專利名稱：檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的構(gòu)建方法及其檢 測方法。細(xì)菌為大腸桿菌。該生物吸附劑用于檢測環(huán)境中甲苯類有機(jī)污染物。
背景技術(shù)：
近年來，隨著工業(yè)化和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，大量使用合成物質(zhì)和化學(xué)農(nóng)藥 等產(chǎn)品，人類不斷向環(huán)境中排放大量污染物物質(zhì)，這些都使人類的健康乃至生命受到威 脅。甲苯類有機(jī)物的廣泛使用，已經(jīng)嚴(yán)重污染環(huán)境。甲苯類的有機(jī)物已經(jīng)被列為污染水 體，土壤的黑名單，必須進(jìn)行檢測控制。
目前監(jiān)測和檢測污染物主要有兩種方法一是物理化學(xué)分析法。其準(zhǔn)確度和靈 敏度都很高，但需要成套昂貴的精密分析儀器和專業(yè)化實(shí)驗(yàn)室，并且這種方法在一些污 染物檢測中無法實(shí)現(xiàn)on-site檢測。另一種方法是直接利用生物體對特定污染物的響應(yīng)進(jìn) 行檢測，也就是近幾年內(nèi)引起關(guān)注的全細(xì)胞生物監(jiān)測。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器提出了一種可以有效檢測甲 苯類有機(jī)污染物的方法。
本發(fā)明檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器是利用惡臭假單胞菌中的能 夠特異的降解甲苯類有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因與商業(yè)化質(zhì)粒中信號強(qiáng)度 高的Luc報(bào)告基因一起構(gòu)建出的一種有效檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器。
本發(fā)明檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器的具體操作步驟為
1、擴(kuò)增載體片斷
首先利用DELNot-Spe I引物以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模板擴(kuò)增得到線性化片 斷，DELNot I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCACTAGT TCTTCC
GCTTCCTCGCTCAC ； DEL Not I-Spe I 下 游 GACTGAGCTCGGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分別用 Not I 與 Spe I 進(jìn)行酶切處理，并進(jìn)行純化處理；
2、擴(kuò)增終止子片斷；
禾Ij用 下 列 弓 I 物 R R N B Spe 1:5 ‘ ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3‘ RRNB NOT I 5' ATTAGCGGCCGC GAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3 ‘以大腸桿菌基因組為模版進(jìn)行擴(kuò)增得到RRNB終止子序列片斷，利用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處理，并進(jìn)行純化處理；
3、終止子載體重組質(zhì)粒構(gòu)建
將上述兩步構(gòu)建好的片斷按照摩爾比為一比三的比例混合后利用T4連接酶在16 度下進(jìn)行連接；利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒一；
4、利用PCR方法擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào) 控蛋白基因
將從美國菌種保藏管理中心購得的惡臭假單胞菌(編號為ATCC 33015)接 種于#1271Broth:苯甲酸鈉培養(yǎng)基25mL中，30°C振蕩培養(yǎng)M至48小時(shí)。當(dāng)細(xì)菌 生長達(dá)到對數(shù)生長期中期時(shí)，分別利用引物Pu-Not IATTAGCGGCCGCCCCGGGAA AGCGCGATGAAC ； Pu-BamH I ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ； XylR-Luc Xho I CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT ； XylR-Luc Sac I GTACGAGCTCTTTTCACACAACCTGGGGCG擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類有機(jī)物基 因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因；
5、含有降解甲苯類有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因的重組質(zhì)粒的構(gòu) 建；
