專利名稱：一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種簡(jiǎn)便的用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán) 芳烴能力的方法。
背景技術(shù)：
^H^ii (Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs) g由以± 苯環(huán)稠合形成的持久性有機(jī)污染物。PAHs具有“三致”效應(yīng)，因此美國(guó)環(huán)保署把16種PAHs列 為了優(yōu)先控制的污染物。隨著人類活動(dòng)的增加，PAHs廣泛的被分散到大氣，土壤，水和沉積 物中，給生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)分子量的不同，PAHs可以分為低分子量PAHs和高分子 量PAHs，隨著分子量的增加，PAHs的毒性增大，持久性也增強(qiáng)。細(xì)菌可以有效的降解高分子 量PAHs，但對(duì)高分子量就PAHs的降解效果不佳(Juhasz AL and Naidu R. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons :a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene. International Biodeterioration & Biodegradation. 2000，45 :57-88)。近來發(fā)現(xiàn)真菌可以有效的降解包括苯并[a]芘在 內(nèi)的許多高分子量PAHs，因此真菌修復(fù)日益受到重視(Pointing SB. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 2001, 57 20-33)。白腐真菌是一類可以引起木頭腐爛分解的真菌，也是一種重要的PAHs降解真 菌。與其它真菌不同，白腐真菌對(duì)PAHs的代謝主要依賴于一系列胞外分泌的木質(zhì)素降解 酶(木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶)的作用(Asgher M，Bhatti HN, Ashraf M and Legge RL. Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system. Biodegradation. 2008,19 :771_783),因此其 分泌的粗酶液對(duì)PAHs降解率可以表觀白腐真菌本身對(duì)PAHs的降解能力。傳統(tǒng)的測(cè)定真菌對(duì)PAHs的降解能力方法的一般步驟為1)在體積為Vl的培養(yǎng)基 中添加PAHs，使初始含量達(dá)到Cl ；2)接種真菌，培養(yǎng)培養(yǎng)一定時(shí)期后過濾，得到真菌菌絲和 濾液兩部分；3)用有機(jī)溶劑洗滌真菌菌絲若干次吸附的PAHs，得到洗滌液；4)用有機(jī)溶劑 萃取濾液若干次，得到萃取液；5)合并洗滌液和萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，溶解，凈化，氮?dú)?吹干、用親水性有機(jī)溶劑溶解后并定容至V2，高效液相分析其含量為C2 ；6)采用公式
降解率= C1V1-C2V2X100% 1 ^J 1計(jì)算降解率。在該方法中涉及到了萃取、洗滌、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、凈化、吹干等過程，工作 量大、程序繁瑣且易造成PAHs的損失，結(jié)果往往準(zhǔn)確度不高，從而給PAHs高效降解真菌的 篩選與分離帶了諸多不便。基于白腐真菌主要依賴于胞外酶來降解PAHs的原理，提出了一種簡(jiǎn)便的測(cè)定白 腐真菌降解PAHs能力的新方法。該方法操作簡(jiǎn)單，工作量小且準(zhǔn)確度高，從而大大方便了 PAHs降解真菌的篩選與分離。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本專利針對(duì)在真菌對(duì)PAHs降解率測(cè)定過程中工作量大、步驟繁瑣、準(zhǔn) 確度低等問題，提出了一種簡(jiǎn)便的測(cè)定白腐真菌對(duì)PAHs降解能力的方法。該方法程序簡(jiǎn) 單、便于操作、準(zhǔn)確度高，從而大大方便了白腐真菌對(duì)PAHs降解率的測(cè)定。技術(shù)方案一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，步驟為接種白腐 真菌于PDA平板培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后，截取5個(gè)直徑為5mm的菌塊接種于IOOmL Kirk培養(yǎng) 基中，28°C，150rpm條件下培養(yǎng)7天，取IOmL培養(yǎng)基1 IOOOg離心lOmin，得到上清液即為粗 酶液；2)取4. 5mL上清液，加入0. 5mL PAHs的乙腈溶液，混勻，置于暗室28°C培養(yǎng)24h，加 Λ 5. OmL乙腈搖勻終止反應(yīng)，280C，150rpm培育lh, IlOOOg離心IOmin,過0. 