專利名稱：一種在丙酮丁醇梭菌中敲除基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及到pSY9-l-adc和pSY14_thl兩種重組質(zhì)粒，可用于丙酮丁醇梭菌基因敲除。
背景技術(shù)：
由于石油資源的有限性以及國際原油價格的波動性，生物丁醇目前受到越來越多的關(guān)注。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobylicum)是ー種革蘭氏陽性、可產(chǎn)孢子、專性厭氧的細(xì)菌，它可利用多種碳源，并且在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生溶劑丙酮、丁醇和乙醇，因此，丙酮丁醇梭菌也受到各國研究者的普遍重視，近年來對丙酮丁醇梭菌的代謝工程研究越來越
や1-3
O然而，該菌一直存在遺傳操作系統(tǒng)缺乏的問題。2000年之前，研究者們都是以傳統(tǒng)的同源重組方法在丙酮丁醇梭菌中完成基因敲除，主要分為2種，ー種是將攜帯一段與目標(biāo)基因內(nèi)部同源序列的非復(fù)制型整合質(zhì)粒通過單交換插入到靶基因內(nèi)，使靶基因插入失活。另ー種則是將含兩段同源DNA序列及抗性基因的復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該菌，通過抗性的不同來選擇外源DNA與靶基因發(fā)生雙交換的缺失菌株。利用第一種方法，敲除的基因有 buk，pta，aad，及solR基因4_7，這種方法得到的轉(zhuǎn)化子屬于插入失活，但留下較多無關(guān)的外源片段，有可能影響梭菌其他基因的功能。利用第二種方法，敲除的基因有spoOA8，此方法的不足之處在于梭菌的同源重組效率很低，很難挑選到發(fā)生雙交換的突變株，而且即使獲得了雙交換轉(zhuǎn)化子，抗性標(biāo)記仍然留在基因組上，雖然可以通過Flp-Frt系統(tǒng)去除標(biāo)記，但仍會留下“疤痕”。自2002年到2007年，沒有再出現(xiàn)其他關(guān)于該菌基因敲除的報道。2007年，有研究者在該菌中發(fā)展了 Targetron技術(shù)9_12，該技術(shù)是以可移動的ニ類內(nèi)含子來敲除靶基因，不依賴于同源重組，因而可以在梭菌中能有效地敲除基因。但是，該方法仍然屬于插入失活，即使可以通過Flp-Frt系統(tǒng)去除抗性基因，仍然會留下內(nèi)含子的序列?？傊?，上述三種敲除方法都將外源的序列帶入了基因組，難以完全去除。因此，本領(lǐng)域仍然需要一種無痕的基因敲除方法。

發(fā)明內(nèi)容
基于這些問題，本發(fā)明人嘗試了在丙酮丁醇梭菌中建立一種新的敲除技木，利用表達I-kel歸巢內(nèi)切酶，克服該菌的同源重組效率低，而難以獲得雙交換轉(zhuǎn)化子的問題， 并且能完成無痕的基因敲除。因此，本發(fā)明第一方面提供一種分離的多核苷酸序列，所述序列含有SEQ IDNO 1 所示的序列。在一具體實施例中，所述分離的多核苷酸序列由SEQ ID NO 1所示。在一具體實施例中，所述分離的多核苷酸序列編碼I-kel歸巢內(nèi)切酶。本發(fā)明第二方面提供ー種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有本發(fā)明的編碼I-kel歸巢內(nèi)切酶的多核苷酸序列。在一具體實施例中，所述構(gòu)建物以大腸桿菌-丙酮丁醇梭菌的穿梭載體作為骨
jk ο在一具體實施例中，所述構(gòu)建物還含有thl啟動子或ptb啟動子。在一具體實施例中，所述構(gòu)建物還含有Cm抗性基因。在一具體實施例中，所述構(gòu)建物的序列如SEQ ID NO 3或沈所示。本發(fā)明第三方面涉及本發(fā)明分離的多核苷酸序列、I-SceI歸巢內(nèi)切酶或含該多核苷酸序列的構(gòu)建物在敲除梭菌的基因、在梭菌基因組中引入外源基因和對梭菌基因組實施突變中的應(yīng)用。本發(fā)明第四方面提供一種在梭菌中敲除基因的方法，所述方法包括(1)構(gòu)建ー非復(fù)制型整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含梭菌的待敲除基因上下游兩段同源序列和I-kel酶切位點而不含該待敲除基因；(2)將所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述梭菌，篩選獲得整合了所述上下游兩段同源序列和IIceI酶切位點的菌株；和(3)使用本發(fā)明的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化步驟( 所獲得的菌株，從而將待敲除的基因從所述梭菌的基因組上敲除。本發(fā)明第五方面提供一種在梭菌中引入外源基因的方法，所述方法包括(1)構(gòu)建ー非復(fù)制型整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含梭菌基因中待插入位點上下游兩段同源序列和I-kel酶切位點，同時，該質(zhì)粒還含有所述外源基因；(2)將所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述梭菌，篩選獲得整合了所述上下游兩段同源序列、外源基因和I-kel酶切位點的菌株；和(3)使用本發(fā)明的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化步驟( 所獲得的菌株，從而將所述外源基因引入所述梭菌的基因組中。