專利名稱：益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性、定量測定方法
益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性、定量測定方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有益生菌的乳制品技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一
種在益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌Uflcto6ac/〃ws rew&n')的快速定性、 定量測定方法。背景技術(shù)：
益生乳制品因其豐富的營養(yǎng)價值和特殊的益生功效成為人們關(guān)注的 熱點。目前市場上益生菌及含有益生菌的乳制品種類繁多，并且每年以高 速度增長。對其質(zhì)量的監(jiān)管和認證，尤其在定性、定量檢測方面缺乏科學(xué)、 合理、快速的方法。傳統(tǒng)方法中對益生菌的定性、定量檢測，仍采用生理 生化反應(yīng)和選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)分離計數(shù)的方法。傳統(tǒng)方法易受培養(yǎng)條 件、菌種特性等因素影響，檢測效率有限，而且受外界環(huán)境因素和培養(yǎng)基 性能的影響大，檢測結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且耗時耗力。PCR技術(shù)一 經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域。實時焚光定量PCR (Real-time PCR)的出現(xiàn)更是實現(xiàn)了 PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，避免 了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交叉污染的問題。具有特異性強、重復(fù)性好、準 確、快速等優(yōu)點，成為了分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域定量檢測的重要方法。 采用乳桿菌種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)，建立簡便、快速、 準確的益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的定性、定量測定方法，可以簡化益 生菌的檢測程序、提高檢測效率，能提高我國益生菌的檢測能力，完善保 健食品的質(zhì)量監(jiān)管，并為益生菌產(chǎn)業(yè)的長遠發(fā)展提供技術(shù)保障。
本發(fā)明針對益生菌乳制品中含有的羅伊氏乳桿菌，依據(jù)參考文獻自行 設(shè)計羅伊氏乳桿菌的16SrRNA基因序列的種屬特異性引物，應(yīng)用此引物 進行種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳圖 譜分析和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立益生菌乳制品中羅伊氏乳桿 菌的筒〗更、快速、準確的定性和定量測定方法。
發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性 方法。
本發(fā)明的另 一個目的是提供一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快 速定量方法。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明涉及一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性測定方法。
該方法的步驟如下
A、模板DNA的制備
(1 )取益生菌發(fā)酵乳樣品于2.0mL離心管中，加入500|iL TE緩沖 液，混合均勻，再置于液氮中進行凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65。C水浴中進行 i!蟲4匕4-6min, :^jt匕Hii《亍凍il蟲3-5 ^欠；
(2)凍融結(jié)束后，往其中加入60.0^iL10。/q (質(zhì)量體積比)的SDS和 10.0pL 10mg/mL蛋白酶K,在搖床中在溫度37。C下以200r/min進行搖動 4h;
(3 )加入100.0|iL 5M NaCl和lOO[iL CTAB/NaCl溶液(將4.1gNaCl 溶于80ml水中，再緩慢加入10gCTAB得到的溶液)，65。C水浴10min。
(4) 然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異 戊醇混合物，它們的體積比分別是25: 24: 1，混勻，再以10000g/min離 心1 Omin,該溶液分成上層水相、中間固相與下層有才幾相；
(5) 吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯氯仿和異戊醇 混合物抽提一次，分離上清液；
(6 )往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積 的冰異丙醇，混合均勻靜置30min，以10000g/min離心5min得到總DNA 沉淀；
(7)所述沉淀用70體積比％乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然 干燥，得到才莫板DNA;然后加入50.(HiL無菌超純水回溶，在溫度-20。C下 保存?zhèn)溆?。B、 PCR擴增
反應(yīng)體系25.0|iL: 2.5jiL 10xPCRBuffer、 l.OpL 25mmol/L Mg2+、 2^L 2.5mmol/L dNTPs、 2.5pL 5mmol/L上下游引物、1 .OpL 50ng/pL DNA模板， 0.25 uL 5U/(iL Taq酶，二次蒸餾水補足至25.0 pL;
PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3min; 95。C變性40S, 56。C退火30S, 72°C 延伸lmin,循環(huán)40次；72 。C延伸8min,得到PCR擴增產(chǎn)物，在溫度4。C 下保存；
取3.0|iL PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進行檢測；
C、 結(jié)果及判斷
檢測時設(shè)以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒DNA作為4莫4反為陽性對照，以 滅菌水作為模板為陰性對照；根據(jù)在740bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該 益生菌乳制品中含有羅伊氏乳桿菌，相反地則不含有羅伊氏乳桿菌。 在本發(fā)明中，所述的上下游引物分別是 上游引物REf為5 ， -GATTGACGATGGATCACCAG-3 ，； 下游引物REr為5' -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3',擴增片斷長 度為740bp。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的檢測是在5V/cm的電壓下進 行電泳20-30min,再用EB染色，然后進行紫外照相。
本發(fā)明還涉及一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定量測定方 法。該方法的步驟如下
A、 樣品總RNA的制備
采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品總RNA，發(fā)酵樣品500mg在盛有液氮 的研缽中研磨后，迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑盒說明書提取 樣品RNA。然后用DNaseI處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染， 得到純化的RNA樣品，使用微量紫外分光光度儀測定濃度，采用1%瓊 脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，然后將樣本保存于-8(TC;
B、 反轉(zhuǎn)錄擴增
反應(yīng)體系lO.OjiL: 2.0jiL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、 0.5pL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5jiiL Random 6 mers(100 jiM)、總RNA ( <500 ng), RNase Free dH20補足至10.0
反轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)條件37匸反應(yīng)15min; 85。C變性5S，在溫度-20。C下 保存；
C、 實時熒光定量PCR
反應(yīng)體系25.0 12.5pL 2xSYBR Premix Ex TaqTM,各0.5jnL
1Ojamol/L上、下游引物RE飾REr， 2.0pLcDNA模板，9.5nLH20;
熒光定量PCR^應(yīng)參數(shù)95。C變性25S; 95。C變性10S， 58。C退火22S， 40個循環(huán)；在溫度4。C保存；每個樣品重復(fù)3次；
D、 外標準品的制備和標準曲線的繪制
外標準品的制備提取含有以羅伊氏乳桿菌ZL12-1-1目的擴增片斷的 質(zhì)粒pRET的DNA,紫外分光光度計測定A值后，計算出拷貝數(shù)，進行IO 倍系列稀釋，梯度稀釋至10M0"拷貝數(shù)/!iL的濃度，以此作為外標準品進 行熒光定量PCIL良應(yīng)；
標準曲線的繪制以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標，以PCR 反應(yīng)過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標得到羅伊氏乳桿菌的 標準曲線，作為待測樣品定量測定的參照標準；
E、 結(jié)果及判斷
以待測樣品cDNA和標準品的DNA為模板，用羅伊氏乳桿菌的種特異 性引物，以相同的體系同時進行羅伊氏乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒 光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行益生菌乳制品中羅 伊氏乳桿菌的快速定量檢測。
在本發(fā)明中，所述羅伊氏乳桿菌種屬特異性《1物序列如下
上游引物REf為5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3';
下游引物REr為5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3，，擴增片斷長 度為740bp。
下面將詳細地說明本發(fā)明。
本發(fā)明涉及一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性測定方法。 采用液氮凍融-CTAB法抽提樣品中益生菌總DNA和純培養(yǎng)乳酸菌的 總DNA。所述的液氮凍融-CTAB法是一種本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的
8方法，主要是利用CTAB緩沖液提取生物DNA的方法。
該方法的步驟如下
A、模板DNA的制備 (1 )取益生菌發(fā)酵乳樣品于2.0mL離心管中，加入500|aL TE緩沖 液，混合均勻，再置于液氮中進行凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65。C水浴中進行 融化4-6min,如ot匕反復(fù)進^f亍凍融3-5次。
