專(zhuān)利名稱(chēng)：一種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用基因重組技術(shù)制備一種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)與免疫球蛋白Fc (Fe)的融合蛋白(VEGF-Fc)，該融合蛋白可作為基質(zhì)化內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)相關(guān)的細(xì)胞大批量擴(kuò)增及內(nèi)皮/血管誘導(dǎo)修復(fù)等應(yīng)用研究。
背景技術(shù)：
材料的抗凝血及血管化問(wèn)題一直是組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究中所面臨的瓶頸之一，尤其是對(duì)于尺寸超過(guò)200 μ m的再生組織，血管化的不足會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)不足進(jìn)而導(dǎo)致組織內(nèi)部細(xì)胞凋亡1。為了解決這一問(wèn)題，有專(zhuān)家提出一方面可以在體外移植血管，另一方面可以設(shè)計(jì)出一種新型生物材料在體內(nèi)誘導(dǎo)血管再生2。然而，血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖和生存能力是實(shí)現(xiàn)組織血管再生的重要因素。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)可有效調(diào)控細(xì)胞行為，如細(xì)胞的粘附、增殖、遷移、細(xì)胞形貌和細(xì)胞間的分化。因此，我們通過(guò)研究制備可溶性生物信號(hào)分子的細(xì)胞外基質(zhì)化，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和增殖構(gòu)建良好的細(xì)胞外微環(huán)境。人工細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性，影響細(xì)胞生存和生物學(xué)功能。人工細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源主要分為三類(lèi)天然生物大分子(如膠原、海藻酸、透明質(zhì)酸等)、 化學(xué)合成聚合物(如PLA、PGA、PLGA、PEG等)以及近年發(fā)展起來(lái)的基因重組型細(xì)胞外基質(zhì) (如基質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)依賴(lài)型融合蛋白、生長(zhǎng)因子型融合蛋白和鈣粘素依賴(lài)型融合蛋白)。其中， 天然生物大分子以其良好的生物相容性和生物降解性而廣泛用于組織工程領(lǐng)域。然而，這種細(xì)胞外基質(zhì)具有機(jī)械性能差，使用過(guò)程中不穩(wěn)定的缺點(diǎn)?；瘜W(xué)合成聚合物雖然機(jī)械性能強(qiáng)，但其生物相容性差，易弓I起免疫應(yīng)答反應(yīng)。與前兩種人工細(xì)胞外基質(zhì)相比，基因重組蛋白型細(xì)胞外基質(zhì)不僅可特異性增強(qiáng)靶細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，而且可用于構(gòu)建一種安全、可控的細(xì)胞外微環(huán)境達(dá)到調(diào)控細(xì)胞的黏附、增殖、遷移等細(xì)胞生物學(xué)行為的目的。組織工程研究中，VEGF作為促進(jìn)血管新生的有效特異性活性信號(hào)分子，已被廣泛應(yīng)用于促進(jìn)新血管的生成3，4。有報(bào)道指出，VEGF通過(guò)與細(xì)胞外受體KDR結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)一步影響內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖及其功能表達(dá)。近年來(lái)，已報(bào)道了多種固定、緩慢釋放VEGF以提高其生物學(xué)活性的生物材料相關(guān)技術(shù)。例如①利用材料的肝素化通過(guò)生物親和域物理固定并緩釋VEGF，該方法雖可一定程度上避免VEGF的生物降解，提高 VEGF的生物活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但這種物理修飾的方法不能定量調(diào)控VEGF的固定及其釋放行為1，5；②利用化學(xué)鍵合交聯(lián)法固定生長(zhǎng)因子，其結(jié)果均顯示出該方法雖能部分改善VEGF持久促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管再生的性能，但在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中會(huì)有部分生長(zhǎng)因子的固有生物學(xué)活性喪失6，7;③利用可注射水凝膠包埋而達(dá)到生長(zhǎng)因子持續(xù)釋放的目的，進(jìn)而起到誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管的作用。但利用這種方法，生長(zhǎng)因子仍然以可溶性狀態(tài)存在且其半衰期僅為4小時(shí)，VEGF的生物活性仍有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，針對(duì)改善內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的研究，利用基因重組技術(shù)，提供一種可基質(zhì)化的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白(即VEGF-Fc融合蛋白)并開(kāi)發(fā)其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明旨在提供含有目的基因(VEGF、Fe)的真核細(xì)胞蛋白表達(dá)基因質(zhì)粒，如 pcDNA3. I-VEGF-Fc,以及由所述的基因質(zhì)粒制得的VEGF-Fc融合蛋白。