專利名稱：：天山雪蓮sikCOR基因在培育抗寒植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(SaussureainvolucrataKar.etKir)中克隆得到sikCOR基因，構(gòu)建組成型植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，并對抗寒效果進(jìn)行評價，增加植物的抗寒性能。
背景技術(shù)：
：低溫是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一。低溫脅迫可使植物光合作用降低，呼吸作用增強，能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻，消耗增強，植物處于饑餓狀態(tài)，嚴(yán)重影響了植物的正常生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡(郭子武，李憲利等，植物低溫脅迫響應(yīng)的生化與分子生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展，中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004，12(2)54-57)。冷調(diào)節(jié)蛋白(CORPs)是指大多數(shù)植物在低溫馴化誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生的一類特異性蛋白，也叫做冷馴化蛋白(coldacclimationproteins，CAIPs)，它與植物的抗寒力密切相關(guān)(WeiserCJ.Coldresistanceandinjuryinwoodyplants.Sci,1970,1691269-1273)。對大量冷調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)有一定相似性一級結(jié)構(gòu)富含親水性氨基酸(Gly、Thr、His等)，含有重復(fù)單元，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主(王艇，唐振亞.植物的冷馴化和熱激反應(yīng)的分子基礎(chǔ).植物分子遺傳學(xué)[Μ].北京科i^djiKli,1997,499-549)(KurkelaS,FranckM.Cloningandcharacterizationofacold-andABA-inducedArabiopsisgene.PlantMolBiol，1990，15:137_144)。冷調(diào)節(jié)蛋白大多具有極強的親水性、高度的柔韌性和流動性以及熱穩(wěn)定性。但不同植物之間及同一植物內(nèi)部，不同冷調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸組成、序列、重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)和空間結(jié)構(gòu)等方面均表現(xiàn)出一定程度的差異性，它們的組成與結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性。這可能與它們的不同功能有關(guān)(康國章，王正詢，孫谷疇.植物的冷調(diào)節(jié)蛋白[J].植物學(xué)通報，2002，19(2)239-246)。一部分冷調(diào)節(jié)蛋白可作為抗凍劑，提高細(xì)胞在冷脅迫下的抗結(jié)冰能力，阻止冰晶的生成(LinC,GuoWW,EversonE,ThomashowMF.Cold-acclimationinArabidopsisandwheat.Aresponse-associatedwithexpressionofrelatedgenesencoding"Boiling-stable"polypeptides.PlantPhysiol,1990,94:1078_1083)。它們的氨基酸序列與水分子有特殊的氫鍵結(jié)合，能降低細(xì)胞中水的冰點，但不影響熔點，表現(xiàn)出一種熱滯效應(yīng)，并且能依附在冰晶的表面，阻止冰晶的生長，避免重結(jié)晶化，被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)重要的抗凍劑(cryoprotectants)0冷調(diào)節(jié)蛋白高度的親水性可能在低溫脫水過程中，提高細(xì)胞的脫水忍耐性，維持細(xì)胞的正常功能。在細(xì)胞脫水過程中，脫水敏感型蛋白質(zhì)或脂肪可能通過與冷調(diào)節(jié)蛋白的相互聯(lián)結(jié)而避免過度失水變性。在這一結(jié)合過程中，冷調(diào)節(jié)蛋白能把水分子結(jié)合在這些大分子物質(zhì)的表面和三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部(KazuokaT，0edaK.Heat-stableCOR(cold-regulated)proteinsassociatedwithfreezingtoleranceinspinach.PlantCellPhysio,1992,1331107-1114)，防止過量脫水傷害細(xì)胞。—些冷調(diào)節(jié)蛋白可能是細(xì)胞的保護(hù)性功能蛋白，在清除活性氧中起重要作用，具有明顯的抗低溫氧化脅迫能力，在低溫下起直接保護(hù)作用(ZhangH，WangJ,NickelU，AllenRD,GoodmanHΜ.CloningandexpressionofanArabidopsisgeneencodingaputativeperoxisomalasCORbateperoxidase.PlantMolBiol,1997,34:967_971)。許多冷調(diào)節(jié)蛋白可能是低溫脅迫下細(xì)胞主要代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，有助于維持在低溫脅迫下細(xì)胞的主要代謝活動(RoratT，IrzkowskiW，GrygorowiczWF.Identificationandexpressionofnovelcoldinducedgenesinpotato(Solanumsogarandinum).PlantSci，1997，124:69_78)(ReimholzR，GeigarM，HaakeV，DeitingU，KrauseKP，SonnewaldR，StittM.Potatoplantscontainmultipleformsofsucrosephosphatesynthase,whichdifferintheirtissuedistributions,theirlevelsduringdevelopment,andtheirresponsestolowtemperature.PlantCellEmvir，1997，20:291_305)。