專利名稱：一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面最外層，不溶解于水而溶解于有機溶劑(氯仿等)的一類混合物的總稱，它們是由表皮細(xì)胞所合成和分泌，一般認(rèn)為表皮蠟質(zhì)具有阻止植物組織內(nèi)水分的非氣孔性散失、維持植物表面清潔與植物表面防水、防止植物被有害光線損傷、保護植物避免被病菌侵害和防止某些昆蟲的蠶食等功能。此外，表皮蠟質(zhì)的含量通常會影響表皮結(jié)構(gòu)的變化，而表皮結(jié)構(gòu)的變化通常會影響表皮對水分子的吸附和滲透，例如，表皮蠟質(zhì)的含量會影響水稻葉片GUS染色的效果，疏水性的表皮蠟質(zhì)含量越高，GUS染色液就越難被葉表皮吸附和滲透，水稻葉片GUS染色的效果就越差，導(dǎo)致只有葉片的切口邊緣很小一部分區(qū)域能被染色，其他大部分區(qū)域很難被染色。而蠟質(zhì)含量越少，就越有利于 ⑶S染色液的吸附和滲透，⑶S染色的效果就越好。同時對一些作物的研究結(jié)果表明，作物表皮蠟質(zhì)與作物水分利用效率、產(chǎn)量、收獲指數(shù)和角質(zhì)蒸騰等都有較好的相關(guān)性，有蠟質(zhì)表型的材料其抗旱節(jié)水性和產(chǎn)量都要高于無蠟質(zhì)表型的材料。水稻是世界三大糧食作物之一，但水稻生產(chǎn)需要大量的水，干旱已成為缺水地區(qū)水稻生產(chǎn)最大的限制性因子，因此耐旱相關(guān)基因的挖掘和抗旱品種培育，是目前穩(wěn)定糧食生產(chǎn)的最有效途徑。目前，利用正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)的方法，人們已經(jīng)從許多物種中克隆出了蠟質(zhì)相關(guān)基因并進行了相關(guān)的功能分析。根據(jù)這些基因的功能可將它們分為以下幾類蠟質(zhì)合成基因，蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運基因，蠟質(zhì)調(diào)控基因等。雖然這方面的研究取得了不少進展，但目前與耐旱性狀相關(guān)的水稻葉片蠟質(zhì)缺失突變體卻鮮有報道，因此利用水稻葉片蠟質(zhì)缺失突變體克隆與葉片蠟質(zhì)形成相關(guān)的基因，并分析其功能，進一步了解水稻葉表皮蠟質(zhì)與耐旱性之間的相關(guān)性，具有重要的理論意義和實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種與蠟質(zhì)形成相關(guān)的RNA分子。本發(fā)明所提供的RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。表達上述RNA分子的重組干擾載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述重組干擾載體按照包括如下步驟的方法得到將SEQ ID NO 3所示DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點，得到所述重組干擾載體。上述重組干擾載體中，所述出發(fā)載體為pCaml30X ；所述pCaml30X按照包括如下步驟的方法制備得到將CaMV35S啟動子片段插入載體pCAMBIA1300的I3St I和Hind III的識別位點間，得到的重組載體記作pCaml30XM ；將 Nos終止子片段插入載體pCaml30XM的EcoR I和Mc I識別位點間，得到的重組載體即為 pCaml30Xo本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中，所述使出發(fā)植物中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的功能喪失的方法為抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達。上述方法中，所述抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達的方法包括如下步驟向所述出發(fā)植物中導(dǎo)入上述任一所述重組干擾載體。上述方法中，所述蠟質(zhì)為植物表皮蠟質(zhì)；所述植物表皮蠟質(zhì)可為植物葉片表面蠟質(zhì)；上述方法中，所述植物為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。上述方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在調(diào)節(jié)植物中蠟質(zhì)形成中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在培育耐旱植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應(yīng)用中，所述蠟質(zhì)為植物表皮蠟質(zhì)；所述植物表皮蠟質(zhì)可為植物葉片表面蠟質(zhì)；上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。