專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從克氏原螯蝦蝦殼中提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物分子生物學(xué)DNA樣品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從克氏原螯蝦蝦殼中提取DNA的方法。本發(fā)明制備的DNA可以用于克氏原螯蝦種群遺傳多樣性分析及相關(guān)分子生物學(xué)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，隸屬于甲殼綱，十足目，螯蝦科，原螯蝦屬， 原產(chǎn)于墨西哥北部和美國(guó)南部，現(xiàn)已成為世界上著名的入侵物種之一。由于其個(gè)體較大，適應(yīng)性強(qiáng)，能忍受長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月的枯水期，繁殖率高，可形成單優(yōu)勢(shì)種群，壓制、排擠或破壞本地物種，危及到本地物種的生存安全，影響入侵地生物多樣性。然而，由于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值， 克氏原螯蝦已成為我國(guó)一個(gè)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。為防止該入侵物種借助人工養(yǎng)殖的作用繼續(xù)擴(kuò)散，應(yīng)積極開(kāi)展其種群調(diào)節(jié)和控制的各項(xiàng)研究，以最大化地消除其入侵的負(fù)面影響，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)此類(lèi)研究主要集中在克氏原螯蝦在我國(guó)的種群遺傳多樣性、 種群遺傳結(jié)構(gòu)、與抗逆性相關(guān)基因以及分子標(biāo)記等方面，而采集樣本和提取樣本DNA是這些相關(guān)研究的基礎(chǔ)。目前，不僅克氏原螯蝦，其它蝦也多是采集尾肌作為樣本DNA的來(lái)源，尚未見(jiàn)到以蝦殼為樣本DNA來(lái)源的報(bào)道。以蝦尾肌為樣本DNA來(lái)源具有如下缺點(diǎn)1.蝦尾肌在采集和保存的過(guò)程中容易發(fā)生不同程度的腐敗(肉離體后一般會(huì)經(jīng)歷肉的僵直、肉的成熟、肉的腐敗三個(gè)連續(xù)變化過(guò)程，豬肉和雞肉等畜禽肉一般經(jīng)歷前兩階段的時(shí)間較長(zhǎng)，而蝦魚(yú)肉一般經(jīng)歷前兩個(gè)階段的過(guò)程很短，極易進(jìn)入腐敗過(guò)程)，其所含DNA也會(huì)隨之發(fā)生一定程度的降解，夏季采樣時(shí)此種現(xiàn)象尤為明顯；2.取蝦尾肌往往需要處死蝦，因此對(duì)于有些種用蝦或者還需要繼續(xù)飼養(yǎng)以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的蝦來(lái)說(shuō)，取尾肌則是行不通的；3.如果在采樣過(guò)程中蝦尾肌發(fā)生污染，則污染源無(wú)法剔除。若以蝦殼為樣本DNA來(lái)源則可克服以上缺點(diǎn)，具有較強(qiáng)的應(yīng)用性。然而，由于蝦殼堅(jiān)硬，很難裂解，再加上蝦殼中含有豐富的甲殼素在提取過(guò)程中很難洗滌干凈，目前亦尚未見(jiàn)到從蝦殼中成功提取DNA的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從克氏原螯蝦的蝦殼中提取DNA的方法，該種方法操作方便，所用試劑毒性較小，其樣本取樣時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害小，樣本易長(zhǎng)期保存，且提取的DNA 降解程度比從肌肉中提取的DNA降解程度低，經(jīng)過(guò)檢測(cè)和檢驗(yàn)?zāi)軡M(mǎn)足后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的需要。