專利名稱：利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲(chóng)植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲(chóng)的 轉(zhuǎn)基因植物的方法及相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
棉花是我國(guó)第一大經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有極其重要的戰(zhàn)略 地位和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，隨著棉花生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，棉花枯黃萎病、棉鈴蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)、葉螨等病蟲(chóng)害越 來(lái)越重，其中棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera Hubner)是危害中國(guó)棉花生產(chǎn)的最主要害蟲(chóng)， 對(duì)我國(guó)棉花生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅，常年損失達(dá)10 15% (王仁祥，作物研究2001，棉花專緝 6-9)。全國(guó)每年用于棉花害蟲(chóng)防治的殺蟲(chóng)劑用量約占?xì)⑾x(chóng)劑使用總量的2/3，雖然對(duì)減輕蟲(chóng) 害具有明顯的作用，但也帶來(lái)了嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，如棉花的生產(chǎn)成本急劇增加，嚴(yán)重危害棉 農(nóng)的健康及生命安全，棉鈴蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)，環(huán)境污染，生態(tài)失衡等，棉田害蟲(chóng)的防治越來(lái)越 困難。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的培育成為解決此類問(wèn)題最經(jīng)濟(jì)最有效的途徑之一(汪新業(yè)等.種子 科技 2003,3 156-157)。目前使用最廣泛也是最有效的抗蟲(chóng)基因是蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因(Bt基 因)，應(yīng)用于棉花的主要有CryIA(b)、CryIA(c) XryIIA和CryIVA等幾種，以培育抗棉鈴蟲(chóng) 的轉(zhuǎn)基因棉花。經(jīng)改良的CryIA(c)和CryIA(b)的表達(dá)量可達(dá)到棉株中可溶性蛋白的0. 1% 和0. 05%，能有效地殺死棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)。然而，我國(guó)所推廣的針對(duì)棉鈴蟲(chóng)的 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，幾乎都是涉及Bt及其相關(guān)的基因，存在很大的隱患。主要是=(I)Bt抗蟲(chóng)棉 的殺蟲(chóng)活性主要在一代和二代，而在棉鈴蟲(chóng)的第三、第四代時(shí)明顯降低；(2)Bt抗蟲(chóng)棉抗性 比較單一，只對(duì)棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等少數(shù)鱗翅目害蟲(chóng)有效果，而對(duì)棉田其它害蟲(chóng)沒(méi)有抗性；(3) 棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)棉易產(chǎn)生抗性，存在Bt抗蟲(chóng)棉失效和Bt生物農(nóng)藥失效的巨大隱患，試驗(yàn) 研究推測(cè)，大田連續(xù)種植8 10年后，轉(zhuǎn)Bt基因棉可能喪失對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性，從而失去利 用價(jià)值(汪若海等.生物技術(shù)通報(bào)2000，5 :1-6 ；王仁祥，作物研究2001，棉花專緝6_9)。 因此，應(yīng)積極篩選新的抗蟲(chóng)基因，培育高效廣譜的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花?；ㄇ嗨厥侵参锕ず头N皮顏色的主要色素物質(zhì)，是花瓣從紅色、紫色到藍(lán)色的主 要呈色物質(zhì)，是類黃酮的重要組成部分?；ㄇ嗨氐纳锖铣赏緩接薪?0步化學(xué)反應(yīng)，由兩 組基因調(diào)控，第一組大約涉及15個(gè)結(jié)構(gòu)基因，編碼催化花青素生化反應(yīng)的多種酶類，第二 組是調(diào)節(jié)基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子或?qū)儆贛YB-型Cl家族，或是堿性bHLH MYC-型R家族 (HK. Dooner 等· Annual Review of Geneticsl991，25 173-199)，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表 達(dá)。