專利名稱：用于靶向單鏈切割和靶向整合的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開屬于基因組工程、基因靶向、靶向染色體整合和蛋白表達(dá)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)于基因組生物學(xué)，尤其是確定許多基因組的完整核苷酸序列的重要感興趣領(lǐng)域，是基因組序列的靶向改變。人工核酸酶，其連接核酸酶的切割結(jié)構(gòu)域與設(shè)定的DNA結(jié)合蛋白(例如，與如來自 I^okI核酸酶切割結(jié)構(gòu)域連接的鋅指蛋白(ZFP))，已被用于真核細(xì)胞中的靶向切割。例如， 鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯已顯示出能通過(1)在活細(xì)胞的基因組中，特異性地在用于所需修飾的靶位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂，和( 允許DNA修復(fù)的天然機(jī)制以“恢復(fù)”該斷裂，在特定位點(diǎn)修飾人類基因組的序列。為了增加特異性，使用一對或多對用戶設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶誘導(dǎo)切割事件，該鋅指核酸酶在結(jié)合DNA時即二聚化以形成催化激活的核酸酶復(fù)合物。而且，使用一對或多對鋅指核酸酶(ZFN)進(jìn)一步增加了特異性，其包括僅僅在形成異二聚體后切割雙鏈DNA的改造切割半結(jié)構(gòu)域。參見，例如，美國專利公開No. 20080131962，其通過引用全文并入本文。通過人工核酸酶產(chǎn)生的雙鏈斷裂(DSB)已經(jīng)用于，例如，誘導(dǎo)靶向突變誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA序列的靶向缺失和促進(jìn)在預(yù)定染色體位點(diǎn)的靶向重組。參見，例如，美國專利公開 2003023M10 ；20050208489 ；20050026157 ；20050064474 ；20060188987 ； 20060063231 ；20070218528 ；20070134796 ；20080015164 以及國際公開 WO 07/014275 和 WO 2007/139982，其公開內(nèi)容適用于所有目的地通過引用全文并入本文。因此，在靶基因組位點(diǎn)產(chǎn)生DSB的能力允許任意基因組的基因組編輯。有兩種重要且不同的途徑來修復(fù)DSB-同源重組和非同源末端連接(NHEJ)。同源重組需要存在同源序列作為模板(例如“供體”)，以指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)修復(fù)過程，而且修復(fù)的結(jié)果是沒有錯誤并且可預(yù)測的。對于同源重組，缺乏模板(或“供體”)序列，細(xì)胞一般會通過非同源末端連接(NHEJ)的不可預(yù)測和容易出錯的過程修復(fù)DSB。單鏈斷裂(SSB)，包括DNA缺口，是內(nèi)源性活性氧物種和DNA代謝過程如DNA修復(fù)和復(fù)制中最常見的DNA損傷之一。參見，]^燈1111011等Q007)Annu Rev Genomics Hum Genet 8 :37-55 ;01 1110等Q003)Mol Cell Biol 23 :3974-3981。非凋亡細(xì)胞的染色體在整個基因組的大約50kb間隔處含有單鏈中斷(SSB/缺口)。參見，例如，Szekvolgyi等(2007)Proc Natl Acad Sci USA104 14964-14969。大多數(shù)SSB/缺口可通過快速整體SSB修復(fù)過程進(jìn)行修復(fù)，其可以分成4個基本步驟通過聚(ADP-核糖)聚合酶-I(PARP-I)的SSB缺失，通過各種酶的DNA末端加工，通過DNA聚合酶的DNA缺口填補(bǔ)和通過DNA連接酶的DNA連接， 參見 Caldecott，K. W. (2008)Nat Rev Genet 9，619_31。Lee 等 U004)Cell 117:171-184發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，由突變的RAG蛋白誘導(dǎo)的缺口可以在哺乳動物細(xì)胞中啟動同源性定向修復(fù)(HDR)。然而，以前沒有表明改造ZFN可以誘導(dǎo)SSB/缺口，或這些SSB/缺口可以通過同源重組修復(fù)，或ZFN可用于通過同源重組促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的靶向整合。因此，需要在雙鏈DNA中產(chǎn)生單鏈斷裂(缺口)，并通過在缺口位點(diǎn)的同源重組促進(jìn)靶向整合，同時在哺乳動物/人類細(xì)胞中不產(chǎn)生傾向錯誤的NHEJ修復(fù)的方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明公開了用于在任意目標(biāo)雙鏈靶序列中誘導(dǎo)靶向單鏈斷裂的方法和組合物。 還描述了在靶向單鏈切割之后促進(jìn)同源重組和靶向整合的方法。因此，本發(fā)明描述了基因組的靶向調(diào)節(jié)。在一個方面，提供了在所需的雙鏈靶序列中產(chǎn)生單鏈切割的人工(非天然存在) 核酸酶。這里描述的核酸酶包括一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，改造的鋅指蛋白)和至少一個切割結(jié)構(gòu)域或至少一個切割半結(jié)構(gòu)域。在特定的實(shí)施方案中，核酸酶是包括鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指核酸酶，該鋅指結(jié)構(gòu)域被改造以結(jié)合任意選擇的序列(例如，基因)。