專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼抗菌肽的核酸及其原核表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)日益嚴(yán)重，濫用抗生素對(duì)人類(lèi)的危害、細(xì)菌耐性增強(qiáng)和耐藥菌株增加、對(duì)環(huán)境的潛在危害等問(wèn)題已受到全世界的關(guān)注?？咕氖菣C(jī)體在 受到病原體感染時(shí)產(chǎn)生的一類(lèi)小分子多肽，作為一種先天性免疫因子，在保護(hù)機(jī)體不受病 原體的侵害中發(fā)揮重要作用，不易產(chǎn)生菌株耐藥性。牛乳鐵蛋白活性多肽(Lactoferricin B或LfcinB)首先由Bellamy等在1992年于牛乳鐵蛋白的酶解產(chǎn)物中分離得到的一段N端 多肽，其抗菌活性比牛乳鐵蛋白強(qiáng)400多倍。LfcinB來(lái)源于牛乳鐵蛋白的17 41位氨基 酸，由25個(gè)氨基酸殘基組成，分子結(jié)構(gòu)以?xún)捎H性的β-折疊為主。LfcinB具有廣譜抗菌活 性，具有強(qiáng)大的抑菌殺菌作用，同時(shí)具有抗病毒、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫及消炎、抗寄生蟲(chóng) 等多種生物學(xué)功能。LfcinB在醫(yī)藥、保健、食品保鮮等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，然而來(lái)源 昂貴限制了 LfcinB的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了降低LfcinB的成產(chǎn)成本，而提供的一種編碼抗菌肽 Lactoferricin B的核酸及其原核表達(dá)方法。本發(fā)明編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列如下GGATCCTTCAAATGCCGCCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCGCCGTCTATTACCTGCGTG CGTCGCGCGTTCTAAGTCGAC。本發(fā)明編碼抗菌肽Lactoferricin B核酸的原核表達(dá)按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將編 碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列連接到pGHX載體上，構(gòu)建載體pGHX_LCB ；二、用 限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Sal I切割質(zhì)粒pGHX_LCB，然后回收堿基長(zhǎng)度為84bp的基因片 段連接到原核表達(dá)載體PGEX-4T-2的BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 PGEX-4T-2-LCB ；三、用重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX_4T-2_LCB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a ；四、提取被轉(zhuǎn)化 的陽(yáng)性感受態(tài)細(xì)胞DH5a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)；五、經(jīng)轉(zhuǎn)化的Ε. coli BL21菌落接 種于氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)8 12h，然后吸取500 μ L菌 液轉(zhuǎn)接入氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL、體積為50mL的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6，再加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至培養(yǎng)液中異丙基-β -D-硫代半乳糖苷終濃度為 0. 3mmol/L,然后置于33°C環(huán)境中誘導(dǎo)4h，之后取菌液100°C煮沸l(wèi)Omin，再在12000轉(zhuǎn)/min 條件下離心5min，取離心上清液，即實(shí)現(xiàn)編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸的原核表達(dá)。本發(fā)明對(duì)抗菌肽Lactoferricin B的編碼核酸進(jìn)行偏愛(ài)性改造，然后采用基因重 組技術(shù)將編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸導(dǎo)入原核表達(dá)宿主，進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明編碼 抗菌肽Lactoferricin B的核酸的原核表達(dá)方法具有抗菌肽LactoferricinB產(chǎn)量高、易純 化、純化條件溫和、并且大部分以可溶性形式存在的特點(diǎn)。


圖1是具體實(shí)施方式
二步驟二中酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖1中“4”泳道標(biāo)樣為Marker，“ 1 ”泳道標(biāo)樣為pGH-X_LCB，“2”泳道標(biāo)樣為BamH I和Sal I雙酶切后的 pGHX-LCB，“3”泳道標(biāo)樣為pGEX-4T-2。圖2是具體實(shí)施方式