玉米Cl基因在胚乳的糊粉層中調(diào)節(jié)花青素著色與否(KC. Cone等.Proc Natl Acad Sci U S A. 1986，83 :9631-9635)，而R基因調(diào)控花青素著色的時(shí)空分布(SR. Ludwig等.Proc NatlAcad Sci U S A. 1989，86 (18) :7092_7096)。Lc (lear color，簡(jiǎn)稱 Lc)基因?qū)?R 基 因家族，是玉米花青素生物合成途徑中的一個(gè)調(diào)節(jié)基因，編碼大約610個(gè)氨基酸的蛋白， 典型的 bHLH MYC 型轉(zhuǎn)錄因子(SR. Ludwig 等.Proc Natl Acad SciU S A. 1989，86 (18) 7092-7096)。在玉米中，Lc基因參與調(diào)節(jié)花青素生物合成途徑中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因如C2基因的表達(dá)，調(diào)控花青素著色的數(shù)量、分布和時(shí)間。組成型表達(dá)單個(gè)Lc基因足以激活花青素生 物合成途徑，而且還與類黃酮化合物生物合成相關(guān)聯(lián)，對(duì)植物育性和抵抗病蟲(chóng)害起到重要 作用(HK. Dooner 等· AnnualReview of Genetics 1991，25 173-199)，比如，轉(zhuǎn) Lc 基因蘋(píng) 果植株中，PAL、CHS、FHT、DFR、LAR、ANS和ANR的mRNA水平得以提高，葉片中花青素越橘花 青苷(anthocyanin idaein)上升 12 倍，黃燒-3-表兒茶酸(flavan 3_ol印icatechin)上 升 14 倍，同分異構(gòu)兒茶酸(isomeric catechin)上升 41 倍等(H. Li 等.Planta 2007,226 1243-1254)；表達(dá)玉米C2基因的轉(zhuǎn)基因水稻，稻瘟病抗性增強(qiáng)(M. Gandikota等.Molecular Breeding 2001,7 :73_83)。經(jīng)檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有關(guān)玉米Lc基因在抗棉鈴蟲(chóng)植物上應(yīng)用的報(bào)道.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲(chóng)植物上的用途。本發(fā)明另一目的在于提供含有玉米Lc基因的轉(zhuǎn)基因植物、組織或細(xì)胞。本發(fā)明第三目的在于提供含有玉米Lc基因的轉(zhuǎn)基因棉花、棉花組織或棉花細(xì)胞。本發(fā)明第四目的在于提供利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲(chóng)植物的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲(chóng)植物上的應(yīng)用，其中所述的玉米Lc基因編碼由SEQ ID No :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。上述應(yīng)用中所述的玉米Lc基因由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列組成；或者由與 SEQ ID No :1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性并編碼相同功能蛋白的核苷酸序列組 成。所述的玉米Lc基因?yàn)橛衩兹~色基因(leaf color gene)，在Genbank中的編號(hào)為 ID M26227。上述應(yīng)用中所述的植物是指棉花。含有所述的外源玉米Lc基因的植物、組織或細(xì)胞。含有所述的外源玉米Lc基因的棉花、棉花組織或棉花細(xì)胞。利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲(chóng)植物的方法，將玉米Lc基因克隆到質(zhì)粒載體上并 導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株，再經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物，可得抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中所述的質(zhì)粒載體可以是pBI 121。上述方法中所述的農(nóng)桿菌菌株可以是LBA4404。利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲(chóng)植物的方法，包括如下步驟(1)將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織，獲得含有外源玉米Lc基因的植物 細(xì)胞或組織；(2)將含有外源玉米Lc基因的植物細(xì)胞或組織，再生成植物植株，即得抗棉鈴蟲(chóng) 的植物。上述方法中所述的植物優(yōu)選棉花。在一優(yōu)選例中，在步驟(1)中 ，將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞或組織。在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，用攜帶玉米Lc基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌感染棉花 下胚軸。
