專利名稱：白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種白 蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)疾病控制或者流行病學(xué)檢測(cè)。
背景技術(shù)：
內(nèi)臟利什曼病廣泛分布于亞洲、非洲、歐洲和拉丁美洲熱帶及亞熱帶地區(qū)，但以中 國(guó)、印度和地中海沿岸國(guó)家為主。我國(guó)流星雨敢賭、四川、山西、陜西、新疆和內(nèi)蒙古等17省 (市、區(qū))。根據(jù)不同的地理環(huán)境、傳染源和傳播媒介將內(nèi)臟利什曼病分為3型，山丘型，平 原型和自然疫源型。利什曼原蟲不僅種類繁多，且其宿主和媒介亦具多樣性和交叉性，因此正確鑒定 利什曼原蟲對(duì)選擇恰當(dāng)?shù)闹委煷胧?、制定合適的控制策略均至關(guān)重要。利什曼原蟲蟲種復(fù) 雜，且新種時(shí)有發(fā)現(xiàn)。分子方法的不斷涌現(xiàn)及應(yīng)用為解決這一問題提供了契機(jī)，但由于各種 方法自身的特點(diǎn)及所分析的靶序列的差異，其分析結(jié)果往往不一致，甚至矛盾。如何形成一 種“金標(biāo)準(zhǔn)”的分子分析或鑒定方法，并與外在特征相統(tǒng)一是亟待解決的問題。rRNA是常 用的靶基因。rRNA是生物細(xì)胞中最為保守的結(jié)構(gòu)基因，在進(jìn)化過程中，不同種屬真核生物 rDNA序列特征保持相對(duì)穩(wěn)定，常顯示出高度的保守性和廣泛的異種同源性，其序列不同位 置上的變化速度不同而具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，某些序列具有種株特異性，已成為進(jìn)行病原 體種株鑒定和診斷的靶基因，并應(yīng)用于系統(tǒng)分類及構(gòu)建進(jìn)化樹。長(zhǎng)期以來，在現(xiàn)場(chǎng)工作中，白蛉的分類鑒定和感染診斷主要依靠鏡下鑒定，由于白 蛉個(gè)體微小、種間形態(tài)近似以及種下多型的現(xiàn)象，想用解剖鏡鑒別需要較高的解剖技能，以 及研究者多年的經(jīng)驗(yàn)，因此常受到標(biāo)本狀態(tài)、環(huán)境條件和研究者主觀經(jīng)驗(yàn)的影響較大。同 時(shí)，黑熱病媒介監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查中，面臨的往往是大量的白蛉，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)方法的不 足，提供一種簡(jiǎn)單快速、靈敏特異、對(duì)技術(shù)人員要求不高的分子檢測(cè)白蛉體內(nèi)利什曼原蟲的 方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供一種白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒，包括下列組成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反應(yīng)液包括雙蒸滅菌水、2XMaster PCR mix和引物；所述引物含有兩對(duì) 引物，引物1的序列為上游:5，-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3，，其序列如SEQ ID NO 1 所示；下游:5，-CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3，，其序列如 SEQ ID NO 2 所示； 引物 2 的序列為上游5'-CCT GGT TAG TTT CTTTTC CTC CGC T-3，，其序列如 SEQ ID NO: 3 所示；下游5，-CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC-3，，其序列如 SEQ ID NO :4 所示。其中，引物1能特異性擴(kuò)增利什曼原蟲；引物2能特異性擴(kuò)增白蛉屬。在本發(fā)明的另一方面，提供一種白蛉體內(nèi)利什曼原蟲的檢測(cè)方法，包含如下步 驟(1)白蛉的抽提；(2)設(shè)計(jì)并合成如權(quán)利要求1所述的引物1 (上游SEQ ID NO :1，下游SEQID NO 2)和引物 2 (上游 SEQ ID NO :3，下游 SEQ ID NO 4)；(3)將步驟(1)抽提得到的白蛉抽提液作為DNA模板進(jìn)行復(fù)合PCR方法檢測(cè)；檢 測(cè)復(fù)合PCR反應(yīng)體系為DNA模板，2 XMaster PCR mix，步驟⑵合成的引物1和引物2，雙 蒸滅菌水；(4)步驟⑵所得的PCR產(chǎn)物4°C保存，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。步驟⑵中，所述復(fù)合PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30seC、55°C退 火30sec、72°C延伸30sec共35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸lOmin。本發(fā)明的有益效果在于目前的各種PCR衍生技術(shù)中，多重PCR技術(shù)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)檢 測(cè)與假陰性控制。本發(fā)明在PCR反應(yīng)體系中除特異性擴(kuò)增利什曼原蟲的引物外，還加入一 對(duì)特異性擴(kuò)增白蛉屬的引物，作為內(nèi)參，采用該兩對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)可以避免假陰性情 況的發(fā)生。本發(fā)明所用的復(fù)合式PCR方法，在鑒定人員缺乏長(zhǎng)期現(xiàn)場(chǎng)經(jīng)驗(yàn)的情況下，能夠及 時(shí)快速的進(jìn)行陽性白蛉的篩選，一次性確定陽性白蛉，是對(duì)傳統(tǒng)白蛉檢測(cè)的一種有益的補(bǔ) 充和確認(rèn)的方法。為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)白蛉體內(nèi)的利什曼原蟲提供了一種新的檢測(cè)手段。本發(fā) 明從分子水平上進(jìn)行鑒別和診斷，結(jié)果更客觀，靈敏度更高。同時(shí)可以在后續(xù)的工作中應(yīng)用 本發(fā)明方法同時(shí)進(jìn)行蛉種和蟲種的鑒別。