利用相應(yīng)引物的酶分別酶切上步操作得到的片斷，回收純化；利用相應(yīng)的酶酶 切重組質(zhì)粒一中；連入啟動子Pu的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒二；在質(zhì)粒二的基礎(chǔ)上連入調(diào)控蛋白 基因XylR命名為質(zhì)粒三；
6、得到檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器
利用商業(yè)化宿主感受態(tài)細(xì)胞為宿主，將質(zhì)粒三轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞得到甲苯類有機(jī)污 染物的微生物細(xì)胞傳感器
以下通過具體實(shí)事例詳細(xì)說明發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā) 明的實(shí)質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1:第一步接種單菌落(載體細(xì)胞空白同時(shí)接種)于50ml三角瓶中； 氨芐青霉素終濃度為100 μ g/ml ； 37度過夜培養(yǎng)
第二步5ml的LB培養(yǎng)基加入設(shè)定濃度的誘導(dǎo)物(如二甲苯濃度500 μ m)；
第三步菌體培養(yǎng)至OD6OO = 1.2 ；
第四步稀釋到OD600 = 0.4，取5ml的稀釋好的培養(yǎng)液加入第二步準(zhǔn)備好的培 養(yǎng)液中；M度誘導(dǎo)；
第五步對于細(xì)菌，將40 μ 1未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(載體細(xì)胞)與50 μ 1轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物混 合。(細(xì)胞濃度相同)加入10 μ 1 IMIC2HPO4 (ρΗ 7.8)，20mM EDTA (—個溶液)。用-70 度冰箱快速冷凍混合物(凍融)(IOmin)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至室溫并置于室溫水浴中(23度 或置于室溫下平衡30分鐘)。加入300 μ 1新鮮配制的裂解混合物(見附錄)?；旌喜⒂?室溫孵育10分鐘；
第五步檢測；每個九十六空板中加入20 μ 1的裂解液后，加入100 μ 1熒光素 酶檢測液，立刻檢測；
第六步數(shù)據(jù)處理，得到數(shù)據(jù)與空白對照的差值，然后改差值乘以400得到即 為每毫升菌液對應(yīng)的數(shù)值了；對甲苯的最低檢測濃度為40微摩爾/升，最高濃度為1000微摩爾/升。
10毫升裂解混合物配方
5.5ml 水
2ml 5 X CCLR
加入25mgBSA
2.5ml 溶菌酶混合液(配 5ml 配方0.5ml IM IM K2HPO4 (pH 7.8)，20mM EDTA+4.5ml無菌水然后加入25mg溶菌酶)混合均勻。
權(quán)利要求
1.一種微生物傳感器，由細(xì)菌作基本材料，通過基因工程手段構(gòu)建用來檢測甲苯類 有機(jī)污染物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生生物傳感器，其特征在于細(xì)菌大腸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生生物傳感器，其特征在于材料為商業(yè)化質(zhì)粒 pEGMluc
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生生物傳感器，其特征在于基因來源為商業(yè)化菌株惡 臭假單胞菌；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物吸附劑，其制備方法a、擴(kuò)增載體片斷首先利用DELNot-Spe I引物以商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc為模板擴(kuò)增得到線性化片 斷，DEL Not I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCA CTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC ； DEL Not I-Spe I 下游GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分別用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處理，并進(jìn)行純化處理；b、擴(kuò)增終止子片斷；利用下列引物 RRNB Spel 5' ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3' RRNB NOT I 5' ATTAGCGGCCGCGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3‘以大腸桿菌基因組為模版進(jìn)行擴(kuò)增得到RRNB終止子序列片斷，利用Not I與Spe I進(jìn)行酶切處 理，并進(jìn)行純化處理；C、終止子載體重組質(zhì)粒構(gòu)建將上述兩步構(gòu)建好的片斷按照摩爾比為一比三的比例混合后利用T4連接酶在16度下 進(jìn)行連接；利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒一；d、利用PCR方法擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋 白基因?qū)拿绹N保藏管理中心購得的惡臭假單胞菌(編號為ATCC 33015)接種 于#1271Broth:苯甲酸鈉培養(yǎng)基25mL中，30°C振蕩培養(yǎng)24至48小時(shí)。