專利名稱：：在脫墨紙污泥存在下酶水解經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：公開了用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，更具體而言，公開了通過用造紙廠污泥(papermillsludge)處理含木素纖維素材料來增加從該材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的效率的方法。
背景技術(shù)：
：含木素纖維素材料，即生物質(zhì)，可用于產(chǎn)生可發(fā)酵的糖類，其又可用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如再生的(renewable)燃料和化學(xué)物。含木素纖維素材料具有纖維素纖維包裹于木質(zhì)素和半纖維素鞘中的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物包括預(yù)處理、水解并發(fā)酵所述含木素纖維素材料。將含木素纖維素材料轉(zhuǎn)化為可再生的燃料和化學(xué)物常常涉及對生物質(zhì)的物理、生物、化學(xué)和/或(使用酶)酶處理。具體而言，酶將纖維素水解為D-葡萄糖，其為簡單的可發(fā)酵的糖。在含木素纖維素材料中，需要高劑量的酶來降解纖維素以獲得高產(chǎn)量，因為木質(zhì)素和木質(zhì)素衍生物可抑制酶對纖維素的水解。上述抑制可至少以兩種方式進行木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物優(yōu)選結(jié)合所述酶，從而阻止該酶與纖維素結(jié)合或水解纖維素，和/或木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物覆蓋纖維素的一部分，從而減少酶與纖維素的接近。結(jié)果，當(dāng)加工含木質(zhì)素的生物質(zhì)時，能用來降解纖維素的酶可能較少，因為木質(zhì)素及其衍生物可清除所述酶或減少其活性。即使對于能用來降解纖維素的酶，可用的酶也可能無法與纖維素接觸，因為木質(zhì)素可覆蓋纖維素。因此，降低了消化纖維素的工藝的有效性。此外，酶的成本高。因此，當(dāng)降解纖維素所需的酶量較高時，加工成本高昂，在經(jīng)濟上不可取。獲得令人滿意的糖產(chǎn)量所需的酶量的減少可對工藝經(jīng)濟有顯著的影響。因此，提高酶使用效率是生物轉(zhuǎn)化工藝中的主要需求。認(rèn)為數(shù)種因素影響纖維素的酶水解。這些因素包括木質(zhì)素含量、半纖維素含量、乙?；?、纖維素的表面積和纖維素結(jié)晶性。通常應(yīng)理解的是，存在于復(fù)雜底物中的木質(zhì)素對酶性能具有不利作用。尚難確定木質(zhì)素和木質(zhì)素衍生物在限制水解中的準(zhǔn)確作用。然而，已知去除木質(zhì)素及其衍生物的作用增加纖維素的水解并增加可發(fā)酵的糖的產(chǎn)量。該作用可打開更多纖維素表面積以供酶攻擊，且可減少非特異性吸附于木素纖維素底物上的酶量?；蛘?，可使用化合物去除木質(zhì)素及其衍生物的作用從而使得纖維素更易受酶降解。
發(fā)明內(nèi)容公開了在造紙廠污泥存在下通過預(yù)處理和/或水解含木素纖維素材料從該材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選的造紙廠污泥是脫墨紙污泥(deinkingpapersludge)。還公開了用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括預(yù)處理所述含木素纖維素材料；將造紙廠污泥引入經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料；將所述經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和用發(fā)酵微生物發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在一個方面，所述造紙廠污泥可在將所述含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶之前引入該含木素纖維素材料。例如，所述造紙廠污泥可以以約5%w/w造紙廠污泥/含木素纖維素材料總漿料的量引入所述經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。附圖簡述圖1.NP-DPS對PCS的水解的作用。圖2.NP-DPS對PCS的纖維素材料轉(zhuǎn)化率的作用。發(fā)明詳述公開了改進的并更有效的通過使用造紙廠污泥酶水解含木質(zhì)素的生物質(zhì)的方法。在一個優(yōu)選實施方案中所述造紙廠污泥包含脫墨紙污泥。木質(zhì)素是可通過松柏醇和/或芥子醇的脫氫聚合獲得的酚聚合物，并見于多種植物的細胞壁中。如本文中使用的術(shù)語“木質(zhì)素”指木質(zhì)素聚合物的完整結(jié)構(gòu)以及由木質(zhì)素結(jié)構(gòu)破壞得到的所述完整聚合物的任何衍生片段或化合物，包括可溶性木質(zhì)素衍生物、縮合的(condensed)木質(zhì)素和不可溶性沉淀的木質(zhì)素。認(rèn)為木質(zhì)素和木質(zhì)素衍生物與脫墨紙污泥以多種方式相互作用。例如，不可溶的沉淀木質(zhì)素和縮合的木質(zhì)素可具有從水溶液吸附脫墨紙污泥的能力，而與之相對，脫墨紙污泥可吸附可溶性木質(zhì)素衍生物。如本文中使用的術(shù)語“生物質(zhì)漿料”指經(jīng)歷酶水解的水性生物質(zhì)材料。生物質(zhì)漿料通過將生物質(zhì)例如玉米秸稈、甘蔗渣等與水、緩沖液和其它預(yù)處理材料混合產(chǎn)生。在水解之前可預(yù)處理生物質(zhì)漿料。如本文中使用的術(shù)語“木質(zhì)素阻斷(ligninblocking)”意指在將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物的工藝中減少或消除木質(zhì)素的有害作用。此外，如本文中使用的術(shù)語“有效的木質(zhì)素阻斷量”抑制任何可用于促進木質(zhì)素阻斷的量。在一個實施方案中，本方法利用了脫墨紙污泥，其優(yōu)選地比纖維素更易結(jié)合木質(zhì)素?？捎妹撃埼勰嗵幚砀吣举|(zhì)素含量的生物質(zhì)漿料，例如通過將其直接引入經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿料。認(rèn)為陽離子淀粉可優(yōu)選與木質(zhì)素在經(jīng)預(yù)處理的漿料中結(jié)合，從而覆蓋了沉淀于纖維素表面的木質(zhì)素，因此妨礙了沉淀的木質(zhì)素與水解酶的結(jié)合。還認(rèn)為脫墨紙污泥可能夠吸附未沉淀于纖維素表面的木質(zhì)素，使得纖維素水解酶更有效地和迅速地水解纖維素。如果不用脫墨紙污泥處理含木質(zhì)素的生物質(zhì)漿料，木質(zhì)素可與纖維素水解酶一部分結(jié)合使其無法水解纖維素，或可覆蓋纖維素一部分，使其無法被水解酶接近。不拘于任何具體理論，認(rèn)為木質(zhì)素以多種方式作用以抑制酶對生物質(zhì)中纖維素的水解。木質(zhì)素限制纖維素分解酶和半纖維素分解酶可將纖維素轉(zhuǎn)化為單糖的程度。許多研究活動的焦點在于理解細胞壁中木質(zhì)素的性質(zhì)，并開發(fā)將其有效去除的預(yù)處理工藝。對木質(zhì)素抑制酶活性的模式的理解能夠減少傳統(tǒng)上由生物質(zhì)中木質(zhì)素成分導(dǎo)致的有害作用。如下詳述，可在水解含木素纖維素材料或生物質(zhì)之前對其進行預(yù)處理。例如，預(yù)處理可為蒸汽預(yù)處理、堿性預(yù)處理、酸性預(yù)處理或其某種組合的形式。蒸汽預(yù)處理物理地破壞生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即至少部分地打斷連接木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的鍵。堿性預(yù)處理通常包括用堿性物質(zhì)如銨鹽處理生物質(zhì)。堿性預(yù)處理化學(xué)地改變生物質(zhì)。對于生物質(zhì)的木質(zhì)素成分，認(rèn)為堿性預(yù)處理至少部分地降解木質(zhì)素，形成木質(zhì)素衍生物和小的酚類片段，其可不利地影響酶的性能以及酵母的生長和發(fā)酵能力。酸性預(yù)處理也化學(xué)地改變生物質(zhì)的木質(zhì)素成分，形成包括縮合的木質(zhì)素的木質(zhì)素衍生物，其沉淀于纖維素纖維表面。所述縮合木質(zhì)素可通過覆蓋纖維素纖維的表面抑制酶接近纖維素。其它在酸性預(yù)處理過程中形成的木質(zhì)素衍生物包括可抑制酶功能的小的含酚片段和化合物。還認(rèn)為用脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料至少部分是通過結(jié)合木質(zhì)素，因而減少和/或抑制木質(zhì)素對纖維素水解酶的非生產(chǎn)性吸附而起作用的。因此，用脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料可通過抑制木質(zhì)素結(jié)合酶并改進酶活性來改進對含木質(zhì)素底物的加工。脫墨紙污泥可通過阻止所述酶與木質(zhì)素不利地相互作用，從而保持可用于更有效地水解生物質(zhì)底物來減少酶的使用和/或改進酶性能。本方法在含木質(zhì)素的生物質(zhì)漿料的水解中減少酶加載。通過用脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料顯著減少了提供水解所需的酶量。減少酶加載減少了生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工藝的總成本。根據(jù)一個實施方案，所述方法使用脫墨紙污泥增強了含木素纖維素生物質(zhì)的酶水解。該方法包括用有效的木質(zhì)素阻斷量的脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料，并將經(jīng)處理的生物質(zhì)漿料暴露于有效量的水解酶的步驟。所述脫墨紙污泥可在預(yù)處理過程中或之后，或水解之前或過程中直接添加于所述生物質(zhì)漿料。優(yōu)選在添加纖維素水解酶和發(fā)酵生物之前將所述脫墨紙污泥添加至生物質(zhì)漿料。脫墨紙污泥紙再循環(huán)(paperrecycling)是回收廢紙，并將其重新制漿(r印ulp)為新紙制品的工藝。