利用上述所得的轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花培育棉花品種的方法，以上述轉(zhuǎn)Lc基因棉花 為親本之一，利用回交或者雜交的方法，可培育出抗棉鈴蟲(chóng)的棉花品種。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性強(qiáng)，為抗棉鈴 蟲(chóng)育種提供了一種新的途徑；(2)和使用殺蟲(chóng)劑相比，本發(fā)明方法成本低，且不會(huì)造成農(nóng)藥 殘留和環(huán)境污染。


圖1.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花Ttl代植株Southern雜交印跡圖。圖2.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花T1代植株Southern雜交印跡圖。圖3.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花表型照片，其中A為轉(zhuǎn)玉米Lc基因愈傷組織，B為轉(zhuǎn)玉 米Lc基因體細(xì)胞胚，C為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片，D為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株莖桿，E為轉(zhuǎn)玉 米Lc基因植株花蕾，F(xiàn)為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株花藥，G、H為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片柵欄細(xì) 胞，I為黑暗條件下培養(yǎng)一周轉(zhuǎn)玉米Lc基因胚珠，J、K為光照條件下培養(yǎng)一周轉(zhuǎn)玉米Lc基 因胚珠，L為轉(zhuǎn)基因T1代幼苗中Lc基因遺傳分離，陽(yáng)性苗表現(xiàn)出紅色根。圖4.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株葉片粗提物光譜分析曲線圖。圖5.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株葉片花青素含量柱形圖；其中1為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植 株干葉，2為野生型植株干葉，3為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株鮮葉，4為野生型植株鮮葉。圖6.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株葉片花青素成分含量柱形圖；其中1為轉(zhuǎn)玉米Lc基 因植株干葉，2為野生型植株干葉，3為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株鮮葉，4為野生型植株鮮葉。圖7.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片同時(shí)飼喂棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)1天后葉片照片， 其中al、Cl 轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片，bl 非轉(zhuǎn)基因葉片。圖8.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片同時(shí)飼喂棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)3天后照片，其中 A2、c2 轉(zhuǎn)Lc基因葉片，b2 非轉(zhuǎn)基因葉片。圖9.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片分別飼喂棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)5天后照片，其中 d 轉(zhuǎn)玉米Lc基因紅色葉片，e 轉(zhuǎn)玉米Lc基因綠色葉片，f、g 非轉(zhuǎn)基因葉片。圖10.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片分別飼喂棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)5天后幼蟲(chóng)體重 柱形圖；其中1為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片喂養(yǎng)，2為野生型植株葉片喂養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但是不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。