另外，一些冷調(diào)節(jié)蛋白被認(rèn)為可能是低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成部分，參與低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過禾呈(MizoguchiT,IchimuraK,ShimozakiK.Environmentalstressresponseinplants:theroleofmitogen-activatedproteinkinase.TibJ,1997,15:15-19)(JariIloJA,CapelJ,LeyvaA.Tworelatedlowtemperature-induciblegeneofArabidopsisencodeproteinshowinghighhomelogyto14-3_3proteins,afamilyofputativekinaseregulators.PlantMolBiol，1994，25:693_704)。作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(SaussureainvolucrataKar.etKir)，又名天山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長于海拔24004100m的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫35°C，最低月平均溫-19-21°C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。天山雪蓮經(jīng)過長期的自然選擇，形成了穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)、功能和遺傳基因，產(chǎn)生了適應(yīng)極端環(huán)境條件下的生理和生化機(jī)制，這種與環(huán)境相適應(yīng)的機(jī)制，與一般的耐冷、抗寒應(yīng)答性的適應(yīng)機(jī)制不同，主要表現(xiàn)在其低溫條件下能夠正常的生長發(fā)育，而一般的抗寒性植物在相應(yīng)的低溫條件下，生長發(fā)育受到抑制。近年來植物抗寒基因工程得到迅速發(fā)展，并研究出了多種轉(zhuǎn)基因抗寒植物，為培育抗寒植物開辟了新途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是為植物抗寒育種提供有價值的冷調(diào)節(jié)蛋白基因SikCOR，其發(fā)明的目還在于構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438-sikC0R，在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達(dá)，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲得抗(耐)低溫能力明顯增強的植物。本發(fā)明的目的是通過以下過程和方法實現(xiàn)的本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆SikCOR基因，其序列為<210>1。本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆SikCOR基因的過程如下以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質(zhì)粒為模板，用CPl其序列為<210>2和CP2其序列為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；sikCOR基因植物表達(dá)載體構(gòu)建構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438_sikC0R；利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植物以未轉(zhuǎn)化煙草植株葉片為對照，轉(zhuǎn)基因株系在模擬抗寒脅迫8小時后，與未轉(zhuǎn)基因株系相比，葉片相對電導(dǎo)率下降49.1%。當(dāng)溫度高于_2°C時，轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)基因植株煙草葉片的電導(dǎo)率并沒有明顯差別，但是當(dāng)溫度達(dá)到_4°C時，未轉(zhuǎn)基因煙草葉片的電導(dǎo)率明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草葉片，說明在-4°C時，未轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞已經(jīng)不能耐受低溫，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物溢出，導(dǎo)致電導(dǎo)率上升，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞能夠耐受低溫，電導(dǎo)率并未出現(xiàn)大的變化。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量可以表示脂質(zhì)過氧化的程度。轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。煙草經(jīng)不同低溫溫度處理，MDA的含量均有所提高。從結(jié)果中分析得出，不管是0°C，_4°C低溫處理8hr，野生型煙草比轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量增加大，說明野生型植株膜質(zhì)的過氧化程度相對較高。原因可能在于轉(zhuǎn)基因煙草降低了脂質(zhì)過氧化的程度。本發(fā)明不僅得到天山雪蓮抗寒相關(guān)冷調(diào)節(jié)蛋白基因sikCOR，而且將其構(gòu)建成的植物表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)基因植物中研究了該基因在提高植物耐低溫性能中的重要功能。