二步驟三將被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性感受 態(tài)細(xì)胞DH5a雙酶切的凝膠電泳圖，圖2中“ 1 ”泳道標(biāo)樣為Marker，“2”泳道標(biāo)樣為BamH I 和Sal I雙酶切后的pGEX-4T-2-LCB。圖3是具體實(shí)施方式
二步驟五中不同誘導(dǎo)時(shí)間原核 表達(dá)樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果圖，圖3中“1”泳道標(biāo)樣為樣品1 (誘導(dǎo)時(shí)間為5h)，圖3中 “2”泳道標(biāo)樣為樣品2 (誘導(dǎo)時(shí)間為4h)，圖3中“3”泳道標(biāo)樣為樣品3 (誘導(dǎo)時(shí)間為3h)， 圖3中“4”泳道標(biāo)樣為樣品4 (誘導(dǎo)時(shí)間為2h)，圖3中“5”泳道標(biāo)樣為樣品5 (誘導(dǎo)時(shí)間 為Ih)，圖3中“6”泳道標(biāo)樣為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，圖3中“7”泳道標(biāo)樣為PGEX-4T-2轉(zhuǎn)化的 E. coli Rosetta(DE3).圖4是轉(zhuǎn)化的E.coli BL21裂解液上清中各種蛋白含量的檢測(cè)圖。 圖5是具體實(shí)施方式
二中表達(dá)的融合蛋白GST-L fcinB進(jìn)行親和層析純化的洗脫曲線圖。 圖6是具體實(shí)施方式
二中脫峰進(jìn)行SDS-PAGE分析圖，圖6中“ 1”泳道標(biāo)樣為蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)，圖6中“2”泳道標(biāo)樣為裂解液上清，圖6中“3” “6泳道標(biāo)樣為純化后GST-LfcinB融 合蛋白ο
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列如SEQID NO 1所示。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式編碼抗菌肽Lactoferricin B核酸的原核表達(dá)按以 下步驟實(shí)現(xiàn)一、將編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列連接到pGHX載體上，構(gòu)建載 體pGHX-LCB ；二、用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Sal I切割質(zhì)粒pGHX_LCB，然后回收堿基長(zhǎng) 度為84bp的基因片段連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-2的BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)之間， 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-2-LCB ；三、用重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX_4T-2_LCB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5a;四、提取被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性感受態(tài)細(xì)胞DH5a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)；五、經(jīng)轉(zhuǎn)化 的E. coli BL21菌落接種于氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)8 12h，然后吸取500 μ L菌液轉(zhuǎn)接入氨芐青霉素濃度為100 μ g/mL、體積為50mL的LB液體培 養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6，再加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培養(yǎng)液中異 丙基- β -D-硫代半乳糖苷終濃度為0. 3mmol/L，然后置于33°C環(huán)境中誘導(dǎo)4h，之后取菌液 100°C煮沸l(wèi)Omin，再在12000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min，取離心上清液，即實(shí)現(xiàn)編碼抗菌肽 Lactoferricin B的核酸的原核表達(dá)。本實(shí)施方式步驟二酶切質(zhì)粒PGHX-LCB后得到一條堿基長(zhǎng)度為84bp的清晰DNA條 帶，其大小與預(yù)計(jì)結(jié)果相同，2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。用牙簽挑取步驟三將被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性感受態(tài)細(xì)胞DH5a置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 然后用BamH I和Sal I限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切，結(jié)果如圖2所示，84bp處存在一清晰條帶。 經(jīng)過(guò)序列驗(yàn)證，重組質(zhì)粒中含有LfcinB的基因片段，并經(jīng)DNAMAN分析與設(shè)計(jì)的基因片段完全吻合。按誘導(dǎo)時(shí)間不同分別取原核表達(dá)樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示。