如 無(wú)特別說(shuō)明，實(shí)施例中所涉及的方法等皆為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，可參見(jiàn)《分子克 隆實(shí)驗(yàn)指南》等。實(shí)施例1轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花的培育通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation http //www, ncbi. nlm. nih. gov),檢索獲取玉米 Lc 基因序列 數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)如下引物L(fēng)cB-F :5，-ccggatccatggcgctttcagcttcccg-3，(SEQ ID No 3),LcH-R :5，-ggaagctttcaccgcttccctatagctttg-3，(SEQ ID No 4),選取玉米授粉后10天的雌穗，用熱酚法(參見(jiàn)XB Li等.Plant Cell 2005，17 859-875)提取總RNA，根據(jù)QIANGEN —步RT-PCR方案做反轉(zhuǎn)錄，即RNA模板加入到反應(yīng)液 中，50°C下反轉(zhuǎn)錄30分鐘，之后滅活反轉(zhuǎn)錄酶(QIANGEN公司產(chǎn)品使用指南)，cDNA模板 95°C變性15分鐘，以LcB-F和LcH-R為引物PCR擴(kuò)增玉米Lc基因編碼區(qū)cDNA片段，反應(yīng)程 序?yàn)?4°C 45秒、60°C 45秒、72°C 2分鐘，計(jì)30循環(huán)。所獲cDNA片段經(jīng)Bam Hi/Hind III 處理后，_20°C保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒pBI121用BamHI/SacI切開(kāi)，連接上一個(gè)Hind III-SacI 接頭5，-AGCTTGAGCT-3，(SEQ ID No 5), 與前述玉米Lc基因cDNA連接，經(jīng)測(cè)序(北京三博志遠(yuǎn)基因技術(shù)有限公司)確認(rèn)玉 米Lc基因(序列見(jiàn)SEQ ID No 1)正確克隆到35S啟動(dòng)子下游，得到植物表達(dá)載體pBI_Lc。 采用電擊法將表達(dá)載體PBI-Lc導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404。將棉花種子(珂字312，Coker312)用70%乙醇處理1分鐘、10%雙氧水處理 1-2小時(shí)進(jìn)行表面消毒，放置在1/2MS固體培養(yǎng)基(組成成份及其比例為1/2MS無(wú)機(jī)鹽、 1/285維生素、1/2 鐵鹽、0. 5%葡萄糖、0. 5g/L MgCl2 · 6Η20、0· 25% phytagel、ρΗ6· 0)上， 在25 28°C、14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)發(fā)芽。挑取含有質(zhì)粒pBI_Lc的農(nóng) 桿菌LBA4404單菌落，放入IOml LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床中振蕩培養(yǎng)3天，取2ml菌液 5000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入Iml MS共培養(yǎng)基重懸菌體，吸取適量重懸后的菌液， 加入到50ml液體MS共培養(yǎng)基中，使OD值約0. 1。選取發(fā)芽6 9天的棉花幼苗，將其下胚 軸切成5mm的小段，浸入上述處理好的農(nóng)桿菌LBA4404菌液中15min，之后將外植體轉(zhuǎn)至固 體MS共培養(yǎng)基(組成成份及其比例為MS無(wú)機(jī)鹽、維生素B5、鐵鹽、3.0%葡萄糖、0. lmg/L KT,0. 05mg/L 2，4-D、100umol/L 乙酰丁香酮、0. 5g/L MgCl2 ·6Η20、0· 25% phytagel,ρΗ6. 0) 上，在25 28°C、14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗的條件下共培養(yǎng)3天。將外植體轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng) 基(組成成份及其比例為MS無(wú)機(jī)鹽、B5維生素、鐵鹽、3.0%葡萄糖、0. lmg/L KT、0. 05mg/L 2，4-D、0. 5g/L MgCl2 ·6Η20、0· 3% phytagel、pH6. 0，附加頭孢霉素 500mg/L、潮霉素 5mg/L) 上誘導(dǎo)愈傷組織，3 4周繼代培養(yǎng)一次。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組 成成份及其比例MS無(wú)機(jī)鹽、B5維生素、鐵鹽、3. 0%葡萄糖、0. 5g/L MgCl2 · 6H20、1. 9g/L KN03、1. Og/L谷氨酰胺、0. 5g/L天門(mén)冬酰胺、0. 3% phytagel、pH6. 