專利名稱：一種在滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強(qiáng)紫草素合成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過添加多聚物來促進(jìn)滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強(qiáng)紫草素合成的方法。
背景技術(shù)：
滇紫草(OmMwa/7a"/cw/a似w Bur. etFr.)主產(chǎn)云南，是云南省本地常用中草藥，屬紫 草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分不但 具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印 染工業(yè)。目甜，滇紫草的野生資源破壞嚴(yán)重，市場(chǎng)上供需矛盾凸顯。而利用植物細(xì)胞大規(guī) 模培養(yǎng)技術(shù)在反應(yīng)器中直接培養(yǎng)細(xì)胞獲得藥用次生代謝產(chǎn)物是將來生產(chǎn)植物藥最直接、最 有效的手段。而對(duì)于開展細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，獲得一種能顯著促進(jìn)次 生代謝物合成的方法，是保證高生產(chǎn)效率，縮短生長(zhǎng)周期，降低生產(chǎn)成本的有效手段。
隨著植物細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)和革新，發(fā)現(xiàn)了越來越多的生物或非生物的脅 迫因子對(duì)植物次生代謝過程產(chǎn)生影響，而這些影響結(jié)果有不是積極的，是與培養(yǎng)目標(biāo)相一 致的。紫草素作為典型的植物次生代謝產(chǎn)物，已有報(bào)道表明多種物質(zhì)能提高滇紫草培養(yǎng)細(xì) 胞中紫草素含量，如某些真菌提取物可以提高滇紫草培養(yǎng)過程中的紫草素含量一倍左右 (寧文等，植物生理學(xué)報(bào)，1994， 20(4): 325-331);油菜素內(nèi)酯添加到培養(yǎng)基，可以提高 滇紫草細(xì)胞紫草素含量70%以上(張華等，南京大學(xué)學(xué)報(bào)，1999， 35(2): 151-155.);甲基 茉莉酮酸酯配合植物激素作用，可以顯著提高細(xì)胞中紫草素的合成量(Ding et al. In Vitro Cell Dev-PL, 2004, 40: 581-585)。綜合上述，發(fā)現(xiàn)更多、更有效的刺激因子來高植物藥用次 生代謝產(chǎn)物的含量是行之有效的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過添加多聚物一殼聚糖來促進(jìn)滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增 強(qiáng)紫草素合成的方法。
該方法的操作歩驟如下
1)滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基十NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1 °C，避光培養(yǎng)；
32)合成培養(yǎng)基的配制及紫草素合成階段的細(xì)胞培養(yǎng)M10固體培養(yǎng)基+殼聚糖，殼聚
糖加入量為每升M10培養(yǎng)基5-50mg， M10培養(yǎng)基的成分如表l所示；殼聚糖的種類為分子 量60000的殼聚糖、分子量90000的殼聚糖、分子量400000的殼聚糖中的一種。在裝有40mL 固體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行，采用繼代培養(yǎng)15天的細(xì)胞接種，培養(yǎng)溫度為25士1 °C， pH值 5.6，暗培養(yǎng)，該紫草素合成階段的細(xì)胞培養(yǎng)周期為15天。
表1 M10培養(yǎng)基成分
成分 濃度(mg/L) 成分 濃度(mg/L)
KN03 680 NaH2P04*2H20 19
Na2S04 2000 CuCl2'2H20 0.15
CaCl2 500 NaFe-EDTA 2
H3B03 1.6 Sucrose 50000
Inositol 100 Kinetin(KT) 1
3)紫草素含量的測(cè)定將培養(yǎng)的滇紫草細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸
點(diǎn)30 — 60 °C)，用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后在室溫下振蕩(110r/min)提取24 h，提取液用于測(cè)定細(xì)胞屮紫草素的含量。
紫草素呈紅棕色，用分光光度計(jì)測(cè)量，在520nm處有最大吸收峰。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 到C二]87.85X — 2.09， r=0.9995，其中C為石油醚溶液中的紫草素濃度(mg/L)， X為該 測(cè)定溶液的吸光度值。
S= (CNV/W) X100%;
其中，S為紫草素含量(％)， W為愈傷組織干重(mg)， V為萃取液體積(L)， N為 稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)在于1.所添加殼聚糖的分子量；2.添加殼聚糖的濃度。以上關(guān)鍵 點(diǎn)如能把握好，可以顯著提高細(xì)胞紫草素的含量。
本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，效果良好，本發(fā)明可應(yīng)用到植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝 產(chǎn)物的實(shí)際生產(chǎn)過程中。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不是對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例l:
1) 滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 。C，避光培養(yǎng)；