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種從克氏原螯蝦的蝦殼中提取DNA的方法，包括以下步驟1)取克氏原螯蝦蝦殼50mg，用濾紙吸干后置入2ml的離心管中，用剪刀將蝦殼剪碎；2)向步驟1)的離心管中加入500 μ L的組織裂解液，0. 5Μ的EDTA60 μ L，IM的二硫蘇糖醇40 μ L和20mg/mL的蛋白酶K 10 μ L，于65°C下水浴4_5h，期間每隔0. 5 Ih搖勻一次，得到樣品1 ；3)將步驟2)的樣品1取出置冰上冷卻后，加入7. 5M的乙酸銨200 μ L，充分混勻， 冰上冷卻5min，得到樣品2 ；4)將步驟3)的樣品2用冷凍離心機(jī)于4°C，12000rpm,離心IOmin后，吸取上清液
移入另一離心管中，重復(fù)步驟幻，得到樣品3 ；5)用冷凍離心機(jī)將步驟4)中的樣品3于4°C，12000rpm下離心IOmin后，取上清液移入另一離心管中，按體積比加入1 1. 5倍的異丙醇，輕輕搖動(dòng)1 2min，得到樣品4 ；6)采用冷凍離心機(jī)將步驟5)中的樣品4于4°C，12000rpm下離心IOmin后，棄去上清，得DNA沉淀樣品1 ；7)將步驟6)中的沉淀加入濃度為70%的乙醇ImL進(jìn)行洗滌，用冷凍離心機(jī)于4°C 下12000rpm，離心IOmin后棄去上清，得到DNA沉淀樣品2 ；8)將步驟7)中的沉淀加入無(wú)水乙醇ImL進(jìn)行洗滌，用冷凍離心機(jī)于4°C下 12000rpm,離心IOmin后棄去上清，得到DNA沉淀樣品3 ；9)將步驟8)的DNA沉淀樣品3于室溫置于敞開(kāi)的離心管內(nèi)直至可見(jiàn)的痕量的乙醇揮發(fā)殆盡(注意不要使樣品長(zhǎng)時(shí)間干燥，否則很難溶解)后，加入20-40 μ L滅菌雙蒸水， 置于4°C冰箱12-24h直至DNA樣品完全溶解，得到克氏原螯蝦總DNA溶液。其中步驟2)所述的組織細(xì)胞裂解液組分如下100mM Tris-HCl, pH 8. 0 ；50mM EDTA, PH 8.0 十二烷基硫酸鈉。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明中使用的試劑毒性比常規(guī)的酚氯仿法提取DNA所用試劑的毒性要小，且能從堅(jiān)硬的外殼中提取出足夠濃度和高質(zhì)量的DNA以滿(mǎn)足后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需求。2.本發(fā)明中利用的蝦殼屬于蝦體中的堅(jiān)硬組織，因?yàn)閳?jiān)硬的外層對(duì)于時(shí)間和外界環(huán)境因素有很強(qiáng)的抵抗力，可防止內(nèi)層的DNA分子受到破壞，同時(shí)能夠有效地防止外源性 DNA的污染。此外，外表堅(jiān)硬的組織即便采取洗、刮、磨等手段，也不會(huì)破壞內(nèi)層的DNA分子， 能更徹底地去除外源性DNA的污染。3.本發(fā)明中采用無(wú)水乙醇保存蝦殼，經(jīng)無(wú)水乙醇浸潤(rùn)過(guò)的蝦殼取出吸干后用剪刀很容易剪碎，不需要粉碎或研磨，簡(jiǎn)單方便，易于操作。4.因蝦殼DNA分子有堅(jiān)硬的外層保護(hù)，其取材后樣本保存時(shí)間會(huì)比肌肉取材樣本要長(zhǎng)得多，所以從其內(nèi)提取的DNA的降解程度較低。從圖1中可見(jiàn)瓊脂糖檢測(cè)蝦殼DNA的拖帶現(xiàn)象沒(méi)有肌肉DNA的嚴(yán)重，可見(jiàn)從蝦殼提取的DNA的降解程度比從蝦尾肌中提取DNA 的降解程度低。5.克氏原螯蝦的螯足具有再生功能，若以部分螯足作為DNA來(lái)源樣本，可以在不處死克氏原螯蝦的情況下獲取DNA，同時(shí)可以繼續(xù)飼養(yǎng)和觀測(cè)其生長(zhǎng)。


圖1 瓊脂糖檢測(cè)不同個(gè)體蝦尾肌和蝦殼DNA的降解情況。圖中M為marker (1Kb DNA ladder) ；1,3和5為肌肉組織DNA ；2、4和6為外殼DNA0