所述的TE提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螫合Mg^或 Mn"離子，抑制DNase活性；
(2)凍融結(jié)束后，往其中加入60.0jiL質(zhì)量體積比為10%的SDS和 IO.OjiL 10mg/mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37。C下以200r/min進行搖動 4h;
所述的SDS是十二烷基硫酸鈉，它是日本關(guān)東化學(xué)株式會社以商品 名SDS銷售的產(chǎn)品。
所述的蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨 基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的降解。這種 酶經(jīng)純化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中 穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛。本發(fā)明使用的 蛋白酶K是AMRESCO公司以商品名Proteinase K銷售的產(chǎn)品。
所述的搖床是上海智城分析儀器制造有限公司以商品名ZHWY-200D 恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
(3 )加入lOO.O]iL 5M NaCl和100|iL 10°/。CTAB溶液(將4.1gNaCl 溶于80ml水中，再緩慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴10min。
所述的NaCl提供一個鹽環(huán)境，使DNA充分溶解而存在于液相中。
所述的CTAB為十六烷基三曱基溴化銨，是一種陽離子去污劑，具有 從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋 白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強度的溶液里，CTAB與蛋白 質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。最 后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。
(4)然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，它們的體積比分別是25:24:1 ，混勻，再以10000g/min離心 10min，該溶液分成上層水相、中間固相與下層有4幾相。
(5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯酚、氯仿和異 戊醇混合物抽提一次，分離上清液。
(6 )往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積 的水異丙醇，混合均勻，再靜置30min,以10000g/min離心5min,得到 總DNA沉淀；
(7 )所述沉淀用70體積％乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干 燥，得到模板DNA;然后加入50pL無菌超純水回溶，在溫度-20。C下保 存?zhèn)溆谩?br> B、 PCR擴增
PCR擴增是一種體外高效復(fù)制DNA的技術(shù)，該技術(shù)幾乎貫穿于現(xiàn)在 分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。PCR體系由模板、特異性引物、高溫聚合酶、脫 氧核糖核酸幾部分組成。PCR擴增過程可以分模板高溫變性、引物與模板 低溫退火、引物在高溫聚合酶的作用下延伸。
該反應(yīng)體系25.0pL: 2.5pL 10xPCRBuffer、 l.OpiL 25mmol/L Mg2+、 2jnL 2.5mmol/L dNTPs、 2.5|iL 5mmol/L上下游引物、1 .OpL 50ng/|uLDNA模板， 0.25 uL 5U/|iL Taq酶，二次蒸餾水補足至25.0 pL。 在本發(fā)明中，所述的上下游引物分別是 上游引物REf為5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3，； 下游引物REr為5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3'，擴增片斷長 度為740bp。
PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3min; 95。C變性40S， 56。C退火30S, 72°C 延伸lmin，循環(huán)40次；72 。C延伸8min，得到PCR擴增產(chǎn)物，在溫度4°C 下保存；
取3.0pLPCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。瓊脂糖凝膠電泳圖 譜分析是使用UVP^^司以商品名CDS-8000凝膠成像儀銷售的儀器進行 的。
C、 結(jié)杲及判斷檢測時設(shè)以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒DNA作為陽性對照模板，以滅 菌水作為陰性對照模板；根據(jù)在740bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該益生 菌乳制品中含有羅伊氏乳桿菌，相反地則不含有羅伊氏乳桿菌。具體可參 見附圖1。
本發(fā)明還涉及一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定量測定方 法。該方法的步驟如下 A、樣品總RNA的制備