這里描述的任意鋅指蛋白可包括1、2、3、4、5、6或多個鋅指蛋白，每一鋅指蛋白具有一個結(jié)合選擇的序列(例如，基因)中的靶亞位點(diǎn)的識別螺旋。切割結(jié)構(gòu)域可以來源于任意核酸酶，例如，來自IIS型核酸酶如R)kl的切割半結(jié)構(gòu)域。在特定的實(shí)施方案中，切割半結(jié)構(gòu)域包括改造的 i^okl切割半結(jié)構(gòu)域，其與另一個切割半結(jié)構(gòu)域(例如，二聚化結(jié)構(gòu)域中改造的或野生型)形成異二聚體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，切割結(jié)構(gòu)域(例如，改造的i^okl切割半結(jié)構(gòu)域)包括失活核酸酶結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域(酶促活性)的突變。在另一個方面中，本發(fā)明提供了包括一對鋅指核酸酶的復(fù)合物和/或組合物，每個核酸酶包括一個改造的鋅指結(jié)構(gòu)域和一個R)ki切割半結(jié)構(gòu)域，其中切割半結(jié)構(gòu)域形成二聚體(同源二聚體或異二聚體)。在特定的實(shí)施方案中，鋅指核酸酶對中的一個鋅指核酸酶包括第一催化激活的改造切割半結(jié)構(gòu)域，另一個鋅指核酸酶包括第二催化失活的改造切割半結(jié)構(gòu)域，其中第一和第二改造切割半結(jié)構(gòu)域形成專性異二聚體。在另一個方面中，提供了編碼這里描述的任意核酸酶的多核苷酸。在另一個方面中，還提供了含有這里所述的任意蛋白和/或多核苷酸的分離的細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，提供了通過靶向改變引入了外源序列到其中的細(xì)胞系。在特定的實(shí)施方案中，這些細(xì)胞系中的一個或多個選擇的基因被失活(部分或全部)。在其他的實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞系包括一個或多個轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的外源序列，該外源序列已經(jīng)被穩(wěn)定或瞬時引入到細(xì)胞中。通過培養(yǎng)含有這里所述的任意蛋白和/或多核苷酸的細(xì)胞，在導(dǎo)致選擇基因失活的細(xì)胞系中產(chǎn)生這種細(xì)胞系。還本發(fā)明提供了含有一個或多個轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的外源序列的轉(zhuǎn)基因生物，該外源序列已經(jīng)被穩(wěn)定或瞬時引入到細(xì)胞中。進(jìn)一步提供了含有通過這里提供的方法選擇性失活的基因的轉(zhuǎn)基因生物，或含有能改變內(nèi)源序列的表達(dá)的外源序列的生物。這里所述的轉(zhuǎn)基因生物可以是植物(例如農(nóng)作物植物或煙草)或動物(例如，小鼠、大鼠、兔子、魚等等)。在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因生物用于生產(chǎn)攜帶編碼這里所述的核酸酶的一個或多個序列，和/或一個或多個外源序列(例如，使用這里所述的核酸酶通過靶向整合被插入到基因組中的序列)的生物的系。例如，這里公開了含有這里所述的核酸酶的轉(zhuǎn)基因植物和植物系，該核酸酶在可誘導(dǎo)啟動子的調(diào)控下。因此，可以在植物中在所需時間和/或植物的所需組織中，表達(dá)含有編碼核酸酶的游離或整合序列的轉(zhuǎn)基因植物和植物系。此外，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中的靶雙鏈序列中產(chǎn)生特定的單鏈斷裂的方法。在特定的實(shí)施方案中，該方法包括引入一對或多對核酸酶(編碼核酸酶的蛋白或多核苷酸)到細(xì)胞中。每個核酸酶對包括具有第一 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一催化激活切割半結(jié)構(gòu)域的第一核酸酶，和具有第二 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二催化失活的切割半結(jié)構(gòu)域的第二核酸酶。在以便每個核酸酶對的第一與第二切割半結(jié)構(gòu)域形成二聚體并在靶序列中產(chǎn)生單鏈斷裂的條件下，一對或多對核酸酶被引入到細(xì)胞中。在特定的實(shí)施方案中，第一和/或第二 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有鋅指蛋白(例如，改造的鋅指蛋白)。進(jìn)一步地，在這里所述的任意方法中，第一和第二切割半結(jié)構(gòu)域可含有i^okl 切割半結(jié)構(gòu)域，例如被改造以形成專性異二聚體的I^okI切割半結(jié)構(gòu)域。靶序列可以是任意雙鏈序列，例如，細(xì)胞染色質(zhì)中的序列如基因組序列或其部分。而且，靶序列可以是例如質(zhì)粒或病毒中的染色體外的雙鏈DNA序列。類似地，靶序列可以處于任意的細(xì)胞類型中，包括原核和真核細(xì)胞，如真菌細(xì)胞，植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞，靈長類動物細(xì)胞和人類細(xì)胞。單鏈斷裂的位點(diǎn)可與催化激活的核酸酶結(jié)合的序列一致，或者它可以是相鄰的 (例如與結(jié)合位點(diǎn)的近端分隔1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多個核苷酸)。 