脫墨(deinking)或浮選(flotation)是再循環(huán)工藝中的一個步驟。脫墨一般包括三個步驟使墨水從解體的紙纖維表面脫離，這通常是在重新制漿過程中進行的，有效地將油墨顆粒附著于氣泡表面，并將泡沫和油墨顆粒從浮選槽(flatationcell)去除。脫墨化學(xué)劑促進油墨顆粒從浮選槽的去除。其通常包括氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、過氧化氫、螯合劑和表面活性劑的配制物。脫墨紙污泥是來自紙再循環(huán)工藝的廢品。通常，再循環(huán)造紙廠花錢來處置脫墨紙污泥。所述污泥包含從浮選槽去除的泡沫和油墨。其還包含涂料、粘合劑、染料、填充劑、紙微粒(paperfine)和添加用于將油墨和染料從被再循環(huán)的紙去除的脫墨化學(xué)劑。之前并不知道使用脫墨紙污泥改進酶水解工藝。使用脫墨紙污泥以促進酶水解在經(jīng)濟上是有益的。其給造紙廠提供了污泥處置問題的至少部分解決方案，從而減少了處置費用。使用脫墨紙污泥增加酶水解的效率為紙再循環(huán)者和發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)者提供了經(jīng)濟和環(huán)境方面的益處。涵蓋了首先用脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料，然后添加纖維素水解酶使得纖維素轉(zhuǎn)化具有最高的效率。用脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料還可與將水解酶添加至生物質(zhì)漿料同時進行。用脫墨紙污泥處理生物質(zhì)漿料產(chǎn)生從纖維素的水解產(chǎn)量，其可測量為最終糖產(chǎn)量或纖維素轉(zhuǎn)化率提高的百分?jǐn)?shù)。舉例而言，與來自未經(jīng)脫墨紙污泥處理的生物質(zhì)漿料的纖維素的水解產(chǎn)量相比，可于最終的糖產(chǎn)量方面得到大約的提高。此外，再舉一例，與來自未經(jīng)脫墨紙污泥處理的生物質(zhì)漿料的纖維素的水解產(chǎn)量相比，可于纖維素轉(zhuǎn)化率方面得到大約的提高。不拘于任何具體理論，認(rèn)為脫墨紙污泥對木質(zhì)素的非特異性結(jié)合可減少酶對木質(zhì)素表面的非生產(chǎn)性結(jié)合或由于與木質(zhì)素的相互作用對酶活性的抑制。因此，在木素纖維素轉(zhuǎn)化的工藝中使用脫墨紙污泥處理促使酶加載水平下降而取得了相同的目標(biāo)轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)。含木素鄉(xiāng)千纟佳素材料“木素纖維素”或“含木素纖維素材料”意指主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的材料。上述材料常常被稱作“生物質(zhì)”。生物質(zhì)具有纖維素纖維包裹于木質(zhì)素和半纖維素鞘中的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)使其不易受酶水解。為了增強酶水解，必須預(yù)處理生物質(zhì)例如通過在足夠的壓力和溫度條件下進行酸水解以打破木質(zhì)素的密封，糖化并溶解半纖維素，并破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。然后可將纖維素用酶水解，例如通過纖維素分解酶處理，來將糖聚合物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的可發(fā)酵的糖。還可使用半纖維素分解酶處理來水解經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)中任何殘留的半纖維素。生物質(zhì)可為任何含有木素纖維素的材料。在一個優(yōu)選實施方案中，生物質(zhì)含有至少約30wt.%，優(yōu)選至少約50wt.%，更優(yōu)選至少約70wt.%，甚至更優(yōu)選至少約90wt.%木素纖維素。應(yīng)理解的是，所述生物質(zhì)還可包含其它成分如蛋白質(zhì)材料、淀粉和糖如可發(fā)酵或不可發(fā)酵的糖，或其混合物。生物質(zhì)通常見于例如植物的莖、葉、殼/莢(hull)、殼/皮/莢/苞(husk)和穗軸或樹的葉、枝和木材。生物質(zhì)包括但不僅限于草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。應(yīng)理解的是，生物質(zhì)可為在混合的基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料的形式。其它合適的生物質(zhì)的實例包括玉米纖維、稻稈、松木、刨花、甘蔗渣、紙和紙漿加工廢物、玉米秸稈、玉米穗軸、硬木如楊木和樺木、軟木、谷物秸稈如麥稈、稻稈、柳枝稷、芒屬(Miscanthus)、稻殼、城市固體廢物(MSW)、工業(yè)有機廢物、辦公室用紙或其混合物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述生物質(zhì)選自玉米秸稈、玉米穗軸、玉米纖維、麥稈、稻稈、柳枝稷和甘蔗渣中的一種或多種。預(yù)處理所述生物質(zhì)可用任何合適的方式進行預(yù)處理。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理可包括將脫墨紙污泥引入所述生物質(zhì)。預(yù)處理在水解和/或發(fā)酵之前進行。預(yù)處理的目標(biāo)是分離或釋放纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，從而改進水解的速率和效率。預(yù)處理方法(包括濕法氧化和堿性預(yù)處理)靶向木質(zhì)素釋放，而稀酸處理和自水解(auto-hydrolysis)靶向半纖維素釋放。蒸汽爆炸是靶向纖維素釋放的預(yù)處理方法。預(yù)處理步驟可包括其中將脫墨紙污泥添加至生物質(zhì)的步驟。如前所示，當(dāng)添加脫墨紙污泥時，生物質(zhì)通常為生物質(zhì)漿料的形式。如果脫墨紙污泥是在預(yù)處理過程中添加至生物質(zhì)漿料的，預(yù)處理工藝的其余部分仍然保持常規(guī)。然而，或者可將脫墨紙污泥在水解步驟添加，從而使得預(yù)處理步驟為使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)的常規(guī)預(yù)處理步驟。脫墨紙污泥可以以約0_20wt.%總生物質(zhì)漿料的范圍添加。優(yōu)選地，脫墨紙污泥以約IOwt.%或更少的總生物質(zhì)漿料，更優(yōu)選以約5wt.%或更少的總生物質(zhì)漿料的量添加。在預(yù)處理過程中生物質(zhì)可以以約IO-SOwt.%的量，優(yōu)選約20-70wt.%的量，特別是約30-60wt.%的量，如約50wt.%的量存在?；瘜W(xué)、機械和/或生物預(yù)處理在水解之前或過程中，所述生物質(zhì)可經(jīng)化學(xué)、機械、生物預(yù)處理，或其任意組合。優(yōu)選所述化學(xué)、機械或生物預(yù)處理是在水解之前進行的。或者，所述化學(xué)、機械或生物預(yù)處理可與水解同時進行，如與添加一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性同時，以釋放例如可發(fā)酵的糖如葡萄糖或麥芽糖。在一個實施方案中，經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)可以以另一種方式洗滌或解毒。然而，洗滌或解毒并非必需的。在一個優(yōu)選實施方案中，經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)未經(jīng)洗滌或解毒?；瘜W(xué)預(yù)處理短語“化學(xué)預(yù)處理”指促進纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的分離或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理方法的實例包括用例如稀酸、石灰、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫或二氧化碳進行處理。此外，濕法氧化和控制PH的水熱解(hydrothermolysis)亦視為化學(xué)預(yù)處理。在一個優(yōu)選實施方案中，所述化學(xué)預(yù)處理為酸處理，更優(yōu)選，為連續(xù)的稀酸或弱酸(mildacid)處理，例如，用硫酸，或用其它有機酸，如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、鹽酸或其混合物處理。也可使用其它酸。弱酸處理意為處理的PH在約pH1-5，優(yōu)選在約pH1-3的范圍內(nèi)。在一個具體實施方案中，所述酸濃度在0.1到2.酸的范圍內(nèi)，并優(yōu)選為硫酸。該酸可與所述生物質(zhì)相接觸，且混合物可保持在約160-220°C，如約165-195°C范圍內(nèi)的溫度，處理時間為數(shù)分鐘到數(shù)秒，例如，1-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘?？蛇\用強酸(如硫酸)來移除半纖維素。強酸的添加增強了纖維素的可消化性。根據(jù)本發(fā)明亦涵蓋其它化學(xué)預(yù)處理技術(shù)。已經(jīng)顯示纖維素溶劑處理將約90%的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。也顯示了當(dāng)木素纖維素結(jié)構(gòu)被破壞時，極大增強了酶水解。堿、H2O2、臭氧、有機溶劑(使用含水醇中的路易斯酸，I^eCl3,(Al)2SO4)、甘油、二噁燒，苯酚或乙二醇屬于已知破壞纖維素結(jié)構(gòu)并促進水解的溶劑(Mosier等，2005，BioresourceTechnology96673-686)。本發(fā)明也涵蓋了使用堿，例如NaOH，Na2CO3和氨等的堿性化學(xué)預(yù)處理。使用氨的預(yù)處理方法描述于例如WO2006/11089UW02006/110899、W02006/110900、W02006/110901,其通過提述并入本文。濕氧化技術(shù)涉及使用氧化劑，如，基于亞硫酸鹽的氧化劑等。溶劑預(yù)處理的實例包括用DMSO(二甲亞砜)等的處理?；瘜W(xué)預(yù)處理通常進行1到60分鐘，如5到30分鐘，但可依賴于待進行預(yù)處理的材料進行較短或較長的時間。