22 μ m濾膜，采 用高效液相測(cè)定PAHs含量，其中，對(duì)照為粗酶液以滅活形式加入；3)白腐真菌對(duì)多環(huán)芳烴 降解率的計(jì)算公式為降解率=(C-B)X 100% /A其中A反應(yīng)體系中PAHs的初始濃度；B為處理中PAHs的最終濃度；C為對(duì)照中 PAHs的最終濃度。上述所采用的培養(yǎng)基為Kirk培養(yǎng)基或其它適合白腐真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的液體培養(yǎng) 基，其中Kirk培養(yǎng)基成分為IOg葡萄糖，0. 22g酒石酸銨，0. 2g KH2PO4,0. 05g MgSO4 ·7Η20， 0. OlgCaCl2, ImL無(wú)機(jī)溶液，0. 5mL維生素溶液，加去離子水至IL充分溶解，用乙酸鈉調(diào)節(jié)pH 至4.5，121°C滅菌待用。上述白腐真菌在Kirk培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為7 30d，溫度為20 40°C，轉(zhuǎn)速為 100 200rpm。粗酶液的制作方法為在4000 14000g的條件下離心Kirk培養(yǎng)基。采用高效液相測(cè)定PAHs含量時(shí)所用流動(dòng)相為水和乙腈。有益效果本發(fā)明根據(jù)白腐真菌依靠胞外酶降解PAHs的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種白腐真 菌對(duì)PAHs的降解率的測(cè)定方法。在傳統(tǒng)的測(cè)定方法中，菌絲洗滌、萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、凈化、氮 氣吹干等步驟，均在開放的環(huán)境中進(jìn)行，不僅工作量大、操作繁瑣，而且容易造成PAHs的損 失，致使回收率低、準(zhǔn)確度差；在本方法中，所有的操作步驟都十分簡(jiǎn)單且都在密封的條件 下進(jìn)行，從而避免了實(shí)驗(yàn)過程中PAHs的損失，從而提高了回收率和準(zhǔn)確度。此外，本方法還 可用于白腐真菌對(duì)其它有機(jī)污染物如多氯聯(lián)苯，氯酚等的降解率測(cè)定。
四

圖1為采用本方法對(duì)蒽和苯并[a]芘的回收率。其中黑色柱子代表3個(gè)重復(fù)回收 率的平均值，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差?；厥章适窃u(píng)價(jià)PAHs降解率測(cè)定方法優(yōu)劣的一個(gè)重要指 標(biāo)，回收率越高，說明PAHs的損失就越少，結(jié)果也就越可靠。從圖中可以看出，蒽和苯并[a] 芘的回收率很高，分別達(dá)到98. 2%和94. 1%，表明該方法的準(zhǔn)確度是比較高的。圖2為白腐真菌A對(duì)蒽和苯并[a]芘的降解率。其中黑色柱子代表3個(gè)重復(fù)降解 率的平均值，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。從圖中可以看出，白腐真菌A對(duì)蒽和苯并[a]芘的降解率 分別達(dá)到84.0%和43.5%。同時(shí)從結(jié)果還可以看出該方法的重復(fù)性較好，蒽和苯并[a]芘 降解率的變異系數(shù)分別只有2. 4%和2. 3%，表明該方法的精確度比較高。五具體實(shí)施例方式無(wú)機(jī)溶液1·5g 氨基三乙酸酯，3. Og MgSO4 · 7H20，0. 5g MnSO4,1. Og NaCl， IOOmgFeSO4 ·7Η20，IOOmg CoSO4,82mg CaCl2, IOOmg ZnSO4, IOmg CuSO4 ·5Η20, IOmgAlK(SO4)2, IOmg H3BO3, IOmg NaMoO4,加去離子水至IL充分溶解。維生素溶液2mg生物素，2mg葉酸，5mg維生素B1Amg核黃素，IOmg維生素B6鹽酸 鹽，0. Img維生素B12，5mg煙酸，5mg DL-泛酸鈣，5mg對(duì)氨基苯甲酸，5mg硫辛酸，加去離子水 至IL充分溶解。實(shí)施例1 :白腐真菌粗酶液的制備從斜面上挑取白腐真菌A的菌絲接種于PDA平板，培養(yǎng)1周(28°C、避光)，待菌 絲長(zhǎng)滿平板后，截取5個(gè)直徑為5mm的菌塊接種于IOOmL Kirk培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7天(28°C， 150rpm)，取IOmL培養(yǎng)基高速離心(llOOOg，lOmin)，上清液即為白腐真菌粗酶液(C液)。實(shí)施例2 蒽的回收率的測(cè)定取4. 5mL滅活C液(煮沸30min)置于15mL具塞棕色試劑瓶中，加入0. 5mL蒽濃 度為Img L-I的乙腈溶液，擰緊瓶塞，搖勻，置于暗室培養(yǎng)24h (25°C )，加入5. OmL乙腈終止 反應(yīng)。搖勻，培育lh(25°C，150rpm)，高速離心(llOOOg，IOmin)，過0. 22 μ m濾膜，高效液相 測(cè)定。