該融合蛋白不僅提高了生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性，并可作為一種可基質(zhì)化內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子提高組織工程、再生醫(yī)學(xué)相關(guān)生物材料的內(nèi)皮細(xì)胞特異親和性，改善材料快速誘導(dǎo)內(nèi)皮/血管修復(fù)等功能。本發(fā)明提供的含有目的基因(VEGF、Fe)的真核細(xì)胞表達(dá)基因質(zhì)粒，是采用基因重組PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因VEGF和Fc序列，并分別通過(guò)雙酶切連接并嵌入真核細(xì)胞表達(dá)基因質(zhì)粒載體(如PCDNA3. 1)中，得到含有雙功能目的基因(VEGF-Fc)片段的真核細(xì)胞表達(dá)基因質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種可基質(zhì)化應(yīng)用的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白(VEGF-FC)，由所述的基因質(zhì)粒經(jīng)真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)及蛋白A親和層析色譜柱分離純化而制得。本發(fā)明還提供了一種上述VEGF-Fc融合蛋白做為細(xì)胞外基質(zhì)固定化的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的應(yīng)用，其通過(guò)物理包埋或(/及)疏水作用用于材料本體或(/及)材料表面修飾， 提高材料的親水性，改善材料的生物相容性。其使用濃度范圍為lOng/ml-lOOOng/ml。其中，上述VEGF-Fc融合蛋白通過(guò)Fc可在疏水材料表面自組裝分子層的作用，將 VEGF-Fc融合蛋白有序固定于疏水材料表面，實(shí)現(xiàn)VEGF的基質(zhì)化固定，提高材料的內(nèi)皮細(xì)胞特異親和性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖；并可用于普通細(xì)胞培養(yǎng)皿表面修飾及大批量擴(kuò)增VEGF受體陽(yáng)性表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞。其具體方案如下
(1)將純化后的VEGF-Fc融合蛋白用PBS稀釋至lOng/ml-lOOOng/ml，浸泡疏水性生物材料(如聚苯乙烯培養(yǎng)板)；
(2)在4°C至 37°C，孵育 0. 5-24h.
(3)棄上清，用PBS淋洗1-3遍，除去未穩(wěn)定固定的融合蛋白VEGF-Fc ；
(4)在疏水性生物材料表面使融合蛋白VEGF-Fc基質(zhì)化進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞表面VEGF受體的介導(dǎo)，促進(jìn)VEGF受體陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞與基質(zhì)化VEGF-Fc 融合蛋白的特異性粘附，改善生物材料的細(xì)胞特異親和性，提高其細(xì)胞的增殖及分化功能的表達(dá)。并可用于促進(jìn)誘導(dǎo)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化、快速誘導(dǎo)材料表面內(nèi)皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料誘導(dǎo)血管新生的能力。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果
一，本發(fā)明利用基因工程原理和技術(shù)手段，將內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與免疫球蛋白Fc段融合，制備了具有VEGF和Fc雙功能的融合蛋白。二，本發(fā)明通過(guò)免疫球蛋白Fc片段使VEGF以有活性的二聚體形式存在，一方面提高VEGF的穩(wěn)定性，另一方面利用Fc段與蛋白質(zhì)A特異性結(jié)合利于融合蛋白的后期純化。三，本發(fā)明的融合蛋白通過(guò)Fc的可通過(guò)疏水作用自組裝形成單分子層，實(shí)現(xiàn)疏水材料表面固定修飾，在材料表面形成一種基質(zhì)化內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，提高材料的親水性，改善材料的生物相容性，加強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞與材料的特異性相互作用。四，本發(fā)明的VEGF-Fc融合蛋白通過(guò)基質(zhì)化固定可以有效的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖和分化功能表達(dá)，不僅可促進(jìn)材料的快速內(nèi)皮化，提高材料抗凝血性能，同時(shí)還可促進(jìn)實(shí)現(xiàn)組織工程、再生醫(yī)學(xué)相關(guān)種子細(xì)胞的批量擴(kuò)增。五，本發(fā)明的VEGF-Fc融合蛋白提高內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活性，并通過(guò)基質(zhì)化固定可促進(jìn)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化，改善材料的血管新生誘導(dǎo)能力。

圖1是重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖2是重組質(zhì)粒鑒定。①DNA分子標(biāo)記；②質(zhì)粒載體PCDNA3. I-Fc (6112bp);③重組質(zhì)粒 pcDNA3. I-VEGF-Fc 經(jīng) BamHI 和 NotI 雙酶切(573bp，6112bp)； 圖3是純化融合蛋白鑒定；
圖4是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化用于細(xì)胞培養(yǎng)示意圖； 圖5是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響；