其它合適的預(yù)處理方法的實例描述于khell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.105-108卷69-85禾口Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686，以及美國申請公開2002/0164730號，其每一個均通過提述并入本文。機械預(yù)處理短語“機械預(yù)處理”指任何機械的或物理的預(yù)處理，其促進自生物質(zhì)分離或釋放纖維素、半纖維素或木質(zhì)素。舉例而言，機械預(yù)處理包括多種類型的磨制、輻射、汽蒸/蒸汽爆炸(steamexplosion)，以及水熱解。機械預(yù)處理包括粉碎，即機械減小大小。粉碎包括干磨、濕磨和振動球磨(vibratoryballmilling)。機械預(yù)處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)?！案邏骸币庵笁毫υ诩s300到600psi，優(yōu)選400到500psi，例如約450psi的范圍內(nèi)。高溫意指溫度在約100到300°C，優(yōu)選約140到235°C的范圍內(nèi)。在一個優(yōu)選實施方案中，機械預(yù)處理是分批工藝的蒸汽槍水解器系統(tǒng)，其使用如上定義的高壓和高溫。也可為此使用SimdsHydrolyzer(可由SundsDefibratorAB(Sweden)得至丨J)。組合的化學(xué)和機械預(yù)處理在一個優(yōu)選實施方案中，對生物質(zhì)進行了化學(xué)和機械預(yù)處理。例如，所述預(yù)處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。所述化學(xué)和機械預(yù)處理可根據(jù)需要順序或同時進行。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，對生物質(zhì)進行化學(xué)和機械預(yù)處理以促進纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的分離或釋放。在一個優(yōu)選實施方案中，所述預(yù)處理作為稀酸或弱酸預(yù)處理步驟進行。在另一個優(yōu)選實施方案中，預(yù)處理作為氨纖維爆炸(fiberexplosion)步驟(或AFEX預(yù)處理步驟)進行。牛物預(yù)處理短語“生物預(yù)處理”指促進自生物質(zhì)分離或釋放纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可涉及應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,Τ.-A.，1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.Ε.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.禾口Singh,Α.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass-.areview,^"EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.禾口Overend,R.P.編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson,L.禾口Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander,L.禾口Eriksson，K.-Ε.L.，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。^CM在發(fā)酵經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)(優(yōu)選為生物質(zhì)漿料的形式)之前，可將其水解以將纖維素和半纖維素降解為可發(fā)酵的糖。在一個優(yōu)選實施方案中，經(jīng)預(yù)處理的材料在發(fā)酵之前經(jīng)水解，優(yōu)選酶水解。水解過程中的干固體含量可為約5_50wt.%，優(yōu)選約10_40wt.%，優(yōu)選約20-30wt.%的范圍。在一個優(yōu)選實施方案中，水解可作為補料分批工藝進行，其中將經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)(即，底物)逐漸加料于例如含有酶的水解溶液。在一個優(yōu)選實施方案中，水解是通過酶法進行的。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿料可由一種或多種纖維素分解酶如纖維素酶或半纖維素酶或其組合來水解。在一個優(yōu)選實施方案中，水解是使用下述纖維素分解酶制備物來進行的，其包含一種或多種具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，具有纖維素分解增強活性的多肽是家族GH61A來源的。合適和優(yōu)選的纖維素分解酶制備物和具有纖維素分解增強活性的多肽的實例描述于下面的“纖維素分解酶”部分。因為生物質(zhì)可含有除了木質(zhì)素、纖維素和半纖維素之外的組分，水解和/或發(fā)酵可在其它酶活性如蛋白酶活性、淀粉酶活性、糖生成酶活性和酯酶活性如脂肪酶活性存在下進行。酶水解優(yōu)選在合適的水性環(huán)境中在本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定的條件下進行。在一個優(yōu)選實施方案中，水解在對所述酶合適的，優(yōu)選為最佳的條件下進行。合適的工藝時間、溫度和pH條件可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，水解在25至70°C，優(yōu)選40至60°C，特別是約50°C的溫度實施。水解優(yōu)選在pH3_8，優(yōu)選pH4-6，特別是約pH5的pH范圍中實施。此外，水解通常進行12至192小時，優(yōu)選16至72小時，更優(yōu)選24至48小時。鐘來自經(jīng)預(yù)處理和/或水解的生物質(zhì)的可發(fā)酵糖可以通過一種或多種發(fā)酵生物發(fā)酵，所述發(fā)酵生物能夠直接或間接地將糖類，如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖發(fā)酵成想要的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵條件依賴于想要的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物，并且能夠由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。特別是在乙醇發(fā)酵的情況下，發(fā)酵可以進行1-48小時，優(yōu)選I-M小時。在一個實施方案中，所述發(fā)酵在20-40°C，優(yōu)選，特別是大約32°C的溫度進行。在一個實施方案中，PH大于5。在另一個實施方案中，pH為pH3-7，優(yōu)選4-6。然而，某些發(fā)酵生物，例如細菌發(fā)酵生物具有較高的最佳發(fā)酵溫度。因此，在一個實施方案中，發(fā)酵在40-60°C，如50-60°C的溫度進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定合適的發(fā)酵條件。發(fā)酵可以在分批、補料分批或連續(xù)反應(yīng)器中進行。補料分批發(fā)酵可以是固定體積或可變體積的補料分批。在一個實施方案中，采用補料分批發(fā)酵。補料分批發(fā)酵的體積和速率依賴于，例如，發(fā)酵生物、可發(fā)酵糖類的性質(zhì)(identity)和濃度、和想要的發(fā)酵產(chǎn)物。這樣的發(fā)酵速率和體積能夠由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。SSF、HHF和SHF水解和發(fā)酵可作為同時水解和發(fā)酵步驟(SSF)進行。通常這意味組合的/同時水解和發(fā)酵在對所述發(fā)酵生物合適，優(yōu)選最佳的條件(例如，溫度和/或PH)下進行。水解步驟和發(fā)酵步驟可作為混合水解和發(fā)酵(HHF)實施。HHF通常以單獨的部分水解步驟開始，并以同時水解和發(fā)酵步驟結(jié)束。單獨的部分水解步驟為酶法纖維素糖化步驟，通常在對所述的水解酶合適，優(yōu)選最佳的條件(例如在較高溫度)下進行。后續(xù)的同時水解和發(fā)酵步驟通常在對發(fā)酵生物合適的條件(常常在比所述單獨水解步驟更低的溫度)下進行。水解和發(fā)酵步驟也可作為單獨的水解和發(fā)酵步驟進行，其中所述水解在起始發(fā)酵之前已經(jīng)完成。這常常稱作“SHF”。Ml^在發(fā)酵之后，可任選地自發(fā)酵培養(yǎng)基中以任何合適的方式分離發(fā)酵產(chǎn)物。例如，可蒸餾發(fā)酵培養(yǎng)基以提取發(fā)酵產(chǎn)物，或可自發(fā)酵培養(yǎng)基中通過微濾或膜過濾技術(shù)提取發(fā)酵產(chǎn)物。或者，可通過汽提(stripping)回收發(fā)酵產(chǎn)物?；厥辗椒ㄔ诒绢I(lǐng)域為眾所周知的。發(fā)酵生物短語“發(fā)酵生物”指任何適于產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細菌和真菌生物。發(fā)酵生物可為C6或C5發(fā)酵生物，或其組合。C6和C5發(fā)酵生物在本領(lǐng)域均為眾所周知的。合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⒖砂l(fā)酵的糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖直接或間接發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為所需的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物的實例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)白勺，牛寺另0酉良(Saccharomycescerevisiae)##(Saccharomycesuvarum)的菌株，畢赤酵母屬(Pichia)的菌株，特別是樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株如樹干畢赤酵母CBS5773或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假絲酵母屬(Candida)的菌株，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)，阿糖發(fā)酵假絲酵母(Candidaarabinofermentans),ii^fKjix^if^fiJ(Candidadiddensii),Candidasonorensis,^Ρ^塔假絲酵母(Candidashehatae)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)或博伊丁氏假絲酵母(Candidaboidinii)的菌株。