本發(fā)明第六方面提供ー種在梭菌基因組中實施突變的方法，所述方法包括(1)構(gòu)建ー非復(fù)制型整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含梭菌基因中待突變基因上下游兩段同源序列和HceI酶切位點，同時，該質(zhì)粒還含有發(fā)生了突變的該待突變基因序列；(2)將所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述梭菌，篩選獲得整合了所述上下游兩段同源序列、外源基因和I-kel酶切位點的菌株；和(3)使用本發(fā)明的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化步驟( 所獲得的菌株，從而將所述突變基因引入所述梭菌的基因組中。在一具體實施例中，所述突變可以是任何突變，包括插入、缺失或突變。在一具體實施例中，所述突變是點突變。在一具體實施例中，所述梭菌選自梭菌選自丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、熱纖梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、 Clostridium Ijungdahlii> Clostridiumphytofermentans、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣類膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌。在一具體實施例中，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、熱纖梭菌、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium ljungdanlii Jlk1Ciostridium phvtofermentans。
在一具體實施例中，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一具體實施例中，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌，所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒和構(gòu)建物經(jīng)甲基化后再轉(zhuǎn)入所述丙酮丁酸梭菌。在一具體實施例中，所述方法可實現(xiàn)連續(xù)敲除多個基因或大片段基因刪除。在一具體實施例中，所述外源基因位于所述上下游兩段同源序列之間。在一具體實施例中，所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒含待敲除基因上下游兩段同源序列、 I-kel酶切位點、和待插入基因，從而在引入外源基因的同時將該待敲除基因敲除。本發(fā)明第七方面提供ー種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明所述的構(gòu)建物。本發(fā)明的試劑盒可用于從梭菌中敲除基因、在梭菌基因組中引入外源基因或?qū)λ缶蚪M實施突變。本發(fā)明第八方面提供一種梭菌，其采用本發(fā)明所述的方法制備得到。在一具體實施例中，所述梭菌選自梭菌選自丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、熱纖梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、 Clostridium Ijungdahlii> Clostridiumphytofermentans、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣類膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌。在一具體實施例中，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、熱纖梭菌、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium ljungdanlii Jlk1Ciostridium phytofermentans。在一具體實施例中，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌或拜氏梭菌。


圖1顯示本發(fā)明pSY9-l-adc的質(zhì)粒圖譜。圖2顯示本發(fā)明pSY14_thl的質(zhì)粒圖譜。圖3顯示單交換示意圖將非復(fù)制型整合質(zhì)粒pSY9-l-adc甲基化之后，轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌ATCC 824，經(jīng)Em篩選，得到的轉(zhuǎn)化子分別以ch (a) primer/pl (a) primer和ch(b) primer/pl(b) primer兩對引物鑒定，每對引物包括一個來自基因組上的，故稱作“ ch”，另一個來自質(zhì)粒上的“Pi”。由于單交換的位置不同，可以產(chǎn)生兩種結(jié)果，分別如圖中的(1)和