對(duì)照為加入未接菌的培養(yǎng)基代替滅活C液，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用島津UFLC-20系統(tǒng)(島津，日本)分析樣品中PAHs含量。采用反相C18柱 (3mmX 150mm,孔徑2. 2 μ m)分離樣品，流動(dòng)相為乙腈和水，梯度稀釋20min，流量為0. 8mL miiT1，柱溫為 50 0C ο采用SPSS 11.0軟件的One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)施例3 白腐真菌粗酶液對(duì)蒽的降解率的測(cè)定取4. 5ml C液置于15mL具塞棕色試劑瓶中，加入0. 5mL蒽濃度為Img L—1的乙 腈溶液，擰緊瓶塞，搖勻，置于暗室培養(yǎng)24h(25°C )，加入5. OmL乙腈終止反應(yīng)。搖勻，培育 Ih (250C，150rpm)，高速離心(llOOOg, IOmin)，過0. 22 μ m濾膜，高效液相測(cè)定。對(duì)照為C液 煮沸30min后加入，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用島津UFLC-20系統(tǒng)(島津，日本)分析樣品中PAHs含量。采用反相C18柱 (3mmX 150mm,孔徑2. 2 μ m)分離樣品，流動(dòng)相為乙腈和水，梯度稀釋20min，流量為0. 8mL miiT1，柱溫為 50 0C ο采用SPSS 11.0軟件的One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)施例4 苯并[a]芘的回收率的測(cè)定取4. 5mL C液(煮沸30min)置于15mL具塞棕色試劑瓶中，加入0. 5mL苯并[a] 芘濃度為Img Γ1的乙腈溶液，擰緊瓶塞，搖勻，置于暗室培養(yǎng)24h(25°C )，加入5. OmL乙腈 終止反應(yīng)。搖勻，培育lh(25°C，150rpm)，高速離心(11000g，IOmin)，過0. 22 μ m濾膜，高效 液相測(cè)定。對(duì)照為加入未接菌的培養(yǎng)基代替滅活C液，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用島津UFLC-20系統(tǒng)(島津，日本)分析樣品中PAHs含量。采用反相C18 柱(3mmX 150mm，孔徑2.2 μ m)分離樣品，流動(dòng)相為乙腈和水，梯度稀釋20min，流量為 0. SmLmirT1，柱溫為 50 "C。采用SPSS 11. 0軟件的One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)施例5 白腐真菌粗酶液對(duì)苯并[a]芘降解率的測(cè)定
5
取4. 5mL C液(煮沸30min)置于15mL具塞棕色試劑瓶中，加入0. 5mL苯并[a] 芘濃度為Img Γ1的乙腈溶液，擰緊瓶塞，搖勻，置于暗室培養(yǎng)24h(25°C )，加入5. OmL乙腈 終止反應(yīng)。搖勻，培育lh(25°C，150rpm)，高速離心(llOOOg，IOmin)，過0. 22 μ m濾膜，高效 液相測(cè)定。對(duì)照為C液煮沸30min后加入，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用島津UFLC-20系統(tǒng)(島津，日本)分析樣品中PAHs含量。采用反相C18柱 (3mmX 150mm,孔徑2. 2 μ m)分離樣品，流動(dòng)相為乙腈和水，梯度稀釋20min，流量為0. 8mL miiT1，柱溫為 50 0C ο采用SPSS 11. 0軟件的One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)施例6接種白腐真菌于PDA平板培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后，截取5個(gè)直徑為5mm的菌塊接種于 IOOmL Kirk培養(yǎng)基中，28°C，150rpm條件下培養(yǎng)7天，取IOmL培養(yǎng)基IlOOOg離心lOmin， 得到上清液即為粗酶液；2)取4. 5mL上清液，加入0. 5mL PAHs的乙腈溶液，混勻，置于暗室 28°C培養(yǎng)24h，加入5. OmL乙腈搖勻終止反應(yīng)，28°C，150rpm培育lh，IlOOOg離心lOmin，過 0.22μπι濾膜，采用高效液相測(cè)定PAHs含量，其中，對(duì)照為粗酶液以滅活形式加入；3)白腐 真菌對(duì)多環(huán)芳烴降解率的計(jì)算公式為降解率=(C-B)X 100% /A其中A反應(yīng)體系中PAHs的初始質(zhì)量濃度；B為處理中PAHs的最終質(zhì)量濃度；C為 對(duì)照中PAHs的最終質(zhì)量濃度(所有濃度單位由測(cè)量?jī)x器統(tǒng)一)。上述濃度由島津UFLC-20 系統(tǒng)(島津，日本)分析測(cè)得。采用反相C18柱(3mmX150mm，孔徑2.2μπι)分離樣品，流動(dòng) 相為乙腈和水，梯度稀釋20min，流量為0.8mL mirT1，柱溫為50°C。采用SPSS11. 0軟件的 One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。