專利名稱：1-o-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種l-o-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯提取物的制備方法，具體涉及從旋覆 花組織培養(yǎng)物中提取及制備藥用活性成分(1-0-Acetylbritanni lactone, ABL)的方法。
背景技術(shù)：
最新藥理學(xué)研究表明，菊科旋覆花屬植物歐亞旋覆花(I皿la brita皿ica L. var. chinensis)的總提取物具有對外周和中樞神經(jīng)的顯著鎮(zhèn)痛作用，低劑量時(shí)抑制炎性疼痛，
高劑量時(shí)既抑制炎性疼痛又可抑制神經(jīng)疼痛。經(jīng)分離得到的主要活性成分之一為i-o-乙
酰大花旋覆花內(nèi)酯(1-0-Acetyl britanni lactone, ABL)。國外亦有專利報(bào)道，ABL可通過 誘導(dǎo)Bcl-2蛋白磷酸化而引發(fā)癌細(xì)胞編程性死亡，具有和紫杉醇相似或更強(qiáng)的抗癌活性， 可作為一種有效的天然化學(xué)防癌劑和治療藥物，應(yīng)用前景十分廣泛。 目前，ABL的提取及制備主要來源于野生歐亞旋覆花的花序部位。在檢測中發(fā)現(xiàn)， 該活性成分在野生植物中的含量極低且不穩(wěn)定，并明顯受到產(chǎn)地和生長環(huán)境的影響，例如 河北張家口山區(qū)的旋覆花花序中ABL含量為3. 21mg/g，河北平原一帶僅為1. 25mg/g ;而采 自湖北的旋覆花樣品中根本不含有ABL。所以，如果單純依靠大量采集野生植物進(jìn)行提取分 離，不僅質(zhì)量難以控制，產(chǎn)品得率低，難以滿足進(jìn)一步的科研及臨床需要，還會制約著進(jìn)一 步工業(yè)化大規(guī)模的提取加工。 生物合成是通過對植物高產(chǎn)細(xì)胞、組織或器官的篩選與優(yōu)化培養(yǎng)，將植物體作為 一個(gè)"藥物加工廠"，在生物反應(yīng)器內(nèi)達(dá)到目標(biāo)成分的高效產(chǎn)出，對于解決中草藥資源的可 持續(xù)利用及天然藥物的生產(chǎn)問題具有重要意義。因此，本發(fā)明提供了一種以旋覆花不同組 織培養(yǎng)物為生物合成載體對藥用活性成分ABL進(jìn)行提取及制備的方法。
目前，有關(guān)ABL的研究主要集中在該化合物成分的提取、分離、純化，以及關(guān)于其 藥理活性作用的報(bào)道方面(專利CN1957939A公開了 ABL用于預(yù)防和治療血管炎癥性疾病 的作用)。在《旋覆花組織培養(yǎng)及無性系建立的研究》文獻(xiàn)資料中，雖然報(bào)道了旋覆花愈傷 組織、組培苗等培養(yǎng)物建立的方法，但尚未涉及其它組培材料，如毛狀根、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng) 等，尤其是針對組織培養(yǎng)物中活性成分ABL的含量測定、提取和制備方法，以及通過生物反 應(yīng)器途徑實(shí)現(xiàn)ABL的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立旋覆花屬植物完整系統(tǒng)的組織培養(yǎng)體系，以及 以這些培養(yǎng)物為生物合成載體進(jìn)行ABL的提取、純化和制備的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟 A、旋覆花無菌苗的培養(yǎng)取旋覆花種子(優(yōu)選來自于野生的旋覆花)，消毒后培養(yǎng) 獲得無菌幼苗。 獲得的無菌苗可以先接種于MS培養(yǎng)基中，生長幾天后，再繼代于MS+0. 5% (質(zhì) 量比)活性炭培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度23 27t:，濕度60 70%，光強(qiáng)28 32iimol/m2. s，光照時(shí)間13 15h/d ; B、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根或黃化苗的獲得 ①愈傷組織的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表 面以形成傷口，接入MS+0. 05-0. 15mg/L CPPU+O. 5-1. 5mg/L6_BA+0. 2-1. Omg/L NAA培養(yǎng)基， 黑暗或弱光條件下誘導(dǎo)愈傷組織的形成。 為了獲得更為疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊，可將MS基本培養(yǎng)基中 NH4N03和KN03的濃度均調(diào)整為2 5g/L，其它成分保持不變，即可獲得更為疏松、生長迅速 的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊； ②懸浮細(xì)胞的獲得將①中獲得的疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊培養(yǎng)于 MS+O. 05-0. 15mg/L CPPU+O. 5_1. 5mg/L NAA固體培養(yǎng)基中，疏松愈傷組織不斷分離并繼代， 每隔20 40天繼代一次，連續(xù)繼代3 5次。 將生長旺盛、質(zhì)地疏松的顆粒狀白色愈傷組織，過細(xì)目篩獲得單細(xì)胞或小的細(xì)胞 團(tuán)，繼代于液體培養(yǎng)基MS+0. 05-0. 15mg/L CPPU+O. 5_1. 5mg/L NAA中，得到懸浮細(xì)胞系。每 3 5周繼代培養(yǎng)一次。溫度23 27"，搖床轉(zhuǎn)速120 140r min—、黑暗或弱光；