0，附加頭孢霉素500mg/ L、潮霉素5-10mg/L)，在25 28°C、14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗的條件下繼代培養(yǎng)直到長(zhǎng)出 胚狀體。將成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基(組成成份及其比例無(wú)NH4NO3的MS無(wú)機(jī)鹽、B5 維生素、鐵鹽、3. 0%葡萄糖、0. 5g/L MgCl2 ·6Η20、1· 9g/L KNO3>0. 3% phytagel,pH6. 0，附加 頭孢霉素500mg/L、潮霉素5-10mg/L)培養(yǎng)直到長(zhǎng)出幼芽和根。將2-4cm并長(zhǎng)出真葉的幼 苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(組成成份及其比例1/2MS無(wú)機(jī)鹽、1/2B5維生素、1/2鐵鹽、0. 5%葡萄 糖、0. lmg/L IAA,0. lmg/L KT,0. 25% phytagel、ρΗ6· 0)上，25 28°C、14 小時(shí)光照 /10 小 時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)4周，得到轉(zhuǎn)化再生植株并移栽到溫室中。共獲得陸地棉(Gossypium hirsutum, Coker 312)6個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花株系(株系編號(hào)分別為L(zhǎng)28、L82、 L73、L74、L143、L144)。實(shí)施例2轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花中玉米Lc基因的分子檢測(cè)CTAB方法提取實(shí)施例1中所得的6個(gè)轉(zhuǎn)玉米Lc基因的Ttl代植株基因組DNA(L. Wang. Plant Cell 1998，10 1733-46)，以下述序列為引物L(fēng)c-F :5，-atggcgctttcagcttcccgagt-3，(SEQ ID No 6),Lc-R 5' -tcaccgcttccctatagctttgc-3' (SEQ ID No 7),
PCR擴(kuò)增Lc基因片段，制備Southern雜交探針，50ug基因組DNA用限制性內(nèi)切 酶BamHI 37°C酶切過(guò)夜，瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至Hybond N+尼龍膜上(具體方法參見(jiàn) Amersham公司產(chǎn)品使用指南)，地高辛-ll_dUTP標(biāo)記Lc基因探針，42°C下與尼龍膜雜交 過(guò)夜(Roche公司產(chǎn)品使用指南)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因Ttl代植株中，L82含3個(gè)Lc基因拷貝， L73、L74、L143、L144含單拷貝Lc基因，L28含6個(gè)Lc基因拷貝(見(jiàn)圖1)。將6個(gè)轉(zhuǎn)基因Ttl代植株盆栽種植于溫室，單株自交后收獲T1代種子，并種植于相同溫室中，每株系種植20株。CTAB方法提取L143I\代植株基因組DNA，50ug基因組DNA用限 制性內(nèi)切酶BamHI 37°C酶切過(guò)夜，瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至Hybond N+尼龍膜上(Amersham 公司產(chǎn)品使用指南)，地高辛-11-dUTP標(biāo)記Lc基因探針，42°C下與尼龍膜雜交過(guò)夜(Roche 公司產(chǎn)品使用指南)，結(jié)果顯示，外源玉米Lc基因能穩(wěn)定傳遞到T1代，并表現(xiàn)為單基因位點(diǎn) 遺傳(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因棉花植株中Lc基因表達(dá)鑒定熱酚法(參見(jiàn)XB Li等· Plant Cell 2005，17 =859-875)提取實(shí)施例1所得的轉(zhuǎn) 基因植株嫩葉、莖、花器官包括花瓣、子房、花藥和萼片的總RNA，根據(jù)QIANGEN —步RT-PCR 方案做反轉(zhuǎn)錄，即RNA模板加入到反應(yīng)液中，50°C下反轉(zhuǎn)錄30分鐘，之后滅活反轉(zhuǎn)錄酶 (QIANGEN公司產(chǎn)品使用指南)，cDNA模板95°C變性15分鐘，前述Lc基因引物L(fēng)c-F (SEQ ID No 6) ^P Lc-R(SEQ ID No 7)做 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?94°C 45 秒、56°C 45 秒、72°C 2 分鐘， 計(jì)30循環(huán)，同時(shí)PCR擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白基因(Actin基因)作為內(nèi)標(biāo)，所用引物為Actin-F :5，-tttgctggtgatgatgctcc-3，(SEQ ID No 8)Actin-R :5，-ctccaatccagacactgtact-3，(SEQ ID No :9)。