當(dāng)細(xì)菌生長達(dá)到 對數(shù)生長期中期時(shí)，分別利用引物Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAAAGCGCGA TGAAC ； Pu-BamH I ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ； XylR-Luc Xho I CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT ； XylR-Luc Sac I GTACGAGCTC TTTTC ACAC AACCTGGGGCG擴(kuò)增惡臭假單胞菌中降解甲苯類有機(jī)物基因的調(diào)控序列以 及調(diào)控蛋白基因；e、含有降解甲苯類有機(jī)物基因的調(diào)控序列以及調(diào)控蛋白基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；利 用相應(yīng)引物的酶分別酶切上步操作得到的片斷，回收純化；利用相應(yīng)的酶酶切重組質(zhì)粒 一中；連入啟動子Pu的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒二；在質(zhì)粒二的基礎(chǔ)上連入調(diào)控蛋白基因XylR 命名為質(zhì)粒三；f、得到檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器利用商業(yè)化宿主感受態(tài)細(xì)胞為宿主，將質(zhì)粒三轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞得到甲苯類有機(jī)污染物 的微生物細(xì)胞傳感器g接種單菌落(載體細(xì)胞空白同時(shí)接種)于50ml三角瓶中；氨芐青霉素終濃度為 100ug/ml ； 37度過夜培養(yǎng)h 5ml的LB培養(yǎng)基加入設(shè)定濃度的誘導(dǎo)物(如二甲苯濃度500um)；i 菌體培養(yǎng)至OD600 = 1.2 ；j 稀釋到OD600 = 0.4，取5ml的稀釋好的培養(yǎng)液加入第二步準(zhǔn)備好的培養(yǎng)液中； 23度誘導(dǎo)；k 對于細(xì)菌，將40 μ 1未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(載體細(xì)胞)與50 μ 1轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物混合。(細(xì) 胞濃度相同)加入10 μ 1 IM Κ2ΗΡ04 (PH 7.8)，20mM EDTA ( 一個溶液)。用-70度冰 箱快速冷凍混合物(凍融)(IOmin)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至室溫并置于室溫水浴中(23度或 置于室溫下平衡30分鐘)。加入300 μ 1新鮮配制的裂解混合物(見附錄)。混合并于室 溫孵育10分鐘；1檢測；每個九十六空板中加入20ul的裂解液后，加入IOOul熒光素酶檢測液，立 刻檢測；m數(shù)據(jù)處理，得到數(shù)據(jù)與空白對照的差值，然后改差值乘以400得到即為每毫升菌 液對應(yīng)的數(shù)值了；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器的制備方法，其特征在于所述蛋白胨 水液體培養(yǎng)基為25mL;所述振蕩培養(yǎng)的溫度為37°C，酶切在37°C條件下進(jìn)行；
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器的制備方法，其特征在于從美國普通 微生物菌種保藏管理中心購得的惡臭假單胞菌(編號為ATCC33015)在含有苯甲酸鈉的 培養(yǎng)基中經(jīng)誘導(dǎo)，促進(jìn)其甲苯類有機(jī)物降解基因表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器的制備方法，其特征在于微生物傳感 器培養(yǎng)溫度為37°C，微生物傳感器誘導(dǎo)溫度為23°C，檢測數(shù)據(jù)采集利用發(fā)光檢測儀檢 測。
全文摘要
本發(fā)明檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器及其檢測方法涉及一種利用惡臭假單胞菌降解基因的調(diào)控序列及調(diào)控蛋白基因跟商業(yè)化報(bào)告基因質(zhì)粒序列，構(gòu)建檢測甲苯類有機(jī)污染物的微生物細(xì)胞傳感器以及檢測方法。細(xì)菌宿主為大腸桿菌，使用于甲苯類有機(jī)物的檢測。對甲苯的最低檢測濃度為40微摩爾/升，最高濃度為1000微摩爾/升。
文檔編號C12N1/21GK102021219SQ20091009324
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者于清, 呼慶, 莊國強(qiáng) 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心