③毛狀根的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表面 造成傷口 ，置于已活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡5sec 15min，取出吸干表面菌液，接入 MS培養(yǎng)基中，溫度23 27°C，黑暗培養(yǎng)，7 15天后在感染材料的傷口部位可見毛狀根的 萌生； 發(fā)根農(nóng)桿菌優(yōu)選為ATCC15834，購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心，也可 用其它的發(fā)根農(nóng)桿菌。 ④黃化苗的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗的自然根2 5cm，置于MS培 養(yǎng)基中，5 10天后自然根上可直接分化出黃化苗，將其分離并繼代于MS培養(yǎng)基中，黑暗培 養(yǎng)； C、ABL的提取用于提取ABL的組織培養(yǎng)物可以是懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根、黃 化苗、無菌苗或無菌苗自然根中的一種或幾種的混合物。 優(yōu)選用95%乙醇提取組織培養(yǎng)物中的ABL。具體為將旋覆花組織培養(yǎng)物低溫 (40 45°C )烘干，研磨成粉末，95%乙醇回流2 4次，每次0. 5 1小時(shí)，過濾，合并提取 液，回收乙醇得浸膏。將浸膏懸于300 500ml水中，依次用200 400ml石油醚、氯仿萃 取，萃取液濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即可得到純度較高的ABL產(chǎn)品。
本發(fā)明的ABL的提取制備方法還可進(jìn)一步包括生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)步驟利用 植物生物反應(yīng)器對上述組織培養(yǎng)物(包括懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根、自然根、黃化苗、組 培苗等)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并對大規(guī)模組織培養(yǎng)物進(jìn)行ABL的提取制備。
本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步效果表現(xiàn)在 (1)與從自然環(huán)境生長的旋覆花花序中提取ABL的現(xiàn)今生產(chǎn)方式相比，利用旋覆 花組織培養(yǎng)物進(jìn)行ABL的提取和制備，可以不受自然環(huán)境、分布區(qū)域、季節(jié)變換等外部條件 的影響，具有生長周期短、質(zhì)量和產(chǎn)量穩(wěn)定、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)，而且天然藥物的生產(chǎn)是在 人為可控條件下進(jìn)行，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。 (2)與化學(xué)合成的方法相比，通過生物合成途徑獲得ABL，具有產(chǎn)物可無限、連續(xù)、 均勻地生產(chǎn)，分離、提取操作簡單，成本低、試劑消耗少，不污染環(huán)境，節(jié)約人力物力。
(3)旋覆花組織培養(yǎng)物具有生長速度快、遺傳性能穩(wěn)定、繼代操作簡單、易于培養(yǎng) 等特點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)提供大量提取原料用于ABL的制備，并可進(jìn)一步通過植物生物反應(yīng) 器的大規(guī)模培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 (4)本發(fā)明建立了一套從懸浮細(xì)胞、器官至整株水平較為系統(tǒng)的旋覆花組織培 養(yǎng)及代謝體系。檢測發(fā)現(xiàn)，不同組織培養(yǎng)物中均含有一定量的ABL(組培苗^ 0. 153mg/g DW，愈傷組織^ 0. 179mg/g DW，毛狀根^ 0. 060mg/g DW，自然根^ 0. 034mg/g DW，黃化苗 > 0. 107mg/g DW，懸浮細(xì)胞^ 0. 110mg/g DW)。通過本發(fā)明的方法獲得的ABL的純度達(dá)到 90%以上。


圖1:旋覆花組培苗圖2:旋覆花黃化苗圖3:旋覆花愈傷組織圖4:旋覆花細(xì)胞懸浮液圖5:旋覆花毛狀根圖6:ABL對照品HPLC色譜7:旋覆花愈傷組織樣品HPLC色譜圖(圖中ABL對照品濃度0. 101mg/ml)