圖6是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。A 培養(yǎng)液中添加VEGF-Fc融合蛋白促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖；B =VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化固定改善其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物活性；
圖7是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響(A:聚賴(lài)氨酸鋪板；B 聚賴(lài)氨酸鋪板培養(yǎng)液中添加生長(zhǎng)因子VEGF ；C 聚賴(lài)氨酸鋪板培養(yǎng)液中添加VEGF-Fc融合蛋白；D =VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化固定鋪板；a’，b’，C’和d’分別是a，b, c和d圖中方框處放大圖)；
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本發(fā)明研究的基本策略是利用基因重組技術(shù)將人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和免疫球蛋白Fc 段進(jìn)行融合，得到含有目的基因(VEGF、Fe)的質(zhì)粒pcDNA3. I-VEGF-Fc0以pET28A-VEGF質(zhì)粒為模板，利用合成的引物特異性擴(kuò)增VEGF基因。1%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，將膠回收PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHl V和AfoiI雙酶切后，插入pcDNA3. 1 BamHl V和NotY位點(diǎn)之間(圖1)。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHI和NotI雙酶切電泳鑒定，顯示切出與目的基因大小一致的DNA片段(573bp)，將此質(zhì)粒載體命名為pcDNA3. I-VEGF-Fc (圖 2)。實(shí)施例2
將實(shí)例1構(gòu)建的含有目的基因的質(zhì)粒pcDNA3. I-VEGF-Fc轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，利用rProtein A FF柱對(duì)VEGF - Fc融合蛋白進(jìn)行純化。純化的融合蛋白利用抗VEGF 抗體通過(guò)免疫印跡檢測(cè)，圖中沒(méi)有其他非特異性曝光條帶出現(xiàn)，只有一條與預(yù)計(jì)分子量大小(46KD)相似的條帶。此結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明制備得到了 VEGF-Fc融合蛋白(圖3)。將得到的融合蛋白修飾疏水材料表面形成一種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白基質(zhì)用于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，如示意圖(圖4)所示。
實(shí)施例3本發(fā)明通過(guò)MTT法檢測(cè)在不同修飾的聚苯乙烯培養(yǎng)皿表面內(nèi)皮細(xì)胞的黏附情況，進(jìn)而考察VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響。以聚苯乙烯培養(yǎng)板粘附細(xì)胞為100%，接近81. 25%的細(xì)胞能黏附到VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化表面修飾的培養(yǎng)板上；而只有17. 5%的細(xì)胞黏附到涂有IgG的培養(yǎng)板上。結(jié)果表明VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化，其可通過(guò)VEGF受體介導(dǎo)顯著提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附(圖 5)。 實(shí)施例4
本發(fā)明中通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明與溶液中添加VEGF相比，溶液中添加 VEGF-Fc融合蛋白可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)VEGF-Fc融合蛋白可以更好的維持細(xì)胞增殖活性(圖6)。我們可以得出結(jié)論=VEGF-Fc融合蛋白可有效延長(zhǎng)VEGF 在體外的生物活性，VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化可以持久地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。實(shí)施例5
本發(fā)明中利用免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了 VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響(圖7)。比較內(nèi)皮細(xì)胞分別培養(yǎng)于聚賴(lài)氨酸修飾培養(yǎng)板、聚賴(lài)氨酸修飾培養(yǎng)板并于培養(yǎng)基中分別添加VEGF、VEGF-Fc融合蛋白，以及VEGF-Fc融合蛋白修飾培養(yǎng)板形成的VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化表面，其結(jié)果表明黏附于VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化表面的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)更多的肌動(dòng)蛋白纖維且在觀(guān)察時(shí)間范圍內(nèi)(48h)細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，細(xì)胞骨架緊密排列，形成類(lèi)似血管內(nèi)皮層緊密排列的結(jié)構(gòu)；而黏附于聚賴(lài)氨酸修飾且培養(yǎng)基中添加VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞，在培養(yǎng)早期細(xì)胞伸展良好且出現(xiàn)胞間連絲，但在培養(yǎng)48小時(shí)之后，這些細(xì)胞的胞間連絲消失。