圖1是實(shí)施例1的白蛉和利什曼原蟲實(shí)驗(yàn)室混合樣本與野外標(biāo)本對(duì)照的1. 5%瓊 脂糖凝膠電泳圖，圖1中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為利什曼原蟲PCR結(jié)果；2為野外標(biāo)本抽 提DNA的PCR結(jié)果；3為實(shí)驗(yàn)室白蛉和利什曼原蟲混合樣本PCR結(jié)果；4為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1白蛉的抽提(采用QIAGEN DNA抽提試劑盒，產(chǎn)品型號(hào)為69504購自 QIAGEN國(guó)內(nèi)代理商上海市萊楓科技有限公司)1.采集野外白蛉解剖鏡下驗(yàn)證利什曼原蟲陽性、前鞭毛體感染，帶回實(shí)驗(yàn)室；2.取一只白蛉放入1. 5mlEP管(離心管)中，加入ATL (組織裂解液，購自QIAGEN 公司)180ul (微升)，充分研磨，加入20ul蛋白酶K (購自QIAGEN公司)，水浴55°C 2小時(shí)；3.在EP管中加入200ul AL (裂解液，購自QIAGEN公司，水浴70°C 10分鐘；4.在EP管中加入200ul無水乙醇，充分混勻，將混合液移至過濾柱中，離心 8000rpmXlmin ；5.棄收集管和液體，在過濾柱中加入500ul已加入無水乙醇25ml的WAl (洗滌液 1，購自 QIAGEN 公司)，離心 8000rpmXlmin ；
6.棄收集管和液體，在過濾柱中加入500ul已加入無水乙醇30ml的WA2 (洗滌液 2，購自 QIAGEN 公司)，離心 14000rpmX 3min ；7.換新的收集管，空轉(zhuǎn)過濾柱，14000rpmX Imin ；8.加入200ul AE (洗脫液，購自QIAGEN)，把過濾柱放到新的EP管中，靜置1分鐘 后，離心 8000rpmXlmin ；9.得到DNA模板，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)國(guó)際基因庫中已公布的利什曼原蟲保守序列的動(dòng)基體DNA小環(huán)，動(dòng)基體DNA 具有利什曼原蟲屬的高度保守性，同時(shí)，它還具有高度異質(zhì)性特點(diǎn)，不但在種間高度差異， 而且在同種不同地理株間也存在差異，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物引物1的序列為上游:5，-CTTTTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3，，其序列如 SEQ ID NO 1 所示；下游5，-CCACCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3，，其序列如 SEQ ID NO 2 所示；片段長(zhǎng)度140bp左右測(cè)序結(jié)果CCACCTGGCCTATTTTACACCAACCCCCAGTTTTCCGCCTCGGAGCCCATTTTGGCATTTTTGGCCGAT TTTGAACGGGATTCTGCACCCATTTTTCCGATTTTGCAAAACGCCCCTACCCGCGGGACCAGAAAAGA經(jīng)過廣泛研究證實(shí)，核糖體基因(ribosome DNA, rDNA)是分子鑒別和分子系統(tǒng)學(xué) 研究的較理想的分子指標(biāo)，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫中白蛉序列為基礎(chǔ)，其中白蛉核糖體DNA第2內(nèi) 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS2)序列為重要的分子特征序列，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物。引物2的序列為上游5，-CCTGGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T-3，，其序列如 SEQ ID NO :3 所 示；下游5，-CGCAGC TAA CTG TGT GAA ATC-3，，其序列如 SEQ ID NO 4 所示。片段長(zhǎng)度約為500bp測(cè)序結(jié)果TCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTAATATGCTTAAATTCAGGGGGTAGTCACGCATGAGTTGA GGTCGCTTTTTTAAAAATATACATTTTTTCTTTAGACACATTCTTTATTATGAATAATCTCTTATAGTAATAATACT GGAATGTAACAAAAATCTCACATAAGTGATTTATGCAATGATTATGATGTTACACTCACATAATGTAATATTACATT TTTCAATGAGTACATTCAAATGCGTCAAAAAAAATTTTAAGAGCATGAAAGTACAAAGGACTTACATAGCTCCAATG TTTTTACTACCCCCCAACAATTAGGGTGTAGTAAAAACAATTTGTTCTGCTTATTATTTACGACACTCAACCATACG TGGTCCATGCAGTTTAAAAACATAAGTTAAAAACATTAGCATGGACCGCAATGTGCGTTCAAAATGTCGATGTTCAT GTGTCCTGCAGTTCACACGATTTCACACAGTTAGCTGCGA上述引物由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成，測(cè)序由上海鼎安生物科技有限公司 完成。實(shí)施例3復(fù)合PCR方法檢測(cè)檢測(cè)復(fù)合PCR反應(yīng)體系為在0.9ml的PCR管中依次加入以下試劑DNA模板 Ι.Ομ 1 (由實(shí)施例1制得)，2XMaster PCR Mix 12. 5 μ 1 (萊楓生物科技有限公司提供)，實(shí) 施例2合成好的引物1上游(SEQ ID NO 1)10 μ Μ、引物1下游(SEQ ID NO :2) 10 μ Μ、引物2上游(SEQ ID NO :3) 10 μ M、引物 2 下游(SEQID NO :4) 10 μ M 各 0. 5ul，最后加 ddH20(雙蒸 滅菌水)補(bǔ)足25. 