(2)兩種結(jié)果。
圖4顯示PCRftadc單交換。
圖5顯示單交換PCR的測序結(jié)果。
圖6顯示PCRftadc單交換。
圖7顯示單交換PCR的測序結(jié)果。
圖8顯示雙交換示意圖。
圖9顯示菌落PCR。
圖10 顯示 PCR 鑒定 824 Δ adc (pSY14_thl)。
圖11顯示Aadc (pSY14-thl)的測序結(jié)果。
圖12顯示pUC19-adc酶切鑒定圖。
圖13顯示pSY9-l-adc酶切鑒定圖，其中3和
圖14顯示pSY14-thl酶切鑒定圖。
圖15顯示pSY14_ptb的質(zhì)粒圖譜。圖16顯示pSY14_ptb酶切鑒定圖。圖17顯示將甲基化的pSY14-ptb電轉(zhuǎn)ATCC 82^dc_crl之后，菌落PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn) No. 18為野生型條帶。圖18顯示以824adc-crl/pSY14-ptb No. 18的Hiia試管菌液為模板的PCR結(jié)果。圖19顯示以824adc-crl/pSY14-ptb No. 18的Hiia試管菌液為模板的PCR結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明的目的在于建立一種新的無標(biāo)記基因敲除的方法。本發(fā)明的目的可通過本發(fā)明所構(gòu)建的IIceI敲除系統(tǒng)而實現(xiàn)。Ι-keI是釀酒酵母線粒體基因內(nèi)含子編碼的一種歸巢內(nèi)切酶，參與將21S核糖體基因含內(nèi)含子的等位基因復(fù)制到不含有內(nèi)含子的同一基因內(nèi)。I-kel識別并切割18個堿基非対稱序列，切割后留下兩個不能配對的粘端。1995年，Choulika13等證明酵母的I-kel 內(nèi)切酶可以有效地在哺乳動物細(xì)胞染色體的靶基因上引入雙鏈的缺ロ，繼而高效催化染色體DNA和外源DNA之間的同源同組的效率。1999年，Posfai14首先在原核生物的基因敲除中采用該方法，在大腸桿菌中成功地完成了無標(biāo)記的基因敲除。自1999年，該方法首次在大腸桿菌中使用之后，它廣泛應(yīng)用在原核生物中，如炭疽芽孢桿菌15、谷氨酸棒狀桿菌16、 伯克氏菌(Burkholderia cenoc印acia)17、腸炎沙門氏菌w等。使用HceI系統(tǒng)，可以完成基因無痕缺失14_19、連續(xù)敲除15~17、大片段敲除14~17，并且能完成點突變15、及外源基因插入 15。但目前，還未有將該系統(tǒng)應(yīng)用在梭菌的報道。本發(fā)明的Ι-keI敲除系統(tǒng)可含有ー種IIceI構(gòu)建物。本發(fā)明的IIceI敲除系統(tǒng)還可含有如下文所述的各種非復(fù)制型整合載體。本發(fā)明的Ι-keI構(gòu)建物以合適的載體作為骨架，含有IIceI的編碼序列。本發(fā)明的I-kel構(gòu)建物還可含有各種啟動子，優(yōu)選的啟動子包括thl啟動子(SEQ ID NO :3第 4623 4775 位)和 ptb 啟動子(SEQ ID NO 26 第 3924 4039 位)。作為本發(fā)明Ι-keI構(gòu)建物的骨架，可使用各種已知的穿梭載體。這類穿梭載體包括但不限于例如pMTL007 (GenBank :EF525477. 1)、pJIR750 (GenBank :L02937. 1)等大腸桿菌-丙酮丁醇梭菌穿梭載體。因此，在一具體實施例中，本發(fā)明的I-kel構(gòu)建物是ー種載體。在更優(yōu)選的實施例中，該構(gòu)建物是ー種表達載體，用于表達I-kel歸巢內(nèi)切酶。在一具體實施例中，所述Ilce I歸巢內(nèi)切酶的序列如SEQ ID NO 27所示?？蓪Ρ景l(fā)明的構(gòu)建物中的I-kel的編碼序列進行優(yōu)化。在ー個具體實施例中，所述構(gòu)建物中的IIceI的編碼序列如SEQ ID NO 1所示。應(yīng)理解，可對本發(fā)明SEQ ID NO :1所示的序列做出一個或幾個核苷酸突變(即“簡并變異體”)，只要突變所得的多核苷酸序列仍然編碼I-kel氨基酸序列即可。因此，在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的IIceI構(gòu)建物含有SEQ ID NO 1所示的序列或其簡并變異體。在另ー優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的IIceI構(gòu)建物含有SEQ ID NO=I 所示的序列或其簡并變異體和thl啟動子或ptb啟動子。在其它實施例中，本發(fā)明的IIceI構(gòu)建物還可含有Cm抗性基因(GenebankNC 002013. 1)。