參考文獻(xiàn)
1.Chen Lj He Zj Chen B，Yang Mj Zhao Y，Sun W, Xiao Zj Zhang Jj Dai J. Loading of VEGF to the heparin cross-linked demineralized bone matrix improves vascularization of the scaffold. J Mater Sci Mater Med. 2010;21 (1):309—17.
2.Chiu LLj Radisic M. Scaffolds with covalently immobilized VEGF and Angiopoietin—1 for vascularization of engineered tissues. Biomaterials· 2010; 31 (2) : 226-41.
3.Vempati P， Mac Gabhann F， Popel AS. Quantifying the Proteolytic Release of Extracellular Matrix-Sequestered VEGF with a Computational Model. PLoS One. 2010 Jul 29;5 (7):ell860.
4.Kleinheinz J， Jung S， Wermker K， Fischer C， Joos U. Release kinetics of VEGF165 from a collagen matrix and structural matrix changes in a circulation model. Head Face Med. 2010 Jul 19;6:17.
5.Steffens GCj Yao C，Prevel P，Markowicz M，Schenck P，Noah EMj Pallua N. Modulation of angiogenic potential of collagen matrices by covalent incorporation of heparin and loading with vascular endothelial growth factor. 2004;10 (9-10):1502-9.6.I. Zachary. VEGF signalling: integration and endothelial cell biology. Biochemical Society Transactions.
7.Lim SM, Oh SH, Lee HH, Yuk SH, Im GI, Lee factor-releasing nanoparticle/hydrogel system for engineering. J Mater Sci Mater Med. 2010;21 (9):2593-600.
multi-tasking in 2003;31(6):1171-8 JH. Dual growth cartilage tissue
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和免疫球蛋白Fc (Fe)融合蛋白的基因質(zhì)粒，即利用基因工程手段將VEGF和Fc結(jié)構(gòu)域基因重組構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)VEGF和Fc雙功能融合蛋白的基因質(zhì)粒。
2.—種VEGF-Fc融合蛋白，由權(quán)利要求1所述的基因質(zhì)粒經(jīng)真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)及分離純化而制得。
3.—種權(quán)利要求2所述的VEGF-Fc融合蛋白的應(yīng)用，用于材料本體或材料表面修飾，提高材料的親水性，改善材料的生物相容性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用于提高材料的內(nèi)皮細(xì)胞特異親和性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖及批量擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用于促進(jìn)誘導(dǎo)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化、快速誘導(dǎo)材料表面內(nèi)皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料誘導(dǎo)血管新生能力。
全文摘要
本發(fā)明利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了一種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF與免疫球蛋白G的Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(VEGF-Fc)。該融合蛋白一方面可以更好地維持VEGF的生物活性，延長(zhǎng)其半衰期，另一方面將其通過(guò)疏水作用固定于二、三維生物材料的本體或其表面，改善材料的生物相容性及其與內(nèi)皮細(xì)胞的特異親和性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖及誘導(dǎo)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化，提高材料抗凝血及誘導(dǎo)血管新生的生物活性。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102260702SQ20111020253
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日 公開(kāi)號(hào)201110202533.發(fā)明者于美華, 杜鳳移, 楊軍 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)