樣品1、2、3和4在29KDa處存在一條蛋白條帶，為GST-L fcinB融合蛋白， 特別是樣品2蛋白條帶最為清晰明亮。轉(zhuǎn)化的E.coli BL21裂解后裂解液上清中各種蛋白的含量如圖4所示(圖4中箭頭為表達(dá)的融合蛋白所在位置)，經(jīng)測(cè)定所表達(dá)的融合蛋白占總蛋白含量的20%以上，并 且所表達(dá)的蛋白是以可溶形式表達(dá)。將含有陽(yáng)性重組子pGEX-4T-2-LCB的E. coli BL21 (DE3)接種于抗生素Amp濃度為50 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；取上述過(guò)夜培養(yǎng)物0. 5mL接種于新鮮 的LB (含50 μ g/mL Amp)液體培養(yǎng)基中；37°C振蕩培養(yǎng)至OD600 = 0 . 6，加IOOmmol/L IPTG 至終濃度為0. 6mmol/L，33°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，5000r/min離心IOmin收集菌體；按IOOmL培養(yǎng)物 的菌體沉淀加入4mL PBS緩沖液重懸菌體，-20°C冷凍后，冰浴融解；加入溶菌酶至終濃度 lmg/mL，冰上放置30min ；加入Triton X-100至體積濃度為1%，劇烈震蕩；4°C、12000轉(zhuǎn)/ min離心30min，收集上清液；加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5 μ g/mL, 4°C溫浴IOmin ；力口 入DTT (二硫蘇糖醇)至終濃度lmmol/L。GST-LfinB融合蛋白純化GST_LfinB融合蛋白通過(guò)GST (谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶)標(biāo) 簽親和層析進(jìn)行分離純化，上樣體積為100 μ L0純化條件流速0. 5mL/min，壓力0. 25MPa, Binding Buffer (1XPBS,140mmol/L NaCl,2. 7mmol/LKCl,lOmmol/L Na2HPO4,1.8mmol/L KH2PO4,pH 7. 3)處理預(yù)裝柱，UV28tl調(diào)零，基線穩(wěn)定后上載樣品，待流出峰經(jīng)過(guò)，基線完全回歸 零點(diǎn)后更換 Elution Buffer (50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L 還原性谷胱苷肽，pH 8.0)進(jìn) 行洗脫?；厥障疵摲鍢悠方?jīng)SDS-PAGE電泳分析，方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(薩姆布魯克 J.，拉塞爾D.W.2002.學(xué)出版社，P1713-1720)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣品制備參照蛋白質(zhì)純化與鑒定 實(shí)驗(yàn)指南(馬歇克D. R.，門(mén)永J. T.，布格斯R. R.等，科學(xué)出版社，P259-261)。利用GEAKTA蛋白分離純化系統(tǒng)對(duì)表達(dá)的融合蛋白GST-LfcinB進(jìn)行親和層析 純化，洗脫曲線如圖5所示，獲得P 1、P2和P3三個(gè)洗脫峰，Pl和P2為流出峰，P3則為洗 脫峰。將洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖6所示，收集獲得的樣品在29KDa位置有一 清晰條帶，是純化后的GST-LfcinB融合蛋白，其純度大與95%。本實(shí)施方式中pGEX-T系列載體所表達(dá)的融合蛋白標(biāo)簽與目的表達(dá)蛋白間的蛋白 酶切位點(diǎn)為凝血酶Thrombin，表達(dá)的的谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)分子量為26kDa，與目標(biāo) 蛋白融合表達(dá)后大部分是可溶的，并存在于胞質(zhì)中，因此可在無(wú)變性劑的條件下用谷胱苷 肽親和柱進(jìn)行層析，從細(xì)菌裂解物中提純。GST基因融合表達(dá)載體除具有較高誘導(dǎo)表達(dá)量，本底表達(dá)水平低以及在表達(dá)蛋白 純化過(guò)程中純化條件溫和，有利于保持蛋白活性的諸多優(yōu)點(diǎn)。GST基因融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) LfcinB，獲得了理想的表達(dá)效果，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的20%以上，并且大部分以 可溶性形式存在，避免了繁瑣復(fù)雜的包涵體處理操作過(guò)程，而可溶性表達(dá)方式存在的蛋白 可以直接利用親和層析進(jìn)行純化獲得融合蛋白，方便了進(jìn)一步的分離純化過(guò)程。GST融合蛋白可以直接從細(xì)菌裂解液中用固定化谷胱苷肽將它吸附，洗脫條件溫 和，整個(gè)過(guò)程無(wú)變性劑的加入，最大限度地保持了蛋白的天然構(gòu)象。人KTApurifier蛋白純 化系統(tǒng)是目前比較先進(jìn)的分離純化設(shè)備，其GSTrp GST系列親和層析預(yù)裝柱分離純化條件穩(wěn)定，純化效率高，回收率大，對(duì)目標(biāo)蛋白無(wú)影響等優(yōu)點(diǎn)。因此在本實(shí)施方式中采用該設(shè)備 對(duì)GST-LfcinB融合蛋白的分離純化，純化目標(biāo)蛋白純度在95%以上，達(dá)到了極好的分離效果. 本實(shí)施方式步驟五中加入的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的原始濃度為IOOmmol/ L0