本發(fā)明ー個具體的IIceI構(gòu)建物的序列如SEQ ID NO 3或沈所示。本發(fā)明的非復(fù)制型整合質(zhì)粒含有待敲除基因、待插入位點或待突變基因的上下游兩段同源序列和IIceI的識別位點。通常，本文所用“上下游兩段同源序列”的長度在SOObp 1. 5kb左右。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際要敲除的靶基因、插入外源基因的位點、待突變基因的位置等選擇合適長度的上、下游同源序列，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的知識范圍之內(nèi)。待敲除的基因或待突變的基因可以是梭菌中的任意感興趣的基因。本申請中，考慮到adc敲除以后丙酮產(chǎn)量明顯下降，具有明顯的表型，因此本申請選取該基因作為正表型對照。應(yīng)理解，本申請并不限于丙酮丁酸梭菌adc基因的敲除。本申請系統(tǒng)和方法適用于梭菌中任意基因的敲除和任意基因的突變。通常，引入的點突變會造成該突變基因編碼的蛋白失活或活性下降，或者無法編碼完整的蛋白。待插入的外源基因也是各種感興趣的基因，待插入的基因通常用于異源表達某個代謝途徑或引入抗性基因以失活該基因。對待插入的位點也無特殊限制，可根據(jù)實際需要在不同位點插入外源基因。例如， 若插入外源抗性基因以中斷靶基因，則可選取在靶基因內(nèi)部的位置(50 200nt)。如果插入某個異源代謝途徑，則可以插入在基因組某個目的啟動子之后。本申請中，還可在插入外源基因的同時將待敲除的基因敲除。為此，在設(shè)計非復(fù)制型整合質(zhì)粒時，可將該非復(fù)制型整合質(zhì)粒設(shè)計成含有待敲除基因上下游同源序列、待插入基因以及I-kel的識別位點的質(zhì)粒。該待插入基因可處于所述上下游同源序列之間。優(yōu)選地，該非復(fù)制型整合質(zhì)粒還含有該待插入基因的啟動子序列。通常，非復(fù)制型整合質(zhì)粒中，該I-kel的酶切位點(識別位點)處于所述下游同源序列的下游(位于同源臂的外部)。通常，可使用例如pUC19載體作為本發(fā)明非復(fù)制型整合載體的骨架。因此，本申請也涉及上述構(gòu)建物和/或非復(fù)制型整合質(zhì)粒在梭菌基因敲除中的應(yīng)用。除基因敲除之外，該構(gòu)建物還可用于在梭菌基因組上引入外源基因、實現(xiàn)連續(xù)敲除、點突變、及大片段刪除。通常，在將本發(fā)明的非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌(例如，丙酮丁酸梭菌)之前， 可先將其甲基化，然后將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌。可采用本領(lǐng)域周知的方法進行甲基化。在ー個具體實施方式
中，通過將該非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli ER2275/pAm中，從而實現(xiàn)在Cac8I位點甲基化。然后抽提質(zhì)粒， 再將甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌中。然后，同樣地，可先將本發(fā)明的構(gòu)建物經(jīng)E. coli ER2275/pANl在Cac8I位點甲基化后，再轉(zhuǎn)化入經(jīng)非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌中。應(yīng)理解，可采用本領(lǐng)域熟知的各種轉(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌中。在優(yōu)選的實施例中，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌中。可采用本領(lǐng)域周知的方法鑒定所轉(zhuǎn)化的宿主菌是否為所需的宿主菌。例如，可采用PCR方法進行鑒定。本發(fā)明還提供一種試劑盒，該試劑盒含有本發(fā)明的構(gòu)建物。在優(yōu)選實施方式中，試劑盒還可含有實施本發(fā)明方法所需的各種試劑，例如實施轉(zhuǎn)化所需的試劑、實施PCR所需的試劑等等。本發(fā)明的試劑盒還可包括一指導(dǎo)技術(shù)人員使用該試劑盒進行基因敲除的說明書。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于各種梭菌，包括但不限于丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌 (Clostridium Dei jerinckii;、糖」ー酸梭菌(ClostridiumSaccharobutylicum)、糖乙酸多 J 醇梭菌(ClostridiumsaccharoperDutylacetonicum)、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium 丄jungdahlii、Clostridium phytofermentans、熱纖梭菌(Clostridium themocellum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium Botulinum)、艱難梭菌(Clostridium difficile)等。因此，本發(fā)明也包括采用本發(fā)明方法制備得到的目的基因已被敲除、且不保留抗性基因的梭菌、插入了外源基因的梭菌、以及插入了外源基因且目的基因已被敲除的梭菌。 本發(fā)明也包括采用本發(fā)明的方法制備得到的目的基因發(fā)生了突變的梭菌。本發(fā)明還包括Ι-keI歸巢內(nèi)切酶在敲除梭菌的基因、在梭菌基因組中引入外源基因和對梭菌基因組實施點突變中的應(yīng)用。本文所用術(shù)語“I-Scel歸巢內(nèi)切酶”可以是本領(lǐng)域周知的IIceI歸巢內(nèi)切酶。