這對于揭示雪蓮的抗寒機(jī)理，豐富植物抗寒分子生物學(xué)理論，提高植物的耐低溫能力，具有重要的眉、ο圖1是天山雪蓮sikCOR基因PCR擴(kuò)增圖FiglsikCORgenePCRamplified圖2是pGM-sikCORPCR鑒定圖Fig2:PCRidentificationofpGM-sikCOR圖3是sikCOR進(jìn)化分析圖Fig3=PhylogeneticanalysissikCOR圖4是pBin438-sikC0RPCR鑒定Fig4:PCRidentificationofpBin438_sikC0R圖5是pBin438-sikC0R酶切鑒定Fig5=RestrictionenzymedigestionidentificationofpBin438-sikC0R6^轉(zhuǎn)itGV3101PCR'M定Fig6:PCRidentificationofpBin438-sikC0R-GV3101圖7是轉(zhuǎn)化煙草PCR檢測Fig7:PCRidentificationoftransformedtobacco圖8是轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR分析Fig8:RT-PCRanalysisontransgenictobacco圖9是sikCOR基因轉(zhuǎn)化煙草葉片相對電導(dǎo)率的測定Fig9=Relativeconductivityoftobaccoleaves圖10是不同溫度處理對煙草MDA含量的影響Fig.10=EffectoftemperaturetreatmentonthecontentofMDAintobacco圖11是植物表達(dá)載體是pBin438-sikC0R的構(gòu)建流程1中1,2=SikCOR；3陰性對照；M=Marker圖2中1陰性對照；2:pGM-sikC0R；M=Marker圖4中1陰性對照；2-5:pBin438-sikC0R；M=Marker圖5中1,2:pBin438-sikC0R；M=Marker圖6中1-4:pBin438-sikC0R-GV3101；5陰性對照；M=Marker圖7中1-10=SikCOR轉(zhuǎn)化煙草；11陰性對照；M=Marker圖8中1陰性對照；2，3=SikCOR轉(zhuǎn)化煙草；M=Marker具體實施例方式實驗所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為上海生工公司生產(chǎn)；LAPCRTMinvitroCloningKit購自TaKaRa公司；RNA酶、Taq酶、T4-DNA連接酶(T4-DNAligase)、Marker、TRNzol總RNA提取試劑購于TIANGEN公司；BamHI、SalI等限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司原裝；IPTG、X-gal及抗生素、植物激素購自上海Sangon公司；其他試劑及配制MS培養(yǎng)基的各種試劑均為國產(chǎn)分析純。具體實驗操作依據(jù)[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾的《分子克隆實驗指南》。實施例1天山雪蓮cDNA文庫單克隆質(zhì)粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫單克隆保存的甘油管于IOmlLB液體培養(yǎng)基(Cm50μg/ml)中，37°C220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。蘸取菌液于LB固體培養(yǎng)基(Cm50μg/ml)平板上劃線培養(yǎng)，37°C暗培養(yǎng)12-16hr。挑取單克隆于20mlLB液體培養(yǎng)基(Cm50μg/ml)中，37°C220rpm振蕩培養(yǎng)14hr，提取質(zhì)粒，具體方法如下1)將菌液分裝于1.5mlEp管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400mlSTE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；3)沉淀用150μL堿裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配制的300μL堿裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225μL堿裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min；離心(12000rpm，5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min；離心(10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入兩倍體積無水乙醇約為850μL，-20°C放置IOmin；離心(12000rpm,5min)；8)棄去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹干后溶于40μLTE(含RNaseA20μg/ml)溶液中，37°C溫育30min。實施例2從天山雪蓮中克隆到SikCOR基因以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質(zhì)粒為模板，用CPl其序列為<210>2和CP2其序列為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對照。CP1S=Uioa5'GGATCC\ACd[ATGATGAAGGGAGTAAAGAACTA3'BamHICP2為<210>35'GTCGACTCTAATAACACGAAATCTAAAATA3'SailPCR反應(yīng)體系(20μ1)為10XPCRBuffer2.0μ1dNTPs(各2.5mM)0.5μ1MgC12(25mM)Ι.ΟμΙ上游引物(25μΜ)0.5μ1下游引物(25μΜ)O.5μ1模板DNA(ddH20)0.5μ1TaqDNAPolymerase(2.5U/μ1)0.3μ1ddH2014.7μ1Total20.0μ1PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min；94°C變性30s，57°C復(fù)性30s，72°C延伸45s，30cycles；72°C延伸7min；4°C保溫。如圖1、2。