RT-PCR分析顯示，Lc基因在轉(zhuǎn)基因棉花Ttl代植株葉片和花器官中均有表達(dá)，而野 生型棉花植株中檢測(cè)不到Lc基因表達(dá)；不同組織器官中Lc基因表達(dá)水平稍有差異，花瓣中 未檢測(cè)到Lc基因表達(dá)，葉片中Lc基因持續(xù)高水平表達(dá)，4 16天子房中Lc基因表達(dá)水平 最高，7 13天的棉纖維中Lc基因中度表達(dá)，而23天及以后的成熟棉纖維細(xì)胞中，幾乎檢 測(cè)不到Lc基因表達(dá)。實(shí)施例4轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因棉花植株表型觀測(cè)玉米Lc基因轉(zhuǎn)化棉花過(guò)程中，觀察到卡那抗性愈傷組織和體細(xì)胞胚顯現(xiàn)紅色或 紫色，體細(xì)胞成熟胚中，胚根、胚軸和子葉有花青素積累(見(jiàn)圖3.A、B)。轉(zhuǎn)基因幼苗的綠色 真葉同樣積累花青素，根保持紅色。田間生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因Ttl代植株，幼嫩葉片通常表現(xiàn)為紅 色或紫色斑塊，間有綠色區(qū)域，莖、萼片及花藥明顯有著色，而花瓣無(wú)著色(見(jiàn)圖3. C、D、E、 F)。轉(zhuǎn)基因Ttl代植株葉片經(jīng)徒手切片觀察到，花青素積累在葉片的柵欄細(xì)胞及維管中，表 皮細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)有花青素(見(jiàn)圖3.G、H)。非轉(zhuǎn)基因植株衰老葉片保持黃顏色，轉(zhuǎn)基因植株 老葉片則變?yōu)榧t色。上述著色方式可以遺傳到Tl和T2代，并與外源Lc基因共分離(見(jiàn)圖 3. L)。轉(zhuǎn)基因植株及其后代(T1和T2)未發(fā)現(xiàn)形態(tài)變化。實(shí)施例5轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花胚珠離體培養(yǎng)觀察實(shí)施例1中轉(zhuǎn)Lc基因棉花T1代植株開(kāi)花后2天的棉鈴，70%乙醇滅菌5-10分 鐘后，取幼嫩胚珠放入液體培養(yǎng)基(CA Beasley等.Am. J. Bot. 61 188-194)中離體培養(yǎng)一 周，光照條件下棉纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)為深紅色，且在中央液泡中積累紅色或紫色油狀液態(tài)物(見(jiàn) 圖3. J、K)，而在黑暗條件下棉纖維細(xì)胞保持白色(見(jiàn)圖3. I)，表明玉米Lc基因參與花青素合成受光照調(diào)控。實(shí)施例6轉(zhuǎn)Lc基因棉花植株中花青素含量測(cè)定選取實(shí)施例1中轉(zhuǎn)Lc基因棉花植株(L143)的新鮮或風(fēng)干葉片材料提取花青素 (MG Choung 等 J Agric. Food. Chem. 2001,49 5848-5851)，pH 差減法處理提取樣品(J Lee 等 J Ass. Off. Ana. Chem. Inter. 2005,88 1269-1278)，采用 UV-VIS 分光光度計(jì)進(jìn)行定量 分析(ZZ Gong等Plant Mol. Biol. 1997，35 =915-927)，花青素含量計(jì)為氰化_3_葡糖苷， 依照Lambert-Beer’ s定律計(jì)算(Α = ε CL, A-吸收峰值，C-濃度，L-光路長(zhǎng)度以厘米計(jì)， ε-摩爾消光系數(shù)，為26900L/mol ；摩爾質(zhì)量取449g/mol)。對(duì)比非轉(zhuǎn)基因棉花，轉(zhuǎn)Lc基因 棉花植株葉片提取物呈現(xiàn)深紅色，光譜分析顯示，轉(zhuǎn)Lc基因葉片粗提物分別在210-230nm、 280nm、510nm波長(zhǎng)處吸收峰有明顯增加(見(jiàn)圖4)。pH差減法(JLee等· J Ass. Off. Ana. Chem. Inter. 2005,88 1269-1278)定量分析花青素含量，結(jié)果轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片中氰 化-3-葡糖苷達(dá)53. 6mg/100g(干重)，為野生型棉花的3. 5倍(見(jiàn)圖5)。轉(zhuǎn)Lc基因植株 干葉中，單體花青素占總花青素的27. 2%、多聚體花青素占43. 8%、其它占29. 0%，非轉(zhuǎn)基 因植株干葉中分別為17. 3%、67. 2、15. 5% (見(jiàn)圖6)。說(shuō)明轉(zhuǎn)Lc基因棉花植株中Lc基因 的表達(dá)顯著促進(jìn)了棉花葉片中總花青素的產(chǎn)生量。實(shí)施例7轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株棉鈴蟲(chóng)抗性鑒定摘取實(shí)施例1中轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花的Tl代植株(L143-5、L143-6、L143-7)與相 應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因棉株的第四片葉，清水沖洗晾干后喂食三齡棉鈴幼蟲(chóng)。