在一具體實施例中，所述IIceI歸巢內(nèi)切酶的序列如SEQ ID NO 27所示。與現(xiàn)有的方法方法相比，本發(fā)明能實現(xiàn)無標(biāo)記的基因缺失，不會引起極性效應(yīng)的問題，并且可以做連續(xù)敲除；具有在梭菌基因組操作大片段缺失的潛力；具有對梭菌基因組的序列做精密改造的潛力，例如點突變；和具有引入外源基因到基因組目的序列的潛力。下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明使用的菌株和質(zhì)粒為pIMPl-ptb、pANl質(zhì)粒和E. coli ER2275，見參考文獻10和19。質(zhì)粒pITC為pIMPl-ptb的衍生質(zhì)粒(添加了 thl啟動子，并將原本的Em基因改為了 Cm抗性基因)，如下構(gòu)建首先，將pIMPl-ptb啟動子換成thl啟動子(I^stl+BamHI)， 構(gòu)建pIMPl-thl2 ；其次，從？(19ゼ°擴增氯霉素抗性基因表達盒〔Sacl+Clal，上下游引物分別為TAGCGAGCTCGTTGGCCGATTCATTAATGC(SEQ IDNO :20)，atatcgatGAAAAGAAGTGAATGCGCAA (SEQ ID NO :21)〕，分別以Clal+SacI酶切pIMPl(thl2)和氯霉素抗性基因表達盒，以T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在添加氯霉素的抗性LB板上；最后，提取質(zhì)粒，PCR驗證。質(zhì)粒pSY7為ρ IMP Ι-ptb的衍生質(zhì)粒，以引物Cm-I (PvuII)和Cm_2 (ClaI) 從 pC1942。擴增氯霉素抗性基因表達盒，(Cm-1 (PvuII) 5，-CGCAGCTGTTTATGTTACAGTAATATTG AC-3，(SEQ ID NO 22), Cm_2(ClaI)5，-CCATCGATTTATAAAAGCCAGTCATTAG-3，(SEQ ID NO 23)〕，PCR產(chǎn)物以PvuII和ClaI酶切，連入同樣酶切的pIMPl-ptb質(zhì)粒載體，從而將其紅霉素抗性基因表達盒替換為氯霉素抗性基因表達盒。本發(fā)明使用的酶和試劑為限制性內(nèi)切酶購自！^rmentas公司；T4連接酶購自 Takara公司；KOD DNA聚合酶購自Toyobo公司；EasyTaq聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR純化試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自華舜生物制品有限公司，瓊脂購自西巴斯生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進ロ分裝。CGM 培養(yǎng)基配方(g/L) (NH4)2S042g ；K2HPO4Ig ；KH2PO4O. 5g ；MgSO4. 7H20 0. Ig ； FeSO4. 7H20 0. 015g ；CaCl2 0. Olg ；MnSO4. H2O 0. Olg ；CoCl2 0. 002g ；ZnSO4 0. 002g ； Tryptone 2g ；\east extraction Ig ；Glucose 20go實施例1、pUC19_adc質(zhì)粒載體的構(gòu)建1、pUC19-adc質(zhì)粒載體構(gòu)建以丙酮丁醇梭菌基因組為模板，分別以引物HindIII (adc-Ll) -Rl-LKadc)通過 PCR擴增adc上游同源臂adcL ；通過引物L(fēng)2-R2 (adc)和BamHI (adc_R2)通過PCR擴增adc 下游同源臂adcR ；PCR產(chǎn)物回收后(方法見華舜膠回收Kit)，經(jīng)BamHI和HindIII酶切連入相同酶切的質(zhì)粒PUC19 (方法見華舜膠回收Kit)；使用T4連接酶(Takara公司)連接酶切后的片斷及載體，然后16°C過夜。所得質(zhì)粒命名為pUC19-adc。使用pUC19-adc轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，方法參見分子克隆3。然后挑取重組子，LB試管(Amp) 37°C過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用BamHI和HindIII酶切鑒定。其酶切鑒定圖見圖12。挑取正向的克隆子。使用到的引物序列如下HindIII(adc-Ll) -CCCAAGCTTATGATTAATGATAAAAACCTA_3~ (SEQ ID NO 4)Rl-Ll(adc) 5~-GTGACTTTTTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATG-3~ (SEQ ID NO 5)L2-R2(adc) -CTCTTATTTTTAAAAAGTCACCTTCCTAAATTTAAT_3~ (SEQ IDNO 6)BamHI(adc-R2) -CGGGATCCTTAATTTAACTTTCTCTTTAG_3~ (SEQ ID NO :7)使用到的PCR反應(yīng)體系IOOulKOD 酶 Iul ;K0D buffer IOul ；MgCl2 (25uM) IOul ；dNTP(2. 