圖2 對(duì)分別以蝦殼DNA和蝦尾肌DNA為模板的PCR產(chǎn)物檢測(cè)。圖中M為 marker (DL2000) ； 1為以蝦尾肌DNA為模板的PCR產(chǎn)物；2為以蝦殼DNA為模板的PCR產(chǎn)物。圖3 以引物PCLG-09擴(kuò)增的部分群體的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中M為 marker (pucl8DNA/MspI)；其余泳道為引物PCLG-09對(duì)群體中部分個(gè)體DNA的擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但是實(shí)施例不會(huì)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1提取克氏原螯蝦蝦殼DNA從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)新鮮的克氏原螯蝦，取其部分蝦殼，置于無(wú)水乙醇中浸泡保存(保存時(shí)間為一個(gè)月)1)試劑配制A)組織細(xì)胞裂解液=IOOmM Tris-HCl, pH 8. 0 ；50mM EDTA, pH 8. 0 ；十二烷基硫酸鈉(SDS)；B) 0. 5M EDTA :23. 3g 二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na · 2H20)溶于 IOOmL 雙蒸水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，攪拌的同時(shí)加入NaOH調(diào)節(jié)pH值至8. 0，然后高壓蒸汽滅菌 (121°C，滅菌20min)，常溫保存(注二水乙二胺四乙酸二鈉需加入NaOH將溶液的pH值調(diào)至8. 0時(shí)才會(huì)溶解)。C) IM 二硫蘇糖醇(DTT)在二硫蘇糖醇5g的原裝瓶中加32. 4mL水，分成小份貯存于-20 °C ；D)20mg/mL蛋白酶K 在IOOmg蛋白酶K的原裝瓶中加入5mL滅菌雙蒸水，分成小份貯存于-20°C ；E)7. 5M乙酸銨50mL雙蒸水中加入28. 9g乙酸銨，用0. 22um孔徑的濾膜過(guò)濾除菌；F) 70%乙醇70mL的無(wú)水乙醇加上30mL的滅菌雙蒸水配成100mL70%乙醇溶液，
4°C貯存。G)其它試劑如異丙醇等直接冷藏備用。2)按以下步驟提取DNA ①取約50mg外殼(經(jīng)無(wú)水乙醇保存)，用濾紙吸干后置入2ml離心管，用剪刀將蝦殼充分剪碎；②加入500 μ L的組織細(xì)胞裂解液、60 μ L的EDTA、 40 μ L的DTT和10μ L的蛋白酶K(20mg/mL)；③56°C水浴過(guò)夜或65°C 4_5h，期間每隔0. 5 Ih搖勻一次；④拿出冷卻至室溫或置冰上冷卻，加入200 μ L的乙酸銨，充分混勻，冰上冷卻5min或置4°C IOmin ；⑤4°C，12000rpm，lOmin，然后吸取上清液移入另一新的離心管， 加入200 μ L的乙酸銨，充分混勻，冰上冷卻5min或4°C IOmin ；⑥4°C，12000rpm，IOmin ； 然后吸取上清液移入另一新的離心管，加入約1 1.5倍上清液體積的異丙醇，輕輕搖動(dòng) 1 anin ；⑦4°C，12000rpm, IOmin,棄去上清，留沉淀；⑧加入70%乙醇Iml進(jìn)行洗滌，4°C， 12000rpm, IOmin ；⑨棄去上清，加入無(wú)水乙醇Iml進(jìn)行洗滌，4°C，12000rpm，IOmin ；⑩室溫晾干，加入40 μ L的ddH20，-20°C貯存?zhèn)溆谩?shí)施例2按照實(shí)施例1的步驟，其中克氏原螯蝦蝦殼是用無(wú)水乙醇保存為3個(gè)月的材料。
實(shí)施例3按照實(shí)施例1的步驟，其中克氏原螯蝦蝦殼是用無(wú)水乙醇保存為6個(gè)月的材料。實(shí)施例4兩種提取DNA方法的比較本實(shí)施例通過(guò)采用實(shí)施例1方法提取蝦殼DNA，與常規(guī)的酚氯仿法(薩姆布魯克， 黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，200 提取蝦尾肌DNA (組織部位不同，但是提取的DNA個(gè)體相同)的結(jié)果比較，驗(yàn)證了從蝦殼中提取的DNA純度和濃度同樣可以滿(mǎn)足后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的要求?？耸显r群體30尾個(gè)體，雌雄各15尾，分別取蝦殼和蝦尾肌做樣本，無(wú)水乙醇分裝保存。