具體實(shí)施例方式
A、選取采集的野生旋覆花種子，也可以是栽培旋覆花種子，自來水浸種18 24h 后，用流水反復(fù)沖洗干凈，50 6(TC溫水浸泡20 40min后，在超凈工作臺上用體積比(V/ V)為75X的酒精浸泡l 5min，無菌水充分漂洗，然后用質(zhì)量體積比(W/V)為0. 1%的升汞 溶液浸泡1 10min，無菌水充分漂洗5 8次，接種于含有脫脂棉的無菌三角瓶中。種子 萌發(fā)后選取無菌幼苗，接種于MS培養(yǎng)基中，生長幾天后，繼代于MS+0. 5%活性炭培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)溫度23 27。C，濕度60 70%，光強(qiáng)28 32iimol/m2. s，光照時(shí)間13 15h/d ;
B、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根或黃化苗的獲得 ①愈傷組織的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表 面以形成傷口 ，接入MS+0. 05-0. 15mg/L CPPU+0. 5-1. 5mg/L6-BA+0. 2-1. Omg/LNAA培養(yǎng)基， 黑暗或弱光條件下誘導(dǎo)愈傷組織的形成，15 25天后在傷口部位可見愈傷組織顆粒的形 成。 調(diào)整MS基本培養(yǎng)基中NH4N03和KN03的濃度均為2 5g/L，其它成分保持不變，可 獲得更為疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊； ②懸浮細(xì)胞的獲得將①中獲得的疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊，培養(yǎng)于 MS+0. 05-0. 15mg/L CPPU+0. 5_1. 5mg/L NAA固體培養(yǎng)基中，疏松愈傷組織不斷分離并繼代 培養(yǎng)，5 10天后可獲得長勢良好的疏松團(tuán)塊，以后每隔20 40天繼代一次，連續(xù)繼代3 5次。將生長旺盛、質(zhì)地疏松的顆粒狀白色愈傷組織，過細(xì)目篩獲得單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)， 繼代于液體培養(yǎng)基MS+0. 05-0. 15mg/LCPPU+0. 5-1. 5mg/LNAA中，得到懸浮細(xì)胞系。每3 5周繼代培養(yǎng)一次，溫度23 27t:，搖床轉(zhuǎn)速120 140r min—、黑暗或弱光；
③毛狀根的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表面造成傷口 ，置于已活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌液中浸泡5sec 15min，取出吸干表面菌液，接入MS培養(yǎng)基中，溫度23 27t:，黑暗培養(yǎng)，7 15天后在感染材料的傷口部位可見毛狀根的萌生； ④黃化苗的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗的自然根2 5cm，置于MS培養(yǎng)基中，5 10天后自然根上可直接分化出黃化苗，將其分離并繼代于MS培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)； C、ABL的提取用于提取ABL的組織培養(yǎng)物可以是懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根、黃化苗、無菌苗或無菌苗自然根中的一種或幾種的混合物。 將旋覆花組織培養(yǎng)物低溫(40 45°C )烘干，研磨成粉末，95%乙醇回流2 4次，每次O. 5 1小時(shí)，過濾，合并提取液，回收乙醇得浸膏。將浸膏懸于300 500ml水中，依次用200 400ml石油醚、氯仿萃取，萃取液濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即可得到純度較高的ABL產(chǎn)品。 本發(fā)明的ABL的提取制備方法還可進(jìn)一步包括生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)步驟利用植物生物反應(yīng)器對上述組織培養(yǎng)物(包括懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根、自然根、黃化苗、無菌苗等)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并對大規(guī)模組織培養(yǎng)物進(jìn)行ABL的提取制備。