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用上海生工的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為SikCOR0實施例3構(gòu)建SiikCOR基因植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體PBin438-sikC0R。用BamHI/Sall分別雙酶切植物表達(dá)載體pBin438，獲得載體片段?；厥漳康幕蚱魏洼d體片段。將目的基因片段與載體片段進(jìn)行體外連接，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pBin438-sikC0R。在本實施方案中，我們選用煙草作為轉(zhuǎn)基因植物材料，也可選用其它植物作為轉(zhuǎn)基因材料。如圖4、5。在本實施方案中，SikCOR基因和pBin438構(gòu)成一個植物表達(dá)載體，用于植物的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構(gòu)建所選用的植物表達(dá)載體除了pBin438之外，還可以選用其他植物表達(dá)載體。實施例4農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化4.1農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個單菌落于LB液體培養(yǎng)基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen(50ug/ml)中，于28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)48hr；2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至OD6tltl=0.5-0.8收集菌液，冰浴30min；3)分裝菌液于1.5ml離心管，于4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞；4)將沉淀的農(nóng)桿菌用750ul預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2重懸，4°C，8000rpm離心5min；5)棄上清用75ul0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細(xì)胞，保存于_70°C。4.2植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101(凍融法)1)吸取10μ1上述重組載體質(zhì)粒(約0.5μg/μ1)，與75μ1GV3101感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30min，然后液氮凍存5min；2)迅速置于37°C水浴2min；3)加入600μ1液體LB培養(yǎng)基(Rif+Gen)，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)5hr；4)將上述培養(yǎng)液于6000rpm離心5min，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，棄去500μ1液體培養(yǎng)基，剩余100μ1重懸細(xì)胞；5)將菌液涂布在含有Kan50μg/ml,Rif50μg/ml及Gen50μg/ml的固體LB培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)24-48hr。4.3陽性克隆篩選挑取若干單菌落，進(jìn)行菌落PCR，將篩選出的陽性克隆命名為pBin438-sikC0R-GV3101。在本實施方案中，植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過PCR檢測陽性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn)化植物。如圖6。實施例5煙草遺傳轉(zhuǎn)化及再生本發(fā)明中對于靶植物的轉(zhuǎn)化方法不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的各種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但不僅限于農(nóng)桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等均可。本方案中用于將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株的方法，可以使用適合于其他靶植物。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。5.1農(nóng)桿菌浸染液的制備1)從_70°C保存的含有PBin438-sikC0R-GV3101的GV3101農(nóng)桿菌甘油管中挑取菌塊，接種于5ml附加有Kan50μg/ml,Rif50μg/ml,Gen50μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，280C，200rpm振蕩培養(yǎng)約30hr；2)吸取200μ1菌液，再用20mlLB液體培養(yǎng)基(Kan50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen50μg/ml)稀釋，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)約4hr；3)活化的菌液培養(yǎng)至OD6tltl=0.4-0.6時，即為轉(zhuǎn)化用的浸染液。5.2浸染1)超凈工作臺上將浸染液倒入無菌培養(yǎng)皿中，將無菌煙草葉片剪成Icm2大小的方塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin；2)取出煙草葉片，用濾紙吸干凈葉盤上附著的菌液；3)在共培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.3mg/L)上覆一張無菌濾紙，將浸染過的葉盤均勻地擺放在濾紙上；在26°C暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2-3天。