專利名稱：人牙髓干細胞庫的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物組織材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人牙髓干細胞的制備及其細胞庫的
構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
由于各種原因?qū)е碌难荔w缺損和牙齒缺失已成為危害口腔乃至人體健康的主要疾病，其發(fā)病率逐年增加。目前主要是借助于各種牙科材料充填來應(yīng)對牙齒缺損疾病，雖然在一定程度上能阻止病變的繼續(xù)發(fā)展，但卻不能解決根本問題。對于牙齒缺失盡管解決途徑很多，但最有效和最根本的辦法還是牙齒生物性再生。 隨著組織再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，為牙體缺損和牙齒缺失的有效治療帶來了希望。目前已有許多研究利用牙源性上皮和牙源性間充質(zhì)的相互作用再生出了牙齒組織。常用的牙源性間充質(zhì)包括牙乳頭細胞和牙髓組織細胞。由于牙乳頭細胞在臨床上難以獲得，因此，目前用于牙體及牙齒再生的種子細胞首選是牙髓組織來源的細胞，其中最重要的是牙髓干細胞。 2000年首次發(fā)現(xiàn)了牙髓干細胞(S.Gronthos， M.Mankani， J. Brahim， P， et al，Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro andin vivo，Proc Natl AcadSci U S A. 2000 December 5 ;97(25) :13625-13630.)。這是一類具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力等于細胞特性的細胞。已有研究利用該細胞成功地構(gòu)建了牙髓、牙本質(zhì)以及牙齒組織。因此，牙髓干細胞是構(gòu)建牙體及牙齒組織的理想種子細胞。
干細胞庫是在深低溫中儲存干細胞以及搜集存儲干細胞資源相關(guān)資料的場所。完善的干細胞庫應(yīng)具備隨時隨地將健康的干細胞提供于臨床使用的能力。目前已成功建立有一些干細胞庫(如臍帶血干細胞庫)，而至今仍無人牙髓干細胞庫。 從乳恒牙替換至阻生牙、多生牙及正畸牙齒，大量的牙齒被廢棄，其中的牙髓干細胞資源白白流失。因此，制備牙髓干細胞，建立人牙髓干細胞庫，為自體及他人提供牙體治療及牙齒再生的種子細胞具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人牙髓干細胞庫的構(gòu)建方法，并提出一種充分利用乳牙、阻生牙、多生牙及正畸牙為來源的人牙髓干細胞的制備方法；為人牙髓干細胞庫的構(gòu)建和人牙髓干細胞的制備提供容易掌握、安全可行、成本低廉的操作規(guī)范。 本發(fā)明所提出的人牙髓干細胞庫的構(gòu)建方法，有基本信息采集、牙髓干細胞獲取、牙髓干細胞的凍存、入庫以及信息記錄與核對的步驟；具體包括 步驟一、采集基本信息如檢索編碼，供體姓名、年齡、身份證號碼、出生日期、種族、通訊地址、聯(lián)系方式、常規(guī)檢查結(jié)果以及后續(xù)步驟的相關(guān)信息；所述的常規(guī)檢查包括供體血液的AB0/Rh血型檢測、HLA分型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等，還可以包括供體三代以內(nèi)上述項目的檢測；
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步驟二、獲取牙髓干細胞(1)將供體新鮮牙齒組織采用含V/V為5% 20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液完成轉(zhuǎn)移，在無菌條件下用PBS液沖洗清除牙周組織，用破碎機破碎牙齒，挑選牙髓組織用PBS液沖洗；(2)在1000 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3 10分鐘，去除上清液，加入5 10倍體積的消化液后，用吸管吹散均勻，置入37t:孵箱中透氣孵育10 60分鐘，所述的消化液為3 9U/ml膠原酶溶液與相同體積的0. 2 5U/ml分散酶溶液的混合；(3)孵育完成后，在懸液中加入所述含新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹散組織細胞懸液阻止繼續(xù)消化，在800 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3 10分鐘，棄上清后，加入5 10倍體積的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)；(4)培養(yǎng)7 9天后用3 9U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫落后重新接種培養(yǎng)；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙髓干細胞；再用干細胞標(biāo)志物(如STR0-1和CD146)對所得到的細胞進行鑒定，然后采用細胞工廠進行擴增培養(yǎng)； 所述的完全培養(yǎng)基是在a -MEM培養(yǎng)液中按體積比加有10 30%的胎牛血清，終濃度為400 600ng/ml的Noggin和終濃度為20 60ng/ml的成纖維細胞生長因子；另外，細胞條件培養(yǎng)基是牙髓干細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 4天后，收集其培養(yǎng)液去除雜質(zhì)后的液體。 