5uM)8ul ；引物 Inl(IOuM) 4ul ；引物 (IOuM) 4ul ；質(zhì)粒模板 2ul ；ddH20 61ul。使用到的PCR 反應(yīng)條件如下95°C 5min ； 95°C 30s ； 55 °C 30s ； 72 °C Imin ；72°C lOmin。實施例2、pSY9-l-adc質(zhì)粒載體的構(gòu)建以丙酮丁醇梭菌基因組為模板，以引物NdeI(SCeI-thll)、Eml-Thll通過PCR擴增 thl啟動子(包括rbs序列)，并且引入了 Ι-keI歸巢酶識別位點ISbp ；同時以pIMPl質(zhì)粒為模板，以Thl2-Em2、NdeI (XholI-Em-2)為引物，PCR擴增Em抗性基因，分別純化的PCR產(chǎn)物，以之為模板，以 Nde I (Scel-thll) ,NdeI (XholI-Em-2)為引物，通過 Overlapping PCR, 獲得包含thl啟動子+RBS+MLS的序列，NdeI酶切后，連入相同酶切的pUC19-adc質(zhì)粒，經(jīng)過酶切驗證后(其酶切鑒定圖見圖13)，挑選正向的轉(zhuǎn)化子，命名為pSY9-l-adc(見圖1及 SEQ IDNO 2)。所使用到的引物序列如下NdeI(SceI-thl 1) -GAATTCCATATGTAGGGATAACAGGGTAATGTGTTTTTTTTAACAAAAT ATAT-3"(SEQ ID NO 8)Eml-Thll -TCTCGTTCATTCTAACTAACCTCCTAAATTTTG_3~ (SEQ ID NO :9)Thl2-Em2 :5~-AGGTTAGTTAGAATGAACGAGAAAAATATAAAAC-3~ (SEQ ID NO :10)NdeI (XholI-Em-2) 5~-GGAATTCCATATGCTCGAGTTACTTATTAAATAATTTATAG-3~ (SEQID NO 11)其它操作步驟和條件如實施例1。實施例3、pSY14-thl質(zhì)粒載體的構(gòu)建由于Ι-keI原始序列與梭菌中的密碼子使用差距較大，本發(fā)明人優(yōu)化了該基因的密碼子，由南京金斯瑞基生物科技有限公司合成，將合成的基因克隆在市售的PUC57質(zhì)粒上名為pUC57-SceC。以引物(BamHI)和引物keC_2 (SmaI)通過PCR將sceC序列(SEQ ID NO 1)擴增出來，BamHI和SmaI雙酶切后，連入相同酶切的pITC質(zhì)粒，經(jīng)過酶切驗證后(其酶切鑒定圖見圖14)，命名為pSY14-thl (見圖2及SEQ ID NO :3)。所使用到的引物序列如下SceC-I (BamHI) :5:CGCGGATCCATGCATCAAAAGAATCAAGT_3~ (SEQ ID NO :12)SceC-2(SmaI) -TCCCCCGGGTTATTTAAGAAAAGTTTCAC_3~ (SEQ ID NO :13)其它操作步驟和條件如實施例1。實施例4、重組菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824adc-crl構(gòu)建1.重組菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 82^dc-crl構(gòu)建(l)pSY9-l_adc 質(zhì)粒的甲基化首先，制備E. coli ER2275/pANl的化學(xué)感受態(tài)；將pSY9-l_adc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ε. coli ER2275/pANl，轉(zhuǎn)化方法見分子克隆。挑單菌至細(xì)1 LB試管，カロ AmplOO μ g/ml，Cm 25 μ g/ ml，過夜培養(yǎng)。用試劑盒抽提質(zhì)粒。(2)電轉(zhuǎn)pSY9-l-adc甲基化質(zhì)粒至丙酮丁酸梭菌ATCC 824接單菌至CGM培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)；次日，以4%轉(zhuǎn)接100ml CGM培養(yǎng)基，37 °C 培養(yǎng)；OD600 M 0.6左右，取75ml菌液，4000rpm，4°C離心IOmin去上清，以ETM緩沖液懸浮， 4000rpm，4°C離心IOmin ；去上清，以1. 5ml ET緩沖液懸浮；取300ul，加入15 μ g質(zhì)粒，混勻后，加入電轉(zhuǎn)杯Omm)，電擊條件2. OkV,電擊后，加入CGM培養(yǎng)基1ml，37°C培養(yǎng)過夜；取出，以2001涂紅霉素(10ug/ml)抗性平板。37°C，厭氧箱內(nèi)培養(yǎng)48_%h小吋，挑單菌至Em 試管，生長起來的菌液，以菌液PCR驗證。ET緩沖液ETM緩沖液270mM 蔗糖270mM 蔗糖0. 6mM Na2HPO40. 6mM Na2HPO44. 4mM NaH2PO44. 4mM NaH2PO4IOmM MgCl2(3) PCR驗證(包括菌落PCR及抽提敲除菌基因組為模板的PCR)PCR反應(yīng)體系，參見實施例1。PCR 反應(yīng)條件95°C 5min ；95°C 30s ； 55°C 30s ； 72 °C 3min ； 72 °C 3min。G) DNA抽提方法采用生エ基因組抽提試劑盒進行。使用如下的adc單交換鑒定PCR引物ch (a)引物5~-AGCTAAAACCGTAATAGTTG-3~ (SEQ ID NO :14)pi (a)引物5~-TAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC-3~ (SEQ ID NO :15)CN 102559704 A