采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品總RNA，發(fā)酵樣品500mg在盛有液氮的 研缽中研磨后，迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑說明書提耳又樣品 RNA。然后用DNaseI處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到 純化的RNA樣品，測定濃度，在溫度-80。C下保存；
所述的Trizol試劑是由Invitrogen公司專供提取RNA的產(chǎn)品；DNase I 是TaKaRa公司產(chǎn)品；此過程中使用的氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑是天 津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)的產(chǎn)品。
RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，用DEPC-dH20溶解的 RNA樣品可以直接用NanoDr叩-1 OOO微量紫外分光光度計測在260nm波長 處的RNA濃度和純度，DEPC-H20為空白對照，RNA濃度可以直接讀數(shù)， RNA純度通過OD26(V28。來檢測。若比值在1.9-2.1間，認為純度較好，比值 小于1.8說明有雜蛋白質(zhì)較多；比值大于2.2,則表明RNA已經(jīng)降解。
RNA完整性通過1 %瓊脂糖凝膠電泳^r測。
B、 反轉(zhuǎn)錄擴增
反應(yīng)體系10.0pL: 2.0piL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、 0.5jaL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5pL Random 6 mers(100 nM)、總眺 (<500ng)， RNaseFreedH2O補足至10.0nL;
反轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)條件37。C反應(yīng)15min; 85。C變性5S,在溫度-20。C下 保存；
C、 實時熒光定量PCR
反應(yīng)體系25.0)LiL: 12.5)iL 2><SYBR Premix Ex TaqTM ，各0.5)iL
10nmol/L上、下游引物REff口REr, 2.0pLcDNA模板，9.5nLdH20;熒光定量PCR^應(yīng)參數(shù)95。C變性25S; 95。C變性10S, 58。C退火22S, 40個循環(huán)；在溫度4。C保存；每個樣品重復(fù)3次；
D、 外標準品的制備和標準曲線的繪制
夕卜標準品的制備提耳又含有以羅伊氏乳桿菌丄Wo&c/〃w ZL12-1-1目的擴增片斷的質(zhì)粒DNA，紫外分光光度計測定A值后，計算出 拷貝數(shù)，進行10倍系列稀釋，梯度稀釋至10、l()S拷貝數(shù)/uL的濃度，以此 作為外標準品進行熒光定量PCR反應(yīng)；
標準曲線的繪制將外標準品進行10倍系列稀釋，使其成為具一定梯 度拷貝數(shù)含量的模板，以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標，以PCR 反應(yīng)過程中到達焚光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標得到羅伊氏乳桿菌的 標準曲線(參見附圖2),作為待測樣品定量測定提供參照標準；
E、 結(jié)果及判斷
以待測樣品的cDNA和標準品的DNA為模板，用羅伊氏乳桿菌的種特 異性引物，以相同的體系同時進行羅伊氏乳桿菌的16S rRNA的基因片段的 熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行益生菌乳制品中 羅伊氏乳桿菌的快速定量檢測。
實時熒光定量PCR圖譜分析是使用Bio-Red公司以商品名iQTM5銷售的 儀器進行的。
在本發(fā)明中，所述羅伊氏乳桿菌種屬特異性引物序列如下 上游引物REf為5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3'; 下游引物REr為5' -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3'，擴增片斷長 度為740bp。
本發(fā)明益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌快速定量測定方法的誤差分析 如下
與傳統(tǒng)的PCR相比，定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少實驗 過程中產(chǎn)生的交叉污染。由于定量PCR具有特異性強、4s丈感性高、精確性 好的優(yōu)點，所以其操作每一過程都可能造成定量PCR實驗結(jié)果的可靠性 差。如樣本采集和存儲、提取RNA、定量PCR檢測過程的加樣等，所以 應(yīng)用定量PCR技術(shù)時，務(wù)必做到實驗的標準化、合理化、細致化和有效化，使定量PCR技術(shù)更好地為我們服務(wù)。
標準品的制備是建立實時熒光定量PCR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常用的標準品有 三種構(gòu)建方法:一是按照擴增片段序列人工合成一段寡核苷酸；二是回收純 化含有熒光定量PCR擴增片段的常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物；三是將含有熒光定量 PCR擴增片段克隆到質(zhì)粒中回收質(zhì)粒。本發(fā)明選擇第三種方法，構(gòu)建了含 有目的條帶的重組質(zhì)粒作為標準品，以此為標準品制作標準曲線對未知樣 品的絕對量(拷貝數(shù))進行測定。 [有益效果]
本發(fā)明的有益效果是
可以在不進行益生菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡便、快速、準確地定性、定 量檢測益生菌乳制品中的羅伊氏乳桿菌，整個過程對益生菌乳制品中羅伊 氏乳桿菌的檢測程序簡單、檢測效率高、準確性好。