步驟三、牙髓干細胞凍存、入庫將所獲得的牙髓干細胞按1 X 107 8 X 107個/ml的密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，將凍存管在0 4t:條件下，以0. 5 2°C /分鐘的速度冷凍至-80 -120°C ;再將凍存管轉(zhuǎn)移至-196t:液氮中貯存入庫；貯存入庫可以按ABO/Rh和HLA分型進行分類保存； 所述的凍存液包括以下四種①完全培養(yǎng)基中含10%體積的甘油；②完全培養(yǎng)基中含10%體積的二甲基亞砜(DMSO);③所述凍存液①與同體積細胞條件培養(yǎng)基的混合； 所述凍存液②與同體積細胞條件培養(yǎng)基的混合。其中，①和②適用于乳牙及《40歲供體的恒牙牙髓干細胞庫的構(gòu)建；③和④適用于40-60歲供體的牙髓干細胞庫的構(gòu)建。所述凍存液中的二甲基亞砜和甘油，能夠快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點、延緩冷凍過程，同時提高胞內(nèi)離子濃度，避免液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的細胞損傷。
步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立有相關(guān)信息，將前述所采集供體基本信息和相應(yīng)牙髓干細胞制備及其細胞庫構(gòu)建過程的相關(guān)信息錄入計算機信息
庫；并按檢索編碼調(diào)出相關(guān)記錄與供體資料進行核實，納入細胞庫管理；即完成人牙髓干細胞庫的構(gòu)建。 本發(fā)明所構(gòu)建人牙髓干細胞庫的應(yīng)用方法是，按檢索編碼在細胞庫管理中核對相關(guān)信息后，將對應(yīng)的存貯細胞凍存管由液氮中取出，即刻放入37°C 45t:的水浴中，30秒至1分鐘內(nèi)融化，急速融化復(fù)蘇可防止損害細胞；將所復(fù)蘇細胞按照實際需要進行擴增培養(yǎng)后即可應(yīng)用。 本發(fā)明的人牙髓干細胞制備及其細胞庫的構(gòu)建方法，可從廢棄的人健康牙齒的牙髓中獲得大量的牙髓干細胞，利用系統(tǒng)工程，建立有效資源的儲備庫。本發(fā)明儲存于庫內(nèi)的人牙髓干細胞，經(jīng)短期培養(yǎng)可獲得大量(1X1(T 7X1(T)富有功能活性的牙髓干細胞，并能長期保存而不失其活性。與已有的干細胞庫相比，本發(fā)明的構(gòu)建操作規(guī)范，簡單容易掌握，安全可行，建庫成本低廉，標(biāo)準化程度高，針對不同年齡段來源的細胞采用不同的凍存液使得復(fù)蘇后細胞的活性增強，擴大了細胞的來源、增強了細胞的活性。此外，本發(fā)明所使用的牙齒均為各種原因被拔除廢棄的牙齒，大大節(jié)約了醫(yī)療資源；因此，人牙髓干細胞庫的 構(gòu)建具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實施例方式以下結(jié)合實例對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步說明，但并不受限于下述實例。實例中 的操作均在嚴格無菌環(huán)境進行，為保證細胞不受污染，在所有使用的PBS、 a -MEM及DMEM的 溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
實施例1、人智齒牙髓干細胞的制備及其干細胞庫的構(gòu)建 步驟一、采集基本信息抽取供體靜脈血經(jīng)過檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分 型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等)確定安 全性后記錄，采集供體基本信息包括檢索編碼、姓名、年齡、身份證號、出生日期、種族、通 訊地址及聯(lián)系方式等。 步驟二、獲取牙髓干細胞獲取供體阻生智齒兩顆置入準備好的含V/V為15%小 牛血清的DMEM培養(yǎng)液的離心管中，用膜封口后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺，用pH7. 4的PBS液反復(fù) 沖洗牙齒組織去除表面殘留血液和牙周膜；轉(zhuǎn)移至破碎機中破碎牙齒，暴露出完全牙髓組 織，仔細挑選出牙髓組織碎塊用PBS液沖洗；采用1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除上清液， 加入2ml消化液(為6. 