ch (b)引物5:TGTTAATATGGCATTTAAAGAC-3~ (SEQ ID NO :16)pl(b)引物5~-GTATGTTGTGTGGAATTGTGAG-3~ (SEQ ID NO :17)每對引物包括一個來自基因組上的，故稱作“ch”，另ー個來自質(zhì)粒上的“pi”。由于單交換的位置不同，可以產(chǎn)生兩種結(jié)果，分別如圖3中的(1)和(2)兩種結(jié)果。2.單交換實驗結(jié)果以Em試管生長的菌液為模板，PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)824/pSY9-l-adc(N0. 1 在ch(a)引物/pl(a)引物產(chǎn)生的條帶大小為2. 51Λ左右(見圖4)；以ch(b)引物/pl(b)引物條帶大小約為1.81Λ (見圖6)。抽提菌落PCR中陽性重組菌19的基因組，分別以ch (a)/pl (a)引物擴增出的PCR產(chǎn)物純化測序，結(jié)果與預(yù)期的序列相符(見圖幻，包含了 adcL-adc-adcR序列，adcL的上游是染色體上的序列，而adcR下游則是載體的，與圖ー的結(jié)果中的第(2)種單交換相符。以ch(b)引物/pl (b)引物擴增的PCR純化后經(jīng)測序，結(jié)果也與預(yù)期的序列相符(見圖7)，包含了 adcL-adcR的序列，adc-L上游為載體序列，adcR下游為染色體序列。 也與圖3的結(jié)果中的第(2)種單交換相符。因此，我們所得到的824/pSY9-l-adc(N0. 19)發(fā)生的單交換屬于第( 種情況，將該菌命名為824adc-crl。實施例5、重組菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824 Δ adc構(gòu)建1、將pSY14_thl質(zhì)粒經(jīng)Ε. coli ER2275/pANl在Cac8I位點甲基化后，電轉(zhuǎn)丙酮丁醇梭菌ATCC 824 adc-crl，復(fù)蘇過夜后，取200ul細(xì)胞涂布Thia(17ug/ml)抗性平板。37°C， 厭氧箱內(nèi)培養(yǎng)48-%h小吋，挑單菌由菌落PCR驗證。ATCC擬4 Δ adc雙交換的菌落PCR引物如下ch (a)引物5~-AGCTAAAACCGTAATAGTTG-3~ (SEQ ID NO :18)ch (b)引物5:TGTTAATATGGCATTTAAAGAC-3~ (SEQ ID NO :19)2、ATCC 824 Δ adc敲除的其他驗證抽提菌落PCR中陽性重組菌22的基因組，以ch (a)引物和ch(b)引物通過PCR擴增的產(chǎn)物，經(jīng)純化后，測序。具體操作步驟見實施例4。Em 抗性鑒定 PCR 引物如下NdeI (kel-thll) (SEQ ID NO 8)；和 NdeI (XholI-Em-2)(SEQ ID NO :11)。3、雙交換結(jié)果pSY14_thl是Thia抗性，在thl啟動子下表達sceC基因。sceC基因是本發(fā)明根據(jù)丙酮丁醇梭菌的密碼子優(yōu)化之后合成的基因，蛋白序列與I-kel相同。當(dāng)sceC高效表達時，它可以識別IIceI位點，產(chǎn)生雙鏈DNA缺ロ，提高同源重組效率。雙交換吋，根據(jù)同源臂發(fā)生交換的位置，也可以產(chǎn)生兩種結(jié)果，如圖8所示，ー種為野生型，另ー種為缺失了 adc的突變型。將甲基化的pSY14-thl轉(zhuǎn)入82^dc-crl，轉(zhuǎn)化效率約為IO3轉(zhuǎn)化子/ug DNA0 對此進行了菌落PCR驗證(圖9)，并挑選其中No. 22 (因其大小為突變型條帶，并且條帶單一)，進行進一步驗證之后，發(fā)現(xiàn)該菌在Em試管里不生長，表明其丟失了第一歩整合質(zhì)粒 pSY9-l-adc ；同吋，PCR驗證表明它不含有pSY9-l-adc，并且雙交換之后，是純的突變株條帶(見圖10)，該菌命名為SMAadc。然后，將該條帶純化測序發(fā)現(xiàn)，結(jié)果確實缺失了 adc 基因，其他序列未有改變(見圖11)。將ATCC 8MAadc陽性重組菌22接至8%玉米(加CaCO3)發(fā)酵，48小吋，取樣，
12測溶劑含量。發(fā)酵結(jié)果表明，丙酮和乙醇的產(chǎn)量與TargeTron敲除adc的突變株表型吻合。 結(jié)果如下表所示Aadc溶劑測定
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸序列，其特征在干，所述序列含有SEQ ID NO :1所示的序列。
2.—種構(gòu)建物，其特征在干，所述構(gòu)建物含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建物，其特征在干，所述構(gòu)建物以大腸桿菌-丙酮丁醇梭菌的穿梭載體作為骨架。
4.如權(quán)利要求2 3中任ー項所述的構(gòu)建物，其特征在干，所述構(gòu)建物還含有thl啟動子或ptb啟動子和Cm抗性基因。
5.如權(quán)利要求2 4中任ー項所述的構(gòu)建物，其特征在干，所述構(gòu)建物的序列如SEQID NO 3或26所示。