取蝦殼和蝦尾肌用濾紙吸干后，按本發(fā)明方案從蝦殼中提取DNA，并用常規(guī)酚氯仿法(薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，200 從蝦尾肌中提取DNA，提取的部分樣本DNA用1. 0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，提取的全部樣本DNA均用儀器NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific)檢測(cè)其純度和濃度，結(jié)果見(jiàn)表1 :表1克氏原螯蝦蝦殼DNA和蝦尾肌DNA樣本的濃度和純度檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種從克氏原螯蝦的蝦殼中提取DNA的方法，其特征包括以下步驟1)取克氏原螯蝦蝦殼50mg，用濾紙吸干后置入2ml的離心管中，用剪刀將蝦殼剪碎；2)向步驟1)的離心管中加入500μ L的組織裂解液，0. 5Μ的EDTA60 μ L，IM的二硫蘇糖醇40 μ L和20mg/mL的蛋白酶K 10 μ L，于65°C下水浴4_5h，期間每隔0. 5 Ih搖勻一次，得到樣品1 ；3)將步驟2)的樣品1取出置冰上冷卻后，加入7.5M的乙酸銨200 μ L，充分混勻，冰上冷卻5min，得到樣品2 ；4)將步驟3)的樣品2用冷凍離心機(jī)于4°C，12000rpm,離心IOmin后，吸取上清液移入另一離心管中，重復(fù)步驟3)，得到樣品3 ；5)用冷凍離心機(jī)將步驟4)中的樣品3于4°C，12000rpm下離心IOmin后，取上清液移入另一離心管中，按體積比加入1 1. 5倍的異丙醇，輕輕搖動(dòng)1 2min，得到樣品4 ；6)采用冷凍離心機(jī)將步驟5)中的樣品4于4°C，12000rpm下離心IOmin后，棄去上清， 得DNA沉淀樣品1 ；7)將步驟6)中的沉淀加入濃度為70%的乙醇ImL進(jìn)行洗滌，用冷凍離心機(jī)于4°C下 12000rpm,離心IOmin后棄去上清，得到DNA沉淀樣品2 ；8)將步驟7)中的沉淀加入無(wú)水乙醇ImL進(jìn)行洗滌，用冷凍離心機(jī)于4°C下12000rpm， 離心IOmin后棄去上清，得到DNA沉淀樣品3 ；9)將步驟8)的DNA沉淀樣品3于室溫置于敞開(kāi)的離心管內(nèi)，待乙醇揮發(fā)干凈后，加入 20-40 μ L滅菌雙蒸水，置于4°C冰箱12-24h直至DNA樣品完全溶解，得到克氏原螯蝦總DNA 溶液。其中步驟2)所述的組織細(xì)胞裂解液組分如下100mM Tris-HCl, pH 8.0 ；50mM EDTA, pH 8.0 十二烷基硫酸鈉。
2.權(quán)利要求1所述的方法在克氏原螯蝦種群遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物分子生物學(xué)DNA樣品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從克氏原螯蝦蝦殼中提取DNA的方法。其步驟為將浸泡在乙醇溶液中的克氏原螯蝦蝦殼剪碎，向離心管中加入適量組織裂解液、EDTA、二硫蘇糖醇和蛋白酶K等，經(jīng)水浴裂解、乙酸銨抽提等步驟，得到克氏原螯蝦總DNA。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、方便，所用試劑毒性較小，樣本取樣時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害小，樣本易長(zhǎng)期保存，且提取的DNA降解程度比從蝦尾肌中提取的DNA降解程度低。本發(fā)明制備的DNA可以用于克氏原螯蝦種群遺傳多樣性分析及相關(guān)分子生物學(xué)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102477423SQ201010564558
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者劉肖蓮, 張 杰, 李艷和, 王衛(wèi)民, 羅偉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)