25U/ml的膠原酶溶液與相同體積的1U/ml分散酶溶液的混合)后用 吸管吹散牙髓組織碎塊，放入37°C 、5% C02條件的孵箱中透氣孵育50分鐘；孵育完成后，在 懸液中加入所述含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液5ml，吹散組織細胞懸液阻止其繼續(xù)消化，1000 轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除上清，加入4ml的完全培養(yǎng)基重懸細胞(完全培養(yǎng)基是在a -MEM 培養(yǎng)液中按體積比加有20%的胎牛血清，終濃度為400ng/ml的Noggin和終濃度為60ng/ ml的成纖維細胞生長因子)，將細胞懸液移入T型培養(yǎng)瓶進行原代培養(yǎng)，12小時后換液，此 后間隔2 3天換液；7天后用3U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫落后 重新接種培養(yǎng)；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙髓干細胞；對所獲 得的牙髓干細胞進行STR0-1及CD146鑒定檢測；然后將牙髓干細胞接種于細胞工廠中擴增 培養(yǎng)； 步驟三、牙髓干細胞凍存、入庫將擴增所得的牙髓干細胞按3Xl(f個/ml的密度
在凍存液(細胞條件培養(yǎng)基與同體積含10%二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基的混合)中重懸，分
裝進凍存管，將凍存管置于fC環(huán)境中，以1°C /分鐘的速度冷凍至-120°C ，然后將凍存管轉(zhuǎn)
移到_1961:液氮罐中貯存入庫；按AB0/Rh和HLA分型進行分類保存； 步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關(guān)信息(如檢索編碼
和供體姓名)，將前述所采集供體基本信息和牙髓干細胞制備及細胞庫構(gòu)建過程的相關(guān)信
息(如細胞培養(yǎng)液構(gòu)成及濃度、胰酶及膠原酶濃度及消化時間、細胞接種密度及原代與擴
增培養(yǎng)時間、凍存液構(gòu)成及凍存時間等)錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調(diào)出相關(guān)記錄
與供體資料進行核實，確認所有資料及操作準確無誤，納入細胞庫管理；即完成人智齒牙髓
干細胞庫的構(gòu)建。應(yīng)用時將上述細胞按照實際需要進行復(fù)蘇和擴增培養(yǎng)。 實施例2、人正畸拔除牙牙髓干細胞的制備及其干細胞庫的構(gòu)建 步驟一、采集基本信息抽取供體靜脈血經(jīng)過檢測程序(AB0/Rh血型檢測、HLA分
型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等)確定安全性后記錄，采集供體基本信息包括檢索編碼、姓名、年齡、身份證號、出生日期、種族、通 訊地址及聯(lián)系方式等； 步驟二、獲取牙髓干細胞獲取供體因正畸需拔除的尖牙4顆放入準備好的含V/ V為10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液的離心管中，用膜封口后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺，用pH7. 4的 PBS液反復(fù)沖洗牙齒去除表面殘留血液和牙周膜；轉(zhuǎn)移至破碎機進行破碎牙齒，暴露出完 全牙髓組織；仔細挑選出牙髓組織碎塊用PBS液沖洗，采用1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上 清液，加入2ml消化液(為6. 25U/ml的膠原酶溶液與相同體積的0. 5U/ml分散酶溶液的混 合)后用吸管吹散牙髓組織碎塊，放入37°C、5% C02條件的孵箱中透氣孵育50分鐘；孵育 完成后，在懸液中加入所述含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液2ml，吹散組織細胞懸液阻止其繼續(xù) 消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除上清，加入4ml的完全培養(yǎng)基重懸細胞(完全培養(yǎng)基 是在a -MEM培養(yǎng)液中按體積比加有20%的胎牛血清，終濃度為600ng/ml的Noggin和終 濃度為40ng/ml的成纖維細胞生長因子)，將細胞懸液移入T型培養(yǎng)瓶進行原代培養(yǎng)，12小 時后換液，此后每間隔2天換液；8天后用6U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞 完全脫落后重新接種培養(yǎng)；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙髓干細 胞；對所獲得的牙髓干細胞進行STR0-1及CD146鑒定檢測；然后將牙髓干細胞接種于細胞 工廠中擴增培養(yǎng)； 步驟三、牙髓干細胞凍存、入庫將擴增所得的牙髓干細胞按4Xl(f個/ml的密度 