6.I-SceI歸巢內(nèi)切酶、權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列或權(quán)利要求2 5中任ー項所述的構(gòu)建物在敲除梭菌的基因、在梭菌基因組中引入外源基因和對梭菌基因組實施突變中的應(yīng)用。
7.一種在梭菌中敲除基因的方法，其特征在干，所述方法包括(1)構(gòu)建ー非復(fù)制型整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含梭菌的待敲除基因上下游兩段同源序列和 I-SceI酶切位點而不含該待敲除基因；(2)將所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述梭菌，篩選獲得整合了所述上下游兩段同源序列和Ι-keI酶切位點的菌株；和(3)使用權(quán)利要求2 5中任ー項所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化步驟( 所獲得的菌株，從而將待敲除的基因從所述梭菌的基因組上敲除。
8.一種在梭菌中引入外源基因的方法，所述方法包括(1)構(gòu)建ー非復(fù)制型整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含梭菌基因中待插入位點上下游兩段同源序列和I-kel酶切位點，同時，該質(zhì)粒還含有所述外源基因；(2)將所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述梭菌，篩選獲得整合了所述上下游兩段同源序列、外源基因和IIceI酶切位點的菌株；和(3)使用權(quán)利要求2 5中任ー項所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化步驟( 所獲得的菌株，從而將所述外源基因引入所述梭菌的基因組中。
9.ー種在梭菌基因組中實施突變的方法，所述方法包括(1)構(gòu)建ー非復(fù)制型整合質(zhì)粒，該質(zhì)粒含梭菌基因中待突變基因上下游兩段同源序列和I-kel酶切位點，同時，該質(zhì)粒還含有發(fā)生了突變的該待突變基因序列；(2)將所述非復(fù)制型整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述梭菌，篩選獲得整合了所述上下游兩段同源序列、外源基因和IIceI酶切位點的菌株；和(3)使用權(quán)利要求2 5中任ー項所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化步驟( 所獲得的菌株，從而將所述突變基因引入所述梭菌的基因組中。
10.如權(quán)利要求7 9中任一項所述的方法，其特征在干，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、熱纖梭菌、Clostridium carboxidivorans P7> Clostridium ljungdahlii、Clostriaiumphytofermentans、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌或艱難梭菌。
11.如權(quán)利要求7 10中任一項所述的方法，其特征在干，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌和拜氏梭菌。
12.—種試劑盒，其特征在干，所述試劑盒含有權(quán)利要求2 5中任ー項所述的構(gòu)建物。
13.一種梭菌，其采用權(quán)利要求7 9中任一項所述的方法制備得到。
14.如權(quán)利要求13所述的梭菌，其特征在干，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、 糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、熱纖梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、 Clostridium Ijungdahlii> Clostridiumphytofermentans、破傷)；^梭菌、產(chǎn)氣#月臭梭菌、肉毒梭菌或艱難梭菌。
15.如權(quán)利要求13或14所述的梭菌，其特征在干，所述梭菌為丙酮丁酸梭菌或拜氏梭菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在梭菌中實現(xiàn)基因敲除、引入外源基因、點突變、大片段敲除的方法，以及在該方法中使用到的含SEQ ID NO1所示序列的多核苷酸序列、構(gòu)建物等，以及這些多核苷酸序列和構(gòu)建物在梭菌中實現(xiàn)基因敲除、引入外源基因、點突變、大片段敲除的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及采用本發(fā)明方法制備得到的梭菌。
文檔編號C12N1/21GK102559704SQ20101060096
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者姜衛(wèi)紅, 楊晟, 邵麗君 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院