經(jīng)羅伊氏乳桿菌的種屬特異性引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗 結(jié)果見圖1。泳道1以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒pRET作為陽性對照，泳 道2以滅菌水作為陰性對照。 一般認為陽性特征在740 bp處出現(xiàn)預(yù)期擴增 條帶，說明此樣本中含有羅伊氏乳桿菌；陰性對照無特征條帶。泳道3-4 為從西藏采的自然發(fā)酵乳25#和36#樣本，結(jié)杲為陰性說明這2份乳制品 中不含丄.ww&n'。泳道5 7為Z. ^M/en'外的其他種乳酸菌，結(jié)果為陰性， 說明引物特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。
圖2、實時熒光定量檢測羅伊氏乳桿菌的標準曲線。Ct值表示每個反 應(yīng)管的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，每個模板 的Ct和該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例1
益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性檢測 該實施例使用含有目的擴增片斷的質(zhì)粒pRET作為陽性對照；dH20 作陰性對照；另外使用Z^"ok "'〃附ZL12-1-1 、從西藏采的傳統(tǒng)發(fā)
13酵乳酸奶樣25#、 /人西藏采的自然發(fā)酵乳酸奶樣36#、丄.ATCC393、 丄.r/zamwosus 1.2134、丄.ac/tfop/zz7ws ATCC 4356和丄.p/awtorMm 1.2437 4乍為 樣品進行。
所述的r/wm"osus 1.2134、丄./7/a"tonw 1.2437購自中國普通孩i生物 菌種4呆藏中心；丄.acftfopW/ws ATCC 4356、丄.case/ ATCC393購自美國 American Type Culture Collection;丄. wteW ZL12-1-1為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) "乳品生物技術(shù)與工程，，教育部重點實驗室從酸奶中分離得到，保藏號為 IMAU10037。
a.模板DNA的制備
采用液氮凍融-CTAB法抽提樣品DNA，具體步驟如下
(1) 取0.5g益生菌發(fā)酵乳樣品或MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸菌(包括 L ^wten' ZL12-1-1 )于2.0mL離心管中，加入500|iLTE緩沖液，混合均 勻，再置于液氮中進行凍結(jié)，，凍結(jié)后取出放入65。C水浴中進行融化5min， 如此反復(fù)進行凍融4次；
(2) 凍融結(jié)束后，往其中加入60.0pL100/()(質(zhì)量體積比)的SDS和 lO.O]iL 10mg/mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37。C下以200r/min進行搖動 4h;
(3 )加入lOO.O]iL 5M NaCl和100|iiL CTAB/NaCl (將4.1gNaCl溶于 80ml水中，再緩慢加入10gCTAB得到的溶液)，65。C水浴lOmin。
(4) 然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異 戊醇混合物，它們的體積比分別是25:4:1，混勻，再以10000g/min離心 10min，該溶液分成上層水相、中間固相與下層有才幾相；
(5) 吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯氯仿和異戊醇 混合物抽提一次，分離上清液；
(6 )往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積 的水異丙醇，混合均勻靜置30min,以10000g離心5min得到總DNA沉 淀；
(7)所述沉淀用70體積°/。乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干 燥，得到模板DNA;然后加入50.0pL無菌超純水回溶，在溫度-20。C下保存?zhèn)洹?br> b. PCIU全測
反應(yīng)體系25.0|iL: 2.5pL 10xPCR Buffer (含Mg2+)， 2jliL 2.5mmol/L dNTPs，共2.5pL 5mmol/L上下游引物(REf和REr )， l.OpL 50ng L DNA 模板，0.25piL 5U/(iL Taq酶(TakaRa)，用二次蒸餾水補足至25.0pL。將PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20-30min, EB染色，紫 夕卜才白照。
c. 將Z"cto6ac/〃附wwfe,/ ZL12-1-1的PCR產(chǎn)物與pMD18連4妾轉(zhuǎn)化 DH5oc，獲得陽性克隆子pRET。
d. 結(jié)果及判斷
經(jīng)羅伊氏乳桿菌的種屬特異性引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗結(jié) 果見圖l。泳道l以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒pRET作為陽性對照，泳道2以 滅菌水作為陰性對照。 一般認為陽性特征在740 bp處出現(xiàn)預(yù)期擴增條帶， 說明此樣本中含有羅伊氏乳桿菌；陰性對照無特征條帶。泳道3-4為從西 藏采的自然發(fā)酵乳25#和36#樣本，結(jié)果為陰性說明這2份乳制品中不含 Z^ewten'。泳道5 7為丄.wwten'外的其他種乳酸菌，結(jié)果為陰性，說明引物 特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。
實施例2.