可以通過遞送融合蛋白到細(xì)胞中和/或通過遞送編碼一種或多種核酸酶的多核苷酸到細(xì)胞中，在細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，其中該多核苷酸，如DNA，被轉(zhuǎn)錄成mRNA，該mRNA然后翻譯成融合蛋白?？蛇x擇地，RNA分子可以被遞送到細(xì)胞中，該RNA分子然后被翻譯以產(chǎn)生融合蛋白。在本發(fā)明公開的其他地方提供了將用于多核苷酸和多肽遞送到細(xì)胞中的方法。本發(fā)明還提供了用于靶向重組的方法(用于，例如，染色體或者細(xì)胞染色質(zhì)中目標(biāo)區(qū)域中的序列的改變或取代)。例如，用野生型序列取代突變的基因組序列用于遺傳疾病或遺傳紊亂的治療。此外，可以用突變序列取代野生型基因組序列，例如，來防止致癌基因產(chǎn)物或涉及不合宜的炎癥性應(yīng)答的基因產(chǎn)物的功能。進(jìn)一步地，可以用一個或多個不同的等位基因取代基因的一個或多個等位基因(例如，雙等位基因靶向整合)。在本發(fā)明公開的方法中，這里描述的一個或多個靶向核酸酶在靶序列的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生單鏈斷裂，而且其與斷裂區(qū)域中的核苷酸序列具有同源性的“供體”多核苷酸可以被導(dǎo)入到細(xì)胞中。這里已經(jīng)顯示單鏈斷裂的存在有助于供體序列的整合。供體序列可以被物理整合或，可選地，供體多核苷酸用作模板用于通過同源重組修復(fù)斷裂，其導(dǎo)致如供體中的全部或部分核苷酸序列導(dǎo)入到細(xì)胞染色質(zhì)中。因此，細(xì)胞染色質(zhì)中的最初序列可以被改變而且，在特定的實(shí)施方案中，可以被轉(zhuǎn)變成供體多核苷酸中存在的序列。因此，術(shù)語“取代 (“r印lace”)”或“取代的(“r印lacement”)”的使用可以理解為表示用另一個核苷酸序列取代一個核苷酸序列(也即，信息意義上的序列取代)，而且不必要求由另一個多核苷酸對一個多核苷酸進(jìn)行物理或化學(xué)取代。另外，本發(fā)明提供了用第一核苷酸序列取代細(xì)胞染色質(zhì)的目的區(qū)域(例如，基因組序列)的方法，該方法包括(a)改造第一鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合目的區(qū)域中的第二序列；(b)提供第二鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合目的區(qū)域中的第三序列；(c)在細(xì)胞中表達(dá)第一融合蛋白，該第一融合蛋白含有第一鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一催化激活的切割半結(jié)構(gòu)域；(d)在細(xì)胞中表達(dá)第二融合蛋白，該第二融合蛋白含有第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二催化失活的切割半結(jié)構(gòu)域；和(e)使細(xì)胞與含有第一核苷酸序列的多核苷酸接觸；其中第一融合蛋白與第二序列結(jié)合，第二融合蛋白與第三序列結(jié)合，從而定位切割半結(jié)構(gòu)域以便在細(xì)胞染色質(zhì)的目的區(qū)域中產(chǎn)生單鏈斷裂，而且用第一核苷酸序列取代目的區(qū)域中的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，在目的區(qū)域的第二與第三序列之間的位點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞染色質(zhì)中的單鏈斷裂。鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶可作為蛋白和/或編碼所述鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶的一個或多個多核苷酸的方式提供給細(xì)胞。例如，可以導(dǎo)入兩個多核苷酸到細(xì)胞中，每個多核苷酸含有編碼兩種融合蛋白之一的序列?？蛇x擇地，可以引入含有編碼兩種融合蛋白的序列的單個多核苷酸到細(xì)胞中。在這里描述的任意方法中，其他的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白對可用于細(xì)胞內(nèi)另外的靶位點(diǎn)的另外的雙鏈和/或單鏈切割。因此，在一個實(shí)施方案中，用第一核苷酸序列取代細(xì)胞染色質(zhì)中的目的區(qū)域(例如，基因組)的方法包括(a)改造第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合目的區(qū)域中的第二序列；(b) 提供第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合第三序列；和(c)使細(xì)胞與(i)含有第一核苷酸序列的第一多核苷酸；(ii)含有第一融合蛋白的第二多核苷酸接觸，第一融合蛋白含有第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一催化活性半切割第一結(jié)構(gòu)域；和(iii)編碼第二融合蛋白的第三多核苷酸，第二融合蛋白含有第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二催化失活的切割半結(jié)構(gòu)域；其中表達(dá)第一和第二融合蛋白，第一融合蛋白與第二序列結(jié)合，第二融合蛋白與第三序列結(jié)合，從而定位切割半結(jié)構(gòu)域以便在細(xì)胞染色質(zhì)中的目的區(qū)域中產(chǎn)生單鏈斷裂，并用第一核苷酸序列取代目的區(qū)域。