其它發(fā)酵生物包括漢遜酵母屬(Hansenula)的菌株，特別是多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)或異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌株，特別是脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)或馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)的菌株；和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，牛寺另0-(Schizosaccharomycespombe)的菌株。優(yōu)選的細菌發(fā)酵生物包括埃希氏菌屬(Escherichia)，特別是大腸桿菌(Escherichiacoli)的菌株，發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的菌株，特別是運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株，發(fā)酵細菌屬(ZymcAacter)的菌株，特別是棕櫚發(fā)酵細菌(ZymcAactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的菌株，特別是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株，明串珠菌屬(Leuconostoc)的菌株，特別是腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌株，梭菌屬(Clostridium)的菌株，特另Ij是丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的菌株，腸桿菌屬(Enterobacter)的菌株，特別是產(chǎn)H^lflii(Enterobacteraerogenes)的胃_，^,δ,^ΜΙΤlifM(Thermoanaerobacter)的菌株，特別是熱厭氧桿菌BGlLl(App1.Micrbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇熱厭氧桿|if(Thermoanarobacterethanolicus)StJlifttlif(ThermoanaerobacterthermosaccharoIyticum)sK^iffifK^iMiilflii(Thermoanaerobactermathrani)的lif株。還涵蓋了了乳桿菌屬(LactcAacillus)以及谷氨酸棒狀桿菌I^CorynebacteriumglutamicumR)，熱葡糖苷酶芽孢桿菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和熱葡糖苷酶地芽抱桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。在一個實施方案中，所述發(fā)酵生物為C6糖類發(fā)酵生物，例如，釀酒酵母的菌株。與木素纖維素衍生材料的發(fā)酵相關(guān)，涵蓋了C5糖發(fā)酵生物。大多數(shù)C5糖發(fā)酵生物也發(fā)酵C6糖。C5糖發(fā)酵生物的實例包括畢赤酵母屬的菌株，例如樹干畢赤酵母菌種的菌株。C5糖發(fā)酵細菌也是已知的。而且，一些釀酒酵母菌株發(fā)酵C5(和C6)糖。實例為能夠發(fā)酵C5糖的酵母屬菌種的經(jīng)遺傳修飾的菌株，包括，例如，Ho等，1998，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,ρ·1852-1859禾口Karhumaa等，2006,MicrobialCellFactories5:18中關(guān)注的那些。某些發(fā)酵生物的發(fā)酵性能可受發(fā)酵培養(yǎng)基中的抑制劑的存在所抑制，因此減少了乙醇產(chǎn)生能力。已知在生物質(zhì)水解物中的化合物和高濃度的乙醇抑制某些酵母細胞的發(fā)酵能力。預(yù)適應(yīng)或適應(yīng)方法可減少該抑制作用。通常酵母細胞的預(yù)適應(yīng)或適應(yīng)涉及在發(fā)酵前11順序地培養(yǎng)酵母細胞，以增加所述酵母的發(fā)酵性能并增加乙醇產(chǎn)生。酵母預(yù)適應(yīng)和適應(yīng)方法在本領(lǐng)域為已知的。上述方法可包括例如在粗生物質(zhì)水解物的存在下培養(yǎng)酵母細胞；在抑制劑例如酚化合物、糠醛和有機酸的存在下培養(yǎng)酵母細胞；在非抑制量的乙醇存在下培養(yǎng)酵母細胞；以及在酵母培養(yǎng)物中補充乙醛。在一個實施例中，所述發(fā)酵生物為在發(fā)酵之前進行一種或多種預(yù)適應(yīng)或適應(yīng)方法的酵母菌株。某些發(fā)酵生物如酵母需要足夠的氮源以供繁殖和發(fā)酵。許多氮源可供使用，且上述氮源在本領(lǐng)域是眾所周知的。在一個實施方案中，使用了低成本的氮源。這樣的低成本氮源可為有機的，如尿素，DDG，濕餅(wetcake)或玉米醪(cornmash)，或無機的，例如氨或氫氧化銨。適用于乙醇產(chǎn)生的商業(yè)上可得到的酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可由Fermentis/Lesaffre,USA得到)，F(xiàn)ALI(可由Fleischmann，sYeast,USA得到)，SUPERSTART和THERM0SACC新鮮酵母(可由EthanoljTechnology，WI，USA得到)，BIOFERMAFT禾ΠXR(可由NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA得到)，GERTSTRAND(可由GertStrandAB,Sweden得到)，以及FERMI0L(可由DSMSpecialties得到)。發(fā)酵產(chǎn)物本發(fā)明可用于產(chǎn)生任何發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇類(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，吐和0)2)；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)；以及激素。其它產(chǎn)物包括消費醇類工業(yè)產(chǎn)物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工業(yè)產(chǎn)物，例如，發(fā)酵的乳制品；皮革工業(yè)產(chǎn)物和煙草工業(yè)產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇，特別是乙醇。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)可優(yōu)選用作燃料醇/乙醇。然而，對于乙醇，其亦可用作飲用乙醇。酶在本發(fā)明的方法或工藝的上下文中，即使未特別提及，也可理解的是酶以及其它化合物是以有效量使用的?？墒褂靡环N或多種酶。纖維素分解酶本文所使用的短語“纖維素分解活性”應(yīng)理解為包括具有纖維二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)的酶，例如，纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)的酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述纖維素分解活性可為真菌來源的酶制備物的形式，如來自木霉屬(Trichoderma)的菌株，優(yōu)選里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株；腐質(zhì)霉屬(Humicola)的菌株，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)的菌株；或金孢子菌屬(Chrysosporium)的菌株，優(yōu)選ChrysosporiumIucknowense的菌株。所述纖維素分解酶制備物可含有一種或多種下述活性酶、半酶(hemienzyme)、纖維素分解酶增強活性、β-葡糖苷酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或木糖異構(gòu)酶。所述酶可為如PCT/US2008/065417中定義的組合物，其通過提述并入本文。例如，所述纖維素分解酶制備物包括具有纖維素分解增強活性的多肽，優(yōu)選家族GH61A的多肽，優(yōu)選WO2005/074656(Novozymes)中公開的多肽。所述纖維素分解酶制備物還可包括β-葡糖苷酶，例如來源于木霉屬、曲霉屬或青霉屬(Penicillium)菌株的β-葡糖苷酶，包括WO2008/057637中公開的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。所述纖維素分解酶制備物還可包括CBHII酶，優(yōu)選土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纖維二糖水解酶IICEL6A。所述纖維素分解酶制備物還可包含纖維素分解酶，優(yōu)選來源于里氏木霉或特異腐質(zhì)霉的纖維素分解酶。所述纖維素分解酶制備物還可包含WO2005/074656中公開的具有纖維素分解增強活性(GH61A)的多肽；β-葡糖苷酶(W02008/057637中公開的融合蛋白)以及來源于里氏木霉的纖維素分解酶。纖維素分解酶可為商業(yè)上可以獲得的產(chǎn)品CELLUCLAST1.5L或CELLUZYME(可得自NovozymesA/S，Denmark)或ACCELERASE1000(來自GenencorInc.USA)?？