ABL的檢測方法 薄層色譜法檢測精密稱取ABL標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，制成每lml含lmg ABL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。稱取組織培養(yǎng)物干燥粉末2g，加入甲醇30ml超聲處理15 30min，過濾，濾液濃縮至近干，殘?jiān)勇确? 4ml使其溶解，作為供試品溶液。吸取上述供試品溶液5 iU，標(biāo)準(zhǔn)品溶液10yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60 90):乙酸己酯95%乙醇(6.8 : 2.5 : 0.7)為展開劑(本領(lǐng)域公知公用的)，展開，取出，晾干，噴以5%硫酸香草醛溶液(本領(lǐng)域公知公用的)，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。 含量測定稱取組織培養(yǎng)物干燥粉末1. Og，精密稱定，置于50ml具塞三角瓶中，加甲醇20. 0ml，稱重，超聲提取30 40min，稱重，并補(bǔ)足失重，用漏斗塞棉花過濾，取濾液10ml，蒸干，微孔濾膜過濾，濾液備用。色譜條件HypersilC18色譜柱(250mmX4. 6mm，5 P m);流動相:乙腈-水(33 : 67)(本領(lǐng)域公知公用的);流速1. OmL. min—1 ;檢測波長210nm ;進(jìn)樣量20 y 1 ;柱溫為室溫，ABL的保留時(shí)間約為13min。
實(shí)施例
實(shí)施例1 1、選取飽滿的野生旋覆花種子，自來水浸種24h后，用流水反復(fù)沖洗干凈，50 6(TC溫水浸泡30min后，在超凈工作臺上用75% (V/V)酒精浸泡1 2min，無菌水充分漂洗，然后用0. 1% (W/V)升汞溶液浸泡4 5min，無菌水充分漂洗5次，接種于含脫脂棉的無菌三角瓶中。 為了獲得更多的無菌苗，可以在種子萌發(fā)后選取無菌幼苗，接種于MS培養(yǎng)基中，生長幾天后，繼代于MS+0.5X (質(zhì)量比)活性炭培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為白天溫度27士rC，夜晚溫度23士rC，濕度60 65%，光強(qiáng)28 32iimol/m2. s，光照時(shí)間14h/d。
2、切取步驟1中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗葉片為外植體，劃傷葉片表面以形成傷口，接入MS+0.1mg/L CPPU+1.0mg/L 6-BA+0. 5mg/L NAA培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。溫度25士rC，黑暗或弱光。25天后在葉片的傷口部位可見愈傷組織的形成，愈傷組織誘導(dǎo)率為
682. 9%。 為了獲得胚性較好，質(zhì)地疏松的愈傷組織，以用于獲得懸浮細(xì)胞系。將MS基本培養(yǎng)基中NH4N03和KN03的濃度調(diào)整為3g/L，其它成分不變，即可獲得胚性較好，質(zhì)地疏松的愈傷組織，適宜進(jìn)一步誘導(dǎo)形成懸浮細(xì)胞。 3、將步驟2中獲得的愈傷組織在低溫(40 45°C )烘干，研磨成粉末，乙醇回流3次，每次1小時(shí)，過濾，合并提取液，回收乙醇得浸膏。將浸膏懸于400ml蒸餾水中，依次用300ml石油醚、氯仿萃取，萃取液濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即得到純度較高的ABL產(chǎn)品。 經(jīng)檢測，上述愈傷組織中的ABL含量> 0. 179mg/g DW。提取獲得的ABL純度達(dá)到
90%以上。 實(shí)施例2 1、將實(shí)施例1中步驟2中獲得的疏松愈傷組織生長于MS+0. lmg/LCPPU+1. Omg/LNAA固體培養(yǎng)基中不斷分離并繼代培養(yǎng)，5 10天后可獲得長勢良好的疏松團(tuán)塊，以后每隔20 40天繼代一次，連續(xù)繼代3 5次。將生長旺盛、質(zhì)地疏松的顆粒狀白色愈傷組織，過細(xì)目篩獲得單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)，繼代于液體培養(yǎng)基MS+O. lmg/L CPPU+1. Omg/LNAA中，得到懸浮細(xì)胞系。每3 5周繼代培養(yǎng)一次，溫度23 27°C ，搖床轉(zhuǎn)速120 140r *min—、黑暗或弱光。 2、采取實(shí)施例1中的相同提取方法提取ABL。 經(jīng)檢測，上述懸浮細(xì)胞中的ABL含量> 0. 110mg/g DW。提取獲得的ABL純度達(dá)到
95%以上。 實(shí)施例3 1、切取實(shí)施例1步驟1中的旋覆花無菌苗的成熟葉片作為感染材料，劃傷表面造成傷口 ，置于已活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌液中浸泡10min，取出吸干表面菌液，接
入MS培養(yǎng)基中，溫度25士rc，黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，感染一周左右在感染材料的傷口部
位可見毛狀根的萌生。PCR檢測結(jié)果表明，農(nóng)桿菌T-DNA片斷已整合入毛狀根基因組。
2、采取實(shí)施例1中的相同提取方法提取ABL。 經(jīng)檢測，上述毛狀根中的ABL含量^ 0.060mg/g DW。提取獲得的ABL純度達(dá)到