在用于細(xì)胞染色質(zhì)的目的區(qū)域中的序列的靶向重組和/或取代和/或改變的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過與外源“供體”核苷酸序列的同源重組來改變?nèi)旧w的序列。如果存在與斷裂區(qū)域同源的序列，通過細(xì)胞染色質(zhì)中單鏈斷裂的存在來刺激這種同源重組。值得注意的是，細(xì)胞染色質(zhì)中的單鏈斷裂不刺激非同源末端連接的細(xì)胞機(jī)理。在這里描述的任意方法中，第一核苷酸序列(“供體序列”)可含有與目的區(qū)域中的基因組序列同源但不相同的序列，從而刺激同源重組以插入非相同序列到目的區(qū)域中。 因此，在特定的實(shí)施方案中，與目的區(qū)域中序列同源的供體序列部分顯示與被取代的基因組序列有大約80到99%的(或這之間的任意整數(shù))序列同一性。在其他的實(shí)施方案中，供體與基因組序列之間的同源性高于99%，例如如果供體與超過100個連續(xù)堿基對的基因組序列之間只有1個核苷酸不同。在特定的情況下，供體序列的非同源部分可含有目的區(qū)域中不存在的序列，以便引入新的序列到目的區(qū)域中。在這種情況下，非同源序列一般側(cè)接于 50-1，000(或這之間的任意整數(shù)值)個堿基對，或大于1，000的任意數(shù)量的堿基對的序列， 例如人工染色體中發(fā)現(xiàn)的那些序列，其與目的區(qū)域中的序列同源或相同。在其他的實(shí)施方案中，供體序列與第一序列是非同源的，而且通過非同源重組機(jī)制被插入到基因組中。這里描述的任意方法可用于通過供體序列的靶向整合，部分或完全失活細(xì)胞中的一個或多個靶序列，該靶向整合破壞目的基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供了具有部分或完全失活的基因的細(xì)胞系。更進(jìn)一步地，具有部分或完全失活的基因的植物細(xì)胞系可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了包含這里所描述的核酸酶的植物細(xì)胞系，其中核酸酶的表達(dá)由誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動。類似地，具有部分或完全失活的基因的哺乳動物生殖細(xì)胞，如卵母細(xì)胞，可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。此外，這里描述的靶向整合的方法還可用于整合一個或多個外源序列。外源核酸序列可包含，例如，一個或多個基因或cDNA分子，或任意類型的編碼或非編碼序列，以及一個或多個調(diào)控元件(例如，啟動子)。另外，外源核酸序列可以產(chǎn)生一個或多個RNA分子(例如，小的發(fā)夾 RNA (shRNA)，抑制 RNA (RNAi)，小 RNA (miRNA)，等等，)。在這里描述任意細(xì)胞、細(xì)胞系和方法中，細(xì)胞或細(xì)胞系可以是COS，CH0(例如， CHO-S， CHO-Kl， CH0-DG44, CH0-DUXB11, CHO-DUKX， CHOKlSV), VERO, MDCK， WI38， V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, SP2/0_Agl4， HeLa, HEK293(例如，HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), PerC. 6 (Crucell) ；EBx (Sigma-Aldrich Group),昆蟲細(xì)胞如草地貪夜蛾 (Spodoptera fugiperda, Sf)，或真菌細(xì)胞如酵母屬，畢赤氏酵母屬和裂殖酵母屬細(xì)胞。在另一個方面中，本發(fā)明提供了含有這里描述的一個或多個核酸酶(或編碼這些核酸酶的多核苷酸)的試劑盒，該試劑盒用于實(shí)施這里描述的方法。試劑盒任選地可包含試劑、緩沖液、細(xì)胞、合適的容器和說明書。根據(jù)作為一個整體的本公開，這些和其他方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員是非常顯而易見的。附圖簡述

圖1為描述示例性的鋅指核酸酶(ZFN)結(jié)構(gòu)，其包括失活的切割結(jié)構(gòu)域的示意圖。 ZFN對只切割一條DNA鏈以形成單鏈斷裂(SSB)，也稱為缺口。圖2，圖A-C，描述了使用鋅指核酸酶對進(jìn)行雙鏈靶的單鏈切割，其中一個核酸酶包括一個已經(jīng)突變以失活核酸酶結(jié)構(gòu)域的切割活性的切割結(jié)構(gòu)域。圖2A描述了通過用所述的ZFN對切割靶底物獲得的雙鏈切割產(chǎn)物的分析。從左至右，泳道表示分子量階梯，對照，靶向CCR5的ZFN對8196zKK 8267EL,其中KK和 EL指改造的切割結(jié)構(gòu)域，其形成專性的異質(zhì)二聚體以產(chǎn)生雙鏈斷裂(參見，美國專利公開2008/0131962)，本申請中稱為野生型8196ζΚΚ擬67EL (WT)；靴向CCR5的ZFN對 8196zKK擬67EL，其中8267EL蛋白在一個切割半結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域的450位置處還含有一個突變(D450N)，該突變失活ZFN對的一個切割半結(jié)構(gòu)域；靶向CCR5的ZFN對 8196ζΚΚ:擬67EL，其中8267EL蛋白在催化結(jié)構(gòu)域的467位置處還含有一個突變(D467A)， 該突變失活ZFN對的一個切割半結(jié)構(gòu)域；另一個分子量階梯，另一個對照；靶向CCR5的ZFN 對8267RD:8196zDR，其中RD和DR指改造的切割結(jié)構(gòu)域，其形成專性異質(zhì)二聚體(參見， 美國專利公開2008/0131962)，本申請中稱作野生型8267RD:8196zDR(WT)；靶向CCR5的 ZFN對8267RD:8196zDR，其中8196zDR蛋白在一個切割半結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域的450位置處還含有一個突變(D450N)，該突變失活ZFN對的一個切割半結(jié)構(gòu)域；靶向CCR5的ZFN對 8267RD:8196zDR，其中8196zDR蛋白在催化結(jié)構(gòu)域的467位置處還含有一個突變(D467A)， 該突變失活ZFN對的一個切割半結(jié)構(gòu)域。