梢约尤肜w維素分解酶以供水解經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)漿料。纖維素分解酶可以以0.1-100FPU每克總固體(TS)，優(yōu)選0.5-50FPU每克TS，特別是1-20FPU每克TS范圍內(nèi)的劑量加入。在另一個實施方案中，將至少0.Img纖維素分解酶每克總固體(TS)，優(yōu)選至少;3mg纖維素分解酶每克TS，如5-10mg纖維素分解酶每克TS用于水解。內(nèi)切葡聚糖酶(EG)在水解過程中可存在一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶。術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(Ε.C.No.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合型β-1，3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纖維素成分的植物材料中β-1，4-鍵的內(nèi)水解。內(nèi)切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據(jù)(ihOSe，1987，PUreandApp1.Chem.59:257-268的方法確定。內(nèi)切葡聚糖酶可來源于木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉的菌株；腐質(zhì)霉屬的菌株，如特異腐質(zhì)霉的菌株；或金孢子菌屬的菌株，優(yōu)選Chrysosporiumlucknowense的菌株。纖維二糖水解酶(CBH)在水解過程中可存在一種或多種纖維二糖水解酶。術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纖維素，纖維寡糖或任何含有β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中催化l，4-i3-D-葡糖苷鍵的水解，自鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。纖維二糖水解酶的實例為上面提及的，包括來自里氏木霉、特異腐質(zhì)霉的CBHI和CBHII；和來自土生梭孢霉的CBHII纖維二糖水解酶(CELL6A)。纖維二糖水解酶活性可根據(jù)由Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279和由vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters149:152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters187:283-288描述的方法來確定。所述Lever等的方法適用于評估玉米秸桿中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等的方法適用于基于熒光二糖衍生物確定纖維二糖水解酶的活性。g-葡糖苷酶在水解過程中可存在一種或多種β-葡糖苷酶。術(shù)語“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，及β-D-葡萄糖的釋放。就本發(fā)明而言，β-葡糖苷酶的活性根據(jù)由Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法確定，只是如本文所述使用不同的條件。一單位的β-葡糖苷酶活性定義為在IOOmM檸檬酸鈉、0.01%TWEEN20中在50°C、pH5自作為底物的4mMρ-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的ρ-硝基苯酚。所述β-葡糖苷酶可為真菌來源，例如木霉屬、曲霉屬或青霉屬的菌株。所述β-葡糖苷酶可來源于里氏木霉，如由bgll基因編碼的β-葡糖苷酶(參見EP562003的圖1)。所述β-葡糖苷酶可來源于米曲霉(根據(jù)WO2002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)，煙曲霉(Aspergillusfumigatus)(根據(jù)WO2002/095014的實施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生)，或黑曲霉(1981，J.Appl.第3卷，ppl57-163)。半纖維素酶半纖維素可由半酶和/或酸水解分解以釋放其五和六碳糖組分。木素纖維素衍生材料可用一種或多種半纖維素酶進行處理。可使用任何適用于水解半纖維素(優(yōu)選水解為木糖)的半纖維素酶。優(yōu)選的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶，內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及上述兩種或更多種的混合物。優(yōu)選的，用于本發(fā)明的半纖維素酶為外作用的(exo-acting)半纖維素酶，且更優(yōu)選地，所述半纖維素酶為下述的外作用的半纖維素酶，其具有在PH小于7，優(yōu)選3-7的酸性條件下水解半纖維素的能力。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實例包括VISC0ZYME(可自NovozymesA/S,Denmark得到)。所述半纖維素酶可為木聚糖酶。所述木聚糖酶可優(yōu)選為微生物來源的，如真菌來源的(例如，木霉屬、多孔菌屬(Meripilus)、腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium))或來自細菌(例如，芽孢桿菌屬(Bacillus))。所述木聚糖酶可來源于絲狀真菌，優(yōu)選來源于曲霉屬，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的菌株，或腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可優(yōu)選為內(nèi)切_1，4-β-木聚糖酶，更優(yōu)選GHlO或GHll的內(nèi)切-1，4_β-木聚糖酶。商業(yè)木聚糖酶的實例包括來自NovozymesA/S，Denmark的SHEARZYME和BIOFEEDWHEAT。所述半纖維素酶也可以有效水解半纖維素的量添加，如，以不溶性固體的約0.001到0.5wt%總固體(TS)，更優(yōu)選約0.05到0.5wt%TS的量添加。木聚糖酶也可以0.001-1.Og/kg干物質(zhì)(DM)底物的量，優(yōu)選以0.005-0.5g/kgDM底物的量，且最優(yōu)選以0.05-0.10g/kgDM底物的量添加。木糖異構(gòu)酶木糖異構(gòu)酶(D-木糖酮異構(gòu)酶)(E.C5.3.1.5)為催化D-木糖變?yōu)镈-木酮糖的可逆異構(gòu)化反應(yīng)的酶。葡糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化D-葡萄糖到D-果糖的可逆異構(gòu)化。然而，葡糖異構(gòu)酶時稱作木糖異構(gòu)酶。木糖異構(gòu)酶可用于本發(fā)明方法或工藝，且可為任何具有木糖異構(gòu)酶活性的酶，且可得自任何來源，優(yōu)選細菌或真菌來源，如絲狀真菌或酵母。細菌木糖異構(gòu)酶的實例包括屬于鏈霉菌屬(Str印tomyces)、游動放線菌屬(Actinoplanes)、芽孢桿菌屬和黃桿菌屬(FlavcAacterium)的那些，以及棲熱袍菌屬(Thermotoga)的，例如新阿波羅棲熱袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海棲熱袍菌(T.maritime)。真菌木糖異構(gòu)酶的實例為擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)來源的菌種。優(yōu)選的木糖異構(gòu)酶來源于酵母假絲酵母屬的菌株，優(yōu)選博伊丁氏假絲酵母，特別是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.,52(7):1817-1824公開的博伊丁氏假絲酵母木糖異構(gòu)酶。所述木糖異構(gòu)酶可優(yōu)選來源于博伊丁氏假絲酵母的菌株(Kloeckera2201)，其以DSM70034和ATCC48180保藏，公開于Ogata等，Agric.Biol.Chem,33,1519-1520或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem,52(2)，1519-1520。在一個實施方案中，所述木糖異構(gòu)酶來源于鏈霉菌屬的菌株，例如，來源于鼠灰鏈霉菌(Sti^ptomycesmurinus)的菌株(美國專利號4，687，742)、黃微綠鏈霉菌(S.flavovirens)、白色鏈霉菌(S.albus)、不產(chǎn)色鏈霉菌(S.achromogenus)、多刺鏈霉菌(S.echinatus)、威德莫爾鏈霉菌(S.wedmorensis)，其均公開于美國專利3，616，221號。其它的木糖異構(gòu)酶公開于美國專利3，622，463號，美國專利4，351，903號，美國專利4，137，126號，美國專禾Ij3，625，828號，HU專利12,415號，DE專利2，417，642，JP專利69，觀，473號，以及WO2004/044129，每個均通過提述并入本文。所述木糖異構(gòu)酶可為固定化或液體形式。優(yōu)選液體形式。商業(yè)上可得到的木糖異構(gòu)酶的實例包括來自NovozymesA/S，Denmark的SWEETZYMEΤ。添加的木糖異構(gòu)酶的量提供0.01-100IGIU每克總固體范圍內(nèi)的活性水平。α-淀粉酶可使用一種或多種α-淀粉酶。優(yōu)選的淀粉酶是微生物來源的，如細菌或真菌來源。雖然最適合的α-淀粉酶是基于工藝條件確定的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定。優(yōu)選的α-淀粉酶為酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或細菌酸性α-淀粉酶。短語“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(Ε.C.3.2.1.1)，當(dāng)其以有效量添加時，在3到7，優(yōu)選3.5到6，或更優(yōu)選4-5的范圍內(nèi)的ρΗ具有最佳活性。