上述應(yīng)用中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明基因影響葉片蠟質(zhì)形成，是一個控制葉片蠟質(zhì)形成的基因，具體是對葉片蠟質(zhì)形成起正調(diào)控作用。本發(fā)明基因?qū)α私馑救~片蠟質(zhì)形成的機制具有重要的應(yīng)用價值，可以探索將其用于水稻育種，通過基因工程手段改良水稻葉表皮性狀從而提高抗旱能力。此外，本發(fā)明的基因和蛋白控制表皮蠟質(zhì)的含量，表皮蠟質(zhì)的含量會影響水稻葉片GUS 染色的效果，降低表皮蠟質(zhì)的含量可以增強水稻葉片GUS染色的效果，因此可利用該基因來培育檢測外源基因在葉片表達情況的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灢牧稀?br>

圖1為野生型與突變體osgll植株和葉片表型。圖2為野生型3037和突變體osgll的表型。圖3為野生型3037與突變體osgll的葉表皮屬性分析。圖4為干旱對野生型3037與突變體osgll的影響。圖5為互補表達載體的構(gòu)建。圖6為野生型與pGLlRNAi轉(zhuǎn)基因植株及其葉片表型。圖7為野生型日本晴(WT)和轉(zhuǎn)pGLlRNAi植株OsGLl基因表達量。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、基因的發(fā)現(xiàn)1、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的表型分析水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll是野生型3037的自然突變體。在正常情況下，突變體 osgll與野生型3037相比沒有明顯差異(圖1A)，但在在下雨天或者人工淋浴的情況下，突變體osgll的葉片表現(xiàn)出高度親水的表型。在野生型3037中，由于葉表皮蠟質(zhì)的大量存在，水分子往往會在葉表面聚合形成球形狀的水珠，只要稍微抖動一下葉片，都會導(dǎo)致葉片上這些水珠的滴落。而在突變體osgll中，由于葉片高度親水，水分子將會均勻散布在整個葉表面而不形成水珠(圖1B)。圖1中，左為野生型，右為突變體。2、突變體osgll的電鏡觀察分析通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型3037相比(圖2A，B)，突變體osgll葉表皮近軸端與遠(yuǎn)軸端的蠟質(zhì)嚴(yán)重減少(圖2D，E)，而透射電鏡的研究結(jié)果表明，野生型3037表皮膜可分為兩層結(jié)構(gòu)，最外層為透明層，最內(nèi)層為非透明層(圖2C)，與野生型3037相比，突變體 osgll葉表皮膜變薄，最外層的透明層消失，只含有最內(nèi)層的非透明層(圖2F)。圖2中，A 為野生型3037的遠(yuǎn)軸端葉片表面；B為為野生型3037的近軸端葉片表面；C為野生型3037 的表皮膜結(jié)構(gòu)；D為突變體osgll的遠(yuǎn)軸端葉片表面；E為為突變體osgll的近軸端葉片表面；F為突變體osgll的表皮膜結(jié)構(gòu)。P 乳突細(xì)胞；CW 細(xì)胞壁；TL :透明層；OL 非透明層。3、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll葉表皮屬性的分析葉表皮屬性分析的檢測包括葉綠體滲透實驗和葉片的水分散失實驗，對于葉綠體滲透實驗，主要在暗室中進行，我們以抽穗期每個水稻分蘗的倒三葉為研究對象，將葉片切割成3厘米長并侵泡在濃度為80%的30毫升乙醇中，在1-12小時內(nèi)，每隔1小時測定葉綠素的含量，每個時間點的葉綠素滲透率，以該時間點滲透出來的葉綠素含量占第12個小時滲透出來的葉綠素含量的百分比表示。對于水分散失實驗，也是在暗室中進行，也是以抽穗期每個水稻分蘗的倒三葉為研究對象，在O小時，0. 5小時，1小時，1. 5小時，2小時，3小時， 4小時，5小時，6小時，7小時，8小時這11個時間點分別測定樣品的重量，每個時間點的水分散失率，以該時間點損失的水分重量占最初樣品重量的百分比表示。水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll與野生型3037的葉綠體滲透率、水分散失率的測定結(jié)果如圖3所示，表明蠟質(zhì)缺失突變體osgll與野生型3037相比，葉綠體滲透型降低，而水分散失率增加。圖3中，A為野生型3037與突變體osgll的葉綠體滲透實驗；B為野生型3037與突變體osgll的水分散失實驗。每個樣品重復(fù)三次。W:野生型3037 ;M:突變體osgll。4、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的干旱實驗分析將野生型3037和突變體osgll種在同一個盆里，在正常情況下生長6周后，停止給他們澆水，干旱持續(xù)12天后再給他們澆水，觀察他們表型的變化。結(jié)果表明，野生型3037 的大部分葉片能夠恢復(fù)正常，而突變體osgll只有少部分葉片能夠恢復(fù)正常(圖4)，這表明突變體osgll對于干旱更敏感。圖4中，A為干旱實驗開始之前的野生型3037(左)與突變體osgll(右)；B為干旱實驗結(jié)束后的野生型3037(左)與突變體osgll(右)。