5.3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導(dǎo)將共培養(yǎng)過的煙草葉盤轉(zhuǎn)移至MS+6-BA2.Omg/L+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的煙草誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基上，葉盤傷口充分接觸培養(yǎng)基。每15-20天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接1-2次以后，葉盤邊緣逐漸產(chǎn)生淡綠色、致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)直至誘導(dǎo)出叢生芽。5.4轉(zhuǎn)化植株的生根培養(yǎng)和移栽待叢生芽長至2-3cm左右時，將其切下轉(zhuǎn)接到MS+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的煙草生根選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因煙草15天左右開始有根生成，待根系發(fā)達(dá)時，將根系生長良好的轉(zhuǎn)化植株，去除封口膜，室溫環(huán)境中進(jìn)行煉苗7天左右，然后用水洗凈培養(yǎng)基，將苗轉(zhuǎn)入基質(zhì)(蛭石腐質(zhì)土=21)中，26°C，16hr40μmol·πΓ2·s—1光照，70%相對濕度條件下培養(yǎng)，前2-3天需遮陰、避光、保濕。實施例6轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測6.1轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定6.1.1煙草DNA的提取(SDS法)1)取0.Ig新鮮葉片，用玻棒在1.5ml離心管內(nèi)充分研磨；2)加入400μ1提取緩沖液，充分混勻，12000rpm離心5min；3)小心吸取300μ1上清液，加入300μ1異丙醇，室溫沉淀20min,12000rpm離心lOmin，收集沉淀；4)將沉淀充分風(fēng)干，加400μ1TE溶解沉淀；5)加入400μ1氯仿/異戊醇(24/1)，充分混勻，靜置20min，12000rpm離心IOmin；6)小心吸取上清，加入40μ13ΜNaAC(ρΗ5.2),800μ1無水乙醇，_20°C沉淀過夜；7)4°C，12000rpm離心15min，棄上清；8)70%酒精洗滌兩次，吹干后用30μ1ddH20溶解。6.1.2轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定以提取的轉(zhuǎn)化基因的煙草DNA為模板，用CPl其序列為<210>2和CP2其序列為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對照，擴(kuò)增體系如實施例2。如圖7。6.2轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測6.2.1待檢測植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化的煙草總RNA1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均使用0.1%的DEPC處理，高壓滅菌；2)取植物幼嫩葉片約0.Ig于研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1.5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混勻，室溫放置3-5min。4)10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻；5)10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管后，加入600μ1預(yù)冷的異丙醇，于_20°C沉淀30min；6)IOOOOrpm,4°C離心IOmin后，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉淀，即為總RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30μ1ddH20(DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。6.2.2cDNA第一鏈的合成在DEPC處理的0.2ml離心管中加入RNA2μ1，dNTP(2.5mM)1μ1，OligodT1μl,ddH205μ1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在離心管中加入RnaseInhibitor0.5μ1，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μ1，42°Clhr,95°C5min后，冷卻至4°C。7.2.3cDNA第二鏈的合成及擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入cDNA第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物1μl，5XTaqbuffer4μ1，MgCl2(25mM)1.0μ1，dNTP(2.5mM)0.5μ1，上下游引物(25ymol)各0.5μ1，ddH20補足至20μ1，反應(yīng)條件同實施例2。如圖8。實施例7轉(zhuǎn)基因植株的模擬寒害處理及葉片質(zhì)膜透性測定轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。植株成活后選取生長一致的苗(5-7葉期)，進(jìn)行模擬寒害處理。分別用打孔器從葉片中打取小圓片測定葉片質(zhì)膜透性。如圖9所示。實施例8轉(zhuǎn)基因植株的模擬寒害處理葉片的MDA含量測定轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量可以表示脂質(zhì)過氧化的程度。煙草經(jīng)不同低溫溫度處理，MDA的含量均有所提高。從結(jié)果中分析得出，不管是0°C，_4°C低溫處理8hr，野生型煙草比轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量增加大，說明野生型植株膜質(zhì)的過氧化程度相對較高。原因可能在于轉(zhuǎn)基因煙草降低了脂質(zhì)過氧化的程度。如圖10所示。