細菌α-淀粉酶如上所示，所述α-淀粉酶可為芽孢桿菌來源。所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶可優(yōu)選來源于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的菌株，但也可來源于其它芽孢桿菌屬菌種。涵蓋的α-淀粉酶的特定實例包括示于WO1999/19467的SEQIDNO4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，示于WO1999/19467的SEQIDNO5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，和示于WO1999/19467的SEQIDNO:3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(所有序列通過提述并入本文)。在一個實施方案中，所述α-淀粉酶可為分別與示于WO1999/19467(通過提述并入本文)的SEQIDN01，2或3中的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶也可為變體和/或雜合體，特別是描述于W01996/23873、WO1996/23874、WO1997/41213、WO1999/19467、WO2000/60059和WO2002/10355(所有文件通過提述并入本文)中任一的變體和/或雜合體。特別涵蓋的α-淀粉酶變體公開于美國專利6，093，562,6,297,038號或美國專利6，187，576號(通過提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一個或兩個氨基酸缺失的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)變體，優(yōu)選W01996/023873公開的雙缺失-參見，例如，第20頁第1-10行(通過提述并入本文)，優(yōu)選與WO1999/19467公開的SEQIDNO3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比對應(yīng)于Δ(181-182)，或使用WO1999/19467中的SEQIDΝ0:3的編號方式缺失氨基酸R179和G180。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬α-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其較之WO99/19467公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有對應(yīng)于Δ(181-182)的雙缺失，且進一步包括N193F取代(也表示為I181*+G182*+N193F)。細菌雜合體α-淀粉酶可使用一種或多種細菌雜合體淀粉酶。特別涵蓋的雜合體α-淀粉酶包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO4)的445個C-末端氨基酸殘基，以及來源于解淀粉芽孢桿菌的α淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO5)的37個N-末端氨基酸殘基，并具有下列取代中的一個或多個，特別是全部G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢桿菌編號方式)。也優(yōu)選具有一個或更多下述突變的變體(或在其它芽孢桿菌屬α-淀粉酶骨架中的對應(yīng)突變)Η1ΜΥ，Α181Τ，N190F,A209V和收64S和/或位置176和179之間兩個殘基的缺失，優(yōu)選Ε178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDΝ0:5編號方式)。真菌α-淀粉酶可使用一種或多種真菌α-淀粉酶。真菌α-淀粉酶包括來源于曲霉屬菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)，黑曲霉(Aspergillusniger)和川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌α-淀粉酶為Fimgamyl樣α-淀粉酶，其來源于米曲霉的菌株。短語“Fungamyl樣α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即與WO1996/23874的SEQIDNO10中所示氨基酸序列的成熟部分顯示高同一性，即，多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%的同一性。另一個優(yōu)選的酸性α-淀粉酶來源于黑曲霉的菌株。所述酸性真菌α-淀粉酶可為來自黑曲霉，作為“AMYA_ASPNG”以原始登錄號P56271公開于Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫中，并描述于WO1989/01969(實施例3)。來源于黑曲霉的商業(yè)上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。所述真菌α-淀粉酶也可為包含淀粉結(jié)合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非雜合體)或其變體。在一個實施方案中，所述野生型α-淀粉酶可來源于川地曲霉(Aspergilluskawachii)的菌株。其它涵蓋的野生型α-淀粉酶包括來源于根毛霉屬(I^hizomucor)和多孔菌屬(Meripilus)的菌株，優(yōu)選微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178通過提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilusgiganteus)菌株的那些α-淀粉酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述α-淀粉酶來源于川地曲霉，并如Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stableα-amylasefromAspergilluskawachii”公開，并進一步作為EMBL:#AB008370公開。真菌雜合體α-淀粉酶可使用一種或多種真菌雜合體α-淀粉酶。所述真菌酸性α_淀粉酶可為雜合體α-淀粉酶。真菌雜合體α-淀粉酶的實例包括公開于WO2005/003311或美國申請公開2005/0054071號(Novozymes)或美國專利申請60/638，614號(Novozymes)中的那些，將其通過提述并入本文。雜合體α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和糖結(jié)合域/模塊(CBM)，如淀粉結(jié)合域，以及任選的接頭。所涵蓋的雜合體α-淀粉酶的特定實例包括美國專利申請?zhí)?0/638，614實施例中的表1到5中公開的那些，包括具有催化域JA118和羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD(US申請60/638，614號中的SEQIDNO100)的Fungamyl變體，具有羅耳阿太菌AMG接頭和SBD(US申請60/638，614號中的SEQIDNO:101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作為美國申請?zhí)?1/316,535中氨基酸序列SEQIDNO20,SEQIDNO72和SEQIDNO:96的組合公開于表5)，或作為W02006/06^90中表5中的V039，和具有羅耳阿太菌葡糖淀粉酶接頭和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US60/638,614中的SEQIDNO:102)。其它特別涵蓋的雜合體α-淀粉酶為美國申請?zhí)?1/316，535和WO2006/06擬90(每個均通過提述并入本文)實施例4中表3、4、5和6中所列的任何雜合體α-淀粉酶。涵蓋的雜合體α-淀粉酶的其它特定實例包括美國申請公開2005/0054071號中公開的那些，包括第15頁表3公開的那些，如具有川地曲霉接頭和淀粉結(jié)合域的黑曲霉α-淀粉酶。也涵蓋下述α-淀粉酶，其與任何上面提及的α-淀粉酶顯示高同一性，g卩，與成熟酶序列顯示多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%同一性。酸性α-淀粉酶可根據(jù)本發(fā)明以0.1至10AFAU/gDS,優(yōu)選0.10至5AFAU/gDS,特別是0.3至2AFAU/gDS的量添加。商業(yè)性α-淀粉酶產(chǎn)品優(yōu)選的包含α-淀粉酶的商業(yè)組合物包括來自DSM的MYC0LASE；BAN、TERMAMYLSC、FUNGAMyL、LIQUOZYMEX禾口SANtmSUPER、SANEXTRAL(NovozymesA/S)禾口CLARASEL-40,000,DEX-LO,SPEZYMEFRED、SPEZYMEAA禾口SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.)，以及以商品名出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由NovozymesA/S,Denmark得至丨J)。糖源生成酶短語“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其為葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(其為麥芽糖生成者)。糖源生成酶能夠產(chǎn)生碳水化合物，其可由所述發(fā)酵生物用作能量源，例如，當(dāng)用于工藝以供產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇時。所產(chǎn)生的碳水化合物可直接或間接地轉(zhuǎn)化為期望的發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇?？纱嬖谔窃瓷擅傅幕旌衔?。特別涵蓋的混合物為至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特別是酸性淀粉酶，甚至更優(yōu)選酸性真菌α-淀粉酶的混合物。葡糖淀粉酶可使用一種或多種葡糖淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明使用的葡糖淀粉酶可來源于任何合適的來源，例如來源于微生物或植物。