益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的定量測定
對實施例l中提到的不同樣品進行了羅伊氏乳桿菌的定量測定。其測 定步驟如下
a. 樣品總RNA的制備
采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品500mg在盛有液氮的研缽中研磨后，迅 速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑盒說明書提取樣品RNA，然后用 DNaseI處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣 品，按照本申請說明書說明的方法進行濃度測定，RNA完整性通過l。/。瓊 脂糖凝膠電泳檢測。
b. 反轉(zhuǎn)錄擴增
反應(yīng)體系lO.OpL: 2.0pL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、0.5pL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5pL Random 6 mers(100 /iM)、總腿 (<500 ng),認ase Free dH2O補足至10.0pL;
反轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)條件37。C反應(yīng)15min; 85。C變性5S，在溫度-20。C下 保存；
c. 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR按照SYBR PrimeScriptTMRT-PCRKit(大連寶生物工程 有限公司，TaKaRa DRR063A)說明書進行。反應(yīng)體系25.0)iL: 12.5pL SYBR Premix Ex Taq ( 2x )、各0.5jiL 10jimol/L上、下游引物(RE纖口 REr)、 2.0nLcDNA模板、9.5(^L二次蒸餾水。熒光定量PCRX應(yīng)參數(shù)95°C 變性25S; 95。C變性5S, 58。C退火22S， 40個循環(huán)；在溫度4。C保存。
d. 外標準品的制備和標準曲線的繪制
提取以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒pRET總DNA，紫外分光光度計測 定A值后，計算出拷貝數(shù)，做10倍系列稀釋，梯度稀釋至109-102拷貝數(shù) /uL的濃度，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應(yīng)。以不同拷貝數(shù)的 陽性模板的對數(shù)為橫坐標，以PCR反應(yīng)過程中到達熒光閾值的初始循環(huán) 數(shù)(Ct)為縱坐標得到羅伊氏乳桿菌的標準曲線，見附圖2。
e. 結(jié)果及判斷
由圖2可見，Ct值和拷貝數(shù)呈較好的線性關(guān)系，以模板初始拷貝數(shù) 的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制出的焚光定量PCR標準曲線方 程:Y^3.583X+43 (Y代表Ct值，x代表模板初始拷貝數(shù)的對數(shù))，模板初 始拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值之間線性相關(guān)系數(shù)為0.993,斜率為-3.583,所建 立的標準曲線符合Real-Time PCR定量的要求。
以待測樣品的cDNA和標準品DNA為模板，用實施例1描述的羅伊 氏乳桿菌的種特異性引物，以相同的體系同時進行羅伊氏乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒光定量PCR擴增。通過標準曲線和采用Bio-Red公 司的iQTM5多重實時熒光定量PCR儀的計算機軟件分析進行益生菌乳制 品中羅伊氏乳桿菌的快速定量檢測。這些樣品的測定結(jié)果與分析誤差結(jié)果 一并列于下表l中。
16表l丄.rew&n'發(fā)酵乳樣品的Real-time測定結(jié)果樣本單菌發(fā)酵又+SD拷貝數(shù)/g發(fā)酵乳丄.rew/er/ ZL12隱1-17.5±0.9由表1的結(jié)果清楚地表明，定量PCR能準確定量發(fā)酵乳中活性羅伊 氏乳桿菌。序列表
<110>內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性、定量測定方法
<130>
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>對人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計和使用的上游引物REf。
<400> 1
GATTGACGAT GGATCACCAG 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>對人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計和使用的下游引物REr。
<400> 2
ACTACCAGGG TATCTAATCC 20
權(quán)利要求
1.一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性測定方法，其特征在于該方法的步驟如下A、模板DNA的制備(1)取益生菌發(fā)酵乳樣品于2.0mL離心管中，加入500.0μL TE緩沖液，混合均勻，再置于液氮中進行完全凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65℃水浴中進行融化4-6min，如此反復(fù)進行凍融3-5次；(2)凍融結(jié)束后，往其中加入60.0μL 10％(質(zhì)量體積比)SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37℃下以200r/min進行搖動4h；(3)加入100.0μL 5M NaCl和100.0μL 