圖2B描述了通過用所述的ZFN對切割靶底物獲得的單鏈切割產(chǎn)物的分析。如上面圖2A所述，泳道從左至右分別表示分子量階梯，對照，靶向CCR5的ZFN 對 8196zKK:8267EL(WT)；靴向 CCR5 的 ZFN 對 8196zKK:8267EL(D450N)；靴向 CCR5 的 ZFN對8196zKK 8267EL (D467A)；另一個分子量階梯，另一個對照；靶向CCR5的ZFN對 8267RD:8196zDR(WT)；靶向 CCR5 的 ZFN擬67RD:8196zDR 示(D450N)；和靶向 CCR5 的 ZFN 對8267RD:8196zDR(D467A)。圖2C的簡圖描述了使用這里所述的突變切割結(jié)構(gòu)域可能的切割模式，其表明由于在不同的DNA片斷中放射性標(biāo)記的定位，可以在放射自顯影分析中檢測到條帶。圖3，圖A到E，描述了通過HDR依賴的單鏈退火(SSA)途徑，K562細(xì)胞中ZFN誘導(dǎo)的SSB/缺口的修復(fù)。在缺乏(無ZFN，圖3B)或存在圖2A中如上所述的ZFN表達(dá)質(zhì)粒時，K562細(xì)胞未處理(未處理，圖3A)或用SSA-GFP報(bào)告DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶向CCR5的 ZFN8196zKK:8267EL (WT,圖 3C)；靶向 CCR5 的 ZFN8196zKK: 8267EL (D450N，圖 3D)；靶向 CCR5 的ZFN8196zKK:擬67EL(D467A，圖3E)。轉(zhuǎn)染后3天收集細(xì)胞，細(xì)胞用碘化丙錠(PI)孵育 5min染色非活細(xì)胞(PI+)后，進(jìn)行細(xì)胞術(shù)分析。由于GFP供體序列側(cè)接于CCR5序列，該CCR5 序列與缺口位點(diǎn)旁鄰的區(qū)域同源，GFP供體序列通過HDR依賴途徑整合到CCR5基因中的斷裂中。因此，觀察到的GFP熒光信號增強(qiáng)則表明已經(jīng)發(fā)生供體序列的靶向整合。在四分體的上角標(biāo)明了每個四分體中細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)證明含有D450N和D467A突變體的ZNF對能夠整合GFP序列。圖4，圖A到D，描述了誘導(dǎo)靶基因中的雙鏈或單鏈斷裂后，外源序列(膜片供體 (patch donor))的非同源末端連接(NHEJ)和靶向整合(Tl)。圖4A描述了每個泳道中，在含有如上所述的ZFN對的K562細(xì)胞中通過NHEJ對雙鏈而不是單鏈斷裂的修復(fù)。泳道號對應(yīng)于表1中的樣本號。圖4B描述了用表1中表明的ZFN對進(jìn)行CCR-5基因的單鏈或雙鏈切割后，46bp CCR-5膜片供體分子的靶向整合。泳道號與樣本號對應(yīng)。圖4C和4D描述了用單個鋅指核酸酶或兩個鋅指核酸酶的組合(每個泳道中如上所述)處理的細(xì)胞中的同源重組事件。圖5，圖A和B，描述了靶向整合分析，和存在46bp CCR5-膜片供體時對用所示的 ZFN組合轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞進(jìn)行的NHEJ分析。圖5A顯示了靶向整合分析，圖5B顯示了 NHEJ 分析。每個圖下面的數(shù)字表示靶向整合或NHEJ的頻率(％)。圖6，圖A和B，描述了靶向整合分析，和存在CCR5-tNGFR_outGFP供體時用表述的ZFN組合轉(zhuǎn)染的K662細(xì)胞進(jìn)行的NHEJ分析。圖6A顯示了 NHEJ分析，圖6B顯示了通過 Southern印跡進(jìn)行的靶向整合分析。每個圖下面的數(shù)字表示靶向整合或NHEJ的頻率(％)。圖7的圖表描述了用表述的ZFN構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞中，在指示的時間點(diǎn)的 53BPl+foci (指示DSB)?？招膱A表示沒有ZFN的對照細(xì)胞；實(shí)心圓表示用野生型ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；空心正方形表示用野生型ZFN與失活的ZFN(D450N)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；和實(shí)心正方形表示用野生型ZFN與失活的ZFN(D467A)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。圖8描述了 K562細(xì)胞中CXCR4基因座上的靶向整合分析。在缺乏(無ZFN)或存在 C)(CR4D450N ZFN :CXCR4-ZFN-L-EL-D450N+CXCR4-ZFN-R-KK 時，用 QCCR4-膜片供體 DNA 對K562細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。使細(xì)胞恢復(fù)4-7天，然后用相同的DNA再次進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。重復(fù)該過程，進(jìn)行總共4次核轉(zhuǎn)染。最后一次核轉(zhuǎn)染后3天收集細(xì)胞，用于gDNA制備和RFLP分析。 通過箭頭指示由TI對CXCR4修飾的預(yù)期位置。每條泳道下面的數(shù)字表示TI的頻率(％ )。