權(quán)利要求
編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸，其特征在于該核酸的序列如下GGATCCTTCAAATGCCGCCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCGCCGTCTATTACCTGCGTGCGTCGCGCGTTCTAAGTCGAC。
2.編碼抗菌肽LactoferricinB的核酸的原核表達(dá)方法，其特征在于編碼抗菌肽 Lactoferricin B核酸的原核表達(dá)按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將編碼抗菌肽Lactoferricin B的 核酸序列連接到PGHX載體上，構(gòu)建載體pGHX-LCB ；二、用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Sal I切 割質(zhì)粒pGHX-LCB，然后回收堿基長(zhǎng)度為84bp的基因片段連接到原核表達(dá)載體pGEX_4T_2 的BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX_4T-2_LCB ；三、用重組表達(dá)質(zhì)粒 PGEX-4T-2-LCB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a ；四、提取被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性感受態(tài)細(xì)胞DH5a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coliBL21 ；五、經(jīng)轉(zhuǎn)化的E. coli BL21菌落接種于氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL的LB液體 培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)8 12h，然后吸取500 μ L菌液轉(zhuǎn)接入氨芐青霉素濃度為50 μ g/mL、體積 為50mL的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD600 = 0. 6，再加入異丙基-β _D_硫代半乳糖苷至 培養(yǎng)液中異丙基- β -D-硫代半乳糖苷終濃度為0. 3mmol/L，然后置于33°C環(huán)境中誘導(dǎo)4h， 之后取菌液100°C煮沸l(wèi)Omin，再在12000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min，取離心上清液，即實(shí)現(xiàn) 編碼抗菌肽LactoferricinB的核酸的原核表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼抗菌肽LactoferricinB的核酸的原核表達(dá)方法，其特 征在于步驟五中加入的異丙基- β -D-硫代半乳糖苷的原始濃度為lOOmmol/L。
全文摘要
編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表達(dá)方法，它涉及一種編碼抗菌肽的核酸及其原核表達(dá)方法。它降低了LfcinB的成產(chǎn)成本，而提供的一種編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表達(dá)方法。編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸的序列如SEQ ID NO1所示。編碼抗菌肽Lactoferricin B核酸的原核表達(dá)按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、構(gòu)建載體pGHX-L CB；二、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-LCB；三、用重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-LCB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a；四、提取被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性感受態(tài)細(xì)胞DH5a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21；五、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、煮沸、離心，即實(shí)現(xiàn)編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸的原核表達(dá)。本發(fā)明對(duì)抗菌肽Lactoferricin B的編碼核酸進(jìn)行偏愛(ài)性改造，然后采用基因重組技術(shù)將編碼抗菌肽Lactoferricin B的核酸導(dǎo)入原核表達(dá)宿主，進(jìn)行表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101812459SQ201010133179
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者馮興軍, 孟利強(qiáng), 張?jiān)坪? 張先成, 張淑梅, 李晶, 王玉霞, 趙曉宇 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所