297.1，ΑΒ007298.1，ΑΒ209354.1，DQ086814.1BCL7AB-細(xì)胞ΝΜ_001024808.1，ΝΜ_020993.3，Χ89984.1CLL/淋巴，BC094723.1瘤7AMUCl粘蛋白1,NM_001018016.1,NM_001018017.1,NM_跨膜001018021.1，NM_002456.4，M34088.1，M34089.1，J05581.1，X80761.1，X52229.1，U60259.1，U60260.1，AF125525.1，AF348143.1，AY327582.1，AY327584.1，AY327585.1，AY327586.1，AY327587.1，AY3NRP2神經(jīng)粗蛋白NM_018534.3，NM_201264.1，NM_201266.21，NM_201267.1，NM_201279.1，NM_003872.2，AF016098.1，AF022859.1，AF022860.1，BC009222.2，AF280544.1，AF280545.1，AF280546.1，BX537423.1，AK130198.1，AL833606.1NM_001008396.1，NM_007086.2，AJ006266.1，AKOO1538.1，AKOO1權(quán)利要求一種為對(duì)象的肺癌提供預(yù)后的方法，所述方法包括以下步驟(a)將該對(duì)象的生物學(xué)樣品與各自特異性結(jié)合一組生物標(biāo)記物中一種成員的試劑接觸，所述生物標(biāo)記物包括ctnnb1、wnt3a、tp53、kras、erbb3、muc1、erbb2和dusp6；和(b)測(cè)定所述標(biāo)記物在該樣品中是否差別表達(dá)；從而提供肺癌的預(yù)后。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是核酸。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是寡核苷酸。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是PCR引物組。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是抗體。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺癌是肺腺癌。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌癌是I期。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌是II期。9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌是III期。10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述肺腺癌是IV期。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品來(lái)自外科手術(shù)切除的腫瘤。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品來(lái)自肺組織或肺腫瘤活檢。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)后提供長(zhǎng)期死亡率的高或低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。14.一種裝有試劑的試劑盒，所述試劑各自特異性結(jié)合一組生物標(biāo)記物中一種成員，所述生物標(biāo)記物包括ctnnbl、wnt3a、tp53、kras、erbb3、mucl、erbb2和dusp。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述試劑是PCR引物組。16.一種提供患肺癌對(duì)象的預(yù)后的方法，包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少兩種選自下組的生物標(biāo)記的表達(dá)水平rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagUemx2,six3和brcal，其中，所述生物學(xué)樣品源自所述對(duì)象，而所述表達(dá)水平是所述預(yù)后的標(biāo)志。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平是mRNA表達(dá)水平。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述定量測(cè)定包括定量rtPCR。19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平是蛋白質(zhì)表達(dá)水平。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，采用抗體結(jié)合試驗(yàn)定量測(cè)定所述表達(dá)水平。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗體結(jié)合試驗(yàn)是ELISA。22.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少三種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。23.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少四種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。24.如權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括至少四種生物標(biāo)記，其中所述至少四種生物標(biāo)記包括erbb3、lck、wnt3a和rdn3。25.如權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括至少四種生物標(biāo)記，其中所述至少四種生物標(biāo)記包括erbb3、lck、wnt3a和rdn3。26.如權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品是血液樣品27.如權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品是腫瘤活檢。28.如權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品是肺活檢。29.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)水平是蛋白質(zhì)表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平的組合。30.一種提供患肺癌對(duì)象的預(yù)后的方法，所述方法包括檢測(cè)生物學(xué)樣品中至少兩種選自下組的生物標(biāo)記的甲基化水平:rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apUbagUemx2、six3和brcal；其中，所述生物學(xué)樣品源自所述對(duì)象，而所述甲基化水平是所述預(yù)后的標(biāo)志。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少三種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少四種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述至少四種生物標(biāo)記包括erbb3、lck、wnt3a禾口rdn3。34.一種包括患肺癌對(duì)象的預(yù)后的報(bào)道，所述預(yù)后通過(guò)定量測(cè)定該對(duì)象的生物學(xué)樣品中至少兩種選自下組的生物標(biāo)記的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定rnd3、wnt3a,erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3和brcal；其中，所述表達(dá)水平是所述預(yù)后的標(biāo)志ο35.如權(quán)利要求34所述的報(bào)道，其特征在于，包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少三種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。36.如權(quán)利要求34所述的報(bào)道，其特征在于，包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少四種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。37.如權(quán)利要求36所述的報(bào)道，其特征在于，所述至少四種基因包括erbb3、lck、wnt3a禾口rdn3。38.一種包括生物學(xué)樣品的基因表達(dá)概況的報(bào)道，所述生物學(xué)樣品從患肺腺癌的對(duì)象分離，所述基因表達(dá)概況包括至少兩種選自下組的生物標(biāo)記的表達(dá)水平rnd3、wnt3a,erbb3、lck、sh3bgr、fut3、illl、cdc6、cdk2apl、bagl、emx2、six3禾口brcal。39.如權(quán)利要求38所述的報(bào)道，其特征在于，包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少三種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。40.如權(quán)利要求38所述的報(bào)道，其特征在于，包括定量測(cè)定生物學(xué)樣品中至少四種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。41.如權(quán)利要求40所述的報(bào)道，其特征在于，所述至少四種基因包括erbb3、lck、wnt3a禾口rdn3。全文摘要本發(fā)明提供為肺癌提供預(yù)后的方法，該方法利用在肺癌中差別表達(dá)的一組八種分子標(biāo)記物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101821405SQ200880101348公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日發(fā)明者D·J·拉茲,D·M·雅布隆斯申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)