發(fā)明詳述本發(fā)明公開了用于細(xì)胞染色質(zhì)的靶向單鏈切割和細(xì)胞核苷酸序列靶向改變的組合物和方法，例如，通過外源多核苷酸(含有與細(xì)胞核苷酸序列同源的一個或多個區(qū)域)與基因組序列之間同源重組后的靶向單鏈切割?；蚪M序列包括染色體，游離基因，細(xì)胞器基因組(例如，線粒體，葉綠體)，人工染色體中存在的那些序列，和細(xì)胞中存在的任意其他類型的核酸諸如，例如擴(kuò)增的序列、雙微染色體和內(nèi)源或感染細(xì)菌與病毒的基因組。基因組序列可以是正常的(也即，野生型)或突變的；突變序列可包含，例如，插入，缺失，易位，重排和/或點(diǎn)突變?；蚪M序列還可以包含許多不同的等位基因之一。該組合物和方法還可以用于染色體外核苷酸序列例如質(zhì)粒的靶向改變?？捎糜诎邢騿捂溓懈詈椭亟M的組合物包括，含有切割半結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，編碼這些蛋白的多核苷酸，以及多肽與編碼多肽的多核苷酸的組合。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含一個或多個鋅指結(jié)構(gòu)(例如，2，3，4，5,6,7,8,9或更多個鋅指結(jié)構(gòu))，而且可以進(jìn)行改造操作以結(jié)合任意的基因組或游離基因序列。因此，通過確定目標(biāo)靶基因組或游離基因區(qū)域，需要在該基因組或區(qū)域進(jìn)行切割或重組，根據(jù)這里公開的方法，可以構(gòu)建一個或多個融合蛋白，其含有催化激活和催化失活的切割半結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域，該鋅指結(jié)構(gòu)域被改造操作以識別所述基因組或游離基因區(qū)域中的靶序列。細(xì)胞中這種融合蛋白(或蛋白)的存在，將導(dǎo)致融合蛋白與它的(它們的)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，以及所述基因組或游離基因區(qū)域內(nèi)或鄰近所述基因組或游離基因區(qū)域處的單鏈切割。值得注意的是，如這里所示，如果外源多核苷酸也存在于這種細(xì)胞中，該外源多核苷酸具有與基因組或游離基因區(qū)域同源的區(qū)域，基因組或游離基因區(qū)域與外源多核苷酸之間高效率發(fā)生同源重組。概述本發(fā)明在這里公開的方法的實(shí)施，以及組合物的制備和使用，除非另有說明，應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA和本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分說明。參見，例如，Sambrook等MOLECULAR CLONING :A LAB0RAT0R Y MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 和第三版，2001 ；Ausubel 等 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Jo hn Wiley & Sons, New York，1987 和定期更新；METHODS IN ENZYM0L OGY 系列，Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic Press, San Diego, 1998 ；METHODS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304，"Chromatin" (PM. Wassarman 和 A. P. ffolffe,編輯)，Academic Press, San Diego，1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols" (P. B. Becker 編輯)Humana Press, Totowa, 1999。定義術(shù)語“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，指線性或環(huán)狀構(gòu)象，單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合體。為了本公開內(nèi)容的目的，這些術(shù)語不被理解為是對聚合體長度的限制。該術(shù)語可包含天然核苷酸的已知類似物，以及在堿基、糖和 /或磷酸酯部分(例如，硫代磷酯主鏈)被修飾的核苷酸。通常，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對特異性；也即A的類似物將與T進(jìn)行堿基配對。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白，，可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語還應(yīng)用于其中一個或多個氨基酸是對應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物或修飾衍生物的氨基酸聚合物。“結(jié)合”指大分子(例如，蛋白與核酸之間)之間的序列特異的、非共價的相互作用。不是結(jié)合相互作用的所有組分都需要是序列特異性的(例如，與DNA主鏈中的磷酸酯殘基接觸)，只要該相互作用總體上是序列特異性的即可。這種相互作用通常特征在于解離常數(shù)(Kd)為10-6Μ—1或更低?！坝H合性”指結(jié)合的強(qiáng)度增加的結(jié)合親合性與較低的Kd相關(guān)?！敖Y(jié)合蛋白”是能與另一個分子非共價結(jié)合的蛋白。結(jié)合蛋白可與例如DNA分子 (DNA結(jié)合蛋白)、RNA分子(RNA結(jié)合蛋白)和/或蛋白質(zhì)分子(蛋白結(jié)合蛋白)結(jié)合。