培養(yǎng)基為Kirk培養(yǎng)基或其它適合白腐真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的液體培養(yǎng)基，其中Kirk 培養(yǎng)基成分為:10g 葡萄糖，0. 22g 酒石酸銨，0. 2g KH2P04,0 . 05g MgSO4 ·7Η20，0. Olg CaCl2, ImL無(wú)機(jī)溶液，0. 5mL維生素溶液，加去離子水至IL充分溶解，用乙酸鈉調(diào)節(jié)pH至4. 5， 121°C滅菌待用。白腐真菌在Kirk培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為7 30d，溫度為20 40°C，轉(zhuǎn) 速為100 200rpm。粗酶液的制作方法為在4000 14000g的條件下離心Kirk培養(yǎng)基。 采用高效液相測(cè)定PAHs含量時(shí)所用流動(dòng)相為水和乙腈。
權(quán)利要求
一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，其特征在于步驟為接種白腐真菌于PDA平板培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后，截取5個(gè)直徑為5mm的菌塊接種于100mL Kirk培養(yǎng)基中，28℃，150rpm條件下培養(yǎng)7天，取10mL培養(yǎng)基11000g離心10min，得到上清液即為粗酶液；2)取4.5mL上清液，加入0.5mL PAHs的乙腈溶液，混勻，置于暗室28℃培養(yǎng)24h，加入5.0mL乙腈搖勻終止反應(yīng)，28℃，150rpm培育1h，11000g離心10min，過0.22μm濾膜，采用高效液相測(cè)定PAHs含量，其中，對(duì)照為粗酶液以滅活形式加入；3)白腐真菌對(duì)多環(huán)芳烴降解率的計(jì)算公式為降解率＝(C B)×100％/A其中A反應(yīng)體系中PAHs的初始濃度；B為處理中PAHs的最終濃度；C為對(duì)照中PAHs的最終濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，其特征 在于所采用的培養(yǎng)基為Kirk培養(yǎng)基或其它適合白腐真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的液體培養(yǎng)基，其 中Kirk培養(yǎng)基成分為10g葡萄糖，0. 22g酒石酸銨，0. 2g KH2PO4,0. 05g MgSO4 · 7H20， 0. OlgCaCl2, ImL無(wú)機(jī)溶液，0. 5mL維生素溶液，加去離子水至IL充分溶解，用乙酸鈉調(diào)節(jié)pH 至4.5，121°C滅菌待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，其特征在 于所述白腐真菌在Kirk培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為7 30d，溫度為20 40°C，轉(zhuǎn)速為100 200rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，其特征在 于其粗酶液的制作方法為在4000 14000g的條件下離心Kirk培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，其特征在 于采用高效液相測(cè)定PAHs含量時(shí)所用流動(dòng)相為水和乙腈。
全文摘要
一種用于測(cè)定白腐真菌降解多環(huán)芳烴能力的方法，步驟為接種白腐真菌于PDA平板培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后，截取5個(gè)直徑為5mm的菌塊接種于100mLKirk培養(yǎng)基中，28℃，150rpm條件下培養(yǎng)7天，取10mL培養(yǎng)基11000g離心10min，得到上清液即為粗酶液；2)取4.5mL上清液，加入0.5mL PAHs的乙腈溶液，混勻，置于暗室28℃培養(yǎng)24h，加入5.0mL乙腈搖勻終止反應(yīng)，28℃，150rpm培育1h，11000g離心10min，過0.22μm濾膜，采用高效液相測(cè)定PAHs含量，其中，對(duì)照為粗酶液以滅活形式加入；3)白腐真菌對(duì)多環(huán)芳烴降解率的計(jì)算公式為降解率＝(C-B)×100％/A；其中A反應(yīng)體系中PAHs的初始濃度；B為處理中PAHs的最終濃度；C為對(duì)照中PAHs的最終濃度。本方法還可用于白腐真菌對(duì)其它有機(jī)污染物如多氯聯(lián)苯，氯酚等的降解率測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101935683SQ201010250160
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者張晶, 李烜楨, 林先貴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所