試驗(yàn)1 將轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉株葉與非轉(zhuǎn)基因棉株葉放入同一個(gè)培養(yǎng)皿中，放入3 條棉鈴幼蟲(chóng)飼喂1-3天，重復(fù)10皿；試驗(yàn)2 將轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉株葉與非轉(zhuǎn)基因棉株葉分別放在不同的皿中，每皿放 入3條相同大小、相同齡期的棉鈴幼蟲(chóng)飼喂5天，重復(fù)13對(duì)皿。結(jié)果，同時(shí)飼喂轉(zhuǎn)玉米Lc基因和非轉(zhuǎn)基因葉片時(shí)，棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)偏向取食非轉(zhuǎn)基因 葉片，飼喂1天后，轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片保持完整，非轉(zhuǎn)基因葉片則被取食(見(jiàn)圖7)，3天后 這一結(jié)果更加明顯(見(jiàn)圖8)，轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉株葉片被取食通常是葉片的綠色部分而非紅 色區(qū)塊。脅迫飼喂試驗(yàn)中，棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)在轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片上幾乎不取食(見(jiàn)圖9)，幼蟲(chóng) 體重明顯低于非轉(zhuǎn)基因葉片飼喂的幼蟲(chóng)(見(jiàn)圖10)。以上結(jié)果說(shuō)明表達(dá)Lc基因的轉(zhuǎn)基因棉 花具有較好的棉鈴蟲(chóng)抗性。
權(quán)利要求
玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲(chóng)植物上的應(yīng)用，其中所述的玉米Lc基因編碼由SEQ ID No2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的玉米Lc基因由SEQIDNo :1所示的 核苷酸序列組成；或者由與SEQ ID No :1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性并編碼相 同功能蛋白的核苷酸序列組成。
3.按照權(quán)利要求1或者2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物是棉花。
4.含有權(quán)利要求2中所述的外源玉米Lc基因的植物、植物組織或植物細(xì)胞。
5.含有權(quán)利要求2中所述的外源玉米Lc基因的棉花、棉花組織或棉花細(xì)胞。
6.利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲(chóng)植物的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織，獲得含有外源玉米Lc基因的植物細(xì)胞 或組織；(2)將含有外源玉米Lc基因的植物細(xì)胞或組織，再生成植物植株，即得抗棉鈴蟲(chóng)的植物。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的植物是指棉花。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于其步驟(1)中，將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入 棉花細(xì)胞或組織。
9.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于其步驟(1)中，用攜帶玉米Lc基因表達(dá)載 體的農(nóng)桿菌感染棉花下胚軸。
10.利用轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花培育棉花品種的方法，其特征在于以權(quán)利要求6所得的轉(zhuǎn) 玉米Lc基因棉花為親本之一，利用回交或者雜交的方法，可培育出抗棉鈴蟲(chóng)的棉花品種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲(chóng)植物上的應(yīng)用以及培育抗棉鈴蟲(chóng)植物的方法，尤其適于在棉花植物上的應(yīng)用。本發(fā)明轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性強(qiáng)，為抗棉鈴蟲(chóng)育種提供了一種新的途徑；其次，和使用殺蟲(chóng)劑相比，本發(fā)明方法成本低，且不會(huì)造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101864429SQ20101017344
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者劉潔, 唐祚舜, 楊維才, 范小平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所