在凍存液(含10%體積的二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基)中重懸，分裝進凍存管，將凍存管置于 2t:環(huán)境中，以1°C /分鐘的速度冷凍至-IO(TC，然后將凍存管轉(zhuǎn)移到-1961:液氮罐中貯存 入庫；按AB0/Rh和HLA分型進行分類保存； 步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關(guān)信息(如檢索編碼 和供體姓名)，將前述所采集供體基本信息和牙髓干細胞制備及細胞庫構(gòu)建過程的相關(guān)信 息(如細胞培養(yǎng)液構(gòu)成及濃度、胰酶及膠原酶濃度及消化時間、細胞接種密度及原代與擴 增培養(yǎng)時間、凍存液構(gòu)成及凍存時間等)錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調(diào)出相關(guān)記錄 與供體資料進行核實，確認所有資料及操作準確無誤，納入細胞庫管理；即完成人牙髓干細 胞庫的構(gòu)建。應(yīng)用時將上述細胞按照實際需要進行復(fù)蘇和擴增培養(yǎng)。
實施例3、人乳牙牙髓干細胞的制備及其干細胞庫的構(gòu)建 步驟一、采集基本信息抽取供體靜脈血經(jīng)過檢測程序(AB0/Rh血型檢測、HLA分 型檢測、梅毒抗體檢測、異型肝炎抗原抗體檢測、CMV抗體檢測及HIV免疫檢測等)確定安 全性后記錄，采集供體基本信息包括檢索編碼、姓名、年齡、身份證號、出生日期、種族、通 訊地址及聯(lián)系方式等。 步驟二、獲取牙髓干細胞獲取供體因乳恒牙替換需拔除的乳牙3顆置入準備好 的含V/V為10X小牛血清的匿EM培養(yǎng)液的離心管中，用膜封口后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺，用 pH7. 4的PBS液反復(fù)沖洗牙齒組織去除表面殘留血液和牙周膜；轉(zhuǎn)移至破碎機中破碎牙體， 暴露出完全牙髓組織，仔細挑選出牙髓組織碎塊用PBS液沖洗；采用1200轉(zhuǎn)/分鐘離心3 分鐘，去除上清液，加入2ml消化液(為4. 25U/ml的膠原酶溶液與相同體積的0. 4U/ml分散 酶溶液的混合)后用吸管吹散牙髓組織碎塊，放入37°C、5% C02條件的孵箱中透氣孵育45 分鐘；孵育完成后，在懸液中加入所述含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液3ml，吹散組織細胞懸液阻 止其繼續(xù)消化，800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除上清，加入3ml的完全培養(yǎng)基重懸細胞(完全
6培養(yǎng)基是在a -MEM培養(yǎng)液中按體積比加有20%的胎牛血清，終濃度為500ng/ml的Noggin 和終濃度為50ng/ml的成纖維細胞生長因子)，將細胞懸液移入T型培養(yǎng)瓶進行原代培養(yǎng)， 12小時后換液，此后每間隔3天換液；9天后用5U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使 細胞完全脫落后重新接種培養(yǎng)；待細胞長滿瓶底80 90%時，采用磁珠分離法分離出牙髓 干細胞；對所獲得的牙髓干細胞進行STR0-1及CD146鑒定檢測；然后將牙髓干細胞接種于 細胞工廠中擴增培養(yǎng)； 步驟三、牙髓干細胞凍存、入庫將擴增所得的牙髓干細胞按4Xl(f個/ml的密度 在凍存液(含10%體積甘油的完全培養(yǎng)基)中重懸，分裝進凍存管，將凍存管置于4t:環(huán)境 中，以1°C /分鐘的速度冷凍至-IO(TC，然后將凍存管轉(zhuǎn)移到_1961:液氮罐中貯存入庫；按 AB0/Rh和HLA分型進行分類保存； 步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關(guān)信息(如檢索編碼 和供體姓名)，將前述所采集供體基本信息和牙髓干細胞制備及細胞庫構(gòu)建過程的相關(guān)信 息(如細胞培養(yǎng)液構(gòu)成及濃度、胰酶及膠原酶濃度及消化時間、細胞接種密度及原代與擴 增培養(yǎng)時間、凍存液構(gòu)成及凍存時間等)錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調(diào)出相關(guān)記錄 與供體資料進行核實，確認所有資料及操作準確無誤，納入細胞庫管理；即完成人乳牙牙髓 干細胞庫的構(gòu)建。應(yīng)用時將上述細胞按照實際需要進行復(fù)蘇和擴增培養(yǎng)。
權(quán)利要求