93%以上。 實(shí)施例4 1、切取實(shí)施例l步驟l中的旋覆花無菌苗上生長的自然根約3cm置于MS培養(yǎng)基中，5天左右在自然根的生長點(diǎn)上可見生長出黃化苗，再將黃化苗切下繼代于MS培養(yǎng)基中，
溫度25士rc，黑暗培養(yǎng)。 2、采取實(shí)施例1中的相同提取方法提取ABL。 經(jīng)檢測，上述黃化苗中的ABL含量> 0. 107mg/g DW。提取獲得的ABL純度達(dá)到
94%以上。 實(shí)施例5 將實(shí)施例1-3中的愈傷組織、懸浮細(xì)胞或毛狀根，利用植物生物反應(yīng)器(優(yōu)選使用上海高機(jī)生物工程有限公司BI0F-6010B/G/B/A微生物發(fā)酵罐)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并對產(chǎn)物進(jìn)行ABL的提取制備。
7
經(jīng)檢測，各培養(yǎng)物中的ABL含量無顯著下降。提取獲得的ABL純度達(dá)到90%以上。
實(shí)施例6 從實(shí)施例1步驟1中獲得的組培苗或自然根中直接提取ABL。 經(jīng)檢測，組培苗中ABL含量X). 153mg/g DW。自然根中ABL含量X). 034mg/g DW。
提取獲得的ABL純度達(dá)到90%以上。 實(shí)施例7 與實(shí)施例1不同的是，步驟2中所使用的培養(yǎng)基為MS+0. 05mg/LCPPU+0. 5mg/L6-BA+O. 2mg/L NAA，達(dá)到了相同的技術(shù)效果。
實(shí)施例8 與實(shí)施例1不同的是，步驟2中所使用的培養(yǎng)基為MS+0. 15mg/LCPPU+l. 5mg/L6-BA+l. 0mg/L NAA，達(dá)到了相同的技術(shù)效果。
實(shí)施例9 與實(shí)施例2不同的是，所使用的固體培養(yǎng)基為MS+0. 05mg/L CPPU+O. 5mg/LNAA，液體培養(yǎng)基為MS+0. 05mg/L CPPU+O. 5mg/L NAA，達(dá)到了相同的技術(shù)效果。
實(shí)施例10 與實(shí)施例2不同的是，所使用的固體培養(yǎng)基為MS+0. 15mg/L CPPU+1. 5mg/LNAA，液
體培養(yǎng)基為MS+0. 15mg/L CPPU+1. 5mg/L NAA，達(dá)到了相同的技術(shù)效果。 本發(fā)明列舉的實(shí)施例旨在更進(jìn)一步地闡明這種從旋覆花組織培養(yǎng)物中提取及制
備ABL的方法，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制，用本發(fā)明實(shí)施例得到的產(chǎn)品和經(jīng)由本
發(fā)明權(quán)利要求書所述均可從旋覆花組織培養(yǎng)物中提取及制備出ABL產(chǎn)品。 實(shí)施例中涉及的縮寫術(shù)語、培養(yǎng)基及統(tǒng)計(jì)方法說明 1、植物培養(yǎng)基MS (Murashige&Skoog， 1962)培養(yǎng)基，是植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域常用的
基本培養(yǎng)基，在組織培養(yǎng)方面的教科書或?qū)嶒?yàn)指導(dǎo)手冊中均可獲得其配方。 2、 CPPU :N-phenyl-N' - (4_pyridyl) urea， N_苯基-N' _(4_妣啶基)脲；6_BA :
6_Benzyladenine，6_節(jié)基腺嘌呤；NAA : a -Naphthale固cetic acid， a _萘乙酸；TDZ :
Thidiazuron， N_苯基_N_噻二唑-5-脲。 3、菌種發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心。
4、標(biāo)準(zhǔn)品ABL標(biāo)準(zhǔn)品(純度> 98% )由河北醫(yī)科大學(xué)新藥研發(fā)中心制備并提供。
5、愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織的塊數(shù)/接種的芽數(shù)。
權(quán)利要求
一種1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯提取物的制備方法，包括如下步驟A、旋覆花無菌苗的培養(yǎng)取旋覆花種子，消毒后培養(yǎng)獲得無菌幼苗；B、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根或黃化苗的獲得①愈傷組織的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表面以形成傷口，接入MS+0.05-0.15mg/L CPPU+0.5-1.5mg/L6-BA+0.2-1.0mg/LNAA培養(yǎng)基，黑暗或弱光條件下誘導(dǎo)愈傷組織的形成；②懸浮細(xì)胞的獲得將①中獲得的疏松、生長迅速的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊培養(yǎng)于MS+0.05-0.15mg/L CPPU+0.5-1.5mg/L