5、水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的遺傳分析水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll和粳型野生型材料中花11，二品種雜交得Fl代，F(xiàn)l代自交產(chǎn)生F2代，對F2代植株進行表型鑒定，中花11和osgll分別作為正、負(fù)對照，F(xiàn)2代植株的表型鑒定結(jié)果如表1所示，表明水稻蠟質(zhì)缺失這一性狀符合單基因控制遺傳規(guī)律。表1中，正常株數(shù)是指具有中花11表型的株數(shù)，蠟質(zhì)缺失osgll株數(shù)是指具有osgll表型的株數(shù)。表1水稻蠟質(zhì)缺失突變體osgll的遺傳分析
權(quán)利要求
1.一種RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.表達權(quán)利要求1所述RNA分子的重組干擾載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組干擾載體，其特征在于所述重組干擾載體按照包括如下步驟的方法得到將SEQ ID NO :3所示DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點，得到所述重組干擾載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組干擾載體，其特征在于所述出發(fā)載體為pCaml30X；所述pCaml30X按照包括如下步驟的方法制備得到將CaMV35S啟動子片段插入載體pCAMBIA1300的I3St I和Hind III的識別位點間，得到的重組載體記作pCaml30XM ；將 Nos終止子片段插入載體pCaml30XM的EcoR I和Mc I識別位點間，得到的重組載體即為 pCaml30Xo
5.一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的SEQID NO 1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述使出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失的方法為抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因表達；所述抑制出發(fā)植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達的方法包括如下步驟 向所述出發(fā)植物中導(dǎo)入權(quán)利要求2-4中任一所述重組干擾載體。
7.SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在調(diào)節(jié)植物中蠟質(zhì)形成中的應(yīng)用；SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在培育耐旱植物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于所述蠟質(zhì)為植物表皮蠟質(zhì)；所述植物為單子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于所述植物表皮蠟質(zhì)為植物葉片表面蠟質(zhì)；所述單子葉植物為水稻。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于所述SEQID N0:1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該培育蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟使出發(fā)植物中的SEQ ID NO1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明基因影響葉片蠟質(zhì)形成，是一個控制葉片蠟質(zhì)形成的基因，具體是對葉片蠟質(zhì)形成起正調(diào)控作用。本發(fā)明基因?qū)α私馑救~片蠟質(zhì)形成的機制具有重要的應(yīng)用價值，可以探索將其用于水稻育種，通過基因工程手段改良水稻葉表皮性狀從而提高抗旱能力。此外，本發(fā)明的基因和蛋白控制表皮蠟質(zhì)的含量，表皮蠟質(zhì)的含量會影響水稻葉片GUS染色的效果，降低表皮蠟質(zhì)的含量可以增強水稻葉片GUS染色的效果，因此可利用該基因來培育檢測外源基因在葉片表達情況的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灢牧稀?br> 文檔編號C12N15/63GK102168083SQ20101061060
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者唐丁, 李明, 王克劍, 程祝寬, 覃寶祥 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所