優(yōu)選的葡糖淀粉酶是真菌或細菌來源的，選自下組曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBOJ.3(5)p.1097-1102)，及其變體，如公開于W01992/00381，WO2000/04136和WO2001/04273(來自Novozymes，Denmark)的那些；公開于WO1984/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4):p.941-949)，及其變體或片段。其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括具有增強的熱穩(wěn)定性的變體G137A和G139A(Chen等，I"6，Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293EAl(Chen等，I"5，Prot.Eng.8,575-582)；Nl82(Chen等，I"4，Biochem.J.3Ol:275_281)；二硫鍵、A246C(Fierobe等，I"6，Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置導(dǎo)入Pro殘基(Li等，1997，ProteinEng.10:1199-1204)。其它的葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌(之前表示為羅耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(參見美國專利4，727，026號和Nagasaka等，1998，"Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii,ApplMicrobiolBiotechnol.50:323-330)，以及踝節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特別是來源于埃莫森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(W01999/28448)、TalaromycesIeycettanus(美國專利Re.32，153號)、杜邦踝節(jié)菌(Talaromycesduponti)禾口嗜熱碟節(jié)菌(Talaromycesthermophilus)(美國專禾[I4，587，215號)。涵蓋的細菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌屬，特別是熱解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135，138)和熱硫化氫梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(TO1986/01831)以及瓣環(huán)栓菌(Trametescingulata)，其披露于W02006/06^89(通過提述并入本文)。還涵蓋了雜合體葡糖淀粉酶。所述雜合體葡糖淀粉酶的實例公開于W02005/045018。具體實例包括公開于WO2005/045018實施例1表1和4的雜合體葡糖淀粉酶，其以其教導(dǎo)雜合體葡糖淀粉酶的程度通過提述并入本文。還涵蓋了與任何上面提及的葡糖淀粉酶顯示高同一性的葡糖淀粉酶，S卩，與成熟酶序列顯示多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%的同一性。商業(yè)上可得到的包含葡糖淀粉酶的組合物包括AMG200L、AMG300L.SANSUPER、SANEXTRAL、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEtmFUEL、SPIRIZYMEB4U和AMGE(來自NovozymesA/S)；0PTIDEX300(來自GenencorInt.)；AMIGASE禾口AMIGASEPLUS(來自DSM)；G-ZYMEG900、G-ZYME和G990ZR(來自GenencorInt.)。葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/gDS,優(yōu)選0.1-lOAGU/gDS,特別是在l_5AGU/gDS，如0.5AGU/gDS的量添加。g-淀粉酶可使用一種或多種β-淀粉酶。術(shù)語“β-淀粉酶”(Ε.C3.2.1.2)為傳統(tǒng)上給予外作用的(exo-acting)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶的名稱，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉以及相關(guān)的葡萄糖聚合物中1，4-α_葡糖苷鍵的水解。自非還原的鏈末端以逐步的方式連續(xù)移除麥芽糖單元直至分子降解，或者，在支鏈淀粉的情況下，直至到達分枝點。釋放的麥芽糖具有β異18頭物構(gòu)象，由此得到淀粉酶的名稱。已經(jīng)從多種植物和微生物中分離了β-淀粉酶(W.Μ.Fogarty和C.T.Kelly，ProgressinIndustrialMicrobiology，第15卷，pp.112-115，1979)。這些β_淀粉酶的特征在于具有40°C到65°C的最適溫度以及4.5到7的最適pH。來自大麥的商業(yè)上可得到的β-淀粉酶為來自NovozymesA/S，Denmark的NOVOZYMWBA和來自GenencorInt.，USA的SPEZYMEBBA1500。產(chǎn)壽芽糖淀粉酶可使用一種或多種產(chǎn)麥芽糖淀粉酶。淀粉酶也可為產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶?！爱a(chǎn)麥芽糖0-淀粉酶”(葡聚糖1，4-0-麥芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯獬搔翗?gòu)象的麥芽糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株NCIB11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶商業(yè)上可由NovozymesA/S得到。產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶描述于美國專利4，598，048，4，604，355和6，162，628號，其通過提述并入本文。所述產(chǎn)麥芽糖淀粉酶可以0.05-5mg總蛋白/克DS或0.05-5MANU/gDS的量添加。蛋白酶蛋白酶可在水解、發(fā)酵或同時水解和發(fā)酵過程中添加。可添加蛋白酶在發(fā)酵過程中反絮凝發(fā)酵生物，特別是酵母。所述蛋白酶可為任何蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白酶為微生物來源的酸性蛋白酶，優(yōu)選真菌或細菌來源的。酸性真菌蛋白酶是優(yōu)選的，但也可使用其它蛋白酶。合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶為酸性蛋白酶，即，特征為能夠在PH7以下的酸性條件下水解蛋白質(zhì)的蛋白酶。涵蓋的酸性真菌蛋白酶包括來源于曲霉屬，毛霉屬(Mucor)、根霉屬(lihizopus)、假絲酵母屬、革蓋菌屬(Coriolus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、蟲霉屬(Enthomophtra)、耙齒菌屬(Irpex)、青霉屬(Penicillium)、絲核菌屬(Sclerotium)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特別涵蓋的是來源于黑曲霉(參見，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，齋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(參見，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘孢曲霉(W01995/02044)或米曲霉的蛋白酶，如ρ印A蛋白酶，以及來自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucormiehei)的酸性蛋白酶。還涵蓋了中性或堿性蛋白酶，如來源于芽孢桿菌屬菌株的蛋白酶。例如，本發(fā)明涵蓋的蛋白酶來源于解淀粉芽孢桿菌，且具有在Swissprot可作為登錄號P06832得到的序列。也涵蓋與在Swissprot可作為登錄號P06832得到的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特別為至少99%同一性的蛋白酶。進一步涵蓋的是與WO2003/048353中作為SEQIDNO1公開的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特別為至少99%的同一性的蛋白酶。還涵蓋木瓜蛋白酶樣蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)內(nèi)的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(蘿蘑蛋白酶(asclepain)),EC3.4.22.14(獼猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(組織蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰內(nèi)肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。在一個實施方案中，所述蛋白酶可來源于曲霉屬，如米曲霉的菌株的蛋白酶制備物。在另一個實施例中，所述蛋白酶可來源于根毛霉屬，優(yōu)選曼赫根毛霉(Miizomucormiehei)的菌株。在另一個涵蓋的實施方案中，所述蛋白酶可為蛋白酶制備物，優(yōu)選來源于曲霉屬(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制備物以及來源于根毛霉屬(優(yōu)選曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。天冬氛酸蛋白醇描述于,例如,HandbookofProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings禾口J.F.Woessner編，AcademicPress,SanDiego，1998，第270章)。