2) 將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細(xì)胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為M10固f本 培養(yǎng)基+分子量為60000的殼聚糖(用量見表2)， pH值5.6，培養(yǎng)溫度為25土1 'C，避光 培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。
3) 培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定細(xì)胞紫草素的含量，其結(jié)果見表2。
表2不同濃度的殼聚糖(分子量60000)對(duì)滇紫草細(xì)胞紫草素含量的影響 培養(yǎng)基中殼聚糖濃度(mg/L) 紫草素含量(％) 紫草素含量比對(duì)照組提高的百分比(％)
5 1.55 40.9
20 1.71 55.5
50 1.42 29.1
注對(duì)照組為不添加殼聚糖的實(shí)驗(yàn)組。 實(shí)施例2:
1 )湞紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 °C，避光培養(yǎng)；
2) 將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細(xì)胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為M10固體 培養(yǎng)基+分子量為90000的殼聚糖(用量見下表3)， pH值5.6，培養(yǎng)溫度為25士1 °C ，避 光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。
3) 培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定細(xì)胞紫草素的含量，其結(jié)果見表3。
表3不同濃度的殼聚糖(分子量90000)對(duì)滇紫草細(xì)胞紫草素含量的影響
培養(yǎng)基中殼聚糖濃度 紫草素含量(％) 紫草素含量比對(duì)照組提高的百分比(％〉 (mg/L)
5 1.83 66.4
20 1.75 59.1
50 1.21 10.0
注對(duì)照組為不添加殼聚糖的實(shí)驗(yàn)組。實(shí)施例3:
1) 滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L + 2,4-D0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 。C，避光培養(yǎng)；
2) 將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細(xì)胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為M10固體 培養(yǎng)基+分子量為400000的殼聚糖(用量見下表4)， pH值5.6，培養(yǎng)溫度為25土1 °C， 避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。
3) 培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定細(xì)胞紫草素的含量，其結(jié)果見表3。
表4不同濃度的殼聚糖(分子量400000)對(duì)滇紫草細(xì)胞紫草素含量的影響 培養(yǎng)基中殼聚糖濃度(mg/L) 紫草素含量(％) 紫草素含量比對(duì)照組提高的百分比(％) 5 1.98 訓(xùn)
20 1.37 24.5
50 1.18 7.3
注對(duì)照組為不添加殼聚糖的實(shí)驗(yàn)組。
權(quán)利要求
1、一種促進(jìn)滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強(qiáng)紫草素合成的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括1)滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)使用繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25±1℃，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細(xì)胞接種在含殼聚糖的M10固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，殼聚糖的用量為每升M10培養(yǎng)基5-50mg，培養(yǎng)溫度為25±1℃，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的促進(jìn)滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強(qiáng)紫草素合成的方法，其特征 在于殼聚糖的種類為分子量60000的殼聚糖或分子量90000的殼聚糖或分子量400000的殼聚糖o
全文摘要
本發(fā)明是一種滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強(qiáng)紫草素合成的方法。其操作步驟主要包括1.滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)；2.殼聚糖促進(jìn)滇紫草細(xì)胞紫草素的合成；3.紫草素含量測(cè)定過程。向培養(yǎng)基中添加殼聚糖能提高滇紫草細(xì)胞紫草素含量。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，效果良好，本發(fā)明可應(yīng)用到植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的實(shí)際生產(chǎn)過程中。
文檔編號(hào)C12P7/26GK101503715SQ200910094230
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者暢 劉, 劉迪秋, 鋒 葛, 陳朝銀 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)