序列表<110>石河子大學(xué)<120>天山雪蓮SikCOR基因在培育抗寒植物中的應(yīng)用<160>3<210>1<211>661<212>DNA<213>天山雪蓮(Saurrea.involucrataKar.etKir.)<220><221>5，UTP<222>(1)...(9)<220><221>CDS<222>(10)...(636)<220><221>3，UTP<222>(636)...(661)<400>1TranslationofDNAMAN2(10-661)UniversalcodeTotalaminoacidnumber:209，MW=23906MaxORFstartsatAApos4(maybeDNApos10)for209AA(627bases),Mff=233531ggatccaccatgatgaagggagtaaagaactacctgaggatgccgactgatccaactata1METMETLysGlyValLysAsnTyrLeuArgMETProHirAspProHirlie70809010011012061teagaagcateatccaagttaateaatteagatttgaaagacattggagatgccaccaag21SerGluAlaSerSerLysLeulieAsnSerAspLeuLysAsplieGlyAspAlaThrLys13014D150160170180121aaactcgetaatcatgtcateaagctcggggtcageggtggtttgattactaccgtcctt41LysLeuAlaAsnHisVallieLysLeuGlyValSerGlyGlyLeulieHirIhrValLeu190200210220230240181caatggttcgcctgcggtgccgccgtttatttgctgatactagatcgaacaaactggagg61GlnTrpPheAlaCysGlyAlaAlaValTyrLeuLeulieLeuAspArgThrAsnTrpArg250260270280290300241acaaacatgcttactteactcttggtcccttacatettcttgacttttcctaattggctc81ThrAsnMETLeuThrSerLeuLeuValProTyrliePheLeuThrPheRroAsnTrpLeu310320330340350360301ttcggaattttgagaggagacategggaaatggattaccgtcgtcggagtcatattgcgt101PheGlylieLeuArgGlyAsplieGlyLysTrplieIhrValValGlyVallieLeuArg3703803904D0410420361ctcttcttccataagcactttceagattatttggagttacctggagetgtgctccttctg121LeuPhePheHisLysHisPheRroAspTyrLeuGluLeuRroGlyAlaValLeuLeuLeu430440450460470480421gtagtggtagccccgagettcttggetgggtatgtacgattagggtggataggtgtgatt141ValValValAlaProSerPheLeuAlaGlyTyrValArgLeuGlyTrplieGlyVallie490500510520530540481atetgtctagttateggatgctaccttctccaagaacacateagagettctggaggtttc161lieCysLeuVallieGlyCysTyrLeuLeuGlnGluHislieArgAlaSerGlyGlyPhe550560570580590600541aggaatgcattcacgaagageaacggcatttccaacacgateggtategtcctcttgttc181ArgAsnAlaPheThrLysSerAsnGlylieSerAsnThrlieGlylieValLeuLeuPhe610620630640650660601ttccccgtctgggetttgateggcttaatattttagatttcgtgttattagagtcgac201ValPheProValTrpAlaLeulieGlyLeuliePhe***<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>2gtcgactctaataacacgaaatctaaaata<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>3ggatccaccatgatgaagggagtaaagaacta權(quán)利要求一種從天山雪蓮中克隆冷調(diào)節(jié)蛋白基因sikCOR，其特征在于該基因編碼區(qū)全長630bp，其序列為<210>1，編碼209個氨基酸。利用DNAMAN軟件對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中含有一段65個氨基酸的信號肽以及4個跨膜區(qū)。2.一種利用上述基因sikCOR構(gòu)建的植物表達(dá)載體。3.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的sikCOR基因的用途，其特征在于利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植物。全文摘要本發(fā)明涉及一種天山雪蓮sikCOR基因在培育抗寒植物中的應(yīng)用，本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikCOR基因，利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikCOR基因，并在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達(dá)，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲得抗低溫能力明顯增強的植物。從天山雪蓮中篩選、克隆出與抗寒直接相關(guān)的基因，揭示雪蓮低溫適應(yīng)性的機(jī)制，將其用于農(nóng)作物品種改良，具有巨大的學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)價值。文檔編號C12N15/84GK101818156SQ20091011359公開日2010年9月1日申請日期2009年12月22日優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日發(fā)明者劉紅玲,張煜星,沈海濤,王愛英,祝建波申請人:石河子大學(xué)