0μ 1反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為，94°C預(yù)變性5min，94°C變性30seC、55°C退 火30sec、72°C延伸30sec共35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸lOmin。PCR產(chǎn)物4°C保存，進(jìn)行1. 5% 瓊脂糖凝膠(含5 μ g/ml EB (溴化乙錠))電泳。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示的第2條帶，測(cè)序均為目的條帶。圖1中，M為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；1為利什曼原蟲PCR結(jié)果；2為野外標(biāo)本抽提DNA的PCR結(jié)果；3為實(shí)驗(yàn)室白蛉和利什曼 原蟲混合樣本PCR結(jié)果；4為陰性對(duì)照?？梢?，圖1驗(yàn)證了此實(shí)驗(yàn)的可行性，過去媒介白蛉 的流行病學(xué)調(diào)查只能依靠現(xiàn)場(chǎng)解剖，對(duì)解剖標(biāo)本的前處理也很繁瑣，本實(shí)驗(yàn)可一次處理大 量樣本(96孔板PCR儀可一次性處理96只白蛉)，采集標(biāo)本后不用特殊處理，可直接抽提， 且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員沒有很高的要求，所以更利于普及，總耗時(shí)4個(gè)小時(shí)左右。白蛉活動(dòng)范圍小， 飛行能力弱，隨著以藥物殺滅白蛉為防治的主要措施的實(shí)施，結(jié)合環(huán)境治理和個(gè)人防護(hù)達(dá) 到了較好的防治目的。所以目前現(xiàn)場(chǎng)的白蛉的前鞭毛體感染率很低，可以結(jié)合本實(shí)驗(yàn)考慮 混合樣本抽提(10只白蛉為一個(gè)樣本)，可以使現(xiàn)場(chǎng)操作更快捷。序列表
<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所
<120>白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
<130>NP-10-14384
<160>4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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一種白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括下列組成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反應(yīng)液包括雙蒸滅菌水、2×Master PCR mix和引物；所述引物含有兩對(duì)引物，引物1的序列為上游5’ CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C 3’，其序列如SEQ ID NO1所示；下游5’ CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A 3’，其序列如SEQ ID NO2所示；引物2的序列為上游5’ CCT GGT TAG TTT CTTTTC CTC CGC T 3’，其序列如SEQ ID NO3所示；下游5’ CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC 3’，其序列如SEQ ID NO4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述引物1特異 性擴(kuò)增利什曼原蟲，所述引物2特異性擴(kuò)增白蛉屬。
3.一種白蛉體內(nèi)利什曼原蟲的檢測(cè)方法，其特征在于，包含如下步驟(1)白蛉的抽提；(2)設(shè)計(jì)并合成如權(quán)利要求1所述的引物1和引物2；(3)將步驟(1)抽提得到的白蛉抽提液作為DNA模板進(jìn)行復(fù)合PCR方法檢測(cè)；檢測(cè)復(fù) 合PCR反應(yīng)體系為DNA模板，2 XMaster PCR mix，步驟(2)合成的引物1和引物2，雙蒸滅 菌水；(4)步驟(2)所得的PCR產(chǎn)物4°C保存，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求3所述的白蛉體內(nèi)利什曼原蟲的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中， 所述復(fù)合PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec、55°C退火30sec、72°C延伸 30sec共35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白蛉體內(nèi)利什曼原蟲檢測(cè)試劑盒，包括下列組成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反應(yīng)液包括雙蒸滅菌水、2×Master PCR mix和兩對(duì)引物；引物1的序列為上游5’-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3’；下游5’-CCACCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3’；引物2的序列為上游5’-CCT GGT TAG TTTCTT TTC CTC CGC T-3’；下游5’-CGC AGC TAA CTG TGT GAA ATC-3’。此外，本發(fā)明還公開了白蛉體內(nèi)利什曼原蟲的檢測(cè)方法。本發(fā)明的試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單實(shí)用，對(duì)技術(shù)人員要求不高，為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)白蛉體內(nèi)的利什曼原蟲提供了新的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101921862SQ20101026824
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者周曉俊, 周曉農(nóng), 張儀, 顧燈安, 馬憲亮 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所