一種人牙髓干細胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，有基本信息采集、牙髓干細胞獲取、牙髓干細胞的凍存、入庫以及信息記錄與核對的步驟；具體包括步驟一、采集基本信息包括檢索編碼，供體姓名、年齡、身份證號碼、出生日期、種族、通訊地址、聯(lián)系方式、常規(guī)檢查結(jié)果以及后續(xù)步驟的相關(guān)信息；步驟二、獲取牙髓干細胞①將供體新鮮牙齒組織采用含V/V為5％～20％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液完成轉(zhuǎn)移，在無菌條件下用PBS液沖洗清除牙周組織，破碎牙齒挑選牙髓組織用PBS液沖洗；②在1000～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～10分鐘，去除上清液，加入5～10倍體積的消化液后，用吸管吹散均勻，置入37℃孵箱中透氣孵育10～60分鐘；所述的消化液為3～9U/ml膠原酶溶液與相同體積的0.2～5U/ml分散酶溶液的混合；③孵育完成后，在懸液中加入所述含新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹散組織細胞懸液阻止繼續(xù)消化，在800～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～10分鐘，棄上清后，加入5～10倍體積的完全培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)；④培養(yǎng)7～9天后用3～9U/ml濃度的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫落后重新接種培養(yǎng)；待細胞長滿瓶底80～90％時，采用磁珠分離法分離出牙髓干細胞；再用干細胞標(biāo)志物對所得到的細胞進行鑒定，然后采用細胞工廠進行擴增培養(yǎng)；步驟三、牙髓干細胞凍存、入庫將所獲得的牙髓干細胞按1×107～8×107個/ml的密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，在0～4℃條件下，以0.5～2℃/分鐘的速度冷凍至-80～-120℃；再將凍存管轉(zhuǎn)移至-196℃液氮中貯存入庫；步驟四、信息記錄與核對在貯存入庫的容器載體上建立相關(guān)信息，將前述所采集供體基本信息和相應(yīng)牙髓干細胞制備及其細胞庫構(gòu)建過程的相關(guān)信息錄入計算機信息庫；并按檢索編碼調(diào)出相關(guān)記錄與供體資料進行核實，納入細胞庫管理；即完成人牙髓干細胞庫的構(gòu)建。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的細胞庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述的完全培養(yǎng)基是在 a -MEM培養(yǎng)液中按體積比加有10 30%的胎牛血清，終濃度為400 600ng/ml的Noggin 和終濃度為20 60ng/ml的成纖維細胞生長因子；所述的細胞條件培養(yǎng)基是牙髓干細胞在 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 4天后，收集其培養(yǎng)液去除雜質(zhì)后的液體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述的凍存液包括以下四種①完全培養(yǎng)基中含10%體積的甘油；②完全培養(yǎng)基中含10%體積的二甲基亞砜；③所述凍存液①與同體積細胞條件培養(yǎng)基的混合；④所述凍存液②與同體積細胞條件培養(yǎng)基的混 合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細胞庫構(gòu)建方法，其特征在于，在所有使用的PBS、 a -MEM及DMEM的溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
全文摘要
一種人牙髓干細胞庫的構(gòu)建方法，本發(fā)明包括基本信息采集、牙髓干細胞獲取、牙髓干細胞的凍存、入庫以及信息記錄與核對的步驟；應(yīng)用時按照實際需要進行復(fù)蘇和擴增培養(yǎng)。本發(fā)明由廢棄的人健康牙齒的牙髓中獲得牙髓干細胞，利用系統(tǒng)工程，建立有效資源的儲備庫，儲存于庫內(nèi)的人牙髓干細胞，經(jīng)短期培養(yǎng)可獲得大量富有功能活性的牙髓干細胞，并能長期保存而不失其活性；與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的構(gòu)建操作規(guī)范，簡單容易掌握，安全可行，建庫成本低廉，標(biāo)準化程度高，針對不同年齡段來源的細胞采用不同的凍存液使得復(fù)蘇后細胞的活性增強，擴大了細胞的來源、增強了細胞的活性。本發(fā)明所用的牙齒均為各種原因被拔除廢棄的牙齒，大大節(jié)約了醫(yī)療資源，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/074GK101717750SQ20091021940
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者張勇杰, 郭維華, 金巖 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);西安組織工程工程技術(shù)研究中心