10％CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min；(4)加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，它們的體積比分別是25∶24∶1，混勻，再以10000g/min離心10min，該溶液分成上層水相、中間固相與下層有機相；(5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯酚、氯仿和異戊醇混合物抽提一次，分離上清液；(6)往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積的冰異丙醇，混合均勻，再靜置30min，以10000g/min離心5min，得到總DNA沉淀；(7)所述沉淀用70％(體積比)乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL無菌超純水回溶，在溫度-20℃下保存?zhèn)溆茫籅、PCR擴增反應(yīng)體系25.0μL2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg2+、2.0μL2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板，0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸餾水補足至25.0μL；PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3min；95℃變性40S，56℃退火30S，72℃延伸1min，循環(huán)40次；72℃延伸8min，得到PCR擴增產(chǎn)物，在溫度4℃下保存；取3.0μL PCR產(chǎn)物使用1％瓊脂糖凝膠進行檢測；C、結(jié)果及判斷檢測時設(shè)以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒DNA作為模板為陽性對照，以滅菌水作為模板為陰性對照；根據(jù)在740bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該益生菌乳制品中含有羅伊氏乳桿菌，相反地則不含有羅伊氏乳桿菌。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的上下游引物分別疋上游引物REf為5 ， -GATTGACGATGGATCACCAG-3 ，；下游引物REr為5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3'，擴增片斷長度為740bp。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于含有目的擴增片斷的質(zhì)粒DNA是通過將L rewfen'ZL12-l-l的PCR產(chǎn)物與pMD18連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a獲得的陽性克隆子。
4、 一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定量測定方法，其特征在于該方法的步驟如下A、 樣品總RNA的制備采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品總RNA:發(fā)酵樣品500mg在盛有液氮的研缽中研磨后，迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑盒說明書提取樣品RNA，然后用DNaseI處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣品，使用微量紫外分光光度儀測定濃度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，然后將樣本保存于-8(TC;B、 反轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)體系10.0pL: 2.0|iL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、0.5jaL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5jaL Random 6 mers(100 pM)、 TotalRNA ( <500 ng), RNase Free dH20補足至10.0 pL;反轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)條件37。C反應(yīng)15min; 85。C變性5S,在溫度-20。C下保存；C、 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系25.0 nL: 12.5jiL 2xSYBR Premix Ex TaqTM,各0.5pL1Opmol/L上、下游引物RE飾REr， 2.0jiLcDNA模板，9.5pLdH20;熒光定量PCIL良應(yīng)參數(shù)95。C變性25S; 95。C變性10S, 58。C退火22S，40個循環(huán)；每個樣品重復(fù)3次；在溫度4。C保存；D、 外標準品的制備和標準曲線的^^制外標準品的制備提取含有以羅伊氏乳桿菌ZL12-1-1目的擴增片斷的質(zhì)粒pRET的DNA，紫外分光光度計測定A值后，計算出拷貝數(shù)，進行10倍系列稀釋，梯度稀釋至109-102拷貝數(shù)/1^的濃度，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應(yīng)；標準曲線的繪制以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標，以PCR反應(yīng)過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標得到羅伊氏乳桿菌的標準曲線，作為待測樣品定量測定的參照標準；E、 結(jié)果及判斷以待測樣品cDNA和標準品的DNA為模板，用羅伊氏乳桿菌的種特異性引物，以相同的體系同時進行羅伊氏乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值求出益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的起始模板量。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述羅伊氏乳桿菌種屬特異性引物序列如下上游引物REf為5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3';下游引物REr為5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3',擴增片斷長度為740bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性、定量測定方法。該方法針對益生菌乳制品中含有的羅伊氏乳桿菌，自行設(shè)計羅伊氏乳桿菌的16S rRNA基因序列的種屬特異性引物，應(yīng)用此引物進行種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的簡便、快速、準確的定性和定量測定方法。
文檔編號C12Q1/68GK101649353SQ20091017790
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者包秋華, 張和平, 張家超 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)