天冬氨酸蛋白酶的合適的實例包括，例如，R.M.Berka等，Gene,96,313)(1990)；(R.Μ.Berka等Gene,125，195-198)(1993)；以及Gomi等，Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)公開的那些，其通過提述并入本文。商業(yè)上可得到的產(chǎn)品包括ALCALASE、ESPERASEtm、FLAV0URZYMEtm、PR0MIX、NEUTRASE、RENNILASE、N0V0ZYMFM2.OL,以及N0V0ZYM50006(可由NovozymesA/S,Denmark得到)以及來自GenencorInt.，Inc.USA.的GC106和SPEZYMEFAN。所述蛋白酶可以0.0001-lmg酶蛋白每克DS，優(yōu)選0.001到0.Img酶蛋白每克DS的量存在?；蛘?，所述蛋白酶可以0.0001到lLAPU/gDS，優(yōu)選0.001到0.lLAPU/gDS和/或0.0001到ImAU-RH/gDS，優(yōu)選0.001到0.ImAU-RH/gDS的量存在。本申請描述和要求保護的發(fā)明的范圍不受本文公開的具體實施方案的限制，因為這些實施方案旨在說明本發(fā)明的數(shù)個方面。任何等同的實施方案以及所述實施方案中一種或多種的組合意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)上文的描述，除本文所示和描述的修飾之外對本發(fā)明的多種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。這些修飾也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。此處引用了多篇文獻，將它們公開的內(nèi)容通過提述以整體并入。通過以下實施例進一步描述本發(fā)明，不應(yīng)將這些實施例理解為對本發(fā)明范圍的限制。材料和方法同一性兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列間的同一性程度可通過Clustal方法(Higgins，1989,CABIOS5:151-153)使用LASERGENEMEGALIGN軟件(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)及同一性表和下述多重比對(multiplealignment)參數(shù)確定缺口罰分為10，而缺口長度罰分為10。配對比對參數(shù)(pairwisealignmentparameter)為K元組(Ktuple)=1，缺口罰分=3，窗口=5和對角線=5。就本發(fā)明而言，兩個多核苷酸序列間的同一性可通過WiIbur-Lipman方法(Wilbur禾口Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)使用LASERGENEMEGALIGN軟件(DNASTAR，Inc.，Madison,WI)及同一性表和下述多重比對參數(shù)確定缺口罰分為10，而缺口長度罰分為10。配對比對參數(shù)為K元組=3，缺口罰分=3和窗口=20。蛋白質(zhì)測定法AZCL-酪蛋白測定法將0.2%藍色底物AZCL-酪蛋白溶液攪拌懸于硼砂/NaH2PO4緩沖液pH9中。一邊攪拌一邊將所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶試樣，然后將板在Eppendorf熱混合器中在45°C和600rpm溫育30分鐘。使用變性的酶試樣(100°C沸騰20分鐘)作為空白。在溫育后，通過將微滴定板轉(zhuǎn)移至冰上而終止反應(yīng)，且通過在4°C以3000rpm離心5分鐘來分離有色溶液與固體。將60μL上清轉(zhuǎn)移至微滴定板，并使用BioRad微板讀數(shù)器測定在595nm的吸光度。DNA測定法將50μL含蛋白酶的試樣添加至微滴定板，并通過添加100μLImMρΝΑ底物(5mg溶于100μLDMS0,并進一步用硼砂/NaH2PO4緩沖液pH9.0稀釋至IOmL)來起始所述測定法。監(jiān)測OD4tl5在室溫的增加作為蛋白酶活性的量度。葡糖淀粉酶活件(AGU)葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶單位(AGU)測定。Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在37°C，pH4.3，底物麥芽糖23.2mM，緩沖液乙酸鹽0.1M，反應(yīng)時間5分鐘的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量?？墒褂米詣臃治鰞x系統(tǒng)。將變旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脫氫酶試劑中，使得存在的任何α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為β-D-葡萄糖。葡萄糖脫氫酶特異性地與β-D-葡萄糖在上述反應(yīng)中反應(yīng)，形成NADH，其使用光度計在340nm處測定作為起始葡萄糖濃度的量度。AMG溫育底物麥芽糖232mM緩沖液乙酸鹽0.IMpH4.30±0.05溫育溫度37"C±1反應(yīng)時間5分鐘酶工作范圍0.5-4.OAGU/mL顏色反應(yīng)GlucDH430U/L變旋酶9U/LNAD0.2ImM權(quán)利要求1.一種用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括i.預(yù)處理所述含木素纖維素材料；ii將脫墨紙污泥引入經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料；iii.將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和iv.用發(fā)酵生物發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述脫墨紙污泥是在將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶之前引入所述含木素纖維素材料的。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述脫墨紙污泥是在將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶同時引入所述含木素纖維素材料的。4.權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述脫墨紙污泥是以至少10%w/w造紙廠污泥/含木素纖維素材料的量引入所述含木素纖維素材料的。5.權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述脫墨紙污泥是以至少5%w/w造紙廠污泥/含木素纖維素材料的量引入所述含木素纖維素材料的。6.權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中所述脫墨紙污泥包括來自紙再循環(huán)工藝的脫墨紙污泥。7.權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中使用酸性預(yù)處理來預(yù)處理所述含木素纖維素材料。8.權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其中所述含木素纖維素材料選自下組玉米秸稈、玉米穗軸、玉米纖維、柳枝稷、麥稈、稻稈、甘蔗渣及其混合物。9.用于增強含木素纖維素材料酶水解的方法，包括i.將有效的木質(zhì)素阻斷量的脫墨紙污泥引入所述含木素纖維素材料，和ii將所述含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述脫墨紙污泥是在所述含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶之前引入所述含木素纖維素材料的。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述脫墨紙污泥是在所述含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶同時引入所述含木素纖維素材料的。12.權(quán)利要求9-11任一項所述的方法，其中所述脫墨紙污泥是以至少10%w/w造紙廠污泥/含木素纖維素材料的量引入所述含木素纖維素材料的。13.權(quán)利要求9-12任一項所述的方法，其中所述造紙廠污泥是以至少5%w/w造紙廠污泥/含木素纖維素材料的量引入所述含木素纖維素材料的。14.權(quán)利要求9-13任一項所述的方法，其中所述脫墨紙污泥包括來自紙再循環(huán)工藝的脫墨紙污泥。15.權(quán)利要求9-14任一項所述的方法，其中所述含木素纖維素材料選自下組玉米秸稈、玉米穗軸、玉米纖維、柳枝稷、麥稈、稻稈、甘蔗渣及其混合物。16.根據(jù)下述方法制備的發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括i.預(yù)處理所述含木素纖維素材料；ii將造紙廠污泥引入經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料；iii.將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和iv.用發(fā)酵生物發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。17.一種混合物，包含i.含木素纖維素材料；脫墨紙污泥；和iii.一種或多種水解酶。全文摘要用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括預(yù)處理所述含木素纖維素材料；將造紙廠污泥引入經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料；將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和添加發(fā)酵生物發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述造紙廠污泥包含脫墨紙污泥。文檔編號C12P19/02GK102171358SQ200980138366公開日2011年8月31日申請日期2009年9月30日優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日發(fā)明者李鑫,羅菁申請人:諾維信北美公司