在蛋白結(jié)合蛋白的情況中，它可與其自身結(jié)合(形成同源二聚體，同源三聚體，等等)和/或它可與一個不同蛋白或多個蛋白的一個或多個分子結(jié)合。結(jié)合蛋白可具有不止一種的結(jié)合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合和蛋白結(jié)合活性。“鋅指DNA結(jié)合蛋白”(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是一種蛋白或較大蛋白內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，其通過一個或多個鋅指結(jié)構(gòu)以序列特異性的方式結(jié)合DNA，鋅指結(jié)構(gòu)是結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列區(qū)域，其結(jié)構(gòu)通過鋅離子的配合穩(wěn)定。術(shù)語“鋅指DNA結(jié)合蛋白”通常縮寫為鋅指蛋白或 ZFP。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被“工程改造”以結(jié)合預(yù)定的核苷酸序列，例如通過天然存在鋅指蛋白的識別螺旋區(qū)域的改造(改變一個或多個氨基酸)。因此，改造的鋅指蛋白是非天然存在的蛋白。用于改造鋅指蛋白的方法的非限制性實(shí)例是設(shè)計(jì)與選擇。設(shè)計(jì)的鋅指蛋白是非天然存在的蛋白，其設(shè)計(jì)/組成主要源自合理標(biāo)準(zhǔn)。用于設(shè)計(jì)的合理標(biāo)準(zhǔn)包括取代規(guī)則和用于處理儲存現(xiàn)有ZFP設(shè)計(jì)和結(jié)合數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫信息中的信息的計(jì)算機(jī)算法的應(yīng)用。參見，例如，美國專利 6，140,081 ；6，453，242 和 6，534，261 ；還參見 WO 98/53058 ；WO 98/53059 ；WO 98/53060 ；WO 02/016536 和 WO 03/016496?！斑x擇的”鋅指蛋白是自然界中找不到的蛋白，其產(chǎn)生主要是來自實(shí)驗(yàn)處理如噬菌體展示、相互作用捕獲或雜交體選擇。參見，例如，US 5, 789, 538 ；US 5,925, 523 ；US 6，007，988 ；US 6，013，453 ；US 6，200，759 ；WO 95/19431 ；WO 96/06166 ；WO 98/53057；WO 98/54311 ；WO 00/27878 ；WO 01/60970 ；WO 01/88197 和 WO 02/099084。術(shù)語“序列”指任意長度的核苷酸序列，其可以DNA或RNA ；可以是線性、環(huán)形或分支的，而且可以是單鏈或雙鏈的。術(shù)語“供體序列”指插入到基因組中的核苷酸序列。供體序列可以是任意長度的，例如長度為2到10，000(或者之間的任意整數(shù)值或以上)個核苷酸之間，優(yōu)選長度為大約100到1，000(或之間的任意整數(shù))個核苷酸，更優(yōu)選長度為大約 200到500個核苷酸?？蛇x擇地，供體序列可以是人工染色體序列如細(xì)菌人工染色體(BAC) 或酵母人工染色體(YAC)。“同源但不相同的序列”指與第二序列享有一定程度的序列同一性的第一序列，但是其序列與第二序列的序列不相同。例如，含有突變基因的野生型序列的多核苷酸，與突變基因的序列是同源但不相同。在特定的實(shí)施方案中，兩個序列之間的同源性程度足以允許利用正常的細(xì)胞機(jī)理進(jìn)行它們之間的同源重組。兩個同源但不相同的序列可以是任意長度的，而且它們的非同源性程度可以少到1個核苷酸(例如，用于通過靶向同源重組修正基因組的點(diǎn)突變)或大到10個或更多1Λ (例如，用于插入1個基因到染色體的預(yù)定異位位點(diǎn))。 含有同源不相同序列的兩個多核苷酸的長度不必相同。例如，可以使用20到10，000個核苷酸的外源多核苷酸(也即，供體多核苷酸)，人工染色體或核苷酸對。用于確定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。一般地，這種技術(shù)包括確定基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定其編碼的氨基酸序列，并與另一個核苷酸或氨基酸序列進(jìn)行對比。也可以用這種方式測定和對比基因組序列。通常，同一性分別指兩個多核苷酸或多肽序列的精確核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的一致性?？赏ㄟ^測定它們的同一性百分比來對兩個或多個序列(多核苷酸或氨基酸)進(jìn)行對比。兩個序列的同一性百分比，無論是核酸或氨基酸序列，是兩個比對的序列之間的精確匹配的數(shù)目除以較短序列的長度并乘以100的數(shù)目。對于這里描述的序列，需要的序列同一性的程度范圍為大約80%到100%以及二者之間的任意整數(shù)值。一般，序列之間的同一性百分比為至少 70-75 %，優(yōu)選80-82 %，更優(yōu)選85-90 %，更加優(yōu)選92 %，仍然更優(yōu)選95 %，最優(yōu)選98 %的序列同一性。可選地，可以通過在允許同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定的雙螺旋的條件下進(jìn)行多核苷酸的雜交，接著用單鏈特異性核酸酶消化，并測定消化片段的大小來測定多核苷酸之間的序列相似性程度。當(dāng)兩個序列在分子的測定的長度顯示至少大約70% -75%，優(yōu)選 80% -82%,更優(yōu)選85% -90%,更加優(yōu)選92%，仍然更優(yōu)選95%，和最優(yōu)選98%序列同一性時，兩個核酸，或兩個多肽序列彼此是基本上同源的。