NAA固體培養(yǎng)基中，連續(xù)繼代3～5次；將生長旺盛、質(zhì)地疏松的顆粒狀白色愈傷組織，繼代于液體培養(yǎng)基MS+0.05-0.15mg/L CPPU+0.5-1.5mg/L NAA中，得到懸浮細(xì)胞系；培養(yǎng)溫度23～27℃，搖床轉(zhuǎn)速120～140r·min-1，黑暗或弱光培養(yǎng)；③毛狀根的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗任一外植體材料，劃傷表面造成傷口，置于已活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡5sec～15min，取出吸干表面菌液，接入MS培養(yǎng)基中，溫度23～27℃，黑暗培養(yǎng)；④黃化苗的獲得切取步驟A中培養(yǎng)的旋覆花無菌苗的自然根2～5cm，置于MS培養(yǎng)基中，5～10天后自然根上直接分化出黃化苗，將其分離并繼代于MS培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)；C、1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯的提取將獲得的懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根、黃化苗、無菌苗或無菌苗自然根中的一種或幾種的混合物，用于提取1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于旋覆花種子來自于野生的旋覆花。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還進(jìn)一步包括如下步驟，將步驟A獲得的無菌 苗先接種于MS培養(yǎng)基中，生長幾天后，再繼代于MS+0.5X (質(zhì)量比)活性炭培養(yǎng)基中增殖 培養(yǎng)。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其繼代培養(yǎng)條件為溫度23 27。C，濕度60 70%，光強(qiáng)28 32踐ol/m2. s，光照時(shí)間:13 15h/d。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還進(jìn)一步包括如下步驟，將步驟B①中的MS 基本培養(yǎng)基中朋4冊3和1(冊3的濃度均調(diào)整為2 5g/L，其它成分保持不變，獲得疏松、生長 迅速的淡黃色愈傷組織團(tuán)塊。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)根農(nóng)桿菌為ATCC15834。
7. 如權(quán)利要求l-6任一所述的方法，其特征在于將所述的懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀 根、黃化苗、無菌苗或無菌苗自然根中的一種或幾種的混合物，在40 45t:下烘干，研磨成 粉末，95%乙醇回流2 4次，每次0. 5 1小時(shí)，過濾，合并提取液，回收乙醇得浸膏；將浸 膏懸于300 500ml水中，依次用200 400ml石油醚、氯仿萃取，萃取液濃縮，再經(jīng)過柱層析分離、濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥，即得到i-o-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯提取物。
8. 如權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于進(jìn)一步將步驟B中獲得的組織培養(yǎng)物 利用植物生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，用于i-o-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯的提取。
9. 權(quán)利要求1-8所述方法獲得的1-0-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以旋覆花不同組織培養(yǎng)物為生物合成載體對藥用活性成分1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(1-O-Acetyl britanni lactone，ABL)進(jìn)行提取及制備的方法。它包括如下步驟A、旋覆花無菌苗的培養(yǎng)；B、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根或黃化苗的培養(yǎng)；C、旋覆花組織培養(yǎng)物中ABL的提取。懸浮細(xì)胞、愈傷組織、毛狀根或黃化苗等組織培養(yǎng)物還可利用植物生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，用于ABL的提取。
文檔編號C12P17/04GK101787380SQ20101010155
公開日2010年7月28日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者于樹宏, 李倩, 查建蓬, 詹文紅 申請人:河北醫(yī)科大學(xué)