如這里使用的，基本上同源還指與指定的DNA或多肽序列顯示完全相同的序列?？梢栽诶?，如特定系統(tǒng)中限定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中測定基本上同源的DNA序列。測定合適的雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見，例如，Sambrook 等，上文Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J.Higgins, (1985)Oxford；Washington, DC ；IRL Press)0可以如下測定兩個核酸片段的選擇性雜交。兩個核酸分子之間的序列同一性程度影響這兩個分子之間雜交事件的效率和強(qiáng)度。部分相同的核酸序列將至少部分抑制與靶分子完全相同的序列的雜交?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的雜交分析(例如，Southern (DNA)印跡， Northern(RNA)印跡,溶液雜交,等等,參見Sambrook等,Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版，(1989) Cold Spring Harbor, N. Y.)測定完全相同序列的雜交抑制?？墒褂貌煌潭鹊倪x擇性，例如，使用從低到高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟煌瑮l件，進(jìn)行這種分析。如果應(yīng)用低嚴(yán)謹(jǐn)條件，可使用缺乏甚至部分程度序列同一性的第二探針(例如，與靶分子具有小于大約 30%序列同一性的探針)評價不存在非特異性結(jié)合，以便在不存在非特異性結(jié)合事件時， 第二探針不會與靶雜交。雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，例如，Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach,editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985)Oxford ；Washington, DC ；IRL Press)。雜交嚴(yán)謹(jǐn)性指不利于包含不匹配核苷酸的雜交體形成的雜交條件的程度， 同時較高嚴(yán)謹(jǐn)性與不匹配雜交體的較低耐受性相關(guān)。F影響雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其包括但不限于溫度、PH、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑如例如甲酰胺和二甲亞砜的濃度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，雜交嚴(yán)謹(jǐn)性隨較高的溫度、較低的離子強(qiáng)度和較低的溶劑濃度而增加。關(guān)于雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性條件，本領(lǐng)域公知的許多等價條件可以用于通過改變例如下列因子來建立特定嚴(yán)謹(jǐn)性序列的長度和特性，不同序列的堿基組成、鹽和其他雜交液組分的濃度，雜交液中存在或不存在封閉劑(例如，硫酸葡聚糖和聚乙二醇)，雜交反應(yīng)溫度和時間參數(shù)，以及改變洗滌條件。根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法選擇一組特定的雜交條件(參見，例如，Sambrook，等，Molecular CloninR :A Laboratory Manual，Second Edition，(1989) Cold Spring Harbor，N· Y·)。
“重組”指兩個多核苷酸之間互換遺傳信息的過程。為了本公開內(nèi)容的目的，“同源重組0 )”指特定形式的這種交換，其在例如細(xì)胞中雙鏈斷裂的修復(fù)期間發(fā)生。該過程需要核苷酸序列同源性，使用“供體”分子進(jìn)行模板修復(fù)“靶”分子(也即，其經(jīng)歷雙鏈斷裂)， 而且由于它導(dǎo)致遺傳信息從供體到靶的遞送而不同地稱為“非交換型型基因轉(zhuǎn)化”或“短序列基因轉(zhuǎn)化換”。不希望受任何特定理論的束縛，這種轉(zhuǎn)移可涉及在斷裂靶與供體之間形成的異源雙鏈DNA的錯配修正，和/或“合成依賴的鏈退火”，其中供體用于再合成將成為部分靶的遺傳信息和/或相關(guān)過程。這種特殊化的HR通常導(dǎo)致靶分子序列的改變以致供體多核苷酸的部分或全部序列被整合到靶多核苷酸中?！扒懈睢敝窪NA分子的共價主鏈的斷裂。切割可以通過多種方法來啟動，包括但不限于磷酸二酯鍵的酶水解或化學(xué)水解。單鏈切割指切割雙鏈DNA/RNA的一條鏈，雙鏈切割指切割兩條鏈(例如，通過兩個不同的單鏈切割事件)。在特定的實(shí)施方案中，融合多肽用于靶向的單鏈DNA切割?！扒懈畎虢Y(jié)構(gòu)域”指與第二多肽(相同的或不同的)結(jié)合而形成具有切割活性(優(yōu)選雙鏈切割活性)的復(fù)合物的多肽序列。術(shù)語“第一和第二切割半結(jié)構(gòu)域”，“+和-切割半結(jié)構(gòu)域”和“右和左切割半結(jié)構(gòu)域”可交換使用，指二聚化的切割半結(jié)構(gòu)域?qū)??！案脑斓那懈畎虢Y(jié)構(gòu)域”是已經(jīng)被修飾以便與另一個切割半結(jié)構(gòu)域(例如，另一個改造的切割半結(jié)構(gòu)域)形成專性異二聚體的切割半結(jié)構(gòu)